本发明属于微生物技术领域，公开了一种检测变异链球菌生物膜形成量的方法及应用，包括：配置琼脂溶液，高压蒸汽灭菌锅中高压下灭菌；液体状态下滴加等量琼脂溶液到孔板；待琼脂凝固，利用镊子将细胞扒片竖直放在孔板中；制作两个各孔均滴加有等量等浓度琼脂溶液的孔板，记为板A，板B；取板A，每孔滴加入BHI培养基和变异链球菌菌液，摇床培养；利用镊子取出板A各孔的细胞扒片，PBS冲洗，竖直放在板B相应的孔中；板B各孔加入结晶紫溶液进行染色，而后用PBS洗去多余染色剂，接着各孔加入冰醋酸没过细胞扒片，孵育，取出细胞扒片，酶标仪测量OD_600nm。本发明灵敏度高、成本低廉、操作简易、稳定性高。