【技术领域】 【0001】 一、发明领域 本发明涉及抗微生物剂领域。 具体地,本发明涉及包含肽聚糖水解酶序列和与肽聚糖水解酶异源的肽序列的多肽,其中异源肽序列长16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸,包括特定序列基序,其氨基酸长、19 个氨基酸长或 20 个氨基酸长。 本发明还涉及相应的核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒。 本发明提供多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法,或用于对人体或动物体进行诊断的方法。它还涉及使用物品和套件。 根据本发明的多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒可以用作例如食品或饲料、化妆品中的抗微生物剂,或用作消毒剂。 【背景技术】 【0002】 二、相关字段说明 对传统抗生素的耐药性给人类带来了越来越大的健康风险。 新的抗生素耐药机制已经出现,并正在全世界迅速传播。 因此,在不久的将来,治疗常见传染病的能力可能会变得越来越困难。 这种危险在本领域中很容易理解,并且正在探索对抗传染原的新方法。 【0003】 这些新方法包括肽聚糖水解酶与抗菌肽的融合。 在 WO 2010/149792 中,此类融合显示可有效治疗大量细菌。 WO 2010/149792(专利文献1)公开了肽聚糖水解酶和肽的多种组合。 有趣的是,由于未知原因,并非所有肽聚糖水解酶和肽的组合都同样有效。 与 29 残基长的抗菌肽 SMAP-29 肽(SEQ ID NO:1)的组合显示出极高的抗菌活性,而与相同的肽聚糖水解酶组合的其他肽显示出更高的抗菌活性,但仅在较小程度上增加了抗菌活性。 【0004】 因此,本领域仍需要进一步改进此类抗微生物剂的设计。 【0005】 因此,发明人的一个目的是提供新的抗微生物剂,其与肽聚糖水解酶和抗微生物肽的随机组合相比提供改进的结果。 【0006】 这个问题由下面和所附权利要求中提出的主题解决。 [现有技术文件] 【专利文献】 【0007】 【专利文献1】 WO 2010/149792 【发明概要】 【0008】 当使用展示某些常见氨基酸序列基序的肽时,可以有意义地产生肽聚糖水解酶和肽的有效抗菌组合,这让发明人感到惊讶。我发现了。 通过应用这种模式,我们使现有的抗菌肽更加有效。 此外,通过引入相应的突变,我们将一种完全不相关的肽(即以前在抗菌活性方面未知的肽)转化为一种在这方面有用的新型化合物。这是非常成功的。 【0009】 在第一方面,本发明涉及包含序列基序的多肽,其中 (i) 序列基序为 16 个氨基酸长、17 个氨基酸长、18 个氨基酸长、19 个氨基酸长或 20 个氨基酸长; (ii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的选自第一组氨基酸的氨基酸,该组氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成; 每个氨基酸独立地选自第一组; 单独选自该第一组的每个氨基酸,与选自第一组的另外的氨基酸成对,或与选自第一组的两个另外的氨基酸在块中任何位于序列基序内但不出现在块中具有选自第一组的3个或更多个氨基酸,其中选自第一组的氨基酸对至少有两个,至多一个块存在于序列基序内并且包含三个选自第一组的氨基酸组连续存在于序列基序内,进一步的条件是第一组存在于序列基序内,位置-12、-11、-8、-5、-4,相对于三个氨基酸中的第一个氨基酸氨基酸块,+6、+7、+10、+13和+14位的氨基酸在序列基序内发现相应位置时不选自第一组; (iii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的氨基酸选自丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的第二组氨基酸;,包括 每个氨基酸独立地选自第二组; 如果从第一组中选择的氨基酸和从第二组中选择的氨基酸的总和构成序列基序的100%,则从第二组中选择至少3个不同的氨基酸; 如果序列基序包含至少3个不相邻的组氨酸残基,则序列基序具有序列AFV并且序列基序不包含序列AALTH(SEQ ID NO:2), (iv) 序列基序的其余氨基酸,如果存在于基序中,选自第三组,由天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸组成,来自第三组的每个氨基酸独立选择,谷氨酰胺可以仅被选择一次,该选择可以不进一步包括谷氨酰胺和谷氨酸的组合,并且 该多肽不包含 SMAP-29 肽的序列(SEQ ID NO:1)。 【0010】 本发明多肽的一个特别优选的实施方案是本发明的融合蛋白,其中本发明的多肽还包含肽聚糖水解酶序列。 【0011】 另一方面,本发明提供编码本发明多肽的核酸,包含本发明核酸的载体或噬菌体,以及包含本发明多肽、核酸、载体和/或噬菌体的宿主细胞。也有关系。 【0012】 在另一方面,本发明还涉及包含根据本发明的多肽、核酸、载体、噬菌体和/或宿主细胞的组合物。 这样的组合物优选是包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。 【0013】 在另一方面,本发明包括本发明的多肽、核酸、载体、噬菌体和/或宿主细胞和肽聚糖水解酶或各自编码或包含肽聚糖水解酶的核酸,载体、噬菌体和/或宿主细胞是考虑过。 【0014】 最后,本发明提供本发明的多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物,用于治疗方法,特别是用于治疗或预防细菌感染,和/或有关试剂盒。 【发明1001】 (a) 肽聚糖水解酶序列,和 (b) 与肽聚糖水解酶异源的肽序列 一种融合蛋白,包含 所述异源肽序列包含序列基序; (i) 序列基序为 16 个氨基酸长、17 个氨基酸长、18 个氨基酸长、19 个氨基酸长或 20 个氨基酸长; (ii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的选自第一组氨基酸的氨基酸,该组氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成; 每个氨基酸独立地选自第一组; 单独选自第一组的每个氨基酸,与选自第一组的另外的氨基酸成对,或与选自第一组的两个另外的氨基酸在块中任何位于序列基序内但不出现在块中具有选自第一组的3个或更多个氨基酸,其中选自第一组的氨基酸对至少有两个,至多一个块存在于序列基序中并且包含三个选自第一组的连续氨基酸存在于序列基序中,条件是当包含 3 个氨基酸的这样的块存在于序列基序中时,相对于第一个氨基酸的位置 -12、-11、-8、-5、-4、+ 3个氨基酸块。如果可以在序列基序中找到相应位置,则不从第一组中选择位置6、+7、+10、+13和+14的氨基酸; (iii) 至少 40% 和最多 60% 的氨基酸,其序列基序选自第二组氨基酸,包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸;包括 每个氨基酸独立地选自第二组; 如果选自第一组的氨基酸和选自第二组的氨基酸加起来达到序列基序的100%,则至少3个不同的氨基酸选自第二组; 如果序列基序包含至少两个单独的非相邻苯丙氨酸残基并且这些苯丙氨酸残基中的至少一个紧接在赖氨酸残基之前,则序列基序包含序列AFV。不包括在内, 如果序列基序包含至少 3 个单独的非相邻组氨酸残基,则序列基序不包含序列 AALTH (SEQ ID NO:2); (iv) 序列基序的其余氨基酸,如果存在于基序内,则选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸组成的第三组,每个氨基酸独立于第三组;并且谷氨酰胺可以仅被选择一次,该选择可以不进一步包括谷氨酰胺和谷氨酸的组合, (c)融合蛋白不包含SEQ ID NO:1的序列; 融合蛋白。 【发明1002】 本发明,其中序列基序与图 1 所示的一个序列基序匹配,“X”表示序列基序在每个位置不显示选自第一组的氨基酸 1001 融合蛋白。 【发明1003】 本发明的融合蛋白1002,其中“X”表示在该位置处的序列基序表示选自第二组的氨基酸。 【发明1004】 前述发明中任一项的融合蛋白,其中序列基序是17个氨基酸长、18个氨基酸长或19个氨基酸长。 【发明1005】 前述发明中任一项的融合蛋白,其中选自第三组的氨基酸选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸。 【发明1006】 前述发明中任一项的融合蛋白,其中序列基序不包含超过一个选自第三组的氨基酸,优选地序列基序不包含任何选自第三组的氨基酸。 【发明1007】 前述发明中任一项的融合蛋白,其中序列基序不包含第一组的三个氨基酸的块。 【发明1008】 前述发明中任一项的融合蛋白,其中所述肽序列是自然界中不存在的人工肽序列。 【发明1009】 所述融合蛋白,其中所述肽聚糖水解酶为Lys394内溶素、KZ144内溶素、OBPgpLys内溶素或噬弧菌ICP1尾底板蛋白, 具体地,任何前述发明的融合蛋白,包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的序列。 【发明1010】 本发明的任何前述融合蛋白,其中序列基序是螺旋的。 【发明1011】 以上任一项的融合蛋白,其中脯氨酸残基位于序列基序的N端或C端1-5个氨基酸残基内。 【发明1012】 本发明的融合蛋白1011,其中脯氨酸残基位于肽聚糖水解酶序列和序列基序之间。 【发明1013】 前述权利要求中任一项的融合蛋白,其中所述序列基序位于所述肽聚糖水解酶序列的N端。 【发明1014】 SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO: NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO :35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,和 SEQ ID NO: 43 前述发明中任一项的融合蛋白,其包含选自由以下组成的组的序列: 【发明1015】 SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO: NO 一种多肽,包含 NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 或 SEQ ID NO:23 的序列。 【发明1016】 编码发明1001至1014中任一项的融合蛋白或发明1015的多肽的核酸。 【发明1017】 包含本发明的核酸的载体1016。 【发明1018】 包含本发明核酸的噬菌体1016。 【发明1019】 一种宿主细胞,其包含发明 1001-1014 中任一项的融合蛋白、发明 1015 的多肽、发明 1016 的核酸、发明 1017 的载体和/或发明 1018 的噬菌体。 【发明1020】 本发明的任何融合蛋白 1001 至 1014、本发明的多肽 1015、本发明的核酸 1016、本发明的载体 1017、本发明的噬菌体 1018、和/或本发明的宿主细胞 1019,作品。 【发明1021】 发明1020是包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的药物组合物,或包含可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合物的化妆品组合物。 【发明1022】 (i) 发明 1001 至 1014 中任一项的融合蛋白、发明 1015 的多肽、发明 1016 的核酸、发明 1017 的载体、发明 1018 的噬菌体、本发明的宿主细胞发明 1019,和/或本发明 1020 至 1021 中任一项的组合物,和 (ii)进一步包含肽聚糖水解酶,或各自编码或包含肽聚糖水解酶的核酸、载体、噬菌体和/或宿主细胞, 成套工具。 【发明1023】 用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法,或用于对人体或动物体进行诊断的方法,特别是用于治疗或预防细菌感染的方法 本发明的任何融合蛋白 1001 至 1014 [0310] 、本发明的多肽 1015、本发明的核酸 1016、本发明的载体 1017、本发明的噬菌体 1018、本发明的宿主细胞 1019、用于使用、本发明 1020 至 1020 中任一项的组合物1021 或发明 1022 的套件。 【发明1024】 本发明 1001-1014 中任一项的融合蛋白、本发明 1015 的多肽、本发明 1016 的核酸或载体的用途、本发明 1018 的噬菌体、本发明 1019 的宿主细胞、本发明的组合物发明 1020-1021 中的任何一项,或发明 1022 的套件。 【发明1025】 食品材料、食品加工设备、食品加工厂、与食品材料接触的表面、饲料材料、饲料加工设备、饲料加工厂、与饲料材料接触的表面、医疗设备或医院、诊所和其他任何医疗设施本发明的融合蛋白 1001 至 1014、本发明的多肽 1015、本发明的核酸 1016、本发明的载体 1017、本发明的 1018 用于治疗或预防无生命表面的革兰氏阴性细菌污染本发明的噬菌体1019,本发明1020至1021中任一项的组合物,或本发明1022的试剂盒。 [实施发明的方式] 【0015】 说明性实施例的描述 一、定义 如本文所用,术语“多肽”具体指氨基酸残基以特定序列通过肽键连接的聚合物。 多肽的氨基酸残基可以被修饰,例如,通过各种基团如碳水化合物和磷酸盐的共价连接。 其他物质,如血红素或脂质,可能与多肽相对松散地结合,产生缀合的多肽,在本文中也称为术语中包括的“多肽 如本文所用,该术语还应包括蛋白质。 因此,例如,术语“多肽”还包括两个或多个氨基酸聚合物链的复合物。 术语“多肽”包括本领域通常使用的修饰,例如生物素化、乙酰化、聚乙二醇化、氨基、SH基或羧基(例如,保护基)的化学改变。多肽的实施方式,任选地指示等,被包含在内。 从下面的描述中将变得明显,根据本发明的多肽还可以是人工修饰的多肽,其不是以这种形式天然存在的。 例如,与天然存在的多肽相比,此类多肽可能表现出人为变异,或可能包含异源序列,或可能包含并非以这种形式天然存在的天然序列。它也可能是存在的多肽的片段在 此外,根据本发明的多肽可以是融合蛋白,即代表至少两个非天然存在于该组合中的氨基酸序列的连接。 如本文所用,术语“多肽”不限于任何特定长度的氨基酸聚合物链。 但是,最小长度为 16 个氨基酸。 通常但不一定,本发明的典型多肽长度不超过约1000个氨基酸。 本发明的多肽可以是,例如,长度最多约750个氨基酸,长度最多约500个氨基酸,或长度最多约300个氨基酸。 因此,本发明多肽的可能长度范围是,例如但不限于,16至1000个氨基酸、16至约50个氨基酸、约200至约750个氨基酸或约225至50个氨基酸约 600 个氨基酸,或约 250 至约 350 个氨基酸。 【0016】 如本文所用,术语“肽聚糖水解酶”是本领域通常理解的。 是指能水解革兰氏阴性菌等细菌的肽聚糖的多肽。 该术语不限于特定的酶促裂解机制。 关于裂解机制,肽聚糖水解酶包括例如内肽酶、几丁质酶、T4样胞壁质酶、λ样胞壁质酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、胞壁酰-L-可以是丙氨酸-酰胺酶、胞壁质酶、可溶性转糖基酶 (C)、可溶性转糖基酶 (M)、N-乙酰基-胞壁质酶(溶菌酶)、N-乙酰基-葡糖胺酶或转糖基酶。 此外,该术语包括天然存在的肽聚糖水解酶,例*自真核生物、原核生物或病毒(特别是噬菌体)的肽聚糖水解酶。 该术语包括,例如,脊椎动物溶菌酶(例如鸡蛋清溶菌酶和人溶菌酶)、内溶素(例如,KZ144内溶素或Lys394内溶素)、病毒体相关肽聚糖水解酶(VAPGH)、细菌素(例如,溶葡萄球菌素)。以及自溶素。 “肽聚糖水解酶”可以是能够水解细菌肽聚糖的合成或人工修饰的多肽。 例如,其中两个或更多个细胞内溶素结构域互换/交换的酶活性改组细胞内溶素被称为“肽聚糖水解酶”,其中仅酶活性结构域保留的截短细胞内溶素也是如此。 例如,在 Briers 等人(J.Biochem.Biophys Methods;2007;70:531-533)或 Donovan 等人(J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec;265(1) 和类似出版物中描述了活性.可以通过本领域技术人员熟知的测定来测量,例如抗菌测定。 【0017】 当本文提及“氨基酸残基”时,它通常是指L-氨基酸残基。 【0018】 如本文所用,术语“细胞内溶素”是指适用于水解细菌细胞壁的噬菌体衍生酶。 细胞内溶素含有至少一个“酶活性结构域”(EAD),该结构域至少具有以下一种活性:肽链内切酶、几丁质酶、T4 样胞壁质酶、λ 样胞壁质酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、胞壁质酶、可溶性转糖基酶(C)、可溶性转糖基酶(M)、N-乙酰基-胞壁质酶(溶菌酶)、N-乙酰基-葡糖胺酶或转糖基酶。 此外,细胞内溶素还可能包含一个没有酶活性但与宿主细菌细胞壁结合的区域,即所谓的 CBD(细胞壁结合域)。 【0019】 如本文所用,术语“包含”不应被解释为意指“由...组成”(即排除存在额外的其他物质)。 相反,“包含”任选地暗示可以存在另外的物质。 术语“包含”包括,作为其范围内具体设想的实施例,“由(即排除存在额外的其他材料)和“但不得”(即要求存在额外的其他物质),前者更受青睐。 【0020】 此处使用的“一个”或“一个”一词可能表示“一个”,但“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多个”。 【0021】 二、多肽 如上所述,本发明首先涉及包含序列基序的多肽,其中: (i) 序列基序为 16 个氨基酸长、17 个氨基酸长、18 个氨基酸长、19 个氨基酸长或 20 个氨基酸长; (ii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的选自第一组氨基酸的氨基酸,该组氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成; 每个氨基酸独立地选自第一组; 单独选自该第一组的每个氨基酸,与选自第一组的另外的氨基酸成对,或与选自第一组的两个另外的氨基酸在块中任何位于序列基序内但不出现在块中具有选自第一组的3个或更多个氨基酸,其中选自第一组的氨基酸对至少有两个,至多一个块存在于序列基序内并且包含三个选自第一组的氨基酸组连续存在于序列基序内,进一步的条件是第一组存在于序列基序内,位置-12、-11、-8、-5、-4,相对于三个氨基酸中的第一个氨基酸氨基酸块,+6、+7、+10、+13和+14位的氨基酸在序列基序内发现相应位置时不选自第一组; (iii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的氨基酸选自丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的第二组氨基酸;,包括 每个氨基酸独立地选自第二组; 如果从第一组中选择的氨基酸和从第二组中选择的氨基酸的总和构成序列基序的100%,则从第二组中选择至少3个不同的氨基酸; 如果序列基序包含至少3个不相邻的组氨酸残基,则序列基序具有序列AFV并且序列基序不包含序列AALTH(SEQ ID NO:2), (iv) 序列基序的其余氨基酸,如果存在于基序中,选自第三组,由天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸组成,来自第三组的每个氨基酸独立选择,谷氨酰胺可以仅被选择一次,该选择可以不进一步包括谷氨酰胺和谷氨酸的组合,并且 融合蛋白不包含 SMAP-29 肽序列 (SEQ ID NO:1)。 【0022】 上述(i)至(iii)中定义的序列基序可以仅代表本发明多肽的部分序列,即本发明的多肽可以比序列基序长。 或者,序列基序可以是本发明多肽的序列,即本发明多肽的序列可以与序列基序的序列相同。 此外,从图1中提供的实例显而易见,本发明的多肽可包含一个或多个此类序列基序。 例如,一个 20 个残基长的基序基本上可以包括一个满足上述标准的 16 个残基长的基序。 因此,本发明的多肽包含如上定义的“一个”序列基序的事实表明本发明的多肽可以仅包含“一个”序列基序并符合上述限制。不应理解为它不能包含额外的(例如重叠的)序列基序。 【0023】 本发明的多肽的序列基序可以是16个氨基酸长、17个氨基酸长、18个氨基酸长、19个氨基酸长或20个氨基酸长。 优选地,序列基序为17、18或19个氨基酸长,更优选为17或18个氨基酸长。 【0024】 本发明多肽的序列基序包含至少40%且至多60%的选自第一组氨基酸的氨基酸。 第一组由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成。 如果序列基序的长度为 16 个氨基酸,则它将代表选自该第一组的至少 7 个和最多 9 个氨基酸。 如果序列基序的长度为 17 个氨基酸,则它将代表选自该第一组的至少 7 个且至多 10 个氨基酸。 如果序列基序的长度为 18 个氨基酸,则它将代表选自该第一组的至少 8 个且至多 10 个氨基酸。 如果序列基序的长度为 19 个氨基酸,则它将代表选自该第一组的至少 8 个且至多 11 个氨基酸。 如果序列基序的长度为 20 个氨基酸,则它将代表选自该第一组的至少 8 个且至多 12 个氨基酸。 【0025】 在第一组中选择的优选氨基酸是赖氨酸和精氨酸。 优选地,序列基序不包含多于50%的组氨酸残基。 更优选地,序列基序不包含多于25%的组氨酸残基。 在本发明的一些实施例中,序列基序仅包含一个组氨酸残基,或什至不含组氨酸残基。 【0026】 选自第一组的氨基酸是独立选择的。 这意味着,例如,如果给定的序列基序包含例如选自第一组的8个氨基酸,则这8个氨基酸残基中的每一个可以在第一组之前或之后。选择是指独立选择。 因此,所选择的氨基酸可以包括所有三种氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)或可以相同(例如,分别为 8 个赖氨酸残基或 8 个精氨酸残基)。或者可以仅包含三种氨基酸中的两种(例如、赖氨酸和精氨酸)。 同样,独立选择并没有规定单独选择的氨基酸之间的特定比例。 例如但不限于,选自该第一组的8个氨基酸可以是8个赖氨酸残基、7个精氨酸残基和1个组氨酸残基,也可以是3个精氨酸残基、4个赖氨酸残基和1个组氨酸残基. 【0027】 选自第一组的氨基酸残基在序列基序内的定位受到某些限制。 选自该第一组的每个氨基酸单独地、与选自第一组的另外的氨基酸成对地、或与选自第一组的另外两个氨基酸一起放置在一个序列基序内。 【0028】 “单独”是指选自第一组的氨基酸,例如赖氨酸(K),无论是N-末端还是C-末端,都没有侧接来自第一组的另一个氨基酸。 侧翼氨基酸残基可以选自第二组,任选地选自第三组(例如,L K E、N- K E(基序的 N 端),L K -C(基序的 C 端))。 值得注意的是,在本发明的多肽内但在序列基序之外的可能的额外氨基酸不被考虑用于该定位。 因此,来自第一组的氨基酸,在序列基序的两端之一,恰好是序列基序外部之前(N-末端)或之后(C-末端)的氨基酸残基。,精氨酸残基, 组氨酸残基, 甚至赖氨酸残基, 被认为是单一定位的。 【0029】 “与选自第一组的另一个氨基酸成对”是指选自第一组的氨基酸与序列基序内选自第一组的另一个氨基酸直接相邻。 这两个氨基酸因此形成一对选自第一组的氨基酸。 然后,该对在 C 端和 N 端两侧是来自第二组和任选第三组的氨基酸(例如,L 韩国 E(序列号:3),N- 韩国 E(基序的 N 端),L 韩国 -C(基序的 C 端))。 在本发明的多肽内但在序列基序之外的可能的额外氨基酸同样不考虑用于该定位。 【0030】 “在与选自第一组的另外两个氨基酸的区段中”是指选自第一组的三个氨基酸彼此直接相邻。 该块(或三联体)的 C 端和 N 端两侧是来自第二组和任选第三组的氨基酸(例如,L 克朗 E(序列号:4),N- 克朗 E(基序的 N 端;SEQ ID NO:5),L 克朗 -C(基序的 C 端;SEQ ID NO:6))。 在本发明的多肽内但在序列基序之外的可能的额外氨基酸同样不考虑用于该定位。 对于以这种方式排列的氨基酸(三联体;包含第一组三个氨基酸的块),必须满足额外的位置要求,即三个氨基酸块的第一个氨基酸 -12,-11 位的氨基酸、-8、-5、-4、+6、+7、+10、+13 和+14 如果在序列基序中发现,则它一定不是选自第一组的氨基酸。 负值表示三联体第一个氨基酸的N端位置;正值表示三联体第一个氨基酸的C端位置。 位置计算的基础是三联体的第一个(N 端)氨基酸(例如,直接到三联体的 N 末端的氨基酸是 -1,直接到三联体的 C 末端的氨基酸是 +3 将) . 因此这个限制是 像 TIFF2023052138000002.tif6128 这样的序列被排除在外,因为位置 +6 (H) 是第一组氨基酸。 每个位置(-12、-11、-8、-5、-4、+6、+7、+10、+13 和 +14)是否出现在序列基序中是三联体的位置和长度的序列基序。 例如,如果三元组位于序列基序的 N 端,则不使用所有负值(即不需要考虑)。 如果三联体位于序列基序的 C 端,则正值也是如此。 然而,在优选的实施方案中,序列基序不包含具有此类三联体的第一组的任何氨基酸块,即由选自第一组的三个氨基酸组成的块。 【0031】 单独、与选自第一组的额外氨基酸成对以及与选自第一组的两个额外氨基酸成块时的位置要求是:没有重叠,这些术语被理解为相互排斥(例如,三联体不适用于“单独”和/或“成对”等)。 【0032】 对选自第一组的氨基酸的进一步位置要求是序列基序必须包含至少两对选自第一组的氨基酸。 然而,优选并非所有选自第一组的氨基酸都成对排列在序列基序内。 【0033】 本发明的多肽的序列基序不包含选自第一组的四个(四联体)或更多(五联体、六联体)氨基酸的块(即,第一组的氨基酸不以具有3个的块出现或更多选自第 1 组的氨基酸)。 因此,序列基序可能不包括例如“KRKK”(SEQ ID NO:8)或“RRRR”(SEQ ID NO:9)的序列。 【0034】 由于第一组氨基酸仅占序列基序的40%-60%,其余氨基酸应选自其他氨基酸残基。 如上所述,序列基序还包含至少40%和至多60%的选自第二组氨基酸的氨基酸。 第二组由氨基酸残基丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成。 与上述第一组氨基酸一样,第二组的每个氨基酸原则上是独立选择的,即独立选择的。 【0035】 然而,对于第二组,这种独立选择的一般原则存在一些局限性。 如果选自第一组的氨基酸加上选自第二组的氨基酸加起来达到序列基序氨基酸的 100%(即序列基序中不存在来自第三组的氨基酸),则第一个约束适用。 在这种情况下,必须从第二组中选择至少 3 种不同的氨基酸。 在这种情况下,第二组氨基酸不能仅限于例如缬氨酸和色氨酸残基。 【0036】 进一步的(位置)限制是序列基序包含至少两个单独的非相邻苯丙氨酸残基,并且这些苯丙氨酸残基中的至少一个之前(N-末端)是赖氨酸残基。序列基序不能包含三联体序列AFV(丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸)如果基团(即 KF)存在。 非相邻的苯丙氨酸残基是在序列中不连续并且被一个或多个其他氨基酸分开的苯丙氨酸残基。 单个苯丙氨酸残基表示它不是一对苯丙氨酸残基的一部分或几个苯丙氨酸残基的嵌段并且在序列基序内单独定位。 【0037】 以下约束是如果序列基序包含至少 3 个单独的非相邻组氨酸残基,则序列基序不包含序列 AALTH(即丙氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、组氨酸)。这就是它的意思。 非相邻的组氨酸残基是在序列中不连续并且被一个或多个其他氨基酸分开的组氨酸残基。 单个组氨酸残基意味着它不是一对组氨酸残基的一部分或几个组氨酸残基的块,而是仅位于序列基序内。 【0038】 在一个优选的实施方案中,特别是当多肽不包含肽聚糖水解酶序列和/或具有较短长度(例如3、2、1或0)时,异亮氨酸残基选自第二组。 【0039】 也可能本发明的多肽的序列基序不完全由选自第一组和第二组的氨基酸组成(即两者均代表小于100%)。 在这种情况下,序列基序的剩余氨基酸选自第三组氨基酸,包括天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸。 与上述第一组和第二组氨基酸一样,原则上第三组的每个氨基酸都是独立选择的,即来自第二组的每个氨基酸的选择独立于随后的选择。 但是,和上面的第二组一样,第三组氨基酸的选择也有一些限制:谷氨酰胺只能选择一次,同时选择谷氨酰胺和谷氨酸。即如果序列基序中存在谷氨酰胺,谷氨酸不能存在,反之亦然。 优选地,选自第三组的氨基酸限于天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸,即选自第三组的氨基酸包括甲硫氨酸残基或半胱氨酸残基,不包括在内。 【0040】 在优选的实施方案中,序列基序仅包含一个,或更优选不包含来自第三组的氨基酸残基。 【0041】 在本发明的一个优选实施例中,所选氨基酸在序列基序内的排列是图1(和图2a、2b、2c、2d和2e分别)所示的可能序列基序。满足其中一个所示的要求的选项。 图 1 显示,对于给定的 16、17、18、19 或 20 个残基长度,在特定位置有一个氨基酸选自第一组。它表明你无法得到它。 只有选自第二组和/或第三组(如果存在)的氨基酸可以存在于这些位置。 优选地,第二组氨基酸存在于那些位置。 第一组氨基酸只能出现在序列基序的任何剩余位置。 这并不意味着在这些剩余位置只能找到第一组氨基酸。 第二组氨基酸和任选的第三组氨基酸也可以在这些剩余位置找到,只要满足第一组和第二组的总百分比要求即可。 【0042】 优选地,本发明多肽的序列基序具有螺旋结构。 【0043】 本发明多肽的序列基序不包含定义为包括在第一、第二或第三组中的氨基酸残基以外的氨基酸残基。 具体地,本发明的多肽的序列基序不包含脯氨酸残基,并且当第三组限于天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸时,蛋氨酸和半胱氨酸也不包括在内。 【0044】 然而,与SMAP-29序列一样,脯氨酸残基很可能存在于本发明的多肽中。 例如,如果脯氨酸残基位于序列基序的N-末端侧或C-末端侧的1至10个氨基酸残基内,优选1至5个氨基酸残基内,则优选,后者是优选的。 在本发明的多肽还包含肽聚糖水解酶序列(见下文)的情况下,如果在肽聚糖水解酶序列和序列基序之间发现这样的脯氨酸残基是优选的。 优选地,序列基序是肽聚糖水解酶序列的N-末端并且脯氨酸残基位于两者之间的某处,通常靠近序列基序。 【0045】 根据本发明的多肽不包含SEQ ID NO:1的序列。 在一些实施例中,根据本发明的多肽可包含SEQ ID NO:10。 然而,在一个优选的实施方案中,根据本发明的多肽也不包含SEQ ID NO:10的序列。 【0046】 根据本发明的多肽优选是天然不存在的人工多肽。 这种人工构建的序列的例子是 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:17 ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23。 其他实例是 SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74。 因此,根据本发明的多肽的特别优选的实例是 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:16 NO:16, ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:71 ,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,或 SEQ ID NO:74。 【0047】 在一个优选的实施方案中,根据本发明的多肽还包含肽聚糖水解酶序列。 此类多肽(代表本发明的融合蛋白)是 (a) 肽聚糖水解酶序列,和 (b) 肽序列 其中肽序列优选地与肽聚糖水解酶异源,其中(异源)肽序列包含序列基序, (i) 序列基序为 16 个氨基酸长、17 个氨基酸长、18 个氨基酸长、19 个氨基酸长或 20 个氨基酸长; (ii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的选自第一组氨基酸的氨基酸,该组氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成; 每个氨基酸独立地选自第一组; 单独选自该第一组的每个氨基酸,与选自第一组的另外的氨基酸成对,或与选自第一组的两个另外的氨基酸在块中任何位于序列基序内但不出现在块中具有选自第一组的3个或更多个氨基酸,其中选自第一组的氨基酸对至少有两个,至多一个块存在于序列基序内并且包含三个选自第一组的氨基酸组连续存在于序列基序内,进一步的条件是第一组存在于序列基序内,位置-12、-11、-8、-5、-4,相对于三个氨基酸中的第一个氨基酸氨基酸块,+6、+7、+10、+13和+14位的氨基酸在序列基序内发现相应位置时不选自第一组; (iii) 序列基序包含至少 40% 和至多 60% 的氨基酸选自丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的第二组氨基酸;,包括 每个氨基酸独立地选自第二组; 如果从第一组中选择的氨基酸和从第二组中选择的氨基酸的总和构成序列基序的100%,则从第二组中选择至少3个不同的氨基酸; 序列基序的序列 AFV 不包括 如果序列基序包含至少 3 个单独的非相邻组氨酸残基,则序列基序不包括序列 AALTH (SEQ ID NO:2); (iv) 序列基序的其余氨基酸,如果存在于基序中,选自第三组,由天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸组成,来自第三组的每个氨基酸独立选择,谷氨酰胺可以仅被选择一次,该选择可以不进一步包括谷氨酰胺和谷氨酸的组合,并且 (c)融合蛋白不包含SEQ ID NO:1的序列。 【0048】 应当理解,上文详述的本发明多肽的序列基序的特征和特征同样适用于(异源)肽序列的序列基序。 【0049】 本发明的融合蛋白的肽聚糖水解酶可以是任何能够降解细菌肽聚糖的肽聚糖水解酶。 此类肽聚糖水解酶具有例如酶活性,因此适用于降解细菌细胞壁肽聚糖。 优选地,肽聚糖水解酶降解革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌的肽聚糖。 【0050】 细菌细胞壁的肽聚糖结构在很大程度上是保守的,尽管它包含一些小的修改 (Schleifer & Kandler 1972)。 细菌物种可能具有由不同氨基酸组成的肽间桥,甚至没有肽间桥。 在缺乏肽间桥的肽聚糖结构中,二氨基庚二酸 (DAP) 或间二氨基庚二酸(mDAP;代表赖氨酸的 ε-羧基衍生物的氨基酸,肽聚糖的典型成分)是氨基酸 L-Lys。相反,它直接桥接到相对肽链末端的氨基酸 D-Ala。 因此,只有有限类型的可用化学键可以被肽聚糖水解酶水解。 肽聚糖水解酶表现出至少一个具有上述酶促活性的酶促结构域。 此外,在一些情况下,肽聚糖水解酶包含至少一个适合结合肽聚糖并支持肽聚糖水解酶的酶活性的结构域。 结合域通常称为细胞壁结合域 (CBD)。 【0051】 肽聚糖水解酶的实例包括脊椎动物溶菌酶(例如鸡蛋清溶菌酶和人溶菌酶)、内溶素(例如,KZ144内溶素或Lys394内溶素)、病毒体相关肽聚糖水解酶(VAPGH)、细菌素(例如,lysophstafin),以及作为自溶素。 最优选地,本发明的融合蛋白的肽聚糖水解酶是细胞内溶素。 最优选地,肽聚糖水解酶是细胞内溶素。 特别优选的肽聚糖水解酶序列列为 SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:27。 【0052】 肽聚糖对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的降解活性可以通过本领域熟知的测定来测量,例如,它可以通过透化或去除膜的壁溶性测定来测量。 如果酶是活性的,肽聚糖层的降解会导致浊度降低,这可以通过光度法测量(例如 Briers 等人,J. Biochem. Biophys Methods 70:531-533, (2007) 或 Schmelcher 等人。 , Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Schmelcher M, Donovan DM, Loessner MJ. Future Microbiol.). 【0053】 根据本发明的融合蛋白优选还表现出肽聚糖降解酶活性,即能够降解细菌肽聚糖。 优选地,本发明的融合蛋白将能够降解革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌的肽聚糖。 【0054】 包含本发明的序列基序的肽序列优选地与肽聚糖水解酶序列异源。 因此,包含本发明序列基序的肽序列和肽聚糖水解酶序列优选不一起存在于天然存在的多肽链中。 更优选地,序列基序和肽聚糖水解酶序列不一起存在于天然存在的多肽链中。 【0055】 在本发明的融合蛋白中,包含本发明的序列基序的肽序列优选为不存在于自然界中的人工肽序列。 包含根据本发明的序列基序的异源肽的特别优选的实例是SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16 , SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:71 ID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74。 【0056】 在本发明融合蛋白的优选实施方案中,(异源)肽序列(或序列基序)包含氨基酸残基甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸(Gly-Ser-Ser)、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸。 TIFF2023052138000003.tif5128、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala;SEQ ID NO:29),或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸, 丙氨酸, 甘氨酸, 丙氨酸, 甘氨酸, 丙氨酸, 甘氨酸, 丙氨酸, 甘氨酸, 丙氨酸 它通过额外的中间氨基酸残基(接头)连接到肽聚糖水解酶序列,例如 TIFF2023052138000004.tif5128。 【0057】 本发明的多肽,特别是本发明的融合蛋白,当然会含有更多的氨基酸序列元件,例如一个或多个标签,例如 His-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、Gst- tag.标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签或本领域已知的其他标签,例如硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。 【0058】 在这方面,本发明的多肽还可以包含标签,例如用于纯化。 优选地,他的 ₆ 标签(SEQ ID NO:31),优选地在根据本发明的多肽的C-末端和/或N-末端。 标签可以通过额外的氨基酸残基与多肽连接,例如用于克隆。 优选地,标签通过至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个额外的氨基酸残基与蛋白质连接。您可以 在一些实施方案中,额外的氨基酸残基不能被蛋白酶识别和/或切割。 在其他实施方案中,额外的氨基酸残基被蛋白酶切割和/或识别。 在优选的实施方案中,本发明的多肽具有通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接到多肽的His基团。 ₆ 在 C 端包含一个标签。 在另一个优选的实施方案中,本发明的多肽通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)与多肽组氨酸连接。 ₆ 在 N 端包含一个标签。 在另一个优选的实施方案中,多肽是His,通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)与多肽连接。 ₆ 在 N 端和 C 端包含标签。 【0059】 本发明特别优选的融合蛋白是 SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、 SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42 和 SEQ ID NO:43。 根据本发明的另一组融合蛋白包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78。 【0060】 根据本发明的多肽可以通过本领域已知的标准方法产生,例如通过在合适的宿主细胞中重组表达编码相应多肽的核酸。 当本发明的多肽还包含例如氨基酸序列延伸段或标签等时,可以使用标准克隆技术克隆此类融合蛋白,例如 Sambrook 等人 2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 中描述的那些技术. 可以通过使用 连接所需的单个核酸序列来制作。 此类多肽同样可以通过本领域已知的方法产生,例如在重组DNA表达系统中。 根据本发明的相对短的多肽,例如长度最多50个氨基酸,也可以例如通过合成方法制备。 【0061】 III. 核酸、载体、噬菌体和宿主细胞 本发明还涉及编码一种或多种本发明多肽的本发明核酸。 本发明的核酸可以采用所有可能的核酸形式。 具体地,根据本发明的核酸可以是RNA、DNA或其杂交体。 它们可以是单链或双链的。 它们可能有一个小转录本的大小,或一个完整的基因组,例如噬菌体基因组。 如本文所用,编码一种或多种本发明多肽的本发明核酸可以是反映有义链的核酸。 同样,反义链也包括在内。 核酸可包括用于表达本发明的多肽的异源启动子。 特别优选的核酸编码根据本发明的融合蛋白。 【0062】 在另一方面,本发明涉及包含根据本发明的核酸的载体。 这样的载体可以是例如能够表达本发明的多肽的表达载体。 表达可以是组成型的或诱导型的。 该载体可以是包含用于克隆目的的本发明的核酸序列的克隆载体。 【0063】 本发明还涉及包含本发明核酸的噬菌体,特别是编码根据本发明的融合蛋白。 【0064】 本发明还涉及包含根据本发明的多肽、核酸、载体或噬菌体的(分离的)宿主细胞。 宿主细胞尤其可以选自细菌细胞和酵母细胞。 在适当的情况下,其他合适的宿主细胞可以是永生化细胞系,例如哺乳动物(尤其是人类)来源的细胞系。 特别优选的宿主细胞含有根据本发明的融合蛋白。 【0065】 四、作品 在另一方面,本发明涉及包含根据本发明的多肽、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的噬菌体和/或根据本发明的宿主细胞的组合物。 【0066】 本发明特别优选的组合物包含根据本发明的融合蛋白。 其他优选的组合物包含根据本发明的多肽和肽聚糖水解酶。 【0067】 根据本发明的组合物可以是包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的药物组合物。 【0068】 另一方面,根据本发明的组合物是化妆品组合物。 某些细菌种类会刺激暴露于患者身体环境的表面,例如皮肤。 为了防止这种刺激,或为了消除细菌性病原体的轻度症状,可以使用足够量的本发明的多肽、核酸、载体、宿主细胞以实现粉刺消除效果,和/或包含该组合物的特殊化妆品制剂。 【0069】 五、套件 在另一方面,本发明包括根据本发明的多肽、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的噬菌体和/或根据本发明的宿主细胞,以及肽聚糖提供了水解酶,或进一步包含编码或包含此类肽聚糖水解酶的核酸、载体、噬菌体和/或宿主细胞的每种试剂盒。 优选地,试剂盒包含根据本发明的多肽和/或肽聚糖水解酶。 【0070】 本发明特别优选的试剂盒包含根据本发明的多肽但不包含本发明的融合蛋白,即试剂盒中的多肽不包含肽聚糖水解酶序列。 【0071】 在另一个实施方案中,本发明的试剂盒包含至少一种额外的抗微生物剂,例如抗生素或抗微生物肽。 【0072】 六、用法 在另一方面,本发明提供了根据本发明的多肽,用于通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法,或用于对人体或动物体进行诊断的方法,它涉及根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的噬菌体、根据本发明的宿主细胞和/或根据本发明的组合物。 在这种情况下,特别是当使用本发明的融合蛋白时,可以利用本发明的多肽的抗微生物活性。 【0073】 此类方法通常包括向受试者施用有效量的多肽(例如,本发明的融合蛋白)、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞或本发明的组合物。 对象可以是例如人或动物,更优选人对象。 特别地,本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的噬菌体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物可用于细菌感染,例如革兰氏阴性细菌感染.它可以用于治疗或预防的方法中。 治疗方法包括但不限于皮肤、软组织、呼吸系统、肺、胃肠道、眼睛、耳朵、牙齿、鼻咽、口腔、骨骼、阴道感染、菌血症。治疗和/或预防心内膜炎和/或可能包括心内膜炎伤口。 【0074】 用于根据本发明的治疗(或预防)方法的剂量和给药途径取决于待治疗的特定疾病/感染部位。 给药途径可以是例如口服、局部、鼻咽、肠胃外、静脉内、直肠或任何其他给药途径。 【0075】 为了将多肽(例如,本发明的融合蛋白)、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞或本发明的组合物应用于感染部位(或处于感染风险中),到达感染部位的制剂可以是保护活性化合物免受环境影响,如蛋白酶、氧化、免疫反应等,直至应用。 因此,制剂可以是胶囊剂、糖衣丸、丸剂、栓剂、注射液或其他医学上合理的草药制剂。 优选地,草药制剂可包含合适的载体、稳定剂、调味剂、缓冲剂或其他合适的试剂。 例如,用于局部应用的制剂可以是洗剂或软膏,用于鼻咽应用的制剂可以是通过喷雾施加到鼻子的盐水溶液。 【0076】 优选地,本发明的多肽(例如,融合蛋白)、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞或组合物含有抗生素、羊毛硫抗生素、细菌素或其他常规试剂如细胞内溶素等。 . 常规抗微生物剂的施用可以在本发明的多肽(例如,融合蛋白)、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞或组合物的施用之前、同时或之后。 【0077】 在另一方面,本发明可用作医学诊断、食品诊断、饲料诊断或环境诊断中的诊断工具,特别是细菌感染的诊断,特别是那些由革兰氏阴性菌引起的感染。它涉及一种多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞或本发明的组合物用作工具。 在这方面,本发明的多肽、核酸、载体、宿主细胞或组合物可用作特异性降解病原体特别是革兰氏阴性病原体的肽聚糖的工具。 本发明的多肽、核酸、载体、宿主细胞或组合物对细菌细胞的降解可通过添加去污剂如 Triton X-100 或削弱细菌细胞包膜的其他添加剂如多粘菌素 B 来增强。得到支持 特异性细胞裂解可以通过基于核酸的方法如 PCR、核酸杂交或 NASBA(基于核酸序列的扩增)、免疫学方法如 IMS、免疫荧光或 ELISA 技术,或通过不同细菌的定量来进行。其他依赖于细菌细胞内容物的方法,例如使用组或物种特异性蛋白质的酶促测定(例如,用于肠道细菌的 β-半乳糖苷酶和用于凝固酶阳性菌株的凝固酶)被用作初始步骤。用于后续细菌的特异性检测。 【0078】 在另一方面,本发明提供了本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的噬菌体,作为食品、饲料或化妆品中的抗微生物剂或作为消毒剂、宿主本发明的细胞,和/或本发明的组合物。 它们特别是食品材料、食品加工设备、食品加工厂、与食品材料接触的(无生命的)表面(例如货架和食品储藏区)、饲料材料、饲料加工设备、饲料加工厂,用于治疗或预防与饲料材料、医疗设备或医院、诊所和其他医疗设施中的(无生命)表面接触的(无生命)表面(如货架和饲料储存区)的革兰氏阴性细菌污染可用于 【0079】 下面给出附图的简要说明。 附图旨在更详细地说明本发明。 然而,并不旨在将本发明的范围限制于这些特定示例。 【图纸简要说明】 【0080】 【图1】 图1说明了本发明优选序列基序的位置要求。 该表显示了从第一组中选择的氨基酸不能存在的序列基序的位置 16 个氨基酸长(白色)到 20 个氨基酸长(深灰色)(在每个位置用“X”表示)。正在完成). 在那些位置(即标记为“X”的位置),可以仅存在选自第二组和任选的第三组的氨基酸。 更优选地,仅选自第二组的氨基酸存在于那些位置。 选自第一组序列基序的氨基酸只能出现在未标有“X”的位置。 然而,第二组和可能的第三组氨基酸也可存在于未显示的位置。 对于长度为 16、17、18、19 或 20 个氨基酸的每一个,总共提供了 18 个选项。 该表还清楚地确定了第一组三联氨基酸的可能位置(三个连续位置,没有“X”)。 对于选项 1,这将是 8-10。 相对于本发明多肽的序列基序所需的三个氨基酸区段的第一个氨基酸(即第8位)的位置-5(即位置3)、位置-4(即位置8)。 +6位(即第14位)、+7位(即第15位)和+10位(即第18位)的氨基酸不选自第一组。 在第一个选项中找不到-12、-11、-8、+13 和+14 的相对位置,因此不予考虑。 [图2a] 图 2 更详细地说明了首选序列基序的位置要求。 “X”表示序列基序在相应位置不显示选自第一组的氨基酸。 图 2a:16 个氨基酸长的序列基序的位置要求。 [图2b] 图 2b:17 个氨基酸长的序列基序的位置要求。 [图2c] 图 2c:18 个氨基酸长的序列基序的位置要求。 [图2d] 图 2d:19 个氨基酸长的序列基序的位置要求。 [图2e] 图 2e:20 个氨基酸长的序列基序的位置要求。 【例子】 【0081】 下面给出了具体的例子,它们说明了本发明的各个方面和方面。 然而,本发明的范围不受这里描述的具体实施例的限制。 实际上,除了本文描述的那些之外,本发明的各种修改对于本领域的技术人员来说从前面的描述、附图和下面的示例将变得显而易见。 所有这些修改都包含在所附权利要求的范围内。 【0082】 实施例1:将抗菌肽天蚕素A(埃及伊蚊)与本发明的序列基序匹配增加抗菌活性 天蚕素 A(埃及伊蚊),一种抗菌肽 例如,TIFF2023052138000005.tif5141 已在本领域中提出作为与细胞内溶素融合的候选物(参见 WO 2010/149792)。 然而,天蚕素 A(埃及伊蚊)与 KZ144 细胞内溶素的融合体对抗铜绿假单胞菌和大肠杆菌的效果不如 SMAP-29 肽与 KZ144 的融合体。 此外,由于天蚕素 A (埃及伊蚊) 不显示满足至少 40% 的第一组氨基酸必须存在的要求的序列基序,天蚕素 A (埃及伊蚊) 显示本发明的序列基序. 不适合 因此,发明人确定引入该组的额外氨基酸可增加抗菌活性。 【0083】 为检验该假设,我们将天蚕素 A(埃及伊蚊)与 Lys394 细胞内溶素融合,产生含有 SEQ ID NO:45 序列的融合蛋白。 同时,天蚕素 A(埃及伊蚊)肽序列在 C 端被截断并在不同位置发生突变(肽: TIFF2023052138000006.tif4128),将类似的融合蛋白与 Lys394 细胞内溶素融合。 所得融合蛋白含有序列 SEQ ID NO:32。 由于引入了额外的赖氨酸残基,修饰的天蚕素 A(埃及伊蚊)序列变得与本发明的序列基序相容。 测试了两种融合蛋白对肺炎克雷伯菌的抗菌活性。 【0084】 细菌在 (Luria-Bertani) 培养基中生长,并在 Mueller-Hinton 培养基中按 1:10 稀释。 光密度OD约0.6 ₆₀₀ 细菌在相同培养基中以 1:10 稀释,然后以 1:500 稀释。 将蛋白质缓冲液(20 mM HEPES、500 mM NaCl、pH 7.4)和蛋白质移液到 96 孔板中,最终体积为 20 μl,其中含有不同浓度的蛋白质和 500 μM EDTA 最终浓度。 将 180 μl 细菌细胞或培养基 (Muller-Hinton) 对照应用于 96 孔板并混合。 将板在37°C孵育18-22小时,并测量孔的OD600值以确定细菌生长。 测定 MIC,即与非细菌对照显示相同 OD600 值的孔的蛋白质浓度。 【0085】 (表 1) 被测融合蛋白的最低抑菌浓度 TIFF2023052138000007.tif36128 【0086】 天蚕素 A(埃及伊蚊)与 Lys394 细胞内溶素(SEQ ID NO:45)的融合体表现出抗菌活性,MIC 为 25 μg/ml。 对于包含突变天蚕素 A(埃及伊蚊)序列(SEQ ID NO:32)的融合体,MIC 低得多。 ≤5 μg/ml 表示在(最小)起始浓度下已经观察不到细菌生长。 更低的浓度尚未测试,即实际 MIC 可能甚至低于 5 μg/ml。 因此,符合本发明序列基序的天蚕素 A(埃及伊蚊)变体的设计提高了初始抗微生物肽的抗细菌活性。 【0087】 实施例 2:提高抗菌活性与细胞内溶素部分无关 为了测试抗菌活性的增加是否对实施例 1 中使用的肽和细胞内溶素的组合具有特异性,我们测试了与另一种细胞内溶素融合的相同肽,测试了 OBPgpLys(即 SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:44) . 所得多肽(SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:33)基本上如实施例1中所述进行测试,除了针对铜绿假单胞菌PAO1。 【0088】 (表2) 被测融合蛋白的最低抑菌浓度 TIFF2023052138000008.tif36128 【0089】 天蚕素 A(埃及伊蚊)与 OBPgpLys 细胞内溶素(SEQ ID NO:46)的融合体表现出抗菌活性,MIC 为 17.5 μg/ml。 含有突变天蚕素 A(埃及伊蚊)序列(SEQ ID NO:33)的融合体的 MIC 显着降低(12.5 μg/ml)。 因此,抗菌活性的提高与使用的细胞内溶素序列无关。 【0090】 实施例3:肽BMAP-28适应本发明的序列基序增加抗菌活性 导管素家族的牛肽 BMAP-28 TIFF2023052138000009.tif5128 与 KZ144 细胞内溶素 (SEQ ID NO:25) 的衍生物融合,产生含有 SEQ ID NO:48 的融合蛋白。 同时,BMAP-28 的肽序列在两个位置发生突变(肽: TIFF2023052138000010.tif4128),使类似的融合蛋白融合到 KZ144 细胞内溶素的相同衍生物(融合蛋白:SEQ ID NO:34)。 由于将两个精氨酸氨基酸引入 BMAP-28 肽的 N 端区域,其序列变得与本发明的序列基序相容。 测试了两种融合蛋白对大肠杆菌的抗菌活性。 【0091】 细菌在 (Luria-Bertani) 培养基中生长,并在 Mueller-Hinton 培养基中按 1:10 稀释。 光密度OD约0.6 ₆₀₀ 细菌在相同培养基中以 1:10 稀释,然后以 1:500 稀释。 将蛋白质缓冲液(20 mM HEPES、500 mM NaCl、pH 7.4)和蛋白质移液到 96 孔板中,使用的终体积为 20 μl,其中含有不同浓度的蛋白质和 500 μM EDTA 终浓度。 将 180 μl 细菌细胞或培养基 (Muller-Hinton) 对照应用于 96 孔板并混合。 将板在37°C孵育18-22小时,并测量孔的OD600值以确定细菌生长。 测定 MIC,即与非细菌对照显示相同 OD600 值的孔的蛋白质浓度。 【0092】 (表3) 被测融合蛋白的最低抑菌浓度 TIFF2023052138000011.tif37128 【0093】 “>30”表示对于含有原始BMAP-28肽的非突变融合蛋白(SEQ ID NO:48),在高达30μg/ml的浓度下没有观察到抗菌活性。 较高浓度下的抗菌活性是可能的,但未通过实验证实。 相比之下,对于含有突变 BMAP-28 肽片段的融合蛋白,观察到显着的抗菌活性,MIC 为 10 μg/ml。 该结果强调了发明人鉴定的序列基序的重要性,并表明相应多肽的设计将促进新抗微生物剂的产生。 【0094】 示例 4:序列基序中带正电荷的氨基酸类型并不重要 在进一步的实验中,我们使用了 MSI 78(4-20) 片段 用修饰的 MSI 78(4-20) 肽转染由 TIFF2023052138000012.tif5128 和 Lys394 细胞内溶素组成的融合蛋白(含有 SEQ ID NO:50 的融合蛋白)。 比较了其中 TIFF2023052138000013.tif4128 与 Lys394 细胞内溶素融合的类似融合蛋白(融合蛋白:SEQ ID NO:35)。 在修饰的MSI 78(4-20)肽(SEQ ID NO:13)中,MSI 78(4-20)肽的赖氨酸残基被精氨酸残基取代。 测试了两种融合蛋白对大肠杆菌的抗菌活性。 【0095】 细菌在 (Luria-Bertani) 培养基中生长,并在 Mueller-Hinton 培养基中按 1:10 稀释。 光密度OD约0.6 ₆₀₀ 细菌在相同培养基中以 1:10 稀释,然后以 1:500 稀释。 将蛋白质缓冲液(20 mM HEPES、500 mM NaCl、pH 7.4)和蛋白质移液到 96 孔板中,使用的终体积为 20 μl,其中含有不同浓度的蛋白质和 500 μM EDTA 终浓度。 将 180 μl 细菌细胞或培养基 (Muller-Hinton) 对照应用于 96 孔板并混合。 将板在37°C孵育18-22小时,并测量孔的OD600值以确定细菌生长。 测定 MIC,即与非细菌对照显示相同 OD600 值的孔的蛋白质浓度。 【0096】 (表 4) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000014.tif37128 【0097】 两种融合蛋白在基本相同的范围内表现出抗菌活性。 因此,选自本发明序列基序中第一组(例如K或R)的带正电氨基酸的类型是无关紧要的。 【0098】 实施例 5:使肽 Magainin 适应本发明的序列基序提高抗微生物活性 Magainin,一种来自非洲爪蟾的抗菌肽 TIFF2023052138000015.tif4128 与 Lys394 内溶素(SEQ ID NO:24)融合,产生含有 SEQ ID NO:52 的融合蛋白。 平行地,产生了相似的融合蛋白。 magainin 的肽序列被缩短,接头(肽: TIFF2023052138000016.tif4128)。 肽序列与 Lys394 内溶素融合(融合蛋白:SEQ ID NO:36)。 如实施例 2 中所述,测试了两种融合蛋白对铜绿假单胞菌 PAO1 细菌的抗菌活性。 【0099】 (表 5) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000017.tif37128 【0100】 “>30”再次表示对于含有原始爪蟾肽的非突变融合蛋白(SEQ ID NO:52),在高达30μg/ml的浓度下观察不到抗菌活性。 较高浓度的抗菌活性虽然可能,但未通过实验证实。 相比之下,在 MIC ≤ 5 μg/ml 时,观察到含有突变体爪蟾肽片段的融合蛋白具有显着的抗菌活性。 【0101】 实施例6:肽HPA-NT3适应本发明的序列基序增加抗菌活性 HPA-NT3,一种源自幽门螺杆菌的肽 TIFF2023052138000018.tif5128 与 KZ144 细胞内溶素 (SEQ ID NO:25) 的衍生物融合,产生含有 SEQ ID NO:54 的融合蛋白。 平行地,HPA-NT3 的肽序列适应本发明的序列基序(肽: TIFF2023052138000019.tif5128),产生了与 KZ144 细胞内溶素的相同衍生物融合的类似融合蛋白(融合蛋白:SEQ ID NO:37)。 如实施例 2 中所述,测试了两种融合蛋白对铜绿假单胞菌 PAO1 细菌的抗菌活性。 【0102】 (表 6) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000020.tif37128 【0103】 “>18”表示对于含有原始HPA-NT3肽的非突变融合蛋白(SEQ ID NO:54),在高达18μg/ml的浓度下观察不到抗菌活性。 较高浓度的抗菌活性虽然可能,但未通过实验证实。 相反,对于含有突变HPA-NT3肽(SEQ ID NO:15)的融合蛋白,观察到抗菌活性,MIC为12.5μg/ml。 因此,使抗微生物肽适应本发明的基序增加了融合蛋白的抗微生物活性。 【0104】 实施例 7:从石霉毒素序列基序开始的人工抗微生物肽的从头生成 为了进一步确认已识别序列基序的适用性,我们试图将以前未知的具有抗菌活性的肽序列作为与细胞内溶素融合的有用肽序列。我做出了努力。 为此,我们使用了 stonatoxin α 亚基的氨基酸 298-326。 我求助于 TIFF2023052138000021.tif5128。 Stonustoxin 是叶石鱼毒液的一种成分。 这种毒药的影响包括剧痛、休克、麻痹和组织死亡。 然而,抗微生物活性是未知的。 【0105】 SEQ ID NO:55 与 KZ144 细胞内溶素的衍生物融合,产生含有 SEQ ID NO:56 的融合蛋白。 同时,石鱼序列在不同位置发生突变(肽: TIFF2023052138000022.tif4128),产生了与 KZ144 细胞内溶素的相同衍生物融合的类似融合蛋白(融合蛋白:SEQ ID NO:38)。 由于 stonefish 序列中几个氨基酸的交换,该序列的前 18 个氨基酸现在符合本发明的序列基序。 具体而言,序列基序中带正电荷的氨基酸的百分比增加(通过赖氨酸和精氨酸残基)并去除脯氨酸残基。 测试了两种融合蛋白对铜绿假单胞菌的抗菌活性。 【0106】 细菌在 (Luria-Bertani) 培养基中生长,并在 Mueller-Hinton 培养基中按 1:10 稀释。 光密度OD约0.6 ₆₀₀ 细菌在相同培养基中以 1:10 稀释,然后以 1:500 稀释。 将蛋白质缓冲液(20 mM HEPES、500 mM NaCl、pH 7.4)和蛋白质移液到 96 孔板中,使用的终体积为 20 μl,其中含有不同浓度的蛋白质和 500 μM EDTA 终浓度。 将 180 μl 细菌细胞或培养基 (Muller-Hinton) 对照应用于 96 孔板并混合。 将板在37°C孵育18-22小时,并测量孔的OD600值以确定细菌生长。 测定 MIC,即与非细菌对照显示相同 OD600 值的孔的蛋白质浓度。 【0107】 (表 7) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000023.tif37128 【0108】 >91,对于含有第一个石毒素肽(SEQ ID NO:55)的非突变融合蛋白(SEQ ID NO:56),浓度高达 91 μg/ml 时未观察到抗菌活性,这意味着 虽然不能排除较高浓度下的抗菌活性,但未进行测试。 这是意料之中的,因为融合中使用的石毒素片段的抗微生物活性未知,并且单独的 KZ144 细胞内溶素原则上对铜绿假单胞菌无活性。 相比之下,对于含有突变的石毒素肽片段的融合蛋白,观察到意外的从头抗菌活性,MIC 低至 17。 该结果强调了发明人鉴定的序列基序的重要性,并表明每种多肽的设计都有助于产生新的抗微生物剂。 【0109】 实施例 8:从 CagL 蛋白的序列基序开始重新生成工程化抗微生物肽 我们发现了幽门螺杆菌 CagL 蛋白的第 26-48 位氨基酸 基于 TIFF2023052138000024.tif4128 生成了两种额外的从头抗菌肽。 CagL 蛋白是幽门螺杆菌的一种特殊粘附素,靶向纤毛表面,在那里它与整合素 α5β1 结合并介导受体依赖性 CagA 蛋白向胃上皮细胞的递送。 抗菌活性尚未见报道。 【0110】 SEQ ID NO:57 与 KZ144 细胞内溶素的衍生物融合,产生含有 SEQ ID NO:58 的融合蛋白。 同时,两个相似的融合蛋白(肽 1:含有 C 末端接头 TIFF2023052138000025.tif4128;肽 2: TIFF2023052138000026.tif4128) 已创建。 这些肽与 KZ144 细胞内溶素的相同衍生物融合(融合蛋白:SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40)。 如实施例 2 中所述,测试了两种融合蛋白对铜绿假单胞菌的抗菌活性。 【0111】 (表8) 被测融合蛋白的最低抑菌浓度 TIFF2023052138000027.tif32128 【0112】 >90 表示对于含有第一个 CagL 肽(SEQ ID NO:57)的非突变融合蛋白(SEQ ID NO:58),在浓度高达 90 μg/ml 时没有观察到抗微生物活性。 这是意料之中的,因为融合中使用的 CagL 片段没有已知的抗菌活性,并且单独的 KZ144 细胞内溶素对铜绿假单胞菌没有活性。 相比之下,对于含有突变 CagL 肽片段的两种融合蛋白,在低至 12.5 μg/ml 和 15 μg/ml 的 MIC 下观察到意想不到的从头抗菌活性。 【0113】 实施例 9:从 IE1 蛋白的序列基序开始重新生成工程化抗微生物肽 以下从头抗菌肽是 IE1 蛋白的氨基酸 178-198 基于 TIFF2023052138000028.tif4128 创建。 IE1 来源于人巨细胞病毒,具有未知的抗菌活性。 【0114】 SEQ ID NO:59再次与KZ144细胞内溶素的衍生物融合,产生含有SEQ ID NO:60的融合蛋白。 同时,IE1 序列在不同位置发生突变(肽: TIFF2023052138000029.tif4128),产生了与 KZ144 细胞内溶素的相同衍生物融合的融合蛋白(融合蛋白:SEQ ID NO:41)。 如实施例 2 中所述,测试了两种融合蛋白对铜绿假单胞菌的抗菌活性。 【0115】 (表 9) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000030.tif37128 【0116】 >30 表示对于包含第一个 IE1 肽(SEQ ID NO:59)的非突变融合蛋白(SEQ ID NO:60),在浓度高达 30 μg/ml 时没有观察到抗微生物活性。 不能排除较高浓度下的抗菌活性,但未进行测试且预计不会,因为融合中使用的 IE1 片段的抗菌活性未知。 相反,对于含有突变 IE1 肽片段的融合蛋白,在 15-20 μg/ml 的 MIC 下观察到意想不到的从头抗菌活性。 【0117】 实施例10:包含含有本发明序列基序的肽的额外融合蛋白的产生 我们还生成了包含 SEQ ID NO:42 序列的另一种融合蛋白。 融合蛋白包含与本发明相容的肽(SEQ ID NO:20)。 如实施例 2 中所报告的,测试了该融合蛋白对铜绿假单胞菌的抗菌活性。 【0118】 (表 10) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000031.tif41128 【0119】 对于含有新型肽的融合蛋白,在 MIC <5 μg/ml 时观察到显着的抗菌活性。 【0120】 实施例 11 产生含有含有本发明序列基序的肽的融合蛋白的其他变体 我们已生成含有与本发明基序匹配的肽的额外融合蛋白(SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:64、:65、SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68)。 测试了这些融合蛋白对大肠杆菌的抗菌活性。 【0121】 (表 11) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000032.tif53131 【0122】 观察到所有融合蛋白的抗菌活性。 【0123】 实施例12:Briers等人的肽MW2适应本发明的序列基序 Briers 等人 (MBio.2014;5(4):e01379-14) 报道了各种融合蛋白的生成,尤其包括肽 MW2(SEQ ID NO:69)。 该肽不符合本发明的序列基序。 从该肽开始,我们制备了包含该肽和KZ144细胞内溶素(SEQ ID NO:25)的衍生物的融合蛋白,产生了根据SEQ ID NO:70的融合蛋白。 此外,发明人已经产生了 SEQ ID NO:69 的肽的许多衍生物(SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74)。 MW2 不匹配本发明的序列基序,但这些衍生物匹配。 所得融合蛋白在 SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77 和 SEQ ID NO:78 中提供。 如实施例 2 中所述,测试了这些融合蛋白对铜绿假单胞菌 PAO1 细菌的抗菌活性。 【0124】 (表12)测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000033.tif32158 【0125】 观察到所有融合蛋白的抗菌活性。 值得注意的是,基于 MW2 肽的四种衍生物(即适应本发明的序列基序)的融合蛋白显示出改进的抗菌活性。 【0126】 实施例 13:magainin,一种肽与额外的肽聚糖水解酶的组合的用途 发明人还将实施例5的两种肽与额外的肽聚糖水解酶、弧菌噬菌体ICP1尾底板蛋白(SEQ ID NO:27)组合。 得到的融合蛋白包含 SEQ ID NO:79 和 SEQ ID NO:43 的序列。 测试了这些融合蛋白对大肠杆菌的抗菌活性。 【0127】 (表 13) 测试的融合蛋白的最低抑制浓度 TIFF2023052138000034.tif37128 【0128】 所有得到的融合蛋白都表现出抗菌活性。 同样,与本发明的序列基序匹配的肽(SEQ ID NO:14)提供优于野生型肽(SEQ ID NO:51)的活性。 【0129】 实施例 14:额外的肽 在最后一组实验中,我们产生了三种额外的融合蛋白,每种都含有细胞内溶素序列和与本发明的序列基序匹配的肽。 三种肽是SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。 所有三种所得融合蛋白均表现出出色的抗菌活性。 【0130】 序列信息 序列表 <110> 萨西纳帕斯有限公司 <120>修饰肽 <150>PCT/IB2016/057193 <151> 2016-11-30 <160> 79 <170> 专利在版本 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213>未知 <220> <223>SMAP-29绵羊 <400> 1 Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly 20 25 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 序列,它不是序列基序的一部分,如果 序列基序包含至少三个不相邻的组氨酸 残留物 <400> 2 阿拉阿拉亮氨酸 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 氨基酸序列内成对阻断的例子 第一组 <400> 3 Leu Lys Arg Glu 1个 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 氨基酸序列内三联体嵌段的例子 第一组 <400> 4 Leu Lys Arg Lys Glu 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 第一个氨基酸的 N 端三联体嵌段示例 团体 <400> 5 赖氨酸精氨酸赖氨酸谷氨酸 1个 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 第一个氨基酸的 C 端三联体嵌段示例 团体 <400> 6 亮氨酸赖氨酸精氨酸赖氨酸 1个 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 从序列基序中排除的序列示例,如果 第一组氨基酸的三联体存在 <400> 7 Arg Arg Arg Gly Leu Arg His 1 5 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 序列基序中不允许的序列示例 <400> 8 赖氨酸精氨酸赖氨酸赖氨酸 1个 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 序列基序中不允许的序列示例 <400> 9 精氨酸 精氨酸 精氨酸 1个 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213>未知 <220> <223> SMAP-29 绵羊;aa1-18 <400> 10 Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys 1 5 10 15 酪氨酸 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 来自天蚕素 A(埃及伊蚊)的突变肽 <400> 11 Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Lys Lys Ala Gly Lys Arg 1 5 10 15 Val Phe Lys Ala Ala Lys Lys Ala Leu 20 25 <210> 12 <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自 BMAP-28 的突变肽 <400> 12 Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Ile Ile Val Pro Ile Arg Ile Gly 20 25 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自 MSI-78 (4-20) 肽的突变肽 <400> 13 Arg Phe Leu Arg Arg Ala Arg Arg Phe Gly Arg Ala Phe Val Arg Ile 1 5 10 15 亮氨酸 <210> 14 <211> 26 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 来自杂志蛋白的突变肽 <400> 14 甘氨酸 Ile Lys Lys Phe Leu Lys Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Lys Lys Val Ile Arg Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自HPA-NT3肽的突变肽 <400> 15 Lys Arg Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Ile Trp Lys Trp Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Pro 甘氨酸血清 20 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自 α 氨基酸 298-326 的突变肽 石霉毒素亚单位 <400> 16 Ile Lys Leu Ile Lys Arg Val Ile Lys Lys Phe Lys Lys Ile Phe Arg 1 5 10 15 Lys Tyr Pro Leu Thr Val Lys Lys Gly Ile Ala Val Gly 20 25 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自CagL蛋白的氨基酸26-48的突变肽 <400> 17 Gly Leu Lys Lys Leu Lys Arg Val Tyr Arg Lys Trp Val Lys Ala Val 1 5 10 15 Lys Lys Val Leu Lys Leu Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自CagL蛋白的氨基酸26-48的突变肽 <400> 18 Gly Leu Lys Val Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Ile Arg Lys Ala Val 1 5 10 15 Arg Lys Ile Leu Lys Ala 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> IE1蛋白178-198位氨基酸衍生的突变肽 <400> 19 Tyr Lys Arg Ala Phe Lys Lys Val Leu Lys Arg Ile Arg Arg Tyr Ala 1 5 10 15 赖氨酸精氨酸 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 20 Gly Phe Phe Lys Lys Ala Trp Arg Lys Val Lys His Ala Gly Arg Arg 1 5 10 15 Val Leu Lys Thr Ala Lys Gly Val 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213>未知 <220> <223> CAP18AA <400> 21 Gly Leu Arg Lys Ala Leu Arg Lys Phe Arg Asn Lys Ile Lys Glu Ala 1 5 10 15 亮氨酸赖氨酸赖氨酸Ile 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 22 Gly Leu Arg Lys Ala Leu Arg Lys Phe Arg Lys Lys Ile Lys Glu Ala 1 5 10 15 亮氨酸赖氨酸赖氨酸Ile 20 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 23 Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala Arg Gly Val Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly 20 25 <210> 24 <211> 136 <212> PRT <213>未知 <220> <223> S394 细胞内溶素,不含 N-末端甲硫氨酸 <400> 24 Ser Phe Lys Phe Gly Lys Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val Lys 1 5 10 15 Pro Glu Leu Gln Lys Val Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro Tyr 20 25 30 Asp Phe Thr Ile Val Gln Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala Gln 35 40 45 Asn Ile Ala Asn Gly Thr Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser Lys 50 55 60 His Val Thr Gly Asp Ala Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly Lys 65 70 75 80 Ile Asp Trp Lys Asp Leu Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala Phe 85 90 95 Glu Gln Ala Gly Lys Glu Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Ala Asp 100 105 110 Trp Asn Ser Ser Gly Asp Tyr His Asp Glu Ile Asp Arg Gly Thr Tyr 115 120 125 Asp Gly Gly His Val Glu Leu Val 130 135 <210> 25 <211>259 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 用 C14S、C23S 和 C50S 突变的 KZ144,没有 N 端 甲硫氨酸 <400> 25 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln 1 5 10 15 Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile 20 25 30 Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn 35 40 45 Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 50 55 60 Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro 65 70 75 80 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 85 90 95 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 100 105 110 Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 115 120 125 Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu 130 135 140 Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu 145 150 155 160 Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys 165 170 175 Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp 180 185 190 Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg 195 200 205 Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys 210 215 220 Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 225 230 235 240 Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 245 250 255 他的精氨酸赖氨酸 <210> 26 <211> 327 <212> PRT <213>未知 <220> <223> OBPgpLYS片段 <400> 26 Lys Asn Ser Glu Lys Asn Ala Ser Ile Ile Met Ser Ile Gln Arg Thr 1 5 10 15 Leu Ala Ser Leu Ser Leu Tyr Gly Gly Arg Ile Asp Gly Leu Phe Gly 20 25 30 Glu Lys Cys Arg Gly Ala Ile Ile Leu Met Leu Asn Lys Val Tyr Pro 35 40 45 Asn Phe Ser Thr Asn Lys Leu Pro Ser Asn Thr Tyr Glu Ala Glu Ser 50 55 60 Val Phe Thr Phe Leu Gln Thr Ala Leu Ala Gly Val Gly Leu Tyr Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ile Asp Gly Lys Trp Gly Gly Thr Ser Gln Gly Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Val Lys Ser Tyr Arg Gln Ile Thr Glu Ala Glu Arg Ala Gly 100 105 110 Ser Thr Leu Pro Leu Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Lys His Met Ser 115 120 125 Ile Glu Gln Leu Arg Ala Met Leu Pro Thr Asp Arg Gln Gly Tyr Ala 130 135 140 Glu Val Tyr Ile Asp Pro Leu Asn Glu Thr Met Asp Ile Phe Glu Ile 145 150 155 160 Asn Thr Pro Leu Arg Ile Ala His Phe Met Ala Gln Ile Leu His Glu 165 170 175 Thr Ala Cys Phe Lys Tyr Thr Glu Glu Leu Ala Ser Gly Lys Ala Tyr 180 185 190 Glu Gly Arg Ala Asp Leu Gly Asn Thr Arg Pro Gly Asp Gly Pro Leu 195 200 205 Phe Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gln Ile Thr Gly Arg Leu Asn Tyr Val 210 215 220 Lys Cys Gln Val Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Lys Asp Pro Thr Phe Asp 225 230 235 240 Ile Thr Ser Ser Val Thr Cys Ala Gln Gln Leu Ser Glu Ser Pro Leu 245 250 255 Leu Ala Ala Leu Ala Ser Gly Tyr Phe Trp Arg Phe Ile Lys Pro Lys 260 265 270 Leu Asn Glu Thr Ala Asp Lys Asp Asp Ile Tyr Trp Val Ser Val Tyr 275 280 285 Val Asn Gly Tyr Ala Lys Gln Ala Asn Pro Tyr Tyr Pro Asn Arg Asp 290 295 300 Lys Glu Pro Asn His Met Lys Glu Arg Val Gln Met Leu Ala Val Thr 305 310 315 320 Lys Lys Ala Leu Gly Ile Val 325 <210> 27 <211>237 <212> PRT <213>未知 <220> <223> 无N端弧菌噬菌体ICP1尾底板蛋白 甲硫氨酸 <400> 27 Ile Leu Lys Arg Gly Ser Ser Gly Ala Asp Val Lys Asn Met Gln Glu 1 5 10 15 Tyr Leu Thr Ala Leu Gly Tyr Asp Thr Lys Gly Val Gly Gly Thr Phe 20 25 30 Glu Gly Gly Thr Glu Ser Ala Val Lys Ala Phe Gln Lys Asp Met Ser 35 40 45 Phe Thr Val Val Asp Gly Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ala Lys His Leu 50 55 60 Val Asp Met Tyr Tyr Gly Lys Val Val Pro Phe Gly Tyr Val Thr Asn 65 70 75 80 Thr Pro Trp Val Ser Glu Ala Ile Glu Asp Tyr Phe Val Ser Glu Ile 85 90 95 Lys Gly Glu Lys His Asn Pro Arg Val Val Gln Tyr Phe Lys Asp Ala 100 105 110 他的 Ser Ser Trp Phe Thr Asp Asp Glu Thr Pro Trp Cys Ala Ala Ala 115 120 125 Val Ser Ser Trp Leu Glu Arg Ala Gly Ile Arg Ser Val Arg Ser Ala 130 135 140 Arg Ala Arg Asp His Ile Asn Phe Gly Thr Lys Leu Leu Glu Pro Arg 145 150 155 160 Phe Gly Ala Ile Val Val Leu Glu Arg Gly Asn Ser Gly His Val 165 170 175 Gly Phe Val Asn Gly Val Thr Ala Asp Gly Lys Gln Ile Lys Val Leu 180 185 190 Gly Gly Asn Gln Ser Asp Ser Val Asn Glu Arg Met Phe Gln Val Thr 195 200 205 Arg Val Leu Gly Tyr Arg Gln Pro Glu Gly Phe Val Leu Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ile Val Gly Lys Gly Glu Leu Ser Lys Ser Glu Ala 225 230 235 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 链接器 <400> 28 甘氨酸丙氨酸 1个 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 链接器 <400> 29 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 链接器 <400> 30 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 组氨酸标签 (6x) <400> 31 他的他的他的他的他的他的 1 5 <210> 32 <211> 169 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自天蚕素 A(埃及伊蚊)的突变肽与 S394细胞内溶素 <400> 32 Met Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Lys Lys Ala Gly Lys 1 5 10 15 Arg Val Phe Lys Ala Ala Lys Lys Ala Leu Gly Gly Gly Ser Gly Ser 20 25 30 Met Ser Phe Lys Phe Gly Lys Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val 35 40 45 Lys Pro Glu Leu Gln Lys Val Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro 50 55 60 Tyr Asp Phe Thr Ile Val Gln Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala 65 70 75 80 Gln Asn Ile Ala Asn Gly Thr Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser 85 90 95 Lys His Val Thr Gly Asp Ala Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly 100 105 110 Lys Ile Asp Trp Lys Asp Leu Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala 115 120 125 Phe Glu Gln Ala Gly Lys Glu Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Ala 130 135 140 Asp Trp Asn Ser Ser Gly Asp Tyr His Asp Glu Ile Asp Arg Gly Thr 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Gly His Val Glu Leu Val 165 <210> 33 <211> 355 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自天蚕素 A(埃及伊蚊)的突变肽与 OBP gp 赖氨酸细胞内溶素 <400> 33 Met Arg Gly Leu Lys Lys Leu Gly Arg Lys Leu Lys Lys Ala Gly Lys 1 5 10 15 Arg Val Phe Lys Ala Ala Lys Lys Ala Leu Gly Ser Lys Asn Ser Glu 20 25 30 Lys Asn Ala Ser Ile Ile Met Ser Ile Gln Arg Thr Leu Ala Ser Leu 35 40 45 Ser Leu Tyr Gly Gly Arg Ile Asp Gly Leu Phe Gly Glu Lys Cys Arg 50 55 60 Gly Ala Ile Ile Leu Met Leu Asn Lys Val Tyr Pro Asn Phe Ser Thr 65 70 75 80 Asn Lys Leu Pro Ser Asn Thr Tyr Glu Ala Glu Ser Val Phe Thr Phe 85 90 95 Leu Gln Thr Ala Leu Ala Gly Val Gly Leu Tyr Thr Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Trp Gly Gly Thr Ser Gln Gly Ala Ile Asp Ala Leu Val Lys 115 120 125 Tyr Arg Gln Ile Thr Glu Ala Glu Arg Ala Gly Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Leu Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Lys His Met Ser Ile Glu Gln Leu 145 150 155 160 Arg Ala Met Leu Pro Thr Asp Arg Gln Gly Tyr Ala Glu Val Tyr Ile 165 170 175 Asp Pro Leu Asn Glu Thr Met Asp Ile Phe Glu Ile Asn Thr Pro Leu 180 185 190 Arg Ile Ala His Phe Met Ala Gln Ile Leu His Glu Thr Ala Cys Phe 195 200 205 Lys Tyr Thr Glu Glu Leu Ala Ser Gly Lys Ala Tyr Glu Gly Arg Ala 210 215 220 Asp Leu Gly Asn Thr Arg Pro Gly Asp Gly Pro Leu Phe Lys Gly Arg 225 230 235 240 Gly Leu Leu Gln Ile Thr Gly Arg Leu Asn Tyr Val Lys Cys Gln Val 245 250 255 Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Lys Asp Pro Thr Phe Asp Ile Thr Ser Ser 260 265 270 Val Thr Cys Ala Gln Gln Leu Ser Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Leu 275 280 285 Ala Ser Gly Tyr Phe Trp Arg Phe Ile Lys Pro Lys Leu Asn Glu Thr 290 295 300 Ala Asp Lys Asp Asp Ile Tyr Trp Val Ser Val Tyr Val Asn Gly Tyr 305 310 315 320 Ala Lys Gln Ala Asn Pro Tyr Tyr Pro Asn Arg Asp Lys Glu Pro Asn 325 330 335 His Met Lys Glu Arg Val Gln Met Leu Ala Val Thr Lys Lys Ala Leu 340 345 350 甘岛谷 355 <210> 34 <211> 290 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自与突变 KZ144 相关的 BMAP-28 的突变肽 带 C14S、C23S 和 C50S <400> 34 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Gly Pro Ile Ile Val Pro Ile Ile Arg Ile Gly Gly Ser Lys 20 25 30 Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr 35 40 45 Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe 50 55 60 Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser 65 70 75 80 Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe 85 90 95 Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr 100 105 110 Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu 115 120 125 Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile 130 135 140 Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr 145 150 155 160 Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn 165 170 175 Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg 180 185 190 Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu 195 200 205 Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr 210 215 220 Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe 225 230 235 240 Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu 245 250 255 Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys 260 265 270 Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His 275 280 285 精氨酸赖氨酸 290 <210> 35 <211> 162 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自 MSI-78 (4-20) 肽的突变肽连接至 S394细胞内溶素 <400> 35 Met Arg Phe Leu Arg Arg Ala Arg Arg Phe Gly Arg Ala Phe Val Arg 1 5 10 15 Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Ser Phe Lys Phe Gly Lys 20 25 30 Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val Lys Pro Glu Leu Gln Lys Val 35 40 45 Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro Tyr Asp Phe Thr Ile Val Gln 50 55 60 Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala Gln Asn Ile Ala Asn Gly Thr 65 70 75 80 Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser Lys His Val Thr Gly Asp Ala 85 90 95 Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly Lys Ile Asp Trp Lys Asp Leu 100 105 110 Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala Phe Glu Gln Ala Gly Lys Glu 115 120 125 Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Ala Asp Trp Asn Ser Ser Gly Asp 130 135 140 Tyr His Asp Gly Ile Asp Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly His Val Glu 145 150 155 160 亮氨酸 <210> 36 <211> 166 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自与 S394 连接的 magain 肽的突变肽 细胞内溶素 <400> 36 Met Gly Ile Lys Lys Phe Leu Lys Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala 1 5 10 15 Phe Lys Lys Val Ile Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Ser Phe 20 25 30 Lys Phe Gly Lys Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val Lys Pro Glu 35 40 45 Leu Gln Lys Val Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro Tyr Asp Phe 50 55 60 Thr Ile Val Gln Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala Gln Asn Ile 65 70 75 80 Ala Asn Gly Thr Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser Lys His Val 85 90 95 Thr Gly Asp Ala Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly Lys Ile Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Leu Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala Phe Glu Gln 115 120 125 Ala Gly Lys Glu Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Asp Trp Asn 130 135 140 Ser Ser Gly Asp Tyr His Asp Glu Ile Asp Arg Gly Thr Tyr Asp Gly 145 150 155 160 Gly His Val Glu Leu Val 165 <210> 37 <211>282 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自 HPA-NT3 肽的突变肽连接到突变 带 C14S、C23S 和 C50S 的 KZ144 <400> 37 Met Lys Arg Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Ile Trp Lys Trp Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Pro Gly Ser Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly 20 25 30 Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp 35 40 45 Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val 50 55 60 Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly 65 70 75 80 Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro 85 90 95 Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala 丙氨酸 100 105 110 Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln 115 120 125 Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile 130 135 140 Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly 145 150 155 160 Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu 165 170 175 Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu 180 185 190 Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val 195 200 205 Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe 210 215 220 Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Gly Gln Asn Glu Leu 225 230 235 240 Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe 245 250 255 Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu 260 265 270 Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 38 <211>291 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自 α 氨基酸 298-326 的突变肽 stonustoxin 亚基与突变的 KZ144 和 C14S、C23S 相连 和C50S <400> 38 Met Ile Lys Leu Ile Lys Arg Val Ile Lys Lys Phe Lys Lys Ile Phe 1 5 10 15 Arg Lys Tyr Pro Leu Thr Val Lys Lys Gly Ile Ala Val Gly Gly Ser 20 25 30 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile 50 55 60 Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 85 90 95 Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro 100 105 110 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 115 120 125 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 130 135 140 Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 145 150 155 160 Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu 165 170 175 Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu 180 185 190 Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys 195 200 205 Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg 225 230 235 240 Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys 245 250 255 Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 260 265 270 Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 275 280 285 他的精氨酸赖氨酸 290 <210> 39 <211>289 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自CagL蛋白的氨基酸26-48的突变肽 与带有 C14S、C23S 和 C50S 的突变 KZ144 相关联 <400> 39 Met Gly Leu Lys Lys Leu Lys Arg Val Tyr Arg Lys Trp Val Lys Ala 1 5 10 15 Val Lys Lys Val Leu Lys Leu Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Val 20 25 30 Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu 35 40 45 Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly 50 55 60 Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu 65 70 75 80 Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser 85 90 95 Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala 100 105 110 Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn 115 120 125 Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu 130 135 140 Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly 145 150 155 160 Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr 165 170 175 Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys 180 185 190 Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn 195 200 205 Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp 210 215 220 Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu 225 230 235 240 Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala 245 250 255 Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr 260 265 270 Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg 275 280 285 赖氨酸 <210> 40 <211>284 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 源自CagL蛋白的氨基酸26-48的突变肽 与带有 C14S、C23S 和 C50S 的突变 KZ144 相关联 <400> 40 Met Gly Leu Lys Val Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Ile Arg Lys Ala 1 5 10 15 Val Arg Lys Ile Leu Lys Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp 20 25 30 Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly 35 40 45 Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn 50 55 60 Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile 65 70 75 80 Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Pro 85 90 95 Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala 100 105 110 Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr 130 135 140 Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu 145 150 155 160 Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly 165 170 175 Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser 180 185 190 Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg 195 200 205 Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His 210 215 220 Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn 225 230 235 240 Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser 245 250 255 Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr 260 265 270 Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 41 <211>281 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> IE1蛋白178-198位氨基酸衍生的突变肽 与带有 C14S、C23S 和 C50S 的突变 KZ144 相关联 <400> 41 Met Tyr Lys Arg Ala Phe Lys Lys Val Leu Lys Arg Ile Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Ala Lys Arg Ser Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp 20 25 30 Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val 35 40 45 Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val 瓦尔 50 55 60 Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys 65 70 75 80 Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr 85 90 95 Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr 100 105 110 Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu 115 120 125 Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys 130 135 140 Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr 145 150 155 160 Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr 165 170 175 Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met 180 185 190 Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu 195 200 205 Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly 210 215 220 Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala 225 230 235 240 Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met 260 265 270 Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 42 <211> 168 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 42 Met Gly Phe Phe Lys Lys Ala Trp Arg Lys Val Lys His Ala Gly Arg 1 5 10 15 Arg Val Leu Lys Thr Ala Lys Gly Val Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met 20 25 30 Ser Phe Lys Phe Gly Lys Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val Lys 35 40 45 Pro Glu Leu Gln Lys Val Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro Tyr 50 55 60 Asp Phe Thr Ile Val Gln Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala Gln 65 70 75 80 Asn Ile Ala Asn Gly Thr Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser Lys 85 90 95 His Val Thr Gly Asp Ala Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly Lys 100 105 110 Ile Asp Trp Lys Asp Leu Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala Phe 115 120 125 Glu Gln Ala Gly Lys Glu Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Ala Asp 130 135 140 Trp Asn Ser Ser Gly Asp Tyr His Asp Glu Ile Asp Arg Gly Thr Tyr 145 150 155 160 Asp Gly Gly His Val Glu Leu Val 165 <210> 43 <211>267 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 衍生自连接到尾部的 magain 肽的突变肽 弧菌噬菌体 ICP1 底板蛋白 <400> 43 Met Gly Ile Lys Lys Phe Leu Lys Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala 1 5 10 15 Phe Lys Lys Val Ile Arg Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Ile Leu 20 25 30 Lys Arg Gly Ser Ser Gly Ala Asp Val Lys Asn Met Gln Glu Tyr Leu 35 40 45 Thr Ala Leu Gly Tyr Asp Thr Lys Gly Val Glu Gly Thr Phe Glu Gly 50 55 60 Gly Thr Glu Ser Ala Val Lys Ala Phe Gln Lys Asp Met Ser Phe Thr 65 70 75 80 Val Val Asp Gly Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ala Lys His Leu Val Asp 85 90 95 Met Tyr Tyr Gly Lys Val Val Pro Phe Gly Tyr Val Thr Asn Thr Pro 100 105 110 Trp Val Ser Glu Ala Ile Glu Asp Tyr Phe Val Ser Glu Ile Lys Gly 115 120 125 Glu Lys His Asn Pro Arg Val Val Gln Tyr Phe Lys Asp Ala His Ser 130 135 140 Ser Trp Phe Thr Asp Asp Glu Thr Pro Trp Cys Ala Ala Ala Val Ser 145 150 155 160 Ser Trp Leu Glu Arg Ala Gly Ile Arg Ser Val Arg Ser Ala 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Phe Gly Glu Lys Cys Arg Gly Ala Ile Ile Leu 65 70 75 80 Met Leu Asn Lys Val Tyr Pro Asn Phe Ser Thr Asn Lys Leu Pro Ser 85 90 95 Asn Thr Tyr Glu Ala Glu Ser Val Phe Thr Phe Leu Gln Thr Ala Leu 100 105 110 Ala Gly Val Gly Leu Tyr Thr Ile Thr Ile Asp Gly Lys Trp Gly Gly 115 120 125 Thr Ser Gln Gly Ala Ile Asp Ala Leu Val Lys Ser Tyr Arg Gln Ile 130 135 140 Thr Glu Ala Glu Arg Ala Gly Ser Thr Leu Pro Leu Gly Leu Ala Thr 145 150 155 160 Val Met Ser Lys His Met Ser Ile Glu Gln Leu Arg Ala Met Leu Pro 165 170 175 Thr Asp Arg Gln Gly Tyr Ala Glu Val Tyr Ile Asp Pro Leu Asn Glu 180 185 190 Thr Met Asp Ile Phe Glu Ile Asn Thr Pro Leu Arg Ile Ala His Phe 195 200 205 Met Ala Gln Ile Leu His Glu Thr Ala Cys Phe Lys Tyr Thr Glu Glu 210 215 220 Leu Ala Ser Gly Lys Ala Tyr Glu Gly Arg Ala Asp Leu Gly Asn Thr 225 230 235 240 Arg Pro Gly Asp Gly Pro Leu Phe Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gln Ile 245 250 255 Thr Gly Arg Leu Asn Tyr Val Lys Cys Gln Val Tyr Leu Arg Glu Lys 260 265 270 Leu Lys Asp Pro Thr Phe Asp 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Phe 50 55 60 Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser 65 70 75 80 Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe 85 90 95 Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr 100 105 110 Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu 115 120 125 Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile 130 135 140 Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr 145 150 155 160 Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn 165 170 175 Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg 180 185 190 Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu 195 200 205 Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr 210 215 220 Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe 225 230 235 240 Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu 245 250 255 Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys 260 265 270 Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His 275 280 285 精氨酸赖氨酸 290 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> MSI-78 (4-20) 肽 <400> 49 Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Lys Ile 1 5 10 15 亮氨酸 <210> 50 <211> 162 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 与 S394 内溶素连接的 MSI-78 (4-20) 肽 <400> 50 Met Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Lys 1 5 10 15 Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Ser Phe Lys Phe Gly Lys 20 25 30 Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val Lys Pro Glu Leu Gln Lys Val 35 40 45 Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro Tyr Asp Phe Thr Ile Val Gln 50 55 60 Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala Gln Asn Ile Ala Asn Gly Thr 65 70 75 80 Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser Lys His Val Thr Gly Asp Ala 85 90 95 Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly Lys Ile Asp Trp Lys Asp Leu 100 105 110 Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala Phe Glu Gln Ala Gly Lys Glu 115 120 125 Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Ala Asp Trp Asn Ser Ser Gly Asp 130 135 140 Tyr His Asp Gly Ile Asp Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly His Val Glu 145 150 155 160 亮氨酸 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213>非洲爪蟾 <400> 51 Gly Ile Gly Lys Phe Leu 他的 Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Val Gly Glu Ile Met Asn Ser 20 <210> 52 <211> 163 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 与 S394 细胞内溶素连接的 Magainin 肽 <400> 52 Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu 他的 Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala 1 5 10 15 Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Ser Met Ser Phe Lys Phe Gly 20 25 30 Lys Asn Ser Glu Lys Gln Leu Ala Thr Val Lys Pro Glu Leu Gln Lys 35 40 45 Val Ala Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Pro Tyr Asp Phe Thr Ile Val 50 55 60 Gln Gly Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Ala Gln Asn Ile Ala Asn Gly 65 70 75 80 Thr Ser Phe Leu Lys Asp Pro Ser Lys Ser Lys His Val Thr Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Asp Phe Ala Pro Tyr Ile Asn Gly Lys Ile Asp Trp Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Lys Ala Phe Glu Gln Ala Gly Lys 115 120 125 Glu Leu Gly Ile Lys Leu Arg Phe Gly Asp Trp Asn Ser Ser Gly 130 135 140 Asp Tyr His Asp Glu Ile Asp Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly His Val 145 150 155 160 谷氨酸 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213>幽门螺杆菌 <400> 53 Phe Lys Arg Leu Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Trp Asn Trp Lys 1 5 10 15 <210> 54 <211>277 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 与突变的 KZ144 连接的 HPA-NT3 肽的氨基酸 XXX C14S、C23S 和 C50S <400> 54 Met Phe Lys Arg Leu Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Trp Asn Trp Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln 20 25 30 Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp 35 40 45 Gly Ile Phe Gly Asn Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys 50 55 60 Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala 65 70 75 80 Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro 85 90 95 Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn 100 105 110 Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe 115 120 125 Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser 130 135 140 Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met 145 150 155 160 Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly 165 170 175 Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu 180 185 190 Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro 195 200 205 Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala 他的 Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala 210 215 220 Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe 225 230 235 240 Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly 245 250 255 Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val 260 265 270 阿拉阿拉他精氨酸赖氨酸 275 <210> 55 <211> 29 <212> PRT <213> 紫锥菊 <400> 55 Ile Pro Leu Ile His Asp Lys Ile Ser Asn Phe Gln Gln Ile Phe Gln 1 5 10 15 Asp Tyr Met Leu Thr Val Gln Lys Lys Ile Ala Glu Lys 20 25 <210> 56 <211>291 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> stonustoxin α 亚基的氨基酸 298-326 连接至 用 C14S、C23S 和 C50S 突变的 KZ144 <400> 56 Met Ile Pro Leu Ile His Asp Lys Ile Ser Asn Phe Gln Gln Ile Phe 1 5 10 15 Gln Asp Tyr Met Leu Thr Val Gln Lys Lys Ile Ala Glu Lys Gly Ser 20 25 30 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile 50 55 60 Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 85 90 95 Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro 100 105 110 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 115 120 125 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 130 135 140 Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 145 150 155 160 Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu 165 170 175 Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu 180 185 190 Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys 195 200 205 Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg 225 230 235 240 Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys 245 250 255 Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 260 265 270 Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 275 280 285 他的精氨酸赖氨酸 290 <210> 57 <211> 22 <212> PRT <213>幽门螺杆菌 <400> 57 Gly Leu Lys Gln Leu Asp Ser Thr Tyr Gln Glu Thr Asn Gln Gln Val 1 5 10 15 Leu Lys Asn Leu Asp Glu 20 <210> 58 <211>284 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CagL 蛋白的氨基酸 26-48 连接到突变的 KZ144 C14S、C23S 和 C50S <400> 58 Met Gly Leu Lys Gln Leu Asp Ser Thr Tyr Gln Glu Thr Asn Gln Gln 1 5 10 15 Val Leu Lys Asn Leu Asp Glu Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp 20 25 30 Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly 35 40 45 Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn 50 55 60 Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile 65 70 75 80 Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Pro 85 90 95 Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala 100 105 110 Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr 130 135 140 Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu 145 150 155 160 Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly 165 170 175 Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser 180 185 190 Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg 195 200 205 Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His 210 215 220 Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn 225 230 235 240 Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser 245 250 255 Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr 260 265 270 Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 59 <211> 19 <212> PRT <213>人巨细胞病毒 <400> 59 Tyr Lys Glu Lys Phe Met Val Cys Leu Lys Gln Ile Val Gln Tyr Ala 1 5 10 15 瓦尔阿森瑟 <210> 60 <211>281 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> IE1 蛋白的氨基酸 178-198 与突变的 KZ144 相关联 C14S、C23S 和 C50S <400> 60 Met Tyr Lys Glu Lys Phe Met Val Cys Leu Lys Gln Ile Val Gln Tyr 1 5 10 15 Ala Val Asn Ser Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp 20 25 30 Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val 35 40 45 Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val 瓦尔 50 55 60 Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys 65 70 75 80 Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr 85 90 95 Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr 100 105 110 Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu 115 120 125 Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys 130 135 140 Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr 145 150 155 160 Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr 165 170 175 Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met 180 185 190 Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu 195 200 205 Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly 210 215 220 Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala 225 230 235 240 Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met 260 265 270 Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 61 <211>278 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 61 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser 20 25 30 Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro 35 40 45 Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln 50 55 60 Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp 65 70 75 80 Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile 85 90 95 Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met 100 105 110 Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr 115 120 125 Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr 130 135 140 Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr 145 150 155 160 Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr 165 170 175 Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu 180 185 190 Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu 195 200 205 Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala 他的 Phe Phe Gly Pro Gly Ala 210 215 220 Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Thr His 225 230 235 240 Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp 245 250 255 Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys 260 265 270 Val Ala Ala 他的 Arg Lys 275 <210> 62 <211>286 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 62 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys 20 25 30 Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu 35 40 45 Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr 50 55 60 Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp 65 70 75 80 Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser 85 90 95 Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser 100 105 110 Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly 115 120 125 Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe 130 135 140 Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln 145 150 155 160 Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys 165 170 175 Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg 180 185 190 Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile 195 200 205 Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu 210 215 220 Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly 225 230 235 240 Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn 245 250 255 Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu 260 265 270 Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 285 <210> 63 <211> 279 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 63 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val 20 25 30 Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys 35 40 45 Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe 50 55 60 Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr 65 70 75 80 Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr 85 90 95 Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Thr Pro Val 100 105 110 Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu 115 120 125 Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys 130 135 140 Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys 145 150 155 160 Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro 165 170 175 Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala 180 185 190 Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg 195 200 205 Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly 210 215 220 Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr 225 230 235 240 His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys 245 250 255 Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly 260 265 270 Lys Val Ala Ala 他的 Arg Lys 275 <210> 64 <211> 285 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 64 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Lys Pro Lys Pro Lys Pro Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly 20 25 30 Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser 35 40 45 Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe 50 55 60 Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly 65 70 75 80 Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro 85 90 95 Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg 100 105 110 Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val 115 120 125 Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp 130 135 140 Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe 145 150 155 160 Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr 165 170 175 Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile 180 185 190 Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu 195 200 205 Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala 210 215 220 His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln 225 230 235 240 Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro 245 250 255 Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val 260 265 270 Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 285 <210> 65 <211> 280 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 65 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Gly Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu 20 25 30 Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly 35 40 45 Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys 50 55 60 Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn 65 70 75 80 Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys 85 90 95 Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 100 105 110 Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala 130 135 140 Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp 145 150 155 160 Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 165 170 175 Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly 180 185 190 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Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu 20 25 30 Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly 35 40 45 Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys 50 55 60 Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn 65 70 75 80 Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys 85 90 95 Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 100 105 110 Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala 130 135 140 Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp 145 150 155 160 Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 165 170 175 Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys 195 200 205 Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro 210 215 220 Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn 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