技术领域 [0001]本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用。 背景技术 [0002]在临床上，钛金属因其卓越的机械性能、良好的生物相容性和极强的耐腐蚀性而成为首选的金属内植物。然而，纯钛金属没有抗菌能力，且骨整合能力差，一旦植入物发生细菌感染，植入物与骨组织的整合就会受到严重感染和炎症反应的阻碍，从而导致内植物周围炎、种植体脱落等术后并发症，给患者带来沉重的经济负担和身心痛苦。大量的钛金属内植物手术的失败病例也显示，细菌感染以及骨整合阻碍是钛金属内植物手术失败的首要原因。为解决这一问题，钛金属表面的抗菌及促成骨功能改性受到广泛研究并取得了一定的进展。目前，钛及其合金可通过物理吸附或共价结合的方式掺入各种抗菌剂，包括金属离子、抗生素、天然抗菌剂、低分子有机抗菌剂、高分子有机抗菌剂等。其中，高分子有机抗菌剂因具有高反应活性、高稳定性、可显著提升抗菌效能等优势而展现出高效稳定抗菌的潜能。聚N-卤胺是高分子有机抗菌剂中值得关注的一种类型，与传统的抗菌剂相比，聚N-卤胺不仅有广谱抗菌力而不产生耐药性，同时还具有长期稳定性和可再生性，被广泛应用于纺织品、水体处理等。同样，聚N-卤胺的优秀抗菌性能使其也可应用在骨科内植物上。然而，对于部分骨科内植物来说，由于需要永久植入体内深部，故只能在封闭的体内环境中依靠自身的抗菌能力进行长期抗菌。因此，在这种应用场景下，对这类钛内植物的抗菌要求不仅要着重于高效的广谱抗菌性、高稳定性和良好生物相容性，同时要更着重于抗菌持久性。 [0003]ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由多个赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基连接而成的一种同型氨基酸聚合物，其丰富的侧链氨基提供了理想的N-卤胺来源。同时，ε-PL作为一种绿色、安全的生物食品防腐剂被广泛使用，其在酸性、中性和微碱性环境下对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌均有显著抑制作用。有研究显示，ε-PL还可选择性地促进成骨细胞黏附和巨噬细胞的M2表型极化，从而促进成骨分化，介导抑炎反应，参与组织重建。ε-PL本身具有安全无毒、水溶性和热稳定性好、耐高温且在酸和碱性环境中比较稳定的优点，是一种理想的钛基植入物的表面改性物质。 [0004]因此，如果能将ε-PL与钛内植物结合，则钛内植物N-卤胺ε-PL的卤胺涂层消耗完后，去卤胺化的ε-PL涂层仍具有一定的抗菌效能，能实现钛基植入物在体内长效级联的抗菌模式以及促成骨细胞能力。 发明内容 [0005]本发明通过共价接枝的方法，利用硅烷偶联剂将PSI固定在钛金属表面上，再通过PSI与ε-PL的共价结合使ε-PL结合在钛表面，然后通过次氯酸钠溶液浸泡的方法，将ε-PL氯化，获得N-卤胺化的ε-PL涂层，从而制备得到一种具有级联抗菌以及促成骨作用的钛基金属材料，解决了现有钛内植物只能在封闭的体内环境中依靠自身抗菌的问题。 [0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下： [0007]一种改性钛基金属材料，所述制备方法包括以下步骤： [0008]步骤1:将清洗预处理后的钛基金属材料浸入氢氧化钠溶液中进行碱热处理； [0009]步骤2:将步骤1处理后的钛基金属材料浸入带氨基硅烷偶联剂的乙醇溶剂中，浸泡10-30min后经洗涤干燥得到带氨基的钛基金属材料； [0010]步骤3:将步骤2处理后的钛基金属材料浸入聚琥珀酰亚胺的二甲基亚砜溶液中，在50-70℃下反应6-24h，洗涤干燥后得到接枝聚琥珀酰亚胺的钛基金属材料； [0011]步骤4:将步骤3处理后的钛基金属材料浸入ε-聚赖氨酸的PBS缓冲液中，在50-70℃下反应6-24h，洗涤干燥后得到接枝ε-聚赖氨酸的钛基金属材料； [0012]步骤5:将步骤4处理后的钛基金属材料浸入碱溶液中反应，使钛表面的聚琥珀酰亚胺水解羧基化； [0013]步骤6:将步骤5处理后的钛基金属材料浸入有效氯含量为1％-14％的次氯酸钠溶液中卤胺化1-4h，洗涤干燥后得到级联抗菌兼促成骨钛基金属材料。 [0014]本发明利用KH550将PSI接枝在钛金属表面，再通过PSI与聚赖氨酸的共价结合引入聚赖氨酸，卤胺化后得到级联抗菌兼促成骨的涂层。聚赖氨酸是一种天然的抑菌剂，在钛金属表面引入聚赖氨酸后，即具有一定的抗菌性能，卤胺化后通过氯正离子杀菌，改性钛金属材料抗菌性能大大提升，当氯正离子释放完后，改性钛金属材料仍具有抗菌效果，实现高效且稳定的级联抗菌。 [0015]优选地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤1具体包括以下步骤： [0016]步骤1.1：依次用1000Cw、1200Cw、2000Cw的砂纸对钛金属片进行逐级打磨，然后分别在丙酮、无水乙醇和去离子水中进行超声清洗； [0017]步骤1.2：将步骤1.1清洗后的钛金属片浸入5-10mol/L的氢氧化钠溶液中反应，然后清洗干燥制得碱热处理后的钛基金属材料。 [0018]优选地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤2中所述乙醇溶剂的体积百分比浓度为75％-95％。 [0019]进一步地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤2中所述带氨基硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)。 [0020]进一步地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤2中所述带氨基硅烷偶联剂在乙醇溶剂中的质量分数为5％-20％。 [0021]进一步地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤3中所述聚琥珀酰亚胺与二甲基亚砜的质量体积比为(2.4-9.6)：1g/L。 [0022]进一步地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤4中所述ε-聚赖氨酸与PBS缓冲液的质量体积比为(2-8)：1g/L。 [0023]进一步地，所述的改性钛基金属材料的制备方法，步骤5的反应条件为在40-60℃下反应0.5-1.5h。 [0024]进一步地，由上述所述的制备方法制备得到的改性钛基金属材料。 [0025]再进一步地，所述的改性钛基金属材料的制备方法所制备的钛基金属材料在制造抗菌材料或促成骨材料的的应用。 [0026]本发明的有益效果如下： [0027]本发明通过共价接枝的方法，利用硅烷偶联剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)将聚琥珀酰亚胺(PSI)接枝在钛金属表面上，再通过PSI与ε-聚赖氨酸的共价结合使ε-聚赖氨酸结合在钛表面，然后通过次氯酸钠溶液浸泡的方法，将ε-聚赖氨酸氯化，获得N-卤胺化的ε-聚赖氨酸涂层。通过将N-卤胺化ε-聚赖氨酸应用于植入物材料领域后，发现了N-卤胺化ε-聚赖氨酸拥有高效且稳定的级联抗菌效果，当N-卤胺涂层消耗完后，ε-聚赖氨酸仍可继续发挥抑菌效能。另外，PSI在反应过程中会水解成为聚天冬氨酸，有螯合钙离子作用，ε-聚赖氨酸还具有促细胞黏附和介导抑炎反应的作用，同时对成骨细胞的成骨分化也有很好的促进作用，且聚天冬氨酸和ε-聚赖氨酸都为聚氨基酸，具有很好的生物安全性。本发明的制备方法反应条件温和，工艺简单，效率高，适用于任何形状的钛基材料，可重复性好，还为构建抗感染且促成骨的钛基金属材料提供了新方法，在医用生物材料领域具有广阔的应用前景。 附图说明 [0028]图1是实施例1-11制备的级联抗菌兼促成骨钛基金属材料(Ti-NCl)的有效氯含量柱状图； [0029]图2是实施例1-11制备的级联抗菌兼促成骨钛基金属材料(Ti-NCl)的有效氯质量/面积比柱状图； [0030]图3是实施例1和实验例1制备的不同钛金属表面的扫描电镜形貌图，图中：a为纯钛金属(Ti)，b为经过碱热处理后的钛金属(Ti-OH)，c为硅烷偶联剂处理后的钛金属(Ti-KH550)，d为接枝了聚琥珀酰亚胺的钛金属(Ti-PSI)，e为接枝了ε-PL的钛金属(Ti-PL)，f为N-卤胺化ε-PL的钛金属(Ti-NCl)，g为消除N-卤胺的钛金属(Ti-X)； [0031]图4是实施例1和实验例1制备的不同钛金属针对金黄色葡萄球菌的抗菌性能图，图中：a为经过碱热处理后的钛金属(Ti-OH)，b为接枝了ε-PL的钛金属(Ti-PL)，c为N-卤胺化ε-PL的钛金属(Ti-NCl)，d为消除N-卤胺的钛金属(Ti-X)，e为不同钛金属Ti-OH、Ti-PL、Ti-NCl、Ti-X的金黄色葡萄球菌数量柱状图，f为不同钛金属Ti-PL、Ti-NCl、Ti-X的抗菌率柱状图； [0032]图5是实施例1和实验例1制备的不同钛金属细胞毒性检测结果图，图中：a为不同钛金属的吸光度柱状图，b为不同钛金属的相对细胞存活率柱状图； [0033]图6是实施例1和实验例1制备的不同钛金属片对人骨髓来源间充质干细胞(hBM-MSC)成骨分化功能的影响图。 具体实施方式 [0034]下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规说法。 [0035]实施例1：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0036]制备方法包括以下步骤： [0037](1)对钛基金属材料(Ti)进行清洗预处理：分别用1000Cw、1200Cw、2000Cw的砂纸对纯Ti金属片进行逐级打磨，然后将纯Ti金属片分别在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗15min； [0038](2)钛表面碱热处理：将清洗后的Ti金属片浸入5mol/L的氢氧化钠溶液中，在60℃下反应24h，取出后用去离子水震荡清洗6次，真空干燥后得到Ti-OH； [0039](3)钛表面硅烷偶联剂处理：配制95％乙醇/5％去离子水(v/v)的溶剂体系，搅拌下缓慢加入硅烷偶联剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)，配成质量分数为10％的溶液，室温静置30min后将步骤(2)制得的Ti-OH浸入以上溶液中，浸泡10min后取出，置于110℃真空烘箱中烘烤3h，取出后分别在无水乙醇和去离子水中清洗3次，干燥后得到Ti-KH550； [0040](4)钛表面PSI接枝：用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为4.8mg/mL的聚琥珀酰亚胺(PSI)溶液，将步骤(3)制得的Ti-KH550浸入PSI溶液中在60℃下反应6h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PSI； [0041](5)钛表面ε-PL接枝：用PBS缓冲液配制浓度为4mg/mL的ε-聚赖氨酸(ε-PL)溶液，将步骤(4)制备的Ti-PSI浸入ε-PL溶液中在60℃下反应6h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PL； [0042](6)钛表面PSI水解羧基化：将步骤(5)制得的Ti-PL浸入pH＝9.5的NaOH溶液中于50℃下反应1h，取出后用去离子水清洗3次待用。 [0043](7)钛表面ε-聚赖氨酸的卤胺化处理：将ε-PL接枝后的Ti金属片浸入有效氯含量为1％的NaClO溶液中，于常温避光浸泡2h，取出后用75％乙醇清洗3次，再在45℃的真空烘箱中真空干燥2h，即得到级联抗菌兼促成骨钛基金属材料(Ti-NCl)。 [0044]实施例2：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0045]制备方法同实施例1，不同之处在于，(4)钛表面PSI接枝：用DMSO配制浓度为2.4mg/mL的聚琥珀酰亚胺(PSI)溶液，将步骤(3)制得的Ti-KH550浸入PSI溶液中在60℃下反应6h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PSI。 [0046]实施例3：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0047]制备方法同实施例1，不同之处在于，(4)钛表面PSI接枝：用DMSO配制浓度为9.6mg/mL的聚琥珀酰亚胺(PSI)溶液，将步骤(3)制得的Ti-KH550浸入PSI溶液中在60℃下反应6h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PSI。 [0048]实施例4：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0049]制备方法同实施例1，不同之处在于，(4)钛表面PSI接枝：用DMSO配制浓度为4.8mg/mL的聚琥珀酰亚胺(PSI)溶液，将步骤(3)制得的Ti-KH550浸入PSI溶液中在60℃下反应12h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PSI。 [0050]实施例5：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0051]制备方法同实施例1，不同之处在于，(4)钛表面PSI接枝：用DMSO配制浓度为4.8mg/mL的聚琥珀酰亚胺(PSI)溶液，将步骤(3)制得的Ti-KH550浸入PSI溶液中在60℃下反应24h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PSI。 [0052]实施例6：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0053]制备方法同实施例1，不同之处在于，(5)钛表面ε-PL接枝：用PBS缓冲液配制浓度为4mg/mL的ε-PL溶液，将步骤(4)制备的Ti-PSI浸入ε-PL溶液中在60℃下反应12h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PL。 [0054]实施例7：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0055]制备方法同实施例1，不同之处在于，(5)钛表面ε-PL接枝： [0056]用PBS缓冲液配制浓度为4mg/mL的ε-PL溶液，将步骤(4)制备的Ti-PSI浸入ε-PL溶液中在60℃下反应24h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PL。 [0057]实施例8：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0058]制备方法同实施例1，不同之处在于，(5)钛表面ε-PL接枝：用PBS缓冲液配制浓度为2mg/mL的ε-PL溶液，将步骤(4)制备的Ti-PSI浸入ε-PL溶液中在60℃下反应6h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PL。 [0059]实施例9：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0060]制备方法同实施例1，不同之处在于，(5)钛表面ε-PL接枝：用PBS缓冲液配制浓度为8mg/mL的ε-PL溶液，将步骤(4)制备的Ti-PSI浸入ε-PL溶液中在60℃下反应6h，取出后用去离子水清洗3次，干燥后得到Ti-PL。 [0061]实施例10：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0062]制备方法同实施例1，不同之处在于，(7)钛表面ε-聚赖氨酸的卤胺化处理：将ε-PL接枝后的钛金属片浸入有效氯含量为4％的NaClO溶液中，于常温避光浸泡2h，取出后用75％乙醇清洗3次，再在45℃的真空烘箱中真空干燥2h，即得到级联抗菌兼促成骨钛基金属材料(Ti-NCl)。 [0063]实施例11：一种级联抗菌兼促成骨钛基金属材料 [0064]制备方法同实施例1，不同之处在于，(7)钛表面ε-聚赖氨酸的卤胺化处理：将ε-PL接枝后的钛金属片浸入有效氯含量为14％的NaClO溶液中，于常温避光浸泡2h，取出后用75％乙醇清洗3次，再在45℃的真空烘箱中真空干燥2h，即得到级联抗菌兼促成骨钛基金属材料(Ti-NCl)。 [0065]实验例1：测定钛金属材料(Ti-NCl)的有效氯含量和有效氯质量/面积比 [0066]通过标准碘量/硫代硫酸盐(Na₂S₂O₃)滴定法来测定实施例1-11制备得到的Ti-NCl的有效氯含量，并将测定完有效氯含量或有效氯质量/面积比的材料作为消除N-卤胺的钛材料(Ti-X)。 [0067]有效氯含量的计算公式如下所示： [0068] [0069]有效氯质量/面积比的计算公式如下所示： [0070] [0071]N为Na₂S₂O₃溶液的浓度，单位为mol/L；V为消耗Na₂S₂O₃溶液的体积，单位为L；35.45为Cl⁺的相对原子质量，单位为g/mol；W为Ti-NCl的质量，单位为g；S为Ti-NCl的表面积，单位为m²。 [0072]实验结果： [0073]如图1所示，实施例1-11制备得到的Ti-NCl的有效氯含量分别为39.24p.p.m.、19.41p.p.m.、15.12p.p.m.、28.92p.p.m.、10.13p.p.m.、13.82p.p.m.、15.48p.p.m.、22.71p.p.m.、16.12p.p.m.、16.72p.p.m.、11.39p.p.m.；如图2所示，实施例1-11制备得到的Ti-NCl有效氯质量/面积比分别为11.09mg/m²、5.76mg/m²、4.63mg/m²、7.79mg/m²、2.87mg/m²、4.01mg/m²、4.61mg/m²、7.07mg/m²、4.54mg/m²、4.64mg/m²、3.46mg/m²。其中，实施例1测得的有效氯含量最高且具有统计学上的差异，因此我们选用实施例1方案作为优选方案，进行下一步抗菌性能检测及生物相容性检测。 [0074]实验例2：分析不同钛金属材料的表面形貌 [0075]分别取纯钛金属材料、实施例1制备得到的不同钛金属材料和实验例1测完有效氯含量或有效氯质量/面积比后的消除N-卤胺的钛金属材料(Ti-X)，使用扫描电子显微镜(S-4800，Hitachi，Japan)来分析不同钛金属材料的表面形貌。 [0076]实验结果： [0077]图3a为纯钛金属材料(Ti)的表面，图3b为经过碱热处理后的钛金属材料(Ti-OH)表面形貌，可以明显看出表面出现了许多纳米级的孔洞，并且表面的粗糙度增大。图3c为硅烷偶联剂处理后的钛金属材料(Ti-KH550)表面，图3d为接枝了聚琥珀酰亚胺的钛金属材料(Ti-PSI)表面，图3e为接枝了ε-PL的钛金属材料(Ti-PL)表面，图3f为N-卤胺化ε-PL的钛金属材料(Ti-NCl)表面，图3g为消除N-卤胺的钛金属材料(Ti-X)的表面，可以看出不同钛金属材料有明显差异并保持了多孔结构。 [0078]实验例3：测试钛金属材料的级联抗菌性能 [0079]测试方法包括以下步骤： [0080](1)取实施例1制备得到的Ti-PL、Ti-NCl、Ti-OH和实验例1测完有效氯含量或有效氯质量/面积比后的消除N-卤胺的钛金属材料(Ti-X)，其中Ti-PL、Ti-NCl和Ti-X作为实验组，Ti-OH作为对照组，且实验组和对照组的钛金属片均为直径9.50mm，厚度0.31mm的圆片状，再将各组钛金属片在75％乙醇中浸泡至少30min进行灭菌，每组实验组和对照组分别设置3个复孔，每个复孔放一个钛金属片，再分别置于24孔板中烘干。 [0081](2)将金黄色葡萄球菌用LB培养基稀释到1×10⁶CFU/mL，每组钛金属片表面滴入25μL的金黄色葡萄球菌悬液，同时各组钛金属片周围的间隙用PBS溶液填充，避免金黄色葡萄球菌悬液蒸发。每组钛金属片在37℃下培养6h后，每孔加入1975μL PBS溶液。收集悬液和钛金属片并转移到新的4mL管中，然后振动30s洗脱细菌。 [0082](3)细菌悬液稀释1000倍后，取稀释的20μL悬浮液接种到无菌琼脂平板上，再培养24h，然后，对琼脂平板进行统计菌落数量(CFU)，抗菌率的计算公式：抗菌率(％)＝(对照组CFU-实验组CFU)/对照组CFU×100％。 [0083]实验结果： [0084]图4为金黄色葡萄球菌在不同钛表面培养6h后平板计数法的结果，其中图4a-4d分别是Ti-OH、Ti-PL、Ti-NC和Ti-X组培养后的活菌，由图4e所示，培养6h时Ti-OH、Ti-PL、Ti-NCl以及Ti-X表面粘附的平均活菌数量分别为：200.5±23.8、44.0±32.2、1.3±1.9、25.0±9.8，由图4f所示,与对照组Ti-OH相比，Ti-PL、TiNCl以及Ti-X组的抗菌率分别为78.1％、99.4％和87.5％，存在显著的统计学差异(p<0.001)。结果表明，当钛金属材料经过ε-聚赖氨酸改性后，钛材料已具有一定的抗菌效能，而ε-聚赖氨酸涂层经过N-卤胺化后，改性的钛材料可以将抗菌效能显著提高至99％，并且当N-卤胺涂层消耗完之后，改性的钛材料依旧有着较高的抗菌效能，从而实现改性涂层的级联抗菌模式。 [0085]实验例4：细胞相容性及促成骨实验 [0086]本实验采用的是人骨髓来源间充质干细胞(hBM-MSC)，某些其他类型的细胞比如成骨细胞或小鼠前成骨细胞MC3T3-E1同样适用于本实验。 [0087]1、检测钛金属片对hBM-MSC的细胞毒性 [0088]检测方法包括以下步骤： [0089](1)将实施例1和实验例1制备得到的Ti-NCl与Ti-X作为实验组，Ti-OH作为对照组，将每组钛金属片各取3片放入24孔板中，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养hBM-MSC，细胞贴壁生长后，更换新鲜的培养基，当细胞达到80％的聚集程度时，将细胞以5×10⁴/孔的密度接种在24孔板中的材料表面培养24h，此外设立一个空白组，只加与实验组、对照组相同的培养基。 [0090](2)使用CCK-8试剂盒对每组钛金属片检测细胞毒性，然后在450nm波长下通过酶标仪测定各组的吸光度。相对细胞存活率的计算公式如下： [0091]相对细胞存活率(％)＝(实验组的吸光度值-空白组的吸光度值)/(对照组的吸光度值-空白组的吸光度值)×100％。 [0092]实验结果： [0093]如图5a所示，各实验组与对照组的吸光度都随天数增加而增加，且各组在同一天数的吸光度水平相近；如图5b所示，第1天、第3天、第7天时Ti-NCl的相对细胞存活率分别为90.0％、101.0％、98.3％，Ti-X的相对细胞存活率分别为99.1％、98.5％、89.8％。试验结果表明，Ti-NCl和Ti-X对于细胞生长活力的影响较小。 [0094]2、检测钛金属片对hBM-MSC成骨分化功能的影响 [0095]检测方法包括以下步骤： [0096]将实施例1和实验例1制备得到的Ti-OH、Ti-PSI、Ti-NCl和Ti-X作为实验组，将Ti作为对照组，每组材料各取3片放入24孔板中。 [0097]用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养hBM-MSC；细胞贴壁生长后，再更换新鲜的培养基；当细胞达到80％的聚集程度时，将细胞以5×10⁴/孔的密度接种在24孔板中，待细胞贴壁生长后，更换为含有体积分数为10％的胎牛血清、1％双抗、1％磷酸甘油、1‰维生素C、0.1‰地塞米松的DMEM培养基作为成骨诱导培养基，诱导hBM-MSC进行成骨分化。 [0098]分别在每组钛金属材料成骨诱导分化的第8天、12天使用多聚甲醛固定细胞，再加入茜素红染液对各组钛金属材料表面的钙结节进行染色，观察不同样本材料表面的着色情况。 [0099]实验结果： [0100]如图6所示，Ti-OH、Ti-PSI、Ti-NCl和Ti-X在成骨诱导hBM-MSC分化的8天、12天时，实验组钛金属材料表面的钙沉淀均明显高于对照组Ti，证明了Ti-NCl和Ti-X均能够促进hBM-MSC的成骨分化能力，且Ti-X促成骨能力更显著。 [0101]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。