技术领域 [0001]本发明涉及一种生物支架，尤其涉及一种含有不同孔隙的多孔复合支架，用于Ceffe的释放，利于骨修复。 背景技术 [0002]主要由创伤、肿瘤和先天性畸形引起的骨缺损可以显著影响患者的正常功能运动和外观，这仍然是世界范围内的一个重大临床挑战。特别是临界尺寸缺陷需要临床干预以促进损伤区域的再生。传统上，自体骨移植是临床实践中的“金标准”，但它有许多缺点，如：骨源有限、供区免疫反应和对靶区的几何适应不良。因此，基于生物材料的骨支架替代物被认为是克服大型骨缺损治疗挑战的有前景的选择。 [0003]骨再生需要一系列复杂且精心安排的事件，这对骨基质、骨髓和骨膜的各种因素之间的相互作用和协作提出了相当高的要求。最近，人们对模拟骨骼再生微环境和诱导生物材料与疾病损伤修复之间的相互作用越来越感兴趣。通过模拟骨再生的发育空间结构以及细胞因子的整合和释放，构建促进骨再生的骨再生微环境也是一个重要途径。 [0004]骨愈合的生物学过程与细胞募集、炎症反应、血管再生以及成骨分化交织在一起。植入物放置后的炎症反应由巨噬细胞(包括炎性M1巨噬细胞和活化的愈合M2巨噬细胞)引起，其可改变其表型以调节炎症或愈合功能。而抑制或破坏炎症反应可导致病理性纤维化或瘢痕。因此，精确和严格地调节炎症反应非常重要。构成骨基质沉积物的新生血管网络是骨组织形成的另一个先决条件，因为间充质细胞通常聚集在血管附近或周围，并分化为成骨细胞，成熟骨将通过骨基质的钙化形成。因此，同时应用具有增强M2复极、血管生成和成骨作用的药物非常重要。 [0005]以前，构建骨组织的细胞组织工程受到细胞来源不足和免疫原性问题的限制。而无细胞脂肪提取物(cell-free fat extract，Ceffe)是从新鲜人体脂肪组织中分离的无细胞部分，富含多种生长因子，包括VEGF、bFGF、IL-6、TGF-α、HGF、GM-CSF、TGF-β和IGF-1等。这些无细胞提取物克服了同种异体移植的免疫排斥等问题。我们之前的研究表明，这些因素的组合协同调节巨噬细胞的表型转化，并促进新生血管的形成。然而，Ceffe在体内吸收迅速且不稳定。因此，我们需要一种合适的方法来有效负载Ceffe并提高其有效性，同时保持其生物活性。 发明内容 [0006]本发明的一个目的在于提供一种多孔组合支架，作为载体用于模拟骨骼再生微环境和诱导骨再生。 [0007]本发明的另一个目的在于提供一种多孔组合支架，作为载体用于装载Ceffe，提高Ceffe在体内的稳定性，延缓其吸收速度。 [0008]本发明的再一个目的在于提供一种多孔组合支架，作为载体用于装载Ceffe，实现Ceffe在体内的释放节奏，与骨生长生理相匹配。 [0009]本发明的又一个目的在于提供一种医疗器械，采用多孔组合支架，实施骨组织修复。 [0010]本发明发现大孔材料和介孔材料可有效治疗骨再生。当细胞迁移到大孔支架内生长时，大孔支架为细胞生长提供临时支持。随着时间的推移，多孔支架逐渐降解，它为细胞迁移和生长提供了更多的空间。同时，介孔支架小梁上的介孔结构富含骨再生微环境所需的细胞因子，在调节早期炎性细胞转化、新生血管和最终成骨分化中发挥重要作用。 [0011]为了实现Ceffe在体内的缓慢释放，与骨生长节奏相匹配，利于骨修复，本发明提供一种多孔组合支架，其由2种孔隙率的支架材料组合而成，即以大孔支架(macroporousscaffold)包裹介孔支架(mesoporous scaffold，MSN)。大孔支架上具有200μm～250μm孔径的孔隙，各个孔隙的孔壁且彼此相连，呈类似蜂巢形貌。介孔支架具有2nm～50nm孔径的孔隙。 [0012]多孔组合支架中，大孔支架由生物可降解材料制成，这些材料如：聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、PLLA、PGA、PHB、PHA、明胶和丝素蛋白等。介孔支架由生物可降解材料制成，这些材料如：介孔二氧化硅(MSN)、聚多巴胺和MOF等。 [0013]大孔支架与介孔支架质量比为10∶1。 [0014]一种具体的多孔材料的实施方式，大孔支架由PLGA制成，PLGA已证明其良好的生物相容性，并可通过改变丙二醇酯的比例和控制分子量和结晶度来调节PLGA的降解行为。同时，介孔二氧化硅为介孔支架，一方面利于吸附Ceffe，另一方面其还能缓慢释放硅，具有促进新生血管的作用。 [0015]另一种具体的多孔材料的实施方式，将MSN粉末加入10wt％的PLGA的1，4-二恶烷溶液(MSN与PLGA重量为1∶1)，搅拌使MSN粉末均匀分散。将与MSN溶液混合的PLGA加入含有200μm～250μm氯化钠(作为成孔剂)容器中，并用盐颗粒均匀铺展，将上述系统立即放置在-80℃冰箱中过夜，然后真空干燥24小时以除去任何残留溶剂。然后将所得MSN/PLGA复合支架浸入去离子水中72小时，并进行超声振荡(去离子水每12小时更换一次)，以滤出盐。最后，空气干燥48小时和真空干燥24小时后，制得MSN@PLGA组合支架。 [0016]Ceffe是从新鲜的人体脂肪组织中分离出来的，它具有调节早期炎症细胞转化、新生血管和最终成骨分化的作用。实验结果表明，负载Ceffe的多孔组合材料，如：Ceffe-MSN@PLGA是一种能更好地适应损伤骨组织再生的技术方案。将本发明的多孔材料用于骨修复时，将多孔组合支架置于含有Ceffe的液体中，使得Ceffe通过分子筛层析吸附负载于介孔支架上，载量为0.001μg/ml-1mg/ml。 [0017]本发明的多孔组合支架，加快Ceffe在1-7天释放速度，减缓Ceffe在8-21天释放速度，有效调控了巨噬细胞向M2极化的方向，这与炎症反应的早期和精确调控相一致。 [0018]本发明将一种大孔支架(如：PLGA支架)与一种介孔支架(如：介孔二氧化硅支架，MSN)相结合，构建了多功能细胞载体和药物阻滞系统(MSN@PLGA)用于释放Ceffe(Ceffe-MSN@PLGA)。Ceffe作为不同蛋白质大小的细胞因子的组合，可以完美地负载在该介孔和大孔系统上。因此Ceffe-MSN@PLGA可以调节抗炎反应，为血管生成提供足够的二氧化硅和Ceffe-MSN@PLGA系统慢慢退化。同时，血管网络周围早期招募的骨髓基质细胞(BMSC)将被刺激分化为成骨细胞。最终，在Ceffe-MSN@PLGA作用下，通过外围区域骨组织向内生长和内部骨岛形成模式实现显著的骨再生。 [0019]这些孔径为200～250μm的大孔不仅促进骨髓基质细胞(BMSC)的粘附和扩散，而且与新骨组织的向内生长有关。同时，介孔二氧化硅由许多较小的纳米颗粒和许多二氧化硅聚集体组成，导致其中间孔的形成。 [0020]因此，Ceffe-MSN@PLGA支架达到了体内骨置换所需的物理化学、生物相容性和生物活性。此外，Ceffe-MSN@PLGA由于以下特征，还具有优异的药物递送性能：(i)支架内的大孔和介孔为药物装载和释放提供药物递送通道；(ii)大的表面积和孔体积提高了载药效率和控释性能；(iii)人体自身脂肪的无细胞提取物富含细胞因子，为颅骨再生提供了良好的微环境。 附图说明 [0021]图1为合成和表征Ceffe-MSN@PLGA介孔-大孔支架结果图，其中：A为制取MSN@PLGA以及加载Ceffe的流程示意图，B1为Ceffe-MSN@PLGA支架外观图，B2为MSN@PLGA支架外观图，B3为PLGA支架外观图：C1为Ceffe-MSN@PLGA支架宏观结构的SEM图；C2为MSN@PLGA支架宏观结构的SEM图；C3为PLGA支架支架宏观结构的SEM图；D1为图C1中小梁结构的SEM高分辨率观察图；D2为图D1中位置的SEM高倍率观察图，D3为通过TEM观察到的含介孔二氧化硅的Ceffe结构； [0022]图2为载Ceffe大孔-介孔双孔径系统精确调节炎症反应的体内外评估结果图，其中：A为支架材料与Raw264.7共培养的示意图，B为大孔-介孔材料中负载的Ceffe的载药释放曲线图，C为Ceffe从Ceffe介孔二氧化硅中缓慢降解和释放的示意图将诱导M1巨噬细胞转化为M2巨噬细胞结果图；D为Ceffe处理后Raw264.7巨噬细胞形态学变化的荧光共聚焦显微镜图像(细胞用F-actin和DAPI染色)；E为显示不同处理后Raw264.7巨噬细胞的细胞形态学变化的SEM图像；F为巨噬细胞的TNF-α、IL-1β和IL-6基因表达的结果统计图(*，p＜0.05)；G为巨噬细胞的CD206、MR和FIZ1基因表达的结果统计图(*，p＜0.05)；H为巨噬细胞条件培养基的TNF-α的ELISA检测结果统计图(*，p＜0.05)；I为巨噬细胞条件培养基的IL-10的ELISA检测结果统计图(*，p＜0.05)；J为支架周围炎性细胞在第3、7、14天对M1型和M2型巨噬细胞的浸润影像图；K为组织中iNOS炎性细胞浸润的统计结果图(*，p＜0.05)，三角形图例表示PLGA，正方形图例表示MSN@PLGA，圆形图例表示：Ceffe-MSN@PLGA：L为组织中CD206炎性细胞浸润的统计结果图(*，p＜0.05)，三角形图例表示PLGA，正方形图例表示MSN@PLGA，圆形图例表示：Ceffe-MSN@PLGA； [0023]图3为载Ceffe的大孔-介孔双孔径系统促进血管再生的体外和体内评价结果，其中A为细胞迁移试验观察到Ceffe-MSN@PLGA在12小时和24小时对HUVEC迁移的影响图；B为细胞迁移实验结果的定量分析结果统计图；C为管成形节点和分支数量的统计分析结果统计图；D为RT-PCR检测血管生成相关基因vegf和pdgf-bb表达的结果统计图。E为术后8周的骨愈合结果图，F术后8周的微缩胶片血管造影图；G为术后8周血管体积定量分析结果图(*，与PLGA组相比p＜0.05；#，与MSN@PLGA组)；H为组织免疫组织化学CD31染色图； [0024]图4为负载Ceffe的介孔-介孔双孔径系统促进成骨分化的体外评估结果图；其中，A为影响Ceffe-MSN@PLGA关于hBMSC的迁移；B为成骨诱导7，14天后的ALP染色图；C为成骨诱导后7，14天的AR染色图；D为hBMSCs迁移的定量分析结果图(*，与PLGA组相比，p＜0.05；#，与PLGA相比，p＜0.05MSN@PLGA组)；E为成骨诱导7、14天后ALP染色的定量分析结果图(*，与PLGA组相比，p＜0.05；#，与PLGA相比，p＜0.05MSN@PLGA组)；F为成骨诱导7、14天后AR染色的定量分析结果图(*，与PLGA组相比，p＜0.05；#，与PLGA相比，p＜0.05MSN@PLGA组)；G为成骨相关基因OCN、OSX、OPN、ALP、BMP2和COL1的表达统计结果图(*，与PLGA组相比，p＜0.05；#，与PLGA相比，p＜0.05MSN@PLGA组)； [0025]图5为负载Ceffe的大孔-介孔双孔系统促进成骨分化的体内评估结果图；其中，A为Micro-CT，HE染色和Masson染色评估骨再生结果图；B1为Micro-CT定量BV/TV结果图(*，与PLGA组相比p＜0.05；#，与MSN@PLGA组)；B2为Micro-CT定量BMD结果图(*，与PLGA组相比p＜0.05；#，与MSN@PLGA组)；C为免疫荧光OCN定量结果图(*，与PLGA组相比p＜0.05；#，与MSN@PLGA组)；D为免疫荧光RUNX2定量结果图(*，与PLGA组相比p＜0.05；#，与MSN@PLGA组)。 具体实施方式 [0026]以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 [0027]图1A为制取Ceffe-MSN@PLGA的流程图。即将氯化钠晶体研磨细碎，过筛获得大小相仿的氯化钠晶体微颗粒，以之为成孔剂。以二氧化硅纳米颗粒为原料合成了可降解的介孔二氧化硅纳米颗粒。将制备的MSN添加到PLGA溶液中并充分混合，将其置于研磨机中，通过冷冻干燥立即除去有机溶剂，然后放入去离子水中以除去盐颗粒，这将导致大孔。分子筛层析吸附法制备的MSD负载Ceffe的介孔结构和大孔结构。 [0028]本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下： [0029]1)材料 [0030]PLGA购自Sigma-Aldrich，正硅酸乙酯(TEOS)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，25wt％)、三乙醇胺(TEA)、乙醇和盐酸(HCl，37％)购自阿拉丁工业公司(AladdinIndustrial Inc.)。 [0031]2)制取介孔二氧化硅(MSN) [0032]首先，在搅拌下，将十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，2g)和三乙醇胺(TEA)在95℃下依次溶解在20mL水中。20分钟后，逐滴加入包含1g原硅酸四乙酯(TEOS)的溶液，并将所得混合物再搅拌4小时。通过离心收集产物，并用乙醇和水洗涤数次以除去残余反应物。然后，将收集的产物在78℃下用盐酸(HCl)乙醇溶液(10％v/v)萃取两次，持续12小时，通过回流除去模板CTAC。通过离心收集产品，并将其分散在4°的无水乙醇中。 [0033]3)制取MSN@PLGA [0034]首先，将500mg PLGA溶解在5ml 1，4-二恶烷中并搅拌1小时以形成10wt％的PLGA溶液。然后，将制备的500mg MSN粉末干燥并添加到PLGA溶液中，并搅拌6小时，直到MSN粉末均匀分散在PLGA溶液。多孔支架采用成熟的盐析技术制作，氯化钠作为成孔剂。用直径为200μm～250μm的筛子筛选氯化钠，并将其均匀分布在直径为3.5cm的培养皿中，培养皿上覆盖有密封膜，以便于完全移除支架。将与MSN溶液混合的PLGA滴入培养皿中，并用盐颗粒均匀铺展。将上述系统立即放置在-80℃冰箱中过夜，然后真空干燥24小时以除去任何残留溶剂。然后将所得MSN/PLGA复合支架浸入去离子水中72小时，并进行超声振荡(去离子水每12小时更换一次)，以滤出盐。空气干燥48小时和真空干燥24小时后，将MSN@PLGA支架储存在干燥器中。使用高分辨率扫描电子显微镜(SEM)研究支架的多孔形态。 [0035]4)制取Ceffe-MSN@PLGA和Ceffe的释放研究 [0036]如前所述18-22，从新鲜脂肪组织中获得Ceffe(AesthetSurg J 2018，38(6)，667-675；Adv Mater 2014，26(20)，3290；Adv Mater2009，21(41)，4070-4070；Stem Cells2006，24(4)，835-843；ChemEng J 2018，341，112-125；Theranostics 2018，8(19)，5482-5500；J Nanobiotechnology 2022，20(1)，259)，将MSN@PLGA支架浸入Ceffe溶液中72h，将含有Ceffe的支架冷冻干燥并储存在4℃。这个MSN@PLGA在冷冻干燥器中干燥负载Ceffe的介孔-介孔支架。然后，再次测量溶液中的Ceffe含量，以计算MSN@PLGA大口径介孔支架的载荷。 [0037]Ceffe的体外药物释放试验是通过将MSN@PLGA于37℃条件下，将支架置于5ml去离子水中。以给定的时间间隔提取释放介质(0.5ml)，并用等体积的去离子水代替。通过BCA试剂盒测定收集溶液中的蛋白质浓度。在相同条件下进行三次重复，结果取平均值作为标准偏差。 [0038]5)细胞培养和CCK-8检测 [0039]从先天性手指畸形患者切除手指的骨髓中分离人骨髓基质细胞(hBMSC)，所有操作均获得上海市第九人民医院伦理委员会的批准。Raw264.7巨噬细胞和HUVEC细胞系最初从中国科学院上海细胞研究所获得，并保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEMHyclone，UT，USA)中，该培养基含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，Grand Island)和抗生素抗真菌剂(×100，Gibc)。在用于以下实验的该细胞系中未检测到支原体。 [0040]通过CCK-8测定评估不同支架上hBMSC的体外增殖。简言之，在37℃下将1×10³hBMSC接种在48孔板的空白孔或支架上。在接下来的24小时内将细胞附着到支架上。在第1、3、5和7天，将培养基改为每孔CCK-8工作溶液(400μl)。将细胞在37℃培养箱中培养2小时。将上述培养基(200μl)转移至另一个96孔板，并使用微板读取器(Bio-Rad 680，USA)在450nm处测量吸光度。实验分三次重复进行。 [0041]6)复合支架的生物相容性和巨噬细胞极化评估 [0042]将等量的hBMSC和HUVEC接种在Ceffe-MSN@PLGA支架，将含有细胞的支架培养24小时和72小时。通过活-死细胞染色确认细胞在支架上的附着、存活和增殖。活细胞和死细胞通过激光共聚焦显微镜成像。此外，将hBMSC和HUVEC以5000个细胞/cm²的密度接种到细胞爬行上，MSN@PLGA，Ceffe-MSN@PLGA在含有10％FBS的DMEM培养皿中，分别孵育1天和3天后，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鬼笔环肽(Yeasen Biotech，上海，中国)和F-actin和DAPI核染色观察细胞形态，使细胞形态可见。最后通过激光共聚焦显微镜对细胞骨架进行成像。 [0043]7)体外巨噬细胞极化评估 [0044]RT-PCR分析：将RAW264.2细胞与支架材料共培养。培养物孵育36小时。通过轻轻刮取一小部分样品进行表型确认，并通过qRT PCR监测支架炎性基因表达的影响。简而言之，将细胞(2×10⁴/孔)接种在24孔板上进行共培养，并在37℃下在5％CO₂环境中培养。使用Trizol试剂提取总RNA，然后通过cDNA转录试剂盒(Invitrogen)转录成cDNA。使用SYBR预混物Ex Taq(Takara，中国)通过以下基因进行RT-PCR：原始264.7巨噬细胞中的TNF-α和IL-1β、IL-6、CD206、MR、FIZ1。根据管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)标准化了相对基因表达，本研究中使用的引物序列列于表S1。为了进一步评估Ceffe对不同RAW264.7细胞的影响，根据说明书，使用TNF-α和IL-10定量因子ELISA试剂盒(中国上海ExCellBio)检测条件培养基中的炎症因子浓度(每组n＝3)。 [0045]SEM分析：以2×10⁴细胞/cm²的密度接种Raw264.7细胞，MSN@PLGA和Ceffe-MSN@PLGA或24小时，然后用2.5％戊二醛固定。通过SEM成像后，样品在乙醇浓度梯度(30％、50％、70％、80％、90％和100％)中脱水。为了观察细胞骨架，用低聚甲醛固定细胞，用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行染色，并对细胞核进行DAPI染色。 [0046]8)体外成管分析和成管基因表达 [0047]首先，96孔板的每个孔在使用前立即涂上50μl Matrigel(生长因子还原；BDBiosciences，USA)。然后将浓度为1000细胞mL^-1的HUVEC接种到每个孔中，PLGA@MSN和Ceffe-MSN@PLGA在高糖DMEM中浸渍48小时后，加入24孔板的不同孔中以在显微镜(Leica)下捕获图像。如前所述，使用ImageJ中的血管生成分析仪宏对6个随机选择区域中的小管长度、分割和结节数量进行量化。 [0048]RT-PCR用于检测血管生成基因表达的影响，简而言之，将细胞(2×10⁴/孔)在12孔板上共同培养，并在37℃(5％CO2)下培养。使用Trizol试剂提取总RNA，然后通过cDNA转录试剂盒(Invitrogen)转录成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq(Takara，中国)通过以下基因进行RT-PCR：检测HUVEC中pdgf、vegf基因表达，本研究中使用的引物序列列于表S1(详细方案：支持信息) [0049]9)成骨分化和成骨基因表达 [0050]骨髓干细胞培养24小时后，用含有0.2mM抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸和10^-7M地塞米松的成骨诱导培养基替换培养基。骨诱导培养基每两天更换一次。在培养基中培养14天后，分析体外成骨。通过胰蛋白酶消化从12孔板中收获hBMSC，通过以3000rpm离心5分钟收集悬浮液后获得细胞沉淀。 [0051]使用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)定量支架上hBMSC的成骨基因表达。在第7天和第14天，通过RNA分离试剂(GeneCopoeia，QP020，USA)提取总细胞RNA，然后根据标准方案使用PrimeScript RT试剂盒(TakaRa，Japan)反向转录用于cDNA合成。使用SYBR Green RT-PCR试剂盒(日本TakaRa)和ABI Step One Plus RT-PCR系统(美国应用生物系统公司)通过RT-PCR进行互补DNA定量。第7天、第14天osterix(Osx)和碱性磷酸酶(Alp)、骨钙素(Ocn)和骨桥蛋白(Opn)、COL1、BMP2基因表达。这些反应重复三次。引物序列列于表S1中。 [0052]10)动物模型 [0053]评估具有临界尺寸颅骨缺损的介孔-大孔-双孔支架Ceffe-MSN@PLGA的骨再生潜能。腹腔注射戊巴比妥(戊巴比妥钠3.5mg/100g)麻醉后，进行2cm矢状面正中矢状剥离，分离骨膜，露出颅骨，使用直径骨钻在颅骨两侧对称产生两个5mm大小的临界缺陷。在用盐水彻底冲洗后，将支架(直径5mm，高度1.3mm)植入缺陷中。大鼠被随机分为三组：1)PLGA；2)MSN@PLGA；3)Ceffe-MSN@PLGA。 [0054]11)Micro-CT分析 [0055]在术后4、8和12周，每组3只大鼠(n＝12个缺陷)在全麻下被安乐死，并取出其头骨以评估骨愈合(n＝3个缺陷)。简而言之，使用微型CT扫描仪检查颅骨愈合情况(μCT-80，Scanco Medical，瑞士)在4％多聚甲醛固定48小时后。对于三维骨可视化和骨体积与组织体积(BV/TV)和骨密度(BMD)的定量分析，阈值分别设置为210。对于血管造影分析，在8周标测后，在全身麻醉下暴露腹主动脉后，首先用肝素钠灌注全身血管系统，然后继续用4％多聚甲醛灌注，最后在血管系统中注射微缩胶片。采集颅骨，然后进行显微CT扫描。 [0056]12)组织学检验 [0057]头骨标本脱钙，石蜡包埋组织学。将样品切割至4μm厚，并用苏木精和伊红(H&E)和Masson三色染色。此外，切片用OCN、RUNX2抗体进行免疫染色。简言之，切片脱蜡，回收抗原，用1％BSA密封，并与OCN、RUNX2抗体在37℃下孵育1小时。然后用PBS洗涤切片两次，并用生物素化的二级抗体孵育。各个切片图像由光学显微镜捕获。 [0058]13)统计分析 [0059]所有实验至少重复三次，数据以平均值±标准差(SD)表示。通过单因素方差分析检测三个或更多组之间的显著差异，然后进行最小显著性差异事后检验，然后使用GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware Inc.，美国)进行Tukey事后检验。显著性水平设定为p＜0.05。 [0060]14)实验用引物 [0061]本实施例中涉及的各个引物序列如下表1所示 [0062]表1 [0063] [0064]实施例1 Ceffe-MSN@PLGA材料表征 [0065]摄影图像Ceffe-MSN@PLGA，MSN@PLGA在图1B(B1、B2、B3)中可以看到，它们都呈现出粗糙的白色。通过SEM观察了三组支架的微观结构。如图1C(C1、C2、C3)所示，三组支架微观结构显示出直径为200-250μm的相对均匀的大孔，这些大孔相互连接，为细胞迁移和养分渗透提供了良好的连接条件。高分辨率SEM图像Ceffe-MSN@PLGA图D1、D2显示了支架，表明小梁上有致密的MSN结构。透射电子显微镜(TEM)图像(图D3)进一步显示，介孔二氧化硅尺寸均匀，外观相对圆形。 [0066]实施例2载Ceffe大孔-介孔双孔径系统精确调节炎症反应的体内外评估 [0067]从大孔-介孔材料中负载的Ceffe的释放曲线如图2B所示，该图显示Ceffe在1-7天的释放更快，在8-21天的释放较慢。这一结果可能是由于小梁表面负载的一些细胞的快速释放效应，这与炎症反应的早期和精确调节的需求相一致。 [0068]巨噬细胞在炎症和修复阶段表现出关键的调节活性。在修复的早期阶段，从最初的炎性M1向促愈合M2巨噬细胞的转变对于恢复正常的稳态至关重要。骨缺损早期炎症微环境的调节对于受损组织的修复至关重要。目的：评价Ceffe从Ceffe-MSN@PLGA在调节巨噬细胞M1向M2型的极化过程中，Raw 264.7与支架材料共培养(图2A)，而Ceffe从Ceffe介孔二氧化硅的缓慢降解和释放将诱导M1巨噬细胞转化为M2巨噬细胞(图2C)。在与不同支架或无材料(对照组)共同培养后，Raw264.7形态的荧光图像(图2D)和SEM图像(图2E)表明，与PLGA和MSN@PLGA显著改变。与对照组相比，PLGA和MSN@PLGA各组获得了更为延伸的板层细胞结构，F-肌动蛋白纤维遍布整个细胞质。与未处理的细胞相比，处理组中的细胞更紧密地粘附于培养表面，这是由于PLGA的酸性降解产物可能刺激炎症细胞的转化。值得注意的是，共处理含有Ceffe的支架后，板层转化显著减少，但仍牢牢固定在基质上。为了进一步测试Ceffe是否能使炎性巨噬细胞M1复极为促愈合M2表型，在此进行了RT-PCR。在PLGA中，MSN@PLGA在共培养微环境中，M1相关的TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平随着PLGA降解而增加(图2F)，而使用Ceffe-MSN@PLGA的巨噬细胞显示CD206、MR和FIZ1的M2相关表达水平增加(图2G)。我们通过FACS分析证实了巨噬细胞的极化，不出所料，与未处理的细胞相比，PLGA共培养组中iNOS+细胞(代表M1巨噬细胞)的密度显著增加，而未显示CD206+细胞(表示M2巨噬细胞)的显着诱导。相比之下，在与Raw264.7细胞共培养的微环境中，48小时后CD206+细胞的诱导增加Ceffe-MSN@PLGA(图2G)。此外，使用MSN@PLGA的原始264.7细胞表现出与用PLGA处理的细胞相似的极化行为，表明MSN的释放不会影响其复极特性(图2G)。使用巨噬细胞条件培养基的ELISA检测炎症(TNF-α)和抗炎(IL-10)蛋白分泌水平(图2H，I)。 [0069]抗炎M2巨噬细胞在组织修复过程中发挥重要作用。因此，在3、7、14天检查支架周围组织中M2巨噬细胞表型的数量，如图2J所示。还特别研究了iNOS(M1巨噬细胞的标记)和CD206(M2巨噬细胞的标记物)的存在。M1巨噬细胞(iNOS细胞)的总数减少Ceffe-MSN@PLGA而M2巨噬细胞(CD206细胞)的总数在该组中增加(图2L)。这些数据表明：Ceffe-MSN@PLGA有效调节巨噬细胞向M2极化的方向，这对组织再生非常有益。 [0070]实施例3载Ceffe的大孔-介孔双孔径系统促进血管再生的体外和体内评价 [0071]角色Ceffe-MSN@PLGA通过体外试管形成试验(图3A，第三行)对促进新生血管的作用进行了测试，并对结果进行了量化(图3C)，结果表明：Ceffe-MSN@PLGA刺激更多HUVEC的募集，并比其他培养基更好地促进管形成和血管生成。对于体内试管形成试验，大鼠在术后8W麻醉后应用血管灌注(图3E)，其中Ceffe-MSN@PLGA微CT重建后，其他两组的血管明显冗余(图3F，图3G)。颅骨缺损大鼠组织切片的免疫组化分析显示：Ceffe-MSN@PLGA该组获得更多的CD31阳性血管。定量分析表明，两组之间的血管面积存在显著差异Ceffe-MSN@PLGA组和其他两组(图3H，图3I)。 [0072]事实证明Ceffe-MSN@PLGA，通过HUVECs迁移和RT-PCR实验测试了其机制。影响Ceffe-MSN@PLGA图3A(第一行和第二行)评估并显示了HUVEC的迁移。PLGA、MSN@PLGA和Ceffe-MSN@PLGA将HUVEC悬浮在培养基中并接种在上室中，并在24小时内观察不同时间点的迁移。显然，在阴性对照组中，在孵育12小时后仅发生有限的细胞反应，在24小时时未观察到明显增加的迁移。在24小时对迁移的HUVEC的数量进行了量化。结果显示，在培养的12小时后，细胞迁移显著增加Ceffe-MSN@PLGA与PLGA组相比(图3B)。定量RT-PCR结果显示，血小板衍生生长因子(pdgf-bb)和血管内皮生长因子(vegf)的表达显著增强Ceffe-MSN@PLGA脚手架(图3D)。 [0073]总之，Ceffe-MSN@PLGA通过增强HUVEC在体内和体外的迁移以及增加pdgf-bb和vegf的表达来促进血管生成。 [0074]实施例4负载Ceffe的介孔-介孔双孔径系统促进成骨分化的体外评估 [0075]影响Ceffe-MSN@PLGA首先评估了人骨髓间充质干细胞(hBMSC)的迁移(图4A)。Ceffe-MSN@PLGA将hBMSCs悬浮在培养基中，并用不同材料接种在上室中，并在24小时内的不同时间点观察到迁移。24小时的定量分析表明，细胞迁移率明显高于培养基Ceffe-MSN@PLGA与PLGA组相比(图4D)。研究成骨分化对成骨细胞的影响Ceffe-MSN@PLGA在第7天和第14天，通过茜素红(AR)和碱性磷酸酶(ALP)染色检测hBMSCs的成骨分化Ceffe-MSN@PLGA共培养14天后促进(图4B、C、E、F)。此外，通过RT-PCR检测几个成骨相关基因的表达水平。RT-PCR结果显示，与对照组相比，共培养7和14天后，实验性HBMSC中OCN、OSX、OPN、ALP、BMP2和COL1的表达水平显著增加(图4G)。 [0076]总的来说，我们得出结论，负载Ceffe的介孔和大孔双孔系统增强了hBMSCs的增殖和迁移，并刺激成骨细胞分化。 [0077]实施例5负载Ceffe的大孔-介孔双孔系统促进成骨分化的体内评估 [0078]二维断层显微计算机断层扫描(Micro-CT)用于体内成骨评估(图5A)。颅盖骨缺损Ceffe-MSN@PLGA在12周时，缺损与新形成的骨完全桥接的组显示出最佳的骨再生。支架植入4周后Ceffe-MSN@PLGA组形成的新骨组织明显多于两组MSN@PLGA显示骨组织从外部的外围区域向内生长的模式和内部的原位骨岛形成模式。支架植入后8周，缺损部位进一步缩小；颅盖骨缺损完全由新骨填充Ceffe-MSN@PLGA支架植入后第12周为一组。显微CT图像显示，颅骨结构仅在Ceffe-MSN@PLGA组PLGA组的苏木精和伊红(H&E)染色显示，大多数缺损部位填充有疏松结缔纤维组织，包裹新形成的骨岛。Masson三色染色证实这些是致密的纤维组织。H&E染色Ceffe-MSN@PLGA研究组显示，缺损主要由骨组织填充，包括未成熟和成熟的骨，如Masson三色染色所示。 [0079]定量分析证实了这一观察结果，显示了骨体积/总体积(BV/TV)的最高值Ceffe-MSN@PLGA组(图5B)。免疫荧光OCN、RUNX2染色显示Ceffe-MSN@PLGA具有更多的成骨基因表达和更高的成骨效果(图5C和图5D)。