CN115918533A 审中 一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法
1.一种桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)选取桂牧一号象草的腋芽,消毒,进行预培养;
(2)将预培养后的腋芽切段,用含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液与水按体积比4:1混合的混合液浸泡处理腋芽段;
(3)浸泡处理后转移至含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液液滴中,快速冷却,超低温保存;
(4)恢复培养。
2.根据权利要求1所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,步骤(1)中所述消毒为依次利用升汞溶液和次氯酸钠溶液浸泡。
3.根据权利要求1所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,步骤(1)中所述预培养的培养基为含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的MS固体培养基,培养时间为4d。
4.根据权利要求1所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,所述玻璃化液为含体积分数30%甘油、15%乙二醇和15%DMSO的0.4M的蔗糖溶液;所述疏水纳米碳酸钙为硬脂酸改性纳米碳酸钙;所述含疏水纳米碳酸钙的玻璃化液中疏水纳米碳酸钙的加入量为0.5~0.6g/L。
5.根据权利要求4所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,所述硬脂酸改性纳米碳酸钙的制备步骤包括:将纳米碳酸钙分散于水中,加入硬脂酸,60~80℃超声,过滤,干燥,粉碎,得到硬脂酸改性纳米碳酸钙。
6.根据权利要求1所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,步骤(2)中所述浸泡处理的温度为0℃,时间为50min。
7.根据权利要求1所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,步骤(4)中所述恢复培养的具体步骤包括:将超低温保存的桂牧一号象草腋芽化冻,卸载,然后接种到恢复培养基中,培养得到桂牧一号象草植株。
8.根据权利要求7所述的桂牧一号象草小滴玻璃化法超低温保存的方法,其特征在于,所述化冻为在35~40℃的温度下保持2~4min;所述卸载的卸载液为含有1.2mol/L蔗糖的MS液体培养基;所述恢复培养基为含0.1mg/L 6-BA,0.05mg/L IAA,30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。
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