技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种检测变异链球菌生物膜形成量的方法及应用。 背景技术 [0002]目前，龋病，俗称虫牙、蛀牙，是一种源于细菌性感染的口腔主要常见疾病，严重时可继发牙髓炎和根尖周炎，甚至会引起牙槽骨和颌骨炎症，作为一种普遍存在于儿童和成人中的慢性口腔传染病，其成因与变异链球菌(Streptococcus mutans)在牙齿表面的定殖有着密切的联系。现代医学研究认为，变异链球菌生物膜吸附其他细菌在牙釉表面所形成的牙菌斑也是致龋的关键因素之一，减少或抑制生物膜的形成同样可达到防治龋齿的目的。生物膜形成量的测定是开展研究工作与评价治疗效果的重要手段，传统方法中，细胞扒片平放于孔板底部，扒片底面与孔板密切接触，由于细菌可黏附的面积少，24h内所形成的生物膜量较少，所以测量灵敏度低；同时，由于扒片和孔板底部之间存在强大的吸附力和表面张力，细胞扒片不宜取出，故操作较为困难。因此，亟需一种新的、灵敏度高、成本低廉、操作简易的检测变异链球菌生物膜形成量的方法。 [0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统方法中，细胞扒片平放于孔板底部，扒片地面与孔板密切接触，短时间内生物膜量形成较少；且由于强大吸附力的存在，扒片不易取出，操作比较困难。 [0004]解决以上问题及缺陷的难度为： [0005](1)24孔板底面积一定，细胞扒片细菌可黏附面积有限。 [0006](2)由于周围都是液体培养基，平方的细胞扒片和孔板底部必然存在吸附力，进而导致细胞扒片取出困难。 [0007]解决以上问题及缺陷的意义为：生物膜的研究是微生物学中极为重要的部分，利用细胞扒片来培养生物膜是目前实验室较为常用的方法。而传统的将细胞扒片平放在孔板底部的方法，细胞扒片地面与孔板密切接触，细菌可以黏附的面积较少，24h内生物膜形成量较少，且由于强大吸附力的存在，扒片不易取出，操作比较困难。针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测变异链球菌生物膜形成量的方法。通过在24孔板底部添加琼脂将细胞扒片直立，可以排除孔板底部的沉菌对细胞扒片上生长的生物膜检测的影响，灵敏度高、成本低廉、操作简易、稳定性高。同时，本发明的检测变异链球菌生物膜形成量的方法，通过直立扒片，增大了细菌对细胞扒片的可依附的面积，所以也增加了之后使用结晶紫测生物膜的灵敏度。 发明内容 [0008]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测变异链球菌生物膜形成量的方法及应用。 [0009]本发明是这样实现的，一种检测变异链球菌生物膜形成量的方法，所述检测变异链球菌生物膜形成量的方法包括以下步骤： [0010]第一步，配置琼脂溶液，高压蒸汽灭菌锅中高压下灭菌；液体状态下滴加等量琼脂溶液到孔板；待琼脂凝固，利用镊子将细胞扒片竖直放在孔板中；制作两个各孔均滴加有等量等浓度琼脂溶液的孔板，记为板A，板B； [0011]第二步，取板A，每孔滴加入BHI培养基和变异链球菌菌液，摇床培养； [0012]第三步，利用镊子取出板A各孔的细胞扒片，PBS冲洗，竖直放在板B相应的孔中；板B各孔加入结晶紫溶液进行染色，而后用PBS洗去多余染色剂，接着各孔加入冰醋酸没过细胞扒片，孵育，取出细胞扒片，酶标仪测量OD_600nm。 [0013]进一步，所述第一步的孔板为24孔板。 [0014]进一步，所述第一步的配置1％-3％琼脂溶液，高压蒸汽灭菌锅中121℃高压下灭菌15min。 [0015]进一步，所述第一步的液体状态下滴加等量琼脂溶液300～500ul/孔到孔板。 [0016]进一步，所述第一步的待琼脂凝固，利用镊子将直径为14mm的细胞扒片竖直放在24孔板中。 [0017]进一步，所述第二步取板A，每孔滴加入1000ul BHI培养基和100ul变异链球菌菌液，摇床培养24h。 [0018]进一步，所述变异链球菌菌液为OD＝0.2，1*10⁷/ml。 [0019]进一步，所述第三步的板B各孔加入1ml 0.1％结晶紫溶液进行染色15min。 [0020]进一步，所述第三步的各孔加入1ml冰醋酸没过细胞扒片，37℃孵育30min。 [0021]本发明的另一目的在于提供一种所述检测变异链球菌生物膜形成量的方法在细菌性感染口腔疾病监测设备中的应用。 [0022]结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的检测变异链球菌生物膜形成量的方法，通过在24孔板底部添加琼脂将细胞扒片直立，可以排除孔板底部的沉菌对细胞扒片上生长的生物膜的影响，灵敏度高、成本低廉、操作简易、稳定性高。同时，本发明通过直立扒片，增大了细菌对细胞扒片的可依附的面积，所以也增加了之后使用结晶紫测生物膜的灵敏度。 附图说明 [0023]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0024]图1.1和1.2是本发明实施例提供的检测变异链球菌生物膜形成量的方法的流程图。 [0025]图2是本发明实施例提供的变异链球菌革兰染色图(10X100)。 [0026]图3是本发明实施例提供的冰乙酸溶脱结晶紫示意图。 [0027]图4是本发明实施例提供的24h处理后结晶紫检测生物膜量示意图。 [0028]图5是本发明实施例提供的24h处理后结晶紫检测溶液PH示意图。 具体实施方式 [0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0030]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测变异链球菌生物膜形成量的方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。 [0031]如图1所示，本发明实施例提供的检测变异链球菌生物膜形成量的方法包括以下步骤： [0032]S101：简易装置的制作：配置1％-3％琼脂溶液，高压蒸汽灭菌锅中121℃高压下灭菌15min；液体状态下滴加等量琼脂溶液(300～500ul/孔)到24孔板。待琼脂凝固，利用镊子将直径为14mm的细胞扒片竖直放在24孔板中；同样的方法制作两个各孔均滴加有等量等浓度琼脂溶液的24孔板，记为板A，板B。 [0033]S102：生物膜形成：取板A，每孔滴加入1000ul BHI培养基和100ul变异链球菌菌液(OD＝0.2，1*10⁷/ml)，摇床培养24h。 [0034]S103：生物膜检测：利用镊子取出板A各孔的细胞扒片，PBS轻轻冲洗，竖直放在板B相应的孔中；板B各孔加入1ml 0.1％结晶紫溶液进行染色15min，而后用PBS洗去多余染色剂，接着各孔加入1ml冰醋酸没过细胞扒片，37℃孵育30min，取出细胞扒片，酶标仪测量OD_600nm。 [0035]本发明的方法通过在24孔板底部添加琼脂将细胞扒片直立，可以排除孔板底部的沉菌对细胞扒片上生长的生物膜的影响。传统方法中，细胞扒片平放于孔板底部，扒片地面与孔板密切接触，很少有生物膜生成。本发明的方法通过直立扒片，增大了细菌对细胞扒片的可依附的面积，所以也增加了之后使用结晶紫测生物膜的灵敏度。 [0036]下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。 [0037]1、材料与方法 [0038]1.1细菌培养和菌液制备 [0039]取变异链球菌ATCC 25175，常规复苏后接种于脑心浸液(Brain Heart InfusionBroth，BHI)琼脂平板上，37℃条件下培养24h后，观察菌落呈圆形，白色，表面湿润光滑，边缘规整，大小均匀，直径3-8mm；并进行革兰染色，油镜(10X100)下观察，可见该菌种菌体呈紫色，为G+小球菌，呈长链状或短链状，成对或分散排列(图2)。用分光光度计将菌液浓度调整到OD_600nm为0.2(细菌数约1×10⁷)备用。 [0040]1.2溶液配制 [0041]液体增菌BHI培养基配置时，称取BHI培养基干粉38.5g，蔗糖1g，加热搅拌于1000mL蒸馏水中；分别称取0.5g、0.75g、1.5g、3g精氨酸粉末，加热搅拌于上述配置的培养基中，加热搅拌，配置成含有0.5％(w/v)、0.75％(w/v)、1.5％(w/v)、3.0％(w/v)精氨酸的液体培养基。龋2g琼脂粉与100ml蒸馏水中配置2％琼脂溶液。以上溶液均在121℃高压灭菌20分钟，备用。 [0042]1.3简易装置制作 [0043]取2个24孔板，记为板A，板B。每孔滴加500ul琼脂溶液。待琼脂凝固，利用镊子将直径为14mm的细胞扒片竖直放在24孔板中。 [0044]1.4细菌培养 [0045]取板A，每孔滴加入1000ul BHI培养基和100ul变异链球菌菌液(OD＝0.2，1*10⁷/ml)，摇床培养24h。 [0046]1.5生物膜检测 [0047]利用镊子取出板A各孔的细胞扒片，PBS轻轻冲洗，竖直放在板B相应的孔中。板B各孔加入1ml 0.1％结晶紫溶液进行染色15min，而后用PBS洗去多余染色剂，接着各孔加入1ml冰醋酸没过细胞扒片，37℃孵育30min，取出细胞扒片，酶标仪测量OD_600nm。 [0048]1.6溶液PH检测 [0049]取上述制备标准菌液100ul接种于无菌的24孔板，各组分别添加不含精氨酸(用于对照)和含有不同浓度精氨酸浓度的液体培养基1mL，置于37℃细菌培养箱中培养24h，测量各组各孔PH。 [0050]2、实验结果 [0051]2.1生物膜量检测结果 [0052]如图3和图4所示，变异链球菌在含有不同浓度精氨酸的BHI培养基中培养24h后，记录相应数据并据单因素方差分析可发现组间差异具有明显的统计学差异(P<0.01)，经结晶紫染色显示精氨酸对细菌生物膜的形成具有抑制作用，且精氨酸浓度越高，生物膜量越少。 [0053]表1 24h处理后结晶紫检测生物膜量 [0054] [0055]2.2溶液PH检测结果 [0056]如表2和图5所示，在经不同浓度精氨酸作用24h后，测量各组各孔PH(表1)。进行方差分析可知，不同浓度精氨酸组间存在明显差异，并且差异具有明显统计学意义P<0.01。且随着处理的精氨酸浓度的增加，处理后PH值的总体趋势也相应增加。 [0057]表2不同精氨酸处理24h后PH值 [0058] [0059]以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。