技术领域 [0001]本发明涉及植物遗传资源保护技术领域，特别涉及一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法。 背景技术 [0002]超低温保存是离体保存与低温生物学相结合的产物，是指-80℃以下的极低温度保存种质资源的一整套生物学技术。在超低温条件下(一般是液氮，-196℃)，几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止，最大程度地抑制了生理活动，减少了遗传变异的发生，从而保持了生物材料的稳定性，但此时的细胞仍然具备活力和形态发生的潜能。超低温保存技术可避免传统的种质保存过程中易染菌和易发生遗传变异等诸多不利因素，种质保存具有长期性、稳定性、方便性等优势。 [0003]根据是否形成冰晶，超低温保存分为两大类，一类是常规超低温保存法，另一类则是基于玻璃化法的超低温保存法。小滴玻璃化法是基于传统玻璃化法的一种更优化的离体保存方法，即用玻璃化液对材料进行处理，而后将材料放在含有玻璃化液滴的铝箔纸上并投入液氮冻存的一种高效超低温保存法。但小滴玻璃化法超低温保存也存在成活率低、保存效果不佳等问题。 [0004]桂牧一号象草属于高产禾本科牧草，它是以矮象草为父本，杂交狼尾草为母本进行有性杂交而得，属于是一种新型杂交牧草，具有产量高、叶量大、茎秆粗壮、质量好、质地柔软、适口性好、利用率高等优点，非常适合大面积种植，是牛、羊、鹅、鸵鸟、鹿、鱼等草食性动物的良好饲草。鉴于桂牧一号象草的各种优异特性，为了农业的可持续发展，本领域有必要对其种质资源进行保存。 发明内容 [0005]为解决上述问题，本发明提供了一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法。 [0006]为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案： [0007]一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法，包括以下步骤： [0008](1)选取桂牧一号象草的腋芽，消毒，进行预培养； [0009](2)将预培养后的腋芽切段，用含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液与水按体积比4:1混合的混合液浸泡处理腋芽段； [0010](3)浸泡处理后转移至含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液液滴中，快速冷却，超低温保存； [0011](4)恢复培养。 [0012]优选地，步骤(1)中所述消毒为依次利用升汞溶液和次氯酸钠溶液浸泡。 [0013]更优选地，所述升汞溶液的浓度为0.1g/100mL；所述次氯酸钠溶液的浓度为2g/100mL。 [0014]优选地，步骤(1)中所述预培养的培养基为含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的MS固体培养基，培养时间为4d。 [0015]优选地，所述玻璃化液为含体积分数30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO的0.4M的蔗糖溶液；所述疏水纳米碳酸钙为硬脂酸改性纳米碳酸钙；所述含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液中疏水纳米碳酸钙的加入量为0.5～0.6g/L。 [0016]更优选地，所述硬脂酸改性纳米碳酸钙的制备步骤包括：将纳米碳酸钙分散于水中，加入硬脂酸，60～80℃超声，过滤，干燥，粉碎，得到硬脂酸改性纳米碳酸钙。 [0017]更优选地，所述纳米碳酸钙的粒径不超50nm；所述硬脂酸的加入量为所述纳米碳酸钙质量的2％。 [0018]优选地，步骤(2)中所述浸泡处理的温度为0℃，时间为50min。 [0019]优选地，步骤(4)中所述恢复培养的具体步骤包括：将超低温保存的桂牧一号象草腋芽化冻，卸载，然后接种到恢复培养基中，培养得到桂牧一号象草植株。 [0020]更优选地，所述化冻为在35～40℃的温度下保持2～4min；所述卸载的卸载液为含有1.2mol/L蔗糖的MS液体培养基；所述恢复培养基为含0.1mg/L6-BA，0.05mg/LIAA，30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。 [0021]更优选地，接种到恢复培养基后，先暗培养1d，然后进行光照16h/d培养。 [0022]本发明的有益技术效果如下： [0023]本发明提供了一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法，通过选用桂牧一号象草的腋芽作为保存对象，先进行预培养，充分激发桂牧一号象草腋芽细胞的活力，再以小滴玻璃化法的超低温保存方式，在玻璃化液中加入疏水纳米碳酸钙，对桂牧一号象草腋芽细胞起到更好的保护作用，使得化冻后桂牧一号象草腋芽的成活率显著提高。 具体实施方式 [0024]现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。 [0025]另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。 [0026]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。 [0027]关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。 [0028]本发明提供了一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法，包括以下步骤： [0029](1)选取桂牧一号象草的腋芽，消毒，进行预培养； [0030](2)将预培养后的腋芽切段，用含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液与水按体积比4:1混合的混合液浸泡处理腋芽段； [0031](3)浸泡处理后转移至含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液液滴中，快速冷却，超低温保存； [0032](4)恢复培养。 [0033]本发明选择桂牧一号象草腋芽芽尖作为超低温保存对象，相对于传统的利用小滴玻璃化法保存茎尖的方案，腋芽芽尖具有更高的分化率，更容易获得植株。 [0034]在超低温环境中，桂牧一号象草腋芽细胞的细胞质在含疏水纳米碳酸钙玻璃化液的保护作用下，能形成玻璃化状态，由于经过前期的浸泡处理，因而细胞质中自由水含量少，而在玻璃化液中加入疏水纳米碳酸钙后，在超低温环境下更不易形成微小冰晶，对细胞的破坏力更小，因此能经受住低温而存活下来。 [0035]优选地，步骤(1)中所述消毒为依次利用升汞溶液和次氯酸钠溶液浸泡。 [0036]更优选地，所述升汞溶液的浓度为0.1g/100mL；所述次氯酸钠溶液的浓度为2g/100mL。 [0037]本发明采用的消毒条件既能够保证消除桂牧一号象草腋芽的污染问题，又不会对桂牧一号象草腋芽造成伤害。 [0038]优选地，步骤(1)中所述预培养的培养基为含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的MS固体培养基，培养时间为4d。 [0039]本发明通过对预培养时间的严格控制，既保证了超低温保存的桂牧一号象草腋芽有充分的活性，又避免因预培养时间过长导致的细胞过于成熟，过于成熟的细胞中含有大液泡，自由水含量较高，在超低温环境中更容易形成破坏细胞膜结构的树状冰晶，导致细胞死亡。 [0040]优选地，所述玻璃化液为含体积分数30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO的0.4M的蔗糖溶液；所述疏水纳米碳酸钙为硬脂酸改性纳米碳酸钙；所述含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液中疏水纳米碳酸钙的加入量为0.5～0.6g/L。 [0041]更优选地，所述硬脂酸改性纳米碳酸钙的制备步骤包括：将纳米碳酸钙分散于水中，加入硬脂酸，60～80℃超声，过滤，干燥，粉碎，得到硬脂酸改性纳米碳酸钙。 [0042]本发明在疏水改性时选用的硬脂酸进行改性，首先，硬脂酸改性的纳米碳酸钙在玻璃化液中分散更好，其次，硬脂酸改性的纳米碳酸钙更容易进入到桂牧一号象草腋芽细胞中，从而在超低温条件下对桂牧一号象草腋芽细胞起到保护作用，化冻后又不会对桂牧一号象草腋芽产生毒性。 [0043]更优选地，所述纳米碳酸钙的粒径不超50nm；所述硬脂酸的加入量为所述纳米碳酸钙质量的2％。 [0044]优选地，步骤(2)中所述浸泡处理的温度为0℃，时间为50min。 [0045]优选地，步骤(4)中所述恢复培养的具体步骤包括：将超低温保存的桂牧一号象草腋芽化冻，卸载，然后接种到恢复培养基中，培养得到桂牧一号象草植株。 [0046]更优选地，所述化冻为在35～40℃的温度下保持2～4min；所述卸载的卸载液为含有1.2mol/L蔗糖的MS液体培养基；所述恢复培养基为含0.1mg/L6-BA，0.05mg/LIAA，30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。 [0047]本发明在化冻时所选用的温度条件能够避免化冻过程中因缓慢升温而导致的细胞内再次结冰的现象，能够最大程度保持桂牧一号象草腋芽的细胞活性。 [0048]更优选地，接种到恢复培养基后，先暗培养1d，然后进行光照16h/d培养。 [0049]本发明实施例及对比例中所用玻璃化液为含体积分数30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO的0.4M的蔗糖溶液。 [0050]实施例1 [0051](1)硬脂酸改性纳米碳酸钙的制备：将粒径不超过50nm的纳米碳酸钙置于烧杯中，加水，搅拌分散后，放入恒温超声清洗机中，先恒温至70℃，加入纳米碳酸钙质量分数2％的硬脂酸，超声处理20min，然后过滤，干燥，研磨至粒径不超过100nm，得到硬脂酸改性纳米碳酸钙； [0052](2)预培养：选取桂牧一号象草的腋芽，先用无菌水冲洗，然后加入到0.1g/100mL的升汞溶液中浸泡25min，然后加入到2g/100mL的次氯酸钠溶液中浸泡20min，无菌水冲洗，吸干水分，转入到含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的MS固体培养基中进行预培养，培养条件为2000Lux光照14h/d，温度为25±2℃，湿度为75±5％，培养4d； [0053](3)玻璃化液处理：将预培养后桂牧一号象草的腋芽切成0.4～0.5mm的腋芽段，加入到0℃含0.5g/L步骤(1)所得硬脂酸改性纳米碳酸钙的玻璃化液与无菌水按体积比4:1混合的混合液中，浸泡50min； [0054](4)超低温保存：将步骤(3)浸泡后的腋芽段转移至滴有含0.5g/L步骤(1)所得硬脂酸改性纳米碳酸钙的玻璃化液液滴的铝箔条中，进入液氮中2s，而后转移至装满液氮的冻存管中进行超低温保存； [0055](5)恢复培养：超低温保存1d后，取出铝箔条，投入到40℃的无菌水中化冻3min，然后转移至含有1.2mol/L蔗糖的MS液体培养基中进行卸载，卸载时间为20min，最后转移至含0.1mg/L6-BA，0.05mg/LIAA，30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基中，在温度为25±2℃，湿度为75±5％的条件下暗培养1d，然后进行2000Lux光照16h/d培养，得到桂牧一号象草植株。恢复培养时选取100段超低温保存的桂牧一号象草腋芽段，记录长成桂牧一号象草植株的数量，计算成活率(％)，成活率(％)＝桂牧一号象草植株数/100×100％。 [0056]对比例1 [0057]与实施例1相比，区别仅在于，省略硬脂酸改性纳米碳酸钙的步骤，后续步骤(3)和(4)中含0.5g/L硬脂酸改性纳米碳酸钙的玻璃化液替换为含0.5g/L纳米碳酸钙(粒径不超过50nm)的玻璃化液。 [0058]对比例2 [0059]与实施例1相比，区别仅在于，省略硬脂酸改性纳米碳酸钙的加入。 [0060]对比例3 [0061]与实施例1相比，区别仅在于，预培养时间为2d。 [0062]对比例4 [0063]与实施例1相比，区别仅在于，预培养时间为5d。 [0064]对比例5 [0065]与实施例1相比，区别仅在于，化冻温度为25℃。 [0066]统计实施例1及对比例1～4各组超低温保存桂牧一号象草腋芽段的存活率，统计结果见表1。 [0067]表1各组超低温保存桂牧一号象草腋芽段的存活率 [0068] [0069]从表1所记录的成活率能够看出，相比于未加入纳米碳酸钙或加入未改性纳米碳酸钙的超低温保存条件，本发明在加入疏水改性纳米碳酸钙后，超低温保存的桂牧一号象草腋芽成活率显著提升；同时，预培养时间也对桂牧一号象草腋芽的成活率具有较大影响；另外，化冻温度的合理选择也能够对桂牧一号象草腋芽的成活率起到积极效果。 [0070]以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。