WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 用于异种移植的基因修饰 1. 政府许可权 100011 本发明是在政府支持下完成的,授权号为 P01 A1045 897,由国家过敏和传染病研究所 (NIAID)、美国国立卫生研究院 ( NIH)。 政府对本发明享有某些权利。 2. 相关申请 100021 的交叉引用 本申请要求 2020 年 9 月 7 日提交的美国序列号 63/075,285 和 2020 年 11 月 3 日提交的美国序列号 63/108,986 的权益,每篇的公开内容均并入本文 在此全部引用。 3. 参考以电子方式提交的序列表 100031 本申请包含以 ASCII 格式以电子方式提交的序列表,其全部内容通过引用并入本文。 该 ASCII 副本创建于 2021 年 8 月 26 日,名为 14648-015-228 Sequence Listing.txt,大小为 42,743 字节。 4. 领域 100041 本文提供以组织特异性方式表达人 CD47 的重组小型猪(例如,GalT 敲除小型猪)。 还提供了从小型猪分离的肾脏,其中肾小球表达人CD47的水平高于肾小管中人CD47的表达水平。 此外,本文提供了将这种具有人CD47的肾小球特异性表达的猪肾从重组小型猪移植到人受体中的方法。 在某些方面,本文提供移植方法,包括移植来自第一供体动物(例如,小型猪)的表达人CD47的造血干细胞和来自第二供体动物(例如,小型猪)的肾小球中的表达人CD47的肾脏 ) 给收件人(例如,人类收件人)。 5. 背景 100051 目前所有基因供体的严重短缺限制了器官移植的数量。 这种供需差异可以通过使用其他物种的器官(异种移植)来纠正。 鉴于与使用非人灵长类动物相关的 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 的伦理问题和不切实际,猪被认为是最适合人类的供体物种。 除了器官大小和与人类的生理相似性外,猪快速繁殖和近亲繁殖的能力使它们特别适合基因改造,从而提高它们作为人类移植供体的能力。 参见,例如 Sachs (1994),Path。 生物学。 42:217-219 和 Piedrahita 等人。 (2004),上午。 J. 移植,4 增刊。 6:43-50。 100061 尽管移植联合非特异性免疫抑制治疗与高早期移植物接受率相关,但临床器官移植成功的一个主要限制是晚期移植物丢失,这主要是由于移植物的慢性排斥反应。 因此,免疫耐受是移植的主要目标,并且对于成功的临床异种移植更为重要,因为防止异种移植排斥所需的终生免疫抑制水平可能毒性太大而无法接受。 此外,尚未鉴定出可可靠指示患者是否已实现免疫耐受的标志物,导致缺乏可作为免疫抑制戒断基础的实验室参数。 100071 因此,异种移植的目标包括实现耐受性。 这可以通过异种胸腺移植或通过优化来自供体动物的混合嵌合细胞在移植到异种受体后的耐久性,以及维持供体动物的健康和生存能力来实现。 100081 混合嵌合体可以在受体的 T 细胞、B 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞水平上诱导对供体的耐受性参见,例如,Griesemer eta! (2014),免疫学。 修订版 258:241-258; 萨克斯等人。 (2014),冷泉港。 透视医学。 4:a015529。 100091 CD47,也称为整合素相关蛋白 (TAP),是一种普遍表达的 50-kDa 细胞表面糖蛋白,可作为信号调节蛋白 (S1RP)a(也称为 CD172a 和 SHPS-1)的配体。 参见,例如,Brown (2002),Curr。 意见。 细胞。 生物学,14:603-7; 以及 Brown 和 Frazier (2001),Trends Cell Biol.,111130-5。CD47 和 SIRPcc 构成细胞间通讯系统,在多种细胞过程中发挥重要作用,包括细胞迁移、B 细胞粘附和 T 细胞活化。 参见,例如,Liu 等人。 (2002),J. Biol。 化学。 277: 10028; 茂木等。 (2003), EMBO 122:2634; Yoshida et cd. (2002), J. lmmunol. 168:3213; 和拉图尔等人。 (2001),免疫学杂志。 167:2547。 此外,CD47-SIRPu 系统涉及巨噬细胞吞噬作用的负调节。 一些细胞类型(即红细胞、血小板或白细胞)的 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 表面上的 CD47 抑制巨噬细胞的吞噬作用。 CD47-SIRPa 相互作用在抑制吞噬作用中的作用已通过以下观察得到说明:原代野生型小鼠巨噬细胞快速吞噬从 CD47 缺陷小鼠而非野生型小鼠获得的未调理的红细胞 (RBC)。 参见,例如,Oldenborg 等人 (2000),Science 288:2051。 也有报道称,CD47 通过其受体 SIRPa 抑制 Fcy 和补体受体介导的吞噬作用。 参见,例如,Oldenborg 等人。 (2001), J. Exp. 医学。 193:855。 100101 CD47K0 细胞在注入同源野生型 (WT) 小鼠后被巨噬细胞强烈排斥,表明 CD47 向巨噬细胞发出“不要吃我”的信号。 参见,例如,Oldenborg PA 等人。 (2000),科学,288:2051-4; 和王等人。 (2007),Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13744。 以猪为移植源的异种移植有可能解决人体器官供体严重短缺的问题,这是临床移植的主要限制因素。 参见,例如,Yang 等人。 (2007),自然评论免疫学。 7:519-31。 巨噬细胞对异种细胞的强烈排斥(参见,例如,Abe (2002), The Journal of Immunology 168:621)主要是由于供体 CD47 和受体 SIRPa 之间缺乏功能性相互作用(参见,例如,Wang 等人。 (2007), Blood; 109:836-42; Ide et at. (2007), Proc Natl Acad Sci USA 104:5062-6; and Navarro-Alvarez (2014), Cell tr​​ansplantation, 23:345-54), leading 人类 CD47 转基因猪的发展(参见,例如,Tena 等人 (2017),Transplantation 101:316-21;和 Nomura 等人 (2020),Xenotransplantation 2020;27:e12549)。 除了巨噬细 . 45:669-84)。 CD47-SIRPa 信号还抑制 DC 激活及其启动 T 细胞的能力,并且在通过供体特异性输血 (DST) 或肝细胞移植诱导 T 细胞耐受性方面发挥重要作用。 参见,例如,Wang 等人。 (2007), Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13744- 9; 王等。 (2014), 细胞移植 23:355-63; 和张等人。 (2016),科学报告 6:26839。 6. 概述 100111 一方面,本文提供了一种用于预防肾移植受者蛋白尿或减轻其严重程度的方法,其中该方法包括:(i) 将肾脏移植到受体中,其中该肾脏获自 -1,3 半乳糖基转移酶缺陷型小型猪和肾脏肾小球表达人 CD47 的水平足以 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 预防或减轻受体蛋白尿的严重程度; (ii)移植到受体猪造血干细胞中,其中猪造血干细胞表达人CD47并且获自缺乏α-1,3半乳糖基转移酶的小型猪。 100121 在一些实施方案中,肾小球以高于肾小管中人CD47表达水平的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的2倍至10倍。 在一些实施方案中,α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MEC近交的Columbia/Sachs小型猪。 在一些实施方案中,人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应测量。 100131 在一些实施例中,接受者是哺乳动物。 在一些实施例中,接受者是人。 100141 在一些实施方案中,猪造血干细胞获自骨髓、外周血、脐带血或胎肝细胞。100151 在一些实施方案中,人 CD47 在与内源性猪 CD47 相同的调控元件下表达。 在一些实施方案中,人CD47替代α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪中的内源性猪CD47。 在一些实施方案中,人CD47在肾小球特异性启动子下表达。 在一些实施方案中,肾小球特异性启动子是nephrin。 100161 在一些实施方案中,蛋白尿是肾性蛋白尿。 在一些实施方案中,蛋白尿减少至每 24 小时少于 3 g。 在一些实施方案中,蛋白尿减少至每 24 小时 500 mg。 在一些实施方案中,蛋白尿减少至每 24 小时 300 毫克。 在一些实施方案中,蛋白尿减少至每 24 小时 150 mg。 在一些实施方案中,蛋白尿在移植后两周内消退。 在一些实施方案中,蛋白尿在移植后一个月内消退。 在一些实施方案中,蛋白尿在移植后两个月内消退。 在一些实施方案中,蛋白尿在移植后四个月内消退。 100171 在一些实施方案中,肾脏是胸腺肾。 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 100181 在另一方面,本文提供分离自小型猪的肾脏,其中肾脏的肾小球表达 人 CD47 的表达水平高于肾小管中的人 CD47 表达水平。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的2倍至10倍。 在一些实施方案中,人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应测量。 在一些实施方案中,人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。 在一些实施方案中,人CD47在肾小球特异性启动子下表达。 在一些实施方案中,肾小球特异性启动子是nephrin。 在一些实施例中,肾脏是胸腺肾。 在一些实施方案中,小型猪是α-半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。 在一些实施方案中,α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。 100191 另一方面,本文提供了一种将小型猪的肾脏移植到人类受体中的方法,其中该方法包括 (i) 通过骨内移植将第一只小型猪的骨髓移植到受体中; (ii) 将第二只小型猪的肾脏移植给接受者。 在一些实施方案中,所述从第二小型猪移植肾脏的第二步骤在从第一小型猪移植骨髓的第一步之后至少28天进行。 100201 在一些实施方案中,来自第一只小型猪的骨髓表达人CD47。 在一些实施例中,来自第二只小型猪的肾脏表达人CD47。 在一些实施方案中,来自第一只小型猪的骨髓和来自第二只小型猪的肾脏表达人CD47。 100211 在一些实施方案中,人 CD47 在与内源性猪 CD47 相同的调控元件下表达。 在一些实施方案中,人CD47在肾小球特异性启动子下表达。 在一些实施方案中,肾小球特异性启动子是肾上腺素。 100221 在一些实施例中,骨髓和肾脏来自同一只小型猪。 在一些实施例中,第一小型猪和第二小型猪来自相同的、高度近交的小型猪群。 在一些实施方案中,第一小型猪CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019和第二小型猪是α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。 在一些实施方案中,α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。 在一些实施例中,第一小型猪和第二小型猪是基因匹配的小型猪。 在一些实施例中,第一和第二微型猪是MHC匹配的。 100231 在一些实施方案中,该方法进一步包括对接受者施用一种或多种额外治疗。在一些实施方案中,一种或多种额外治疗选自全身照射、胸腺照射、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、他克莫司、霉酚酸酯(MMF)、抗CD154抗体、眼镜蛇毒因子( CVF)、肝素、前列环素、重组猪细胞因子、猪干细胞因子(pCSF)、猪白细胞介素-3(p1L-3)、更昔洛韦、甲泼尼龙、抗IL6受体抗体和抗CD40抗体。 在一些实施方案中,该方法进一步包括将来自小型猪的胰岛细胞移植到接受者。 100241 另一方面,本文提供了来自非人类物种的异种移植物,其中异种移植物包括: (a) 肾脏; (b)朗格汉斯细胞的胰岛,其中肾脏包含肾小球,其表达人CD47的水平高于肾小管中人CD47的表达水平。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的2倍至10倍。 在一些实施方案中,人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应测量。 在一些实施方案中,人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。 在一些实施方案中,人CD47在肾小球特异性启动子下表达。 在一些实施方案中,肾小球特异性启动子是nephrin。 在一些实施例中,肾脏是胸腺肾。 7. 附图简要说明 100251 图 1A-图 1C 显示了人巨噬细胞(图 1A)或狒狒巨噬细胞(图 1B)对猪内皮细胞(“EC”)的吞噬作用,以及狒狒巨噬细胞对足细胞的吞噬作用(图 1C)。 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 100261 图 2A-图 2D:显示使用人(图 2A)、狒狒(图 2B)、恒河猴(图 2C)和 食蟹猴(图 2D)巨噬细胞。 100271 图 3A 和图 3B:显示肾移植后的血清 Cre 水平(图 3A)和肾移植物的组织学(图 3B)。 100281 图 4 显示了用于足细胞特异性表达人 CD47 的载体构建体。 猪 nephrin 基因的基因组片段(以红色表示)包含启动子区域和额外的基因组序列,直至外显子 2 中 nephrin 前导序列的末端。人类 CD47 基因(以绿色表示)作为混合蛋白编码序列引入 /基因组片段由外显子 2-7(第一个绿色区域)的成熟蛋白质编码部分和从内含子 7 开始并延续到外显子 11 的基因组区域组成。这种混合结构将允许产生 CD47 的所有 4 种可变剪接亚型。 包含一个 PKG-GFP 盒(以橙色表示),用于阳性选择已将载体纳入转录允许位点的转染成纤维细胞。 8.详细描述100291 本文提供了将表达人CD47的供体微型猪的肾移植到人接受者的方法。 具体而言,此类供体微型猪在肾小球中的表达水平高于肾小管中的人 CD47。 可以按照第 8.1 节中的描述生成转基因供体小型猪。 可以使用第 8.1 节中描述的技术在供体小型猪中引入遗传修饰。 如第 8.1.4 节所述,这些供体微型猪可以携带额外的基因修饰(例如 α-1,3 半乳糖基转移酶缺陷)。 可以使用第 8.1.1 节中描述的方法实现肾小球特异性表达。 可以使用第 8.1.3 节中描述的方法证明人 CD47 的表达水平。 移植程序可以包括额外的步骤,例如骨髓移植、胰岛-肾复合移植物,或将胸腺组织从小型猪移植到接受者,如第 8.2 节所述。 如第 8.2 节所述的免疫抑制和额外调节可以是移植的一部分。 因此,本公开提供了转基因小型猪、其制备方法、其使用方法,以及本文提供的组分的任何组合或排列。 不受理论的束缚,本文提供的移植方法导致移植接受者肾蛋白尿的风险和/或严重程度降低。 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 8.1 转基因小型猪的产生。 [0030] 本文提供了基因修饰的猪,其中人 CD47 在肾小球中的表达水平高于肾肾小管中的表达水平。 这种转基因猪的肾脏可用于移植到人类受体中。 不受任何特定理论的束缚,移植物中人CD47的这种表达模式防止或减少移植后肾受体的蛋白尿。 下文第 8.2.4 节提供了评估蛋白尿的方法。 [0031] 可以使用第 8.1.1 节中描述的方法实现人 CD47 的肾小球特异性表达。 可以使用第 81.3 节中描述的方法证明人 CD47 的表达水平。 可以使用第 8.1 节中描述的技术在供体小型猪中引入遗传修饰。 如第 8.1.4 节所述,这些供体微型猪可以携带额外的基因修饰(例如 α-1,3 半乳糖基转移酶缺陷)。 8.1.1. 组织特异性人 CD47 表达 [0032] 转基因猪中人CD47转基因的组织特异性表达(例如,人CD47在肾小球中的表达)可以通过以细胞类型特异性方式控制基因表达的方式来实现。 通常,可以使用包含表达盒、用于基因组整合和选择的元件的构建体对动物进行遗传修饰。 表达盒包含启动子和编码转基因例如人CD47的核苷酸序列。 这些元素中的每一个都在下面详细描述。 实现组织特异性表达的其他方法,例如不涉及基因组整合的方法,也可以与本文提供的方法和组合物一起使用。 [0033] 在某些实施方案中,人CD47在内皮组织中是可检测的。 在某些实施方案中,人CD47在猪的内皮组织中是可检测的,但在任何其他组织中是不可检测的。 在某些实施方案中,在猪的内皮组织中可检测到人CD47,但在猪的肾小管中检测不到。 在某些实施方案中,使用下文第 8.1.3 节中描述的技术,人 CD47 在猪肾的肾小球中可检测到,但在肾小管中检测不到。 例如,可以在一种、两种或更多种肾小球细胞类型中检测到人CD47。 肾小球细胞类型的例子包括足细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞。 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 100341 在某些实施方案中,人 CD47 仅在猪肾的肾小球中可检测到,但 在猪的任何其他组织中都检测不到。 在其他实施方案中,人CD47在猪肾的肾小球和猪身体的其余部分中可检测到,但在小管中检测不到。 在某些实施方案中,人CD47在猪的骨髓和猪肾的肾小球中是可检测的。 在某些实施方案中,人CD47在猪的骨髓和猪肾的肾小球中是可检测的,但在猪的任何其他组织中是检测不到的。 100351 在一些实施方案中,转基因猪肾小球表达人 CD47 的水平高于肾小管中人 CD47 表达水平,如使用下文第 8.1.3 节中描述的技术所检测的。 在某些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的2倍至500倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的2倍至50倍。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高51倍至100倍的水平表达人CD47。 在某些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平是肾小管中人 CD47 表达水平的 101 倍至 150 倍。在一些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平是 151 肾小管中人 CD47 表达水平的 200 倍至 200 倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的201倍至250倍。 在某些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的251倍至300倍。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高301倍至350倍的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高351倍至400倍的水平表达人CD47。 在某些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是肾小管中人CD47表达水平的401倍至450倍。 在某些实施方案中,肾小球 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 以比肾小管中人 CD47 表达水平高 451 倍至 500 倍的水平表达人 CD47。 100361 在一些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平比肾小球中人 CD47 表达水平高至少 2 倍、5 倍、10 倍、25 倍、50 倍、75 倍或至少 100 倍 肾小管。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高至少2倍的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高至少5倍的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高至少10倍的水平表达人CD47。在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高至少25倍的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高至少50倍的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球以比肾小管中人CD47表达水平高至少75倍的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平比肾小管中的人 CD47 表达水平高至少 100 倍 100371 在某些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平为 2 比转基因猪任何其他组织中的人 CD47 表达水平高 10 倍至 500 倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的2倍至50倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平比转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平高51倍至100倍。 在某些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的101倍至150倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的151倍至200倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的201倍至250倍。 在某些实施方案中,CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 肾脏的肾小球表达人 CD47 的水平比转基因中任何其他组织中的人 CD47 表达水平高 251 倍至 300 倍 猪。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的301倍至350倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的351倍至400倍。 在某些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的401倍至450倍。 在某些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪中任何其他组织中人CD47表达水平的451倍至500倍。 [0038] 在一些实施方案中,肾脏的肾小球表达人 CD47 的水平比任 转基因猪的其他组织。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平至少是转基因猪任何其他组织中人CD47表达水平的2倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平至少是转基因猪任何其他组织中人 CD47 表达水平的 5 倍。在一些实施方案中,肾小球表达人 CD47 的水平至少 转基因猪任何其他组织中人 CD47 表达水平的 10 倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪任何其他组织中人CD47表达水平的至少25倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪任何其他组织中人CD47表达水平的至少50倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪任何其他组织中人CD47表达水平的至少75倍。 在一些实施方案中,肾小球表达人CD47的水平是转基因猪任何其他组织中人CD47表达水平的至少100倍。 [0039] 在某些实施例中,至少 10%、20%、30%、40%、50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 至少 80%、至少 85%、至少 90% 或至少 95% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 10% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 20% 的肾小球表达 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 人 CD47。 在某些实施方案中,至少 30% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 40% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 50% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 55% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 60% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 65% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 70% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 75% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 80% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 85% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 90% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 95% 的肾小球表达人 CD47。 在某些实施例中,至少 10%、20%、30%、40%、50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80% 至少 85%、至少 90% 或至少 95% 的肾小球以高于肾小管的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 10% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 20% 的肾小球以高于肾小管的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少30%的肾小球以高于肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中,至少40%的肾小球以高于肾小管的水平表达人CD47。 在某些实施方案中,至少 50% 的肾小球以高于肾小管的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 55% 的肾小球以高于肾小管的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 60% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 65% 的肾小球以高于肾小管的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 70% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 75% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 80% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 85% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 90% 的肾小球以高于 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 肾小管的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 95% 的肾小球以比肾小管更高的水平表达人 CD47。 在某些实施例中,至少 10%、20%、30%、40%、50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80% 至少 85%、至少 90% 或至少 95% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 10% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 20% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 30% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 40% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 50% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 55% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。在某些实施方案中,至少 60% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 65% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 70% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 75% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 80% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 85% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 90% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 95% 的肾小球以比猪的任何其他组织更高的水平表达人 CD47。 在某些实施例中,至少 10%、20%、30%、40%、50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80% 、至少 85%、至少 90% 或至少 95% 的肾小球选择性表达人 CD47。 可以使用本领域已知或本文所述的技术来确定肾小球中的CD47水平。 在某些实施方案中,至少 10% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 20% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 30% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 40% 的 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 50% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 55% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 60% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 65% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 70% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 75% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 80% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 85% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 90% 的肾小球选择性表达人 CD47。 在某些实施方案中,至少 95% 的肾小球选择性表达人 CD47。 100431 在某些实施方案中,转基因猪的肾小球和骨髓都表达人 CD47。 在一些实施方案中,肾脏的肾小球和人猪的骨髓是仅有的两个组织,其中人CD47的表达是可检测的,例如,可通过下文8.1.3节中描述的方法检测。 100441 技术人员已知的任何方法都可用于量化人 CD47 的水平(例如,人 CD47 基因或蛋白质表达水平)。 在某些实施方案中,使用下文第 8.1.3 节中描述的技术检测的肾小球中的人 CD47 表达水平使用肾小球中一种或多种持家基因的表达水平标准化。 在其他实施方案中,使用肾小球中一种或多种管家基因的历史表达水平标准化肾小球中的人CD47表达水平。 在某些实施方案中,使用下文第 8.1.3 节中描述的技术检测的人小管中的 CD47 表达水平使用小管中一种或多种管家基因的表达水平标准化。 在其他实施方案中,使用小管中一种或多种管家基因的历史表达水平标准化小管中的人CD47表达水平。 管家基因是本领域众所周知的并且包括例如f3-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)或组蛋白。 100451 在一些实施方案中,存在于肾脏中的所有肾小球以高于肾小管中人CD47表达水平的水平表达人CD47。 在一些实施方案中,超过 75% 的肾小球以高于 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47。在一些实施方案中,超过 50% 的肾小球以高于小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47。 在一些实施方案中,超过 25% 的肾小球以高于肾小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47。 8.1.2. 构建转基因供体动物的产生。 [0046] 制备转基因动物(例如,小型猪)的方法是本领域众所周知的。 参见,例如,Hryhorowicz 等人。 (2020), Genes 2020, 11, 670。下文描述了此类方法的示例。 在某些实施例中,使用来自小型猪近交群的小型猪。 转基因动物可以通过本领域已知的任何合适的方法产生。 因此,可以使用例如体细胞核移植(SCNT)、原核显微注射、精子介导的基因转移(SMGT)或病毒将基因表达构建体(例如本文所述的构建体)引入动物的种系 - 介导的转基因参见,例如,Yum 等人。 (2016) J Vet Sci 2016, 17:261-268; Whyte 和 Prather (2011),Mol Reprod Dev 78:879-891; 萨克斯和加利 (2009)。 [0047] SCNT涉及将供体细胞的细胞核转移到染色体已被去除的卵母细胞或早期胚胎中。 参见,例如,Wilmut 和 Taylor (2015),Phil.Trans。 R. Soc。 B 370:20140366。 原核显微注射涉及将 DNA 直接注射到原核中。 用于这些目的的卵可以从超排卵母猪身上收集,然后通过胚胎移植转移到受体猪身上。 参见,例如,Whyte 和 Prather (2011), !VoiReprodDev 78:879-891。 SMGT 涉及将感兴趣的转基因基因与随后用于授精的精子一起孵育。 参见,例如,Lavitrano 等人,(2002),Proc Nat Acad Sci USA。 99:14230-14235。 病毒介导的转基因依赖于携带转基因的病毒载体感染胚胎或卵母细胞。 示例性病毒载体包括腺相关病毒 (AAV)、自身互补腺相关病毒 (scAAV)、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒(例如猿猴免疫缺陷病毒、人类免疫缺陷病毒或修饰的人类免疫缺陷病毒)、新城疫病毒( NDV)、疱疹病毒(例如,单纯疱疹病毒)、甲病毒、牛痘病毒等)。 [0048] 用于表达转基因的构建体通常包含用于基因组整合和选择的元件,以及表达盒。 表达盒包含启动子和编码转基因例如人CD47的核苷酸序列。 病毒载体 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 还可包含其他元件,例如 Poly(A) 位点、转录终止位点或病毒特异性元件,例如反向末端重复序列。 见,例如 Buard 等人。 (2009),英国药理学杂志 157:153-165。 8.1.2.1 基因组整合元件 100491 人类 CD47 转基因序列特异性插入(或敲入)到供体小型猪的基因组中可以通过序列特异性核酸内切酶结合同源重组(I-1R)来实现 目标染色体位点与包含人类 CD47 转基因的构建体。 参见,例如,Meyer 等人。 (2010),过程。 国家队。 学院。 科学。 美国 107:15022-15026; 崔等。 (2010), 自然。 生物技术。 29:64-67; Moehle 等人。 (2007),Proc Natl Acad Sci USA 104:3055-3060。 该过程依赖于用内切核酸酶靶向特定基因序列,内切核酸酶识别并结合这些序列,并在小型猪细胞的核酸分子中诱导双链断裂。 然后通过同源重组修复双链断裂。 如果反式提供用于同源重组的模板(例如,包含人 CD47 的构建体),则可以使用提供的模板修复双链断裂。 内切核酸酶的非限制性实例包括锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、ZFNickase、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或RNA引导的DNA内切核酸酶(例如,CRISPR/Cas9)。 100501 序列特异性核酸内切酶的另一个例子包括 RNA 引导的 DNA 核酸酶,例如 CRISPR/Cas 系统。 Cas9/CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)系统利用 RNA 引导的 DNA 结合和目标 DNA 的序列特异性切割。 指导 RNA (gRNA)(例如,包含 20 个核苷酸)与基因组 PAM(原型间隔子相邻基序)位点(NNG)和恒定 RNA 支架区域上游的目标基因组 DNA 序列互补。 Cas(CRISPR 相关)蛋白与 gRNA 和 gRNA 结合的目标 DNA 结合,并在 PAM 位点上游的指定位置引入双链断裂。 参见,例如,Geurts 等人。 (2009), 科学 325:433; Mashimo 等人。 (2010), PLoS ONE 5, e8870; Carbery等。 (2010),遗传学 186:451-459; 泰森等人。 (2011), 自然。 生物技术。 29:695-696; Wiedenheft 等人。 (2012), 自然 482,331-338; Jinek 等人。 (2012), 科学 337:816-821; 马里等。 (2013), 科学 339:823-826; 聪等。 (2013), Science 339:819-823.CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 100511 在一个实施例中,序列特异性重组系统可用于实现目标基因的条件性敲除 (例如猪 CD47)。 重组酶是一种识别位于间插多核苷酸侧翼的特定多核苷酸序列(重组酶识别位点)并催化相互链交换,从而导致间插多核苷酸倒位或切除的酶。 参见,例如,Araki 等人。 (1995), 过程。 国家队。 学院。 科学。 美国 92:160-164。 100521 在另一方面,可以使用例如非同源末端连接以序列非特异性方式整合转基因。 100531 在另一个实施方案中,转基因(其编码例如重组酶或人 CD47 转基因)的条件表达可通过使用可被外源刺激物诱导或失活的调节序列来实现。 例如,条件敲除等位基因的序列特异性重组系统可以通过例如使重组酶的活性可由化学物质(药物)诱导来调节。 该化学物质可激活 Cre 重组酶基因的转录,或激活 Cre 重组酶蛋白向细胞核的转运。 或者,重组酶可以通过不存在施用的药物而不是通过其存在来激活。 调节诱导系统(因此,例如诱导条件性敲除)的化学物质的非限制性实例包括四环素、他莫昔芬、RU-486、多西环素等。 参见,例如,Nagy A (2000),Genesis,26:99-109。 参见,例如,美国描述的条件敲除和敲入结构。专利申请号 15/558,789。 100541 在其他实施方案中,内源性猪 CD47 在内源性位点被人 CD47 替代(即,基因敲入)。 本领域已知的各种技术可用于产生人类CD47敲入模型。 例如,一个非限制性示例包括使用 CRISPR/Cas9 和体细胞核移植的组合。 参见,例如,Ruan J 等人。Sci Rep. 2015 年 9 月 18 日;5:14253。 8.1.2.2 表达盒 100551 表达盒通常包含调节元件和转基因。 调节元件可以是例如启动子。 因此,例如,为了实现 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 人类 CD47 转基因在肾小球中的表达,将转基因置于肾小球特异性启动子的控制下(参见第 8.1. 节)。 2.4). 8.1.2.3 转基因 100561 人 CD47 的氨基酸序列可以在以下 NCTIT 参考序列 (RefSeq) 登录号下找到:NP 001768; NP 001369235.1; NP 942088; 和 XP 005247966.1。 编码人 CD47 的核酸序列可以在以下 NCBI RefSeq 登录号下找到:NM 001777; 纳米 198793; X1\4 005247909.2 和 NM 001382306.1。 在一些实施方案中,本文提供的转基因编码人CD47的已知剪接变体。 在一些实施方案中,本文提供的转基因是cDNA和基因组DNA形式的杂交体,其提供从单个转基因构建体产生多重剪接形式(图4)。 100571 其他物种中的 CD47 序列也是已知的。 参见,例如,以下 NCBI RefSeq 编号下的氨基酸序列:XP 516636(黑猩猩); 和 XP 535729(狗); 本文考虑了包括全部或部分CD47胞外结构域的多肽。 参见,例如,Motegi 等人。 (2003), EMBO J., 22: 2634-2644,描述了人 CD47-Fc 融合蛋白的构建。 在本文提供的一些实施方案中,使用人CD47的选择性剪接形式。 参见,例如,Reinhold 等人。 (1999),细胞科学杂志,108:3419-3425。 在某些实施方案中,用于本文所述构建体的编码人CD47的转基因是下表1中列出的转基因。 在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含核苷酸序列SEQ ID NO:3。在其他实施方案中,编码人CD47的转基因包含核苷酸序列SEQ ID NO:4。 100581 在某些实施方案中,编码人CD47的转基因 包含与 SEQ ID NO: 3 至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或至少 98% 相同的核苷酸序列。在某些 在一些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少70%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少75%相同的核苷酸序列。 3.在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少80%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含CA 03191806 2023-3-6 WO的核苷酸序列 2022/051594 PCT/US2021/049019 与 SEQ ID NO: 3 至少 85% 相同。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO: 3 至少 90% 相同的核苷酸序列。在某些情况下 在一些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少95%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少98%相同的核苷酸序列。 3. 100591 在其他实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或至少 与 SEQ ID NO: 4 98% 相同。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO: 4 至少 70% 相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含核苷酸序列 与 SEQ ID NO: 4 至少 75% 相同。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO: 4 至少 80% 相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因 包含与 SEQ ID NO: 4 至少 85% 相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少90%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少95%相同的核苷酸序列 NO:4。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO:4 至少 98%相同的核苷酸序列。 100601 在某些实施方案中,转基因编码 SEQ ID NO:1 的多肽。在某些 在实施方案中,转基因编码与 SEQ ID NO: 1 至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或至少 98% 相同的多肽 在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少70%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少75%相同的核苷酸序列。 ID NO:1。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO:1 至少 80%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含至少 85%的核苷酸序列。 与 SEQ ID NO: 1 相同的百分比。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO: 1 至少 90% 相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含以下核苷酸序列: 与 SEQ ID NO: 1 至少 95% 相同。 在 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO: 1 至少 98% 相同的核苷酸序列 ID NO: 1. 100611 在其他实施方案中,转基因编码 SEQ ID NO: 2 的多肽。在某些实施方案中,转基因编码至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 与 SEQ ID NO: 2 85%、至少 90%、至少 95% 或至少 98% 相同。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO: 至少 70% 相同的核苷酸序列。 2.在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少75%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少80%相同的核苷酸序列。 SEQ ID NO:2。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少85%相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人CD47的转基因包含至少与SEQ ID NO:2相同的核苷酸序列。 与 SEQ ID NO: 2 90% 相同。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含与 SEQ ID NO:2 至少 95% 相同的核苷酸序列。在某些实施方案中,编码人 CD47 的转基因包含核苷酸序列 与 SEQ ID NO:2 至少 98% 相同。 100621 在一个实施方案中,将人 CD47 转基因插入转基因供体动物中除猪 CD47 基因的天然基因座之外的基因座。 8.1.2.4 调控元件 100631 在某些实施方案中,人 CD47 转基因处于肾小球特异性启动子的控制之下。 在一些实施方案中,肾小球特异性启动子对一种或多种肾小球细胞类型具有特异性。 肾小球细胞类型的例子包括足细胞、系膜细胞和肾小球内皮细胞。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是足细胞特异性启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是肾病蛋白启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是足蛋白启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是FGF1启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是系膜细胞特异性启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是内皮细胞特异性启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 CD31 启动子。 在某些实施方案中,肾小球特异性启动子是vWF启动子。 100641 一个启动子可以控制一种以上细胞类型中的基因表达。 在某些实施方案中,启动子控制肾小球细胞中的基因表达。 在某些实施方案中,启动子控制肾小球细胞类型足细胞中的基因表达。100651 在某些实施方案中,可以分析在肾小球中表达的任何基因的启动子,并且赋予在肾小球中表达的调控元件可以与本文提供的方法和组合物一起使用。 通常,可以通过将报告基因(例如荧光蛋白)重组置于感兴趣基因片段的调控下来进行此类启动子分析。 然后可以测试所得构建体的报告基因在肾小球中的表达。 100661 在某些实施例中,启动子可以是可诱导的。 具体地,启动子可以是可诱导的和组织特异性的。 许多诱导型启动子和基因表达系统是本领域已知的。 例如,启动子可以由化学物质诱导,例如,由四环素、他莫昔芬或cumate。 基因表达也可以通过蛋白质-蛋白质相互作用来控制(例如,FKBP12 和 mTOR 之间的相互作用,由雷帕霉素控制)。 参见,例如,Kallunki 等人。 (2019),细胞 8:796。 8.1.3. 测量人 CD47 水平的方法 100671 在某些实施方案中,人 CD47 表达水平可以在 RNA(例如,mRNA 水平)上确定,如下文第 8.1.3.1 节所述。 在某些实施方案中,人 CD47 表达水平可以在蛋白质水平上确定,如第 8.1.3.2 节中所讨论的。 100681 在某些实施方案中,本文提供的方法包括检测和测量供体小型猪的肾小球组织与肾小管组织中差异基因表达的方法。 在某些实施方案中,本文提供的方法包括检测和测量供体小型猪肾小球组织与肾小管组织中人 CD47 差异 mRNA 水平的方法。 在其他实施方案中,本文提供的方法包括检测和测量供体微型猪肾小球组织与肾小管组织中人 CD47 差异蛋白水平的方法。 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/ 049019 100691 组织特异性表达可以通过在测量人 CD47 蛋白或 mRNA 水平之前物理分离感兴趣的组织来确定(例如,通过肾活检或通过基于流式细胞术的分离,例如肾小球特异性细胞)和应用方法来测量 人类 CD47 蛋白或 mRNA 水平,例如以下体外水平。 或者,荧光显微镜等成像技术可用于可视化和测量特定组织(例如,肾小球或肾小管)中的人类 CD47 蛋白表达。 单细胞 qPCR 可用于测量特定组织中的人类 CD47 基因表达。 100701 在一些实施例中,本文提供的方法包括 (i) 对供体小型猪进行肾活检; (ii) 从供体小型猪的肾脏中分离肾小球; 和/或 (iii) 从供体微型猪的肾脏中分离肾小管。 在其他实施例中,本文提供的方法包括(i)对供体小型猪进行肾活检; (ii) 将供体微型猪的肾脏解剖到单个或一组肾单位的水平。 在一些实施例中,上述方法结合进行。 8.1.3.1 检测样品100711中mRNA水平的方法在某些实施方案中,通过本文描述的技术在猪肾的肾小球中检测到人CD47的mRNA,但在小管中检测不到。 在一些实施方案中,肾小球具有比肾小管中人CD47 mRNA水平更高的人CD47 mRNA水平,如使用本文描述的技术100721检测或定量mRNA水平的几种方法在本发明中是已知的。 艺术。 示例性方法包括但不限于 northern 印迹、核糖核酸酶保护测定、基于 PCR 的方法(例如,定量 PCR)、RNA 测序、Fluidigm 分析等。 人CD47的mRNA序列可用于制备与mRNA序列至少部分互补的探针。 然后探针可用于检测样品中的 mRNA,使用任何合适的测定,例如基于 PCR 的方法、northern 印迹、试纸测定、TaqManTM 测定等。 100731 在其他实施方案中,可以制备用于测试生物样品中人 CD47 表达的核酸测定。测定通常包含固体支持物和至少一种接触支持物的核酸,其中核酸对应于CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 mRNA的至少一部分。 该测定法还可以具有检测样品中mRNA表达改变的方法。 测定方法可以根据所需 mRNA 信息的类型而变化。 示例性方法包括但不限于 Northern 印迹和基于 PCR 的方法(例如,qRT-PCR)。 qRT-PCR 等方法也可以准确定量样品中 mRNA 的量。 [0074] 典型的mRNA测定方法可包含以下步骤:(1)获得表面结合的主题探针; (2) 在足以提供特异性结合的条件下,将 mRNA 群体与表面结合的探针杂交; (3) 杂交后洗涤,去除未特异性结合表面结合探针的核酸; (4)检测杂交后的mRNA。 每个步骤中使用的试剂及其使用条件可根据具体应用而变化。 [0075] 其他方法,例如基于PCR的方法,也可用于检测人CD47的表达。 PCR 方法的例子可以在美国专利No. 美国专利号 6,927,024,其全部内容通过引用并入本文。 RT-PCR 方法的例子可以在美国专利No. 美国专利第 7,122,799 号,其全部内容通过引用并入本文。 荧光原位 PCR 的方法描述于美国专利No. 美国专利第 7,186,507 号,其全部内容通过引用并入本文。 [0076] 在一些实施例中,定量逆转录-PCR (qRT-PCR)可用于 RNA 靶标的检测和定量(Bustin 等人,Clin. Sci. 2005, 109-365-379)。在一些实施例中, 基于 qRT-PCR 的测定可用于在基于细胞的测定期间测量 mRNA 水平。 基于 qRT-PCR 的方法的示例可以在例如美国专利No. 美国专利第 7,101,663 号,其全部内容通过引用并入本文。 [0077] 与常规逆转录酶-PCR和琼脂糖凝胶分析相反,qRT-PCR给出定量结果。 qRT-PCR 的另一个优点是使用相对简单和方便。 用于 qRT-PCR 的仪器(如 Applied Biosystems 7500)可在市场上买到,试剂也是如此,如 TaqMang 序列检测化学。 例如,可以按照制造商的说明使用 TaqMan 基因表达分析。 这些试剂盒是预先配制的基因表达检测试剂盒,用于快速、可靠地检测和定量人类、小鼠和大鼠的 mRNA 转录本。 一个示例性的qRT-PCRCA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019程序例如是50℃2分钟,95℃10分钟,95℃15秒40个循环, 然后 60 C. 1 分钟。 8.1.3.2 检测样品中多肽或蛋白质水平的方法100781 在本文提供的某些实施方案中,通过本文描述的技术在猪肾的肾小球中检测到人CD47多肽或蛋白质,但在小管中未检测到。 在一些实施方案中,肾小球具有比肾小管中人CD47多肽或蛋白质水平更高的人CD47多肽或蛋白质水平,如使用本文描述的技术所检测的。 100791 几种蛋白质检测和定量方法可用于测量人 CD47 的水平。 可以使用任何合适的蛋白质定量方法。 在一些实施例中,使用基于抗体的方法。 可以使用的示例性方法包括但不限于免疫印迹法(Western blot)、ELISA、免疫组织化学、免疫荧光法、流式细胞术、细胞术珠阵列、质谱法等。 常用的 ELISA 有几种类型,包括直接 ELISA、间接 ELISA 和夹心 ELISA。 8.1.4. 其他遗传修饰 100801 本文提供的重组小型猪(例如,本文所述移植方法中使用的第一小型猪和/或第二小型猪)可以以其他方式修饰以表达人 CD47 此类其他修饰包括,对于 例如,a-1,3-半乳糖基转移酶的敲除和细胞因子受体的修饰。 在一些实施例中,本文提供的小型猪不表达α-1,3-半乳糖基转移酶。 在一些实施方案中,本文提供的小型猪另外表达人CD55、人CD46、人CD59、IL-3R或其一些组合。 参见,例如,Nomura 等人。 (2020),异种移植。 2020;27:e12549,美国专利号 9,883,939 和美国专利号 9,980,471 B2。 100811 参考第 8.2 节中的移植方法,此类额外的基因修饰可用于作为肾脏供体的小型猪 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 移植,以及此类额外的 修饰也可用于作为造血干细胞供体的小型猪(例如,用于骨髓移植)。 8.2 移植方法 100821 转基因供体小型猪的细胞、组织、器官或体液可用于移植方法(如异种移植)。 100831 接受者可以移植来自一个或两个动物的第一和第二移植物。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在移植来自供体动物的第一移植物至少7天后移植。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在移植来自供体动物的第一移植物至少14天后移植。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在从供体动物移植第一移植物至少21天后移植。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在移植来自供体动物的第一移植物至少28天后移植。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在从供体动物移植第一移植物至少35天后移植。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在移植来自供体动物的第一移植物后至少49天被移植。 在一些实施方案中,从供体动物收获的第二移植物在移植来自供体动物的第一移植物至少54天后移植。100841 在一个实施方案中,本文提供的移植方法包括从供体动物移植具有第 8.1 节中描述的基因修饰的肾脏。 在某些方面,本文提供的移植方法包括在受体中诱导耐受的步骤,例如通过诱导混合嵌合现象。 “混合嵌合体”通常被理解为描述一种状态,其中同种异体造血干细胞受体的淋巴造血系统包含宿主细胞和供体细胞的混合物。 这种状态通常通过骨髓或动员外周血干细胞移植获得。 混合嵌合可能是短暂的或稳定的。 参见,例如,Sachs 等人。 (2014),Cold Spring Harb Perspect Med 2014;4:a015529; 美国专利号 6,296,846 和美国专利号 6,306,651。 混合嵌合体也可以通过同时移植来自供体动物的胸腺组织来实现。 参见,例如,国际专利申请公开号 W02020/061272.CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 100851 在一个实施例中,本公开包括从第二供体动物移植肾脏的方法 到人类接受者中,其中该方法包括:(a)将来自第一供体动物的造血干细胞移植到接受者; (b) 将来自第二个供体动物的肾脏移植到受体,其中第一个供体动物在造血干细胞中表达人 CD47,而第二个供体动物在肾脏的肾小球中选择性表达人 CD47。 在一个具体实施方案中,第一供体动物是小型猪。 在一个具体实施方案中,第二供体动物是小型猪。 在一个具体实施方案中,第一和第二供体动物都是小型猪。 在其他具体实施方案中,第二供体动物是小型猪且第一供体动物不是小型猪。 在一些实施方案中,移植方法任选地包括移植来自第三种供体动物的胸腺组织。 100861 在一个实施例中,本公开包括将第二供体动物的肾脏移植到人类受体中的方法,其中该方法包括: (a) 将第一供体动物的造血干细胞和胸腺组织移植到受体中; (b) 将来自第二个供体动物的肾脏移植到受体,其中第一个供体动物在造血干细胞中表达人 CD47,而第二个供体动物在肾小球中选择性表达人 CD47。 在一个具体实施方案中,第一供体动物是小型猪。在一个具体实施方案中,第二供体动物是小型猪。 在一个具体实施方案中,第一和第二供体动物都是小型猪。 在其他具体实施方案中,第二供体动物是小型猪且第一供体动物不是小型猪。 在一些实施方案中,来自第一供体动物的胸腺组织表达人CD47。 胸腺组织的实例包括血管化胸腺组织和胸腺肾脏(见第 8.2.1.2 节)。 从第一只小型猪到接受者的造血干细胞; (b) 将第二只小型猪的肾脏移植给接受者,其中第一只猪在造血干细胞中表达人 CD47,而第二只猪在肾脏的肾小球中选择性表达人 CD47。 第一头猪也可能在造血干细胞以外的组织中表达人 CD47。 100871 在该方法的某些实施方案中,所述从第二只小型猪移植肾脏的第二步在移植第一步后至少 28 天进行CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 造血干细胞 来自第一只微型猪。 本公开内容包括 Watanabe 等人,Xenotransplantation,2020,27:e12552 和 Nomura 等人,Xenotransplantation,2020,27:e12549 中描述的用于在供体细胞中转基因表达人 CD47 的方法和技术。 100881 造血干细胞可以是任何类型的细胞。 在某些实施方案中,细胞是造血干细胞、淋巴细胞或骨髓细胞。在一些实施方案中,将混合的造血细胞群从第一供体动物(例如,小型猪)移植到受体中。 在某些实施方案中,猪造血干细胞获自骨髓、外周血、脐带血、胎肝或胚胎干细胞。 可以通过本领域已知的任何合适的方法移植造血干细胞,例如通过下文8.2.1.3部分中描述的方法。 在一些实施方案中,造血干细胞通过骨髓内移植,例如,移植到接受者。 如 Watanabe 等人所述。 (2019),异种移植。 2019;00:e12552。 100891 在一些实施方案中,造血干细胞和供体肾脏取自同一供体动物。 在造血干细胞和肾脏取自同一供体的一些实施方案中,供体造血干细胞和供体肾的肾小球表达人CD47。 在造血干细胞和肾脏取自同一供体的一些实施方案中,供体造血干细胞和供体肾的肾小球以高于肾小管的水平表达人CD47。 在其中造血干细胞和肾脏取自同一供体的一些实施方案中,供体造血干细胞和供体肾的肾小球以高于供体动物中任何其他组织的水平表达人CD47。 100901 在一些实施方案中,造血干细胞和供体肾脏取自两种不同但基因匹配的供体动物。 如本文所用,“基因匹配”可指基因之间的同源性,例如MHC基因。 在一些实施例中,基因匹配的供体动物与 MEW 完全匹配。 在一些实施方案中,造血干细胞和供体肾脏取自同一高度近交种群的两只不同动物。CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 8.2.1。 额外的治疗。 [0091] 可以在本文描述的移植方法之前、同时或之后使用额外的治疗。 额外的治疗通常旨在提高异种移植物在接受者中的耐受性,但也可考虑其他治疗。 因此,本文提供的移植方法可包括施用一种或多种额外治疗,例如抑制T细胞、阻断补体或以其他方式下调受体对移植物的免疫反应的治疗。 [0092] 在一些实施方案中,接受者被切除胸腺和/或切除脾脏。 [0093] 在一些实施例中,接受者接受辐射,例如全身辐射。 在特定实施例中,接受者接受 5-10 Gy 或 10-15 Gy 的照射。 在一些实施例中,可以使用胸腺照射。 在一些实施例中,接受者被施用低剂量辐射(例如,100拉德至400拉德全身辐射的亚致死剂量)。 也可以使用局部胸腺放疗。 [0094] 通过本文所述的方法进行移植的受试者的血液可能含有靶向异种移植物的抗体。 这些抗体可以通过器官灌注和/或诱导耐受的骨髓移植来消除。 天然抗体可以通过供体物种肝脏的血液灌流从受体血液中吸收。 类似地,受体中可能存在产生抗体的细胞。 可以通过例如辐射或药物治疗消除此类抗体产生细胞。 , 细胞缺乏 α-1,3- 半乳糖基转移酶),见第 8.1.4 节。 [0095] 在一些实施方案中,施用供体基质组织。 它可以从胎儿肝脏、胸腺和/或胎儿脾脏中获得,可以植入受体中,例如肾囊中。 8.2.1.1 免疫抑制治疗 [0096] 在一些实施方案中,根据本文所述的方法接受异种移植物的患者接受免疫抑制治疗。 免疫抑制疗法可以是任何 FDA 批准的治疗,表明可以减少移植排斥和/或改善 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 异种移植的结果。 免疫抑制疗法的非限制性实例包括钙调神经磷酸酶抑制剂(例如,他克莫司或环孢素)、抗增殖剂(例如,抗代谢物如霉酚酸酯、6-巯基嘌呤或其前药硫唑嘌呤)、哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂(例如 ,西罗莫司,雷帕霉素),类固醇(例如,泼尼松),细胞周期抑制剂(硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯),淋巴细胞耗竭剂(例如,抗胸腺细胞球蛋白或抗体,如阿仑单抗,西普珠单抗或巴利昔单抗)和共刺激阻滞剂( 例如,belatacept)。 参见,例如,Chung 等人 (2020)., Ann Transl Med. 三月; 8(6): 409; 范德马克等人。 (2020),欧洲呼吸修订版; 29:190132 和 Benvenuto 等人。 (2018), J Thorac Dis 10:3141-3155。 在一些实施方案中,免疫抑制疗法包括神经钙蛋白抑制剂。 在一些实施方案中,免疫抑制疗法包括抗增殖剂。 在一些实施方案中,免疫抑制疗法包括mTOR抑制剂。 在一些实施方案中,免疫抑制疗法包括类固醇。 在一些实施方案中,免疫抑制疗法包括淋巴细胞消耗剂。 在一些实施方案中,免疫抑制疗法包括共刺激阻断剂。 100971 免疫抑制治疗可作为诱导治疗(围手术期或手术后立即)、维持剂量或用于急性排斥反应。 诱导治疗通常包括巴利昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白或阿仑单抗。免疫抑制治疗也可以作为维持治疗进行,通常需要在接受者的生命中持续。 维持性免疫抑制治疗通常包括钙调磷酸酶抑制剂(他克莫司或环孢菌素)、抗增殖剂(霉酚酸酯或硫唑嘌呤)和皮质类固醇。 急性排斥反应的免疫抑制疗法通常包括胸腺球蛋白或霉酚酸酯。 参见,例如,Chung 等人。 (2020),安翻译医学。 三月; 8: 409 和 Benvenuto 等人,(2018) J Thorac Dis 10:3141-3155。 100981 免疫抑制剂的非限制性实例包括,(1) 抗代谢物,例如嘌呤合成抑制剂(例如肌苷单磷酸脱氢酶 (IMPDH) 抑制剂,例如硫唑嘌呤、霉酚酸酯和霉酚酸酯)、嘧啶合成抑制剂(例*氟米特和特立氟胺 )和抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤); (2)钙调神经磷酸酶抑制剂,如他克莫司、环孢素A、吡美莫司、沃罗孢素等; (3) TNF-α抑制剂,如沙利度胺、来那度胺; (4) IL-1受体拮抗剂,如阿那白滞素; (5) 雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)抑制剂,例如雷帕霉素(sirolimus),CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 deforolimus、everolimus、temsirolimus、zotarolimus和biolimus A9; (6)皮质类固醇,如强的松; (7) 针对多种细胞或血清靶标(包括抗淋巴细胞球蛋白和抗胸腺细胞球蛋白)中的任何一种的抗体。 100991 非限制性示例性细胞靶标及其各自的抑制剂化合物包括但不限于补体成分 5(例如依库珠单抗); 肿瘤坏死因子 (TNF)(例如,英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇赛妥珠单抗、阿非莫单抗和戈利木单抗); IL-5(例如美泊利单抗); IgE(例如奥马珠单抗); BAYX(例如,nerelimomab); 干扰素(例如 faralimomab); IL-6(例如,elsilimomab); IL-12 和 IL-13(例如,lebrikizumab 和 ustekinumab); CD3(例如,muromonab-CD3、otelixizumab、teplizumab、visilizumab); CD4(例如克伦利昔单抗、凯利昔单抗和扎诺木单抗); CDI la(例如依法珠单抗); CD18(例如厄利珠单抗); CD20(例如,afutuzumab、ocrelizumab、pascolizumab); CD23(例如,鲁米利昔单抗); CD40(例如,teneliximab、toralizumab); CD62L/L-选择素(例如阿塞珠单抗); CD80(例如,加利昔单抗); CD147/basigin(例如,gavilimob); CD154(例如,ruplizumab); BLyS(例如贝利木单抗); CTLA-4(例如,ipilimumab、tremelimumab); CAT(例如,bertilimumab、lerdelimumab、metelimumab); 整合素(例如那他珠单抗); IL-6 受体(例如托珠单抗); LFA-1(例如,odulimomab); 和 IL-2 受体/CD25(例如,巴利昔单抗,达珠单抗、伊利莫单抗)。 8.2.1.2 血管化胸腺移植 1001001 在一些实施方案中,根据此处描述的方法治疗的患者接受血管化胸腺移植。 参见,例如,国际专利申请公开号 PCT W02020061272A1。 胸腺组织可以通过植入自体肾囊下进行血管重建来制备用于移植。 血管化胸腺移植可以是例如“胸腺肾”,即通过将来自供体的胸腺组织移植到供体自己的肾囊下制备的肾脏。 参见,例如,Yamada 等人。 at., Transplantation 68(11):1684-1692 (1999),Yamada 等人,J Immunol 164:3079-3086 (2000) 和 Yamada 等人,Transplantation 76(3):530-536 (2003)。 血管化胸腺移植也可以是与肾脏分开移植的血管化胸腺叶。 参见,例如,LaMattina 等人,Transplantation 73(5):826-831 (200) 和 Kamano 等人,Proc Natl Acad Sci U S 101(11):3827-3832 (2004).CA 03191806 2023-3- 6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 8.2.1.3 造血干细胞移植 1001011 可以通过提供来自供体物种的造血基质环境来增强跨不同物种屏障的干细胞植入和造血作用。 基质基质提供造血干细胞与其基质环境相互作用所需的物种特异性因子,例如造血生长因子、粘附分子及其配体。 1001021 由于肝脏是胎儿造血的主要部位,胎儿肝脏也可以替代骨髓作为造血干细胞的来源。 胸腺是 T 细胞成熟的主要场所。 每个器官都包含一个器官特异性基质,可以支持植入宿主的各个未分化干细胞的分化。 胸腺基质组织可以在移植前进行照射。 作为植入的替代或辅助,胎儿肝细胞可以在液体悬浮液中施用。 1001031 可以将供体的骨髓细胞 (BMC) 或其他造血干细胞来源(例如胎肝悬浮液)注射到受体中,以诱导混合嵌合现象。 造血干细胞可以取自任何来源,例如取自骨髓或外周血干细胞。 参见,例如,Sachs 等人。 (2014),Cold Spring Harb Perspect Med 2014;4:a015529。 供体 BMC 以受体的适当位点为家,并与剩余的宿主细胞连续生长并增殖,形成嵌合淋巴造血细胞群。 通过这个过程,新形成的 B 细胞(及其产生的抗体)暴露于供体抗原,因此移植物将被识别为自身。 在动物的 T 细胞水平上也观察到对供体的耐受性,其中已经实现了造血干细胞(例如骨髓细胞)植入。 胸腺组织(例如血管化胸腺或胸腺肾)的移植可以通过产生对异种移植物无反应的 T 细胞库来诱导 T 细胞耐受。 使用异种供体可以使用来自同一动物或基因匹配动物的骨髓细胞和器官。 对于骨髓移植,接受者可以接受低剂量辐射。 在一些情况下,接受者可以用消耗补体的药剂治疗,例如眼镜蛇毒因子(例如,在第 -1 天)。CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 8.2.1.4 复合 胰岛-肾移植物 [00104] 如本文所提供的,来自转基因猪的肾脏(其中人类 CD47 在肾小球中的表达水平高于肾脏肾小管中的表达水平)可用作异种移植物,用于异种移植到人类患者中。 在一些实施方案中,异种移植物可以包括肾脏(例如第8.1节中描述的肾脏)和胰岛细胞的组合。 例如,胰岛细胞可以与本公开的肾脏组合以产生复合胰岛-肾移植物。 [00105]复合胰岛-肾移植物的产生可以通过本领域已知的任何方法进行。 例如,可以进行部分胰腺切除术并分离胰岛细胞。 此后,胰岛细胞可与肾脏结合形成复合胰岛-肾细胞,然后可用于异种移植。 参见,例如,Pomposelli 等人,Front Endocrinol(洛桑)。 5月12日,12:632605 (2021)。 [00106]因此,在一个具体的实施方案中,异种移植物是来自非人类物种的异种移植物,其中异种移植物包括:(a)肾脏; (b)朗格汉斯细胞的胰岛,其中肾脏包含肾小球,其表达人CD47的水平高于肾小管中人CD47的表达水平。 8.2.2. 治疗效果 1001071 在一些实施方案中,本文所述的移植方法导致蛋白尿的风险或强度降低,参见下文第 8.2.4 节。 在一些实施方案中,与其中供体肾的肾小球不以高于供体肾小球中人CD47表达水平的水平表达人CD47的移植方法相比,本文所述的移植方法导致供体肾脏排斥反应的发生率降低。 供体肾的小管。 [0108] 在一些实施方案中,该方法导致给药减少(例如,给药减少约 10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60- 与供体肾脏的接受者相比,70%、70-80%、80-90% 或超过 90% 的免疫抑制治疗对接受者进行,其中供体肾脏的肾小球表达人 CD47 的水平不高于 供体肾小管中人 CD47 的表达水平。 在特定实施方案中,该方法导致给药减少(例如,CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 给药减少约 10%、10-20%、20-30%、30-40% , 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% 或超过 90%) 的免疫抑制治疗与通常给予接受者的免疫抑制治疗的量相比 可比较的接受者(例如,相同性别和可比较的年龄、身高和/或体重的人),其中可比较的接受者接受了供体肾脏,其中供体肾脏的肾小球表达人 CD47 的水平不高于 供体肾小管中人 CD47 的表达水平。 在其他实施方案中,该方法导致给药减少(例如,给药减少约 10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、 70-80%、80-90% 或超过 90%)的免疫抑制治疗与接受者在接受先前供体肾脏后所需的免疫抑制治疗量相比,其中供体肾脏的肾小球不表达人 CD47 的水平高于供体肾小管中人 CD47 的表达水平。 在一些实施方案中,方法导致接受者不需要进一步施用免疫抑制疗法,例如下文8.2.1.1节中描述的免疫抑制疗法。 1001091 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制治疗减少约 10%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约10%至约20%。在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约20%至约30%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约30%至约40%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约40%至约50%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约50%至约60%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约60%至约70%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约70%至约80%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少约80%至约90%。 在一些实施方案中,该方法导致免疫抑制疗法减少超过约90%。 1001101 在一些实施方案中,与其中供体肾脏的肾小球表达人 CD47 的水平高于供体 CA 小管中人 CD47 表达水平的供体肾脏相比,该方法导致供体肾脏存活时间延长 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 肾脏。 在一些实施例中,该方法导致存活时间延长(例如,存活时间延长约 10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-75%、75-100%、100 -200%、200-300%或超过300%;或延长1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-6年、6-8年、8-10年 年、10-15 年或 15-20 年)供体肾脏与供体肾脏相比,其中肾小球供体肾脏表达人 CD47 的水平不高于移植到可比接受者(例如,相同性别和可比年龄、身高和/或 重量)。 在一些实施例中,该方法导致存活时间延长(例如,存活时间延长约 10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-75%、75-100%、100 -200%、200-300%或超过300%;或延长1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-6年、6-8年、8-10年 年、10-15 年或 15-20 年)与所述接受者先前接受的供体肾脏的活力相比,其中供体肾脏的肾小球不表达人 CD47 的水平高于 人 CD47 在供体肾小管中的表达。 1001111 在一些实施方案中,与其中供体肾脏的肾小球不以高于供体小管中人CD47表达水平的水平表达人CD47的供体肾脏相比,供体肾脏的活力延长约10% 肾。 在一些实施例中,生存力延长约10-20%。在一些实施例中,生存力延长约20-30%。 在一些实施例中,生存力延长约30-40%,在一些实施例中,生存力延长约40-50%。 在一些实施例中,生存力延长约50-75%。 在一些实施例中,生存力延长约75-100%。 在一些实施例中,生存力延长约100-200%。 在一些实施例中,生存力延长约200-300%。 在一些实施例中,生存力延长超过 300%。 1001121 在一些实施方案中,与供体肾脏相比,供体肾脏的生存力延长了 1-2 年,其中供体肾脏的肾小球不以高于肾小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47 供肾。 在一些实施例中,供体肾脏的活力延长了 2-3 年。 在一些实施例中,供体肾脏的活力延长了 3-4 年。 在一些实施例中,供体肾脏的活力延长了 4-5 年。 在一些实施方案中,供体肾脏的活力延长了 5-6 年。 在一些实施方案中,供体肾脏的生存力延长了 6-8 年。 在一些实施方案中,供体肾脏的生存力延长了 8-10 年。 在 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 的一些实施方案中,供体肾脏的生存力延长了 10-15 年。 在一些实施例中,供体肾脏的生存能力延长了 15-20 年。 1001131 在一些实施方案中,与供体肾脏的接受者相比,该方法使接受者的生活质量更好,其中供体肾脏的肾小球表达人 CD47 的水平不高于肾小管中人 CD47 的表达水平 供体肾脏。 在其他实施例中,与可比较的接受者(例如,相同性别和可比较的年龄、身高和/或体重的人)相比,该方法导致接受者更好的生活质量,其中可比较的接受者已经接受了供体 肾,其中供体肾的肾小球不以高于供体肾小管中人CD47表达水平的水平表达人CD47。 在其他实施方案中,与所述接受者在先前用供体肾移植后经历的生活质量相比,该方法导致接受者更好的生活质量,其中供体肾的肾小球不以高于 供体肾小管中人 CD47 的表达水平。 1001141 在一些实施方案中,该方法导致更长的存活率(例如,10-20%、20-30%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%,或 90-100% 长;或 2 至 3 倍、3 至 5 倍、5 至 7 倍、7 至 10 倍或 10 至 15 倍)与供体肾脏的接受者相比,移植接受者 其中供体肾小球表达人CD47的水平不高于供体肾小管中人CD47表达水平。 在其他实施方案中,该方法导致更长的存活(例如,10-20%、20-30%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90% 或 90 -100% 长;或 2 至 3 倍、3 至 5 倍、5 至 7 倍、7 至 10 倍或 10 至 15 倍)移植受者与可比接受者的存活率相比( 例如,性别相同且年龄、身高和/或体重相当的人),其中可比较的接受者接受了供体肾脏,其中供体肾脏的肾小球表达人CD47的水平不高于供体肾小管中人CD47的表达水平。 1001151 在一些实施方案中,与供体肾的受体相比,该方法导致移植受体的存活时间延长 10-20%,其中供体肾的肾小球不以高于人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47 在供体肾的小管中。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 20-30%CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 30-40%。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 50-60%。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 60-70%。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 70-80%。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 80-90%。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 90-100%。 1001161 在一些实施方案中,该方法导致移植接受者的存活时间比供体肾脏的接受者长 2 至 3 倍,其中供体肾脏的肾小球不以高于人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47 在供体肾的小管中。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 3 至 5 倍。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 5 至 7 倍。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 7 至 10 倍。 在一些实施例中,该方法使移植接受者的存活时间延长 10 至 15 倍。 8.2.3. 患者群体 1001171 在一个优选的实施方案中,根据本文描述的方法治疗的患者(例如,一个或多个供体移植物的接受者)是人类患者。 如本文所用,术语“受试者”和“患者”可互换使用并且包括任何人类或非人类哺乳动物。非限制性实例包括人类、马科动物、猪科动物、牛科动物、鼠科动物、鼠科动物、犬科动物和猫科动物物种的成员。 在一些实施例中,受试者是非人类灵长类动物。 在一些实施例中,受试者是人。 在特定实施例中,受试者是成人。 在一些实施例中,受试者是人类儿童。 在具体实施方案中,受试者是人并且接受来自猪供体的一个或多个供体移植物。 在其他具体实施方案中,受试者是非人灵长类动物(例如,狒狒、食蟹猴或恒河猴)并且接受来自猪供体的一个或多个移植物。 1001181 一方面,根据本文所述方法治疗的患者需要肾移植。 由于肾功能衰竭或供体肾脏排斥,患者可能需要肾移植。 肾功能衰竭可能有多种原因,包括但不限于高血压(高血压)、身体损伤、糖尿病、肾脏疾病CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019(多囊肾病、肾小球疾病 ) 和自身免疫性疾病,如狼疮。 肾衰竭可能是急性的或慢性的。 肾功能衰竭也可以通过实验室检查如肾小球滤过率、血尿素氮和血清肌酐、影像学检查(超声波、计算机断层扫描)或肾活检来诊断。 [0119] 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者患有 1 期肾病。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者患有2期肾病。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者患有 3 期肾病。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者患有 4 期肾病。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者患有 5 期肾病。 [00120]在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者具有约90或更高的肾小球滤过率(GFR)。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者具有约60-90的GFR。 在一些实施例中,根据本文所述方法治疗的患者具有约30-60的GFR。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者具有约15-30的GFR。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者具有约15或更小的GFR。 8.2.4. 用于预防或降低蛋白尿严重程度的方法[00121]蛋白尿的特征在于尿液中蛋白质水平升高并且可以是肾功能下降和潜在肾衰竭的症状。 它通常由肾小球疾病引起,导致尿液中白蛋白和免疫球蛋白的丢失。 蛋白尿也可能由肾小管疾病和其他肾脏疾病以及某些药物引起。 参见例如 Carroll 和 Temte, Am Fam Physician 62(6):1333-1340 (2000) 和 BMJ Best Practice: Evaluation of Proteinuria [在线] [于 2020 年 8 月 26 日检索],检索自互联网:。 此外,蛋白尿通常发生在肾移植后。 移植后一年的每天 500 毫克或更少(例如,每天 200-500 毫克)的蛋白尿与不良结果(例如,移植物排斥)相关。 参见,例如,Diena 等人。 (2019), BMC Nephrology 20:443 和 Kang 等人。 (2009) 韩国医学杂志。 24 (Suppl 1):S129-34.CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 1001221 每天超过 150 mg 的蛋白质排泄通常用作蛋白尿的诊断。 试纸分析通常用于测量尿液中的蛋白质浓度。 这是一种半定量方法,其结果表示为阴性、痕量、1+、2+、3+或4+。 参见例如 Carroll 和 Temte, Am Fam Physician 62(6):1333-1340 (2000)。 可以测量总蛋白质水平或仅测量白蛋白水平以提供定量测试。 结果可以表示为总蛋白质或白蛋白水平,或校友与肌酸的比例或蛋白质与肌酸的比例。 持续三个月以上的蛋白尿是慢性肾脏病的诊断标准。 相反,减少蛋白尿被用作慢性肾病管理的替代指标。 参见,例如,BMJ Best Practice:蛋白尿评估 [在线] [2020 年 8 月 26 日检索],检索自互联网。 1001231 一方面,本文描述的移植方法(例如从第一个供体猪移植骨髓到第二个供体猪的肾脏的方法,或从一个供体猪移植骨髓和肾脏的方法,如第 8.2 以上),导致蛋白尿的风险、严重程度或持续时间降低。 在具体实施方案中,本文描述的移植方法(例如,上文第​​ 8.2 节中描述的方法)导致供体肾小球以高于供体肾小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47 减轻蛋白尿的严重程度。 在具体实施方案中,本文描述的移植方法(例如,上文第​​ 8.2 节中描述的方法)导致供体肾小球以高于供体肾小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47 减少蛋白尿的持续时间。 在具体实施方案中,本文描述的移植方法(例如,上文第​​ 8.2 节中描述的方法)导致供体肾小球以高于供体肾小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47 在治疗人群中降低蛋白尿的风险。 例如,与在接受供体肾的患者中观察到的蛋白尿严重性相比,根据本文方法治疗的患者的蛋白尿严重性可能降低,其中供体肾的肾小球不以更高水平表达人CD47 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 1001241 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重程度, 减少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重性降低了 10%。在一些实施方案中,通过蛋白质测量的蛋白尿的严重性降低了 10%尿液中的水平降低了 20%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重程度降低了 30%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重程度降低了 40%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重程度降低了 50%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重性降低了60%。在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重性降低了70%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重程度降低了 80%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重性降低了 90%。 在一些实施方案中,通过尿液中的蛋白质水平测量的蛋白尿的严重性降低超过 95%。 1001251 在一些实施方案中,根据本文提供的方法治疗的患者将不会经历蛋白尿,定义为尿液中每天排泄或超过 150 mg 蛋白质。在一些实施方案中,根据本文提供的方法治疗的患者可能经历 短暂性蛋白尿在 1、2、3、3-7、7-10、10-14 天或 1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7 后消退 -8周,或移植后1、2、3、4、5、6个月。 1001261 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者尿液中的总蛋白浓度小于约 60 mg/天、小于约 80 mg/天、小于约 100 mg/天、小于 每天少于约 120 毫克,每天少于约 140 毫克,每天少于约 160 毫克,每天少于约 200 毫克,每天少于约 220 毫克,每天少于约 240 毫克,每天少于 每天约 260 毫克,每天少于约 280 毫克,每天少于约 300 毫克,每天少于约 320 毫克,每天少于约 340 毫克,每天少于约 360 毫克,每天少于约 380 每天 mg 或每天少于约 400 mg。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约60mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度低于每天约 80 mgCA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约100mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约120mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者尿液中的总蛋白浓度低于约 140 mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约160mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约200mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约220mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约240mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约260mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约280mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约300mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者尿液中的总蛋白浓度低于每天约 320 毫克。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约340mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约360mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约380mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度小于约 400 mg/天。 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 1001271 In 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的出现蛋白尿的接受者尿液中白蛋白的浓度小于约 5 mg/天、小于约 10 mg/天、小于约 20 mg/天、小于约 30 mg 每天 mg,每天少于约 40 mg,每天少于约 50 mg,每天少于约 60 mg,每天少于约 70 mg,每天少于约 80 mg,每天少于约 90 mg 每天或少于每天约 100 毫克。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约5mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约10mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约20mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约30mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗形成蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约40mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约50mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗形成蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约60mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约70mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗形成蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约80mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述的方法治疗的发生蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约90mg/天。 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中白蛋白的浓度小于约100mg/天。 1001281 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的 24 小时尿样中蛋白质与肌酸酐的比率小于约 0.2、小于约 0.4、小于约 0.6、小于约 0.8 或更小 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的 24 小时尿样中白蛋白与肌酸酐的比率小于约 0.02、小于约 0.04、小于约 0.06,CA 03191806 2023 - 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 小于约 0.08 或小于约 0.1。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中蛋白质与肌酸酐的比率小于约0.2。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中蛋白质与肌酸酐的比率小于约0.4。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中蛋白质与肌酸酐的比率小于约0.6。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中蛋白质与肌酸酐的比率小于约0.8。 在在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的 24 小时尿样中蛋白质与肌酐的比率小于约 10。在一些实施方案中,患者 24 小时尿样中白蛋白与肌酐的比率 根据本文所述的方法处理的小于约0.02。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中白蛋白与肌酸酐的比率小于约0.04。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中白蛋白与肌酸酐的比率小于约0.06。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中白蛋白与肌酸酐的比率小于约0.08。 在一些实施方案中,根据本文所述方法治疗的患者的24小时尿样中白蛋白与肌酸酐的比率小于约0.1。 1001291 在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的接受者发生蛋白尿的风险降低了约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、700%、/0%、80%、90% 或 95% 与供体肾脏接受者的风险相比,其中供体肾脏的肾小球不以高于供体肾小管中人 CD47 表达水平的水平表达人 CD47。 在一些实施例中,风险降低了约10%。 在一些实施例中,风险降低了约20%。 在一些实施例中,风险降低了约30%。 在一些实施例中,风险降低了约40%。 在一些实施例中,风险降低了约50%。 在一些实施例中,风险降低了约 60%。 在一些实施例中,风险降低了约 70%。 在一些实施例中,风险降低了约80%。 在一些实施例中,风险降低了约 90%。 在一些实施方案中,风险降低了约 95%。CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 表 1:序列表 1 precursor SQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRV [Homo sapiens] VSWFSPNENTLIVTFPIF'ATLLFWGQFGTKTLKYRSGGMDEKTTALL (NCB T Reference VA GLVITVIVTVGATLFVPGEYSLKNATGL GLIVT STGILTLLHYYV Sequence: FSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGL SLCIAACIPMHGPLLISGLS NP_001768.1 1LALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMM NDE CD47 molecule 2 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVT [Homo sapiens NMEAQNTIEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNK STVPTDFSSAKIEV (huma it)] SQLLK GD A SLKMDK SD A VSHTGNYTCEVTELTREGETTTELKYRV VSWF SPNENILIVIFPIFAILLFW GQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALL NP 942088 VAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYV F STAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGL SLCIAACIPMHGPLLISGLS ILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRNN Homo sapiens CD47 3 GCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCCTGTGACGCGCGGCGGCGG molecule (CD47), TCGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGCTGCTGCTCCGGACA transcript variant 1, CCTGCGGCGGCGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGATGT naRNA GGCCCCTGGTAGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCGGCGTGCTGCGG ATCAGCTCAGCTACTATTTAATAAAACAAAATCTGTAGAATTC NM_001777 ACGTTTTGTAATGACACTGTCGTCATTCCATGCTTTGTTACTAA TATGGAGGCACAAAACACTACTGAAGTATACGTAAAGTGGAA ATTTAAAGGAAGAGATATTTACACCTTTGATGGAGCTCTAAAC AAGTCCACTGTCCCCACTGACTTTAGTAGTGCAAAAATTGAAG TCTCACAATTACTAAAAGGAGATGCCTCTTTGAAGATGGATAA GAGTGATGCTGTCTCACACACAGGAAACTACACTTGTGAAGTA ACAGAATTAACCAGAGAAGGTGAAACGATCATCGAGCTAAAA TATCGTGTTGTTTCATGGTTTTCTCCAAATGAAAATATTCTTAT TGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATACTCCTGTTCTGGGGACAGT TTGGTATTAAAACACTTAAATATAGATCCGGTGGTATGGATGA GA A A A CA ATTGCTTTA CTTGTTGCTGGA CTA GTGATC A CTGTC ATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTCGTCCCAGGTGAATATTC ATTAAAGAATGCTACTGGCCTTGGTTTAATTGTGACTTCTACA GGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAGCGA TTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTG ATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTGGACTGAGTCTCTGTATTGC GGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTG AGTATCTTAGCTCTAGCACAATTACTTGGACTAGTTTATATGA AATTTGTGGCTTCCAATCAGAAGACTATACAACCTCCTAGGAA AGCTGTAGAGGAACCCCTTAATGCATTCAAAGAATCAAAAGG AATGATGAATGATGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCG ATTTGGAGAGTAGTAAGACGTGAAAGGAATACACTTGTGTTTA AGCACCATGGCCTTGATGATTCACTGTTGGGGAGAAGAAACA AGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAGACCCTTACGTGATTG TTAGTTAAGTTTTTATTCAAAGCAGCTGTAATTTAGTTAATAAACA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence ATAATTATGATCTATGTTGTTTGCCCAATTGAGATCCAGTTTTTTGTTGTTATTTTTAATCAATTAGGGGCAATAGTAGAATGGACA ATTTCCAAGAATGATGCCTTTCAGGTCCTAGGGCCTCTGGCCT CTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGTGATAACTACTTAG CACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCTATGAAAACCAGTG GCTTCCATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCACAGCAGCTTTG GGCAGTTATGGCAGTATGGCATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCAC TTCTGGGTCAATGGAATAATAAATTAAGTACAGGCAGGAATTT GGTTGGGAGCATCTTGTATGATCTCCGTATGATGTGATATTGA TGGAGATAGTGGTCCTCATTCTTGGGGGTTGCCATTCCCACAT TCCCCCTTCAACAAACAGTGTAACAGGTCCTTCCCAGATTTAG GGTACTTTTATTGATGGATATGTTTTCCTTTTATTCACATAACC CCTTGAAACCCTGTCTTGTCCTCCTGTTACTTGCTTCTGCTGTA CAAGATGTAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAACATGGTCTAGTGA CACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGGAGCCAGACTTGTTCTCA GAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAGCTATGGTTGT AACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAAAAATCTAC AGTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATGAAAAAAGC AAGATTGAAATTTGAACTATGAGTCTCCTGCATGGCAACAAAA TGTGTGTCA CCATCA GGCCA A CA GGCCA GCCCTTGA ATGGGG ATTTATTACTGTTGTATCTATGTTGCATGATAAACATTCATCAC CTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCCCCTTCCCCTATGATT GAAAAGTAAACAAAACCCACATTTCCTATCCTGGTTAGAAGA AAATTAATGTTCTGACAGTTGTGATCGCCTGGAGTACTTTTAG ACTTTTAGCATTCGTTTTTTACCTGTTTGTGGATGTGTGTTTGT ATGTGCATACGTATGAGATAGGCACATGCATCTTCTGTATGGA CAAAGGTGGGGTACCTACAGGAGAGCAAAGGTTAATTTTGTG CTTTTAGTAAAAACATTTAAATACAAAGTTCTTTATTGGGTGG AATTATATTTGATGCAAATATTTGATCACTTAAAACTTTTAAA ACTTCTAGGTAATTTGCCACGCTTTTTGACTGCTCACCAATACC CTGTAAAAATACGTAATTCTTCCTGTTTGTGTAATAAGATATTC ATATTTGTAGTTGCATTAATAATAGTTATTTCTTAGTCCATCAG ATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATGCCAAATTGATTGTCATATTT CATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAAACCTAAATTTA TGACCTGCTGAGGCCTCTCAGAAAACTGAGCATACTAGCAAG ACAGCTCTTCTTGAAAAAAAAAATATGTATACACAAATATATA CGTATATCTATATATACGTATGTATATACACACATGTATATTCT TCCTTGATTGTGTAGCTGTCCAAAATAATAACATATATAGAGG GAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCCTGCAGCACT TTTTCCTTCTGAAAATATTTACATTTTGCTAACCTAGTTTGTTA CTTTAAAAATCAGTTTTGATGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGG ACTTGAAAAAGATCCAAGCTCCTATTAGAAAAGGTATGAAAA TCTTTATAGTAAAATTTTTTATAAACTAAAGTTGTACCTTTTAA TATGTAGTAAACTCTCATTTATTTGGGGTTCGCTCTTGGATCTC ATCCATCCATTGTGTTCTCTTTAATGCTGCCTGCCTTTTGAGGC ATTCACTGCCCTAGACAATGCCACCAGAGATAGTGGGGGAAA TGCCAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTCCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence TCTGGATAAGTGACCACAGAAGCAGGAGTCCTCCTGCTTGGGC ATCATTGGGCCAGTTCCTTCTCTTTAAATCAGATTTGTAATGGC TCCCAAATTCCATCACATCACATTTAAATTGCAGACAGTGTTT TGCACATCATGTATCTGTTTTGTCCCATAATATGCTTTTTACTC CCTGATCCCAGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCAGTTTTATT TATTGTGTGTTCTCACAGTGACACCATTTGTCCTTTTCTGCAAC AACCTTTCCAGCTACTTTTGCCAAATTCTATTTGTCTTCTCCTT CAAAACATTCTCCTTTGCAGTTCCTCTTCATCTGTGTAGCTGCT CTTTTGTCTCTTAACTTACCATTCCTATAGTACTTTATGCATCT CTGCTTAGTTCTATTAGTTTTTTGGCCTTGCTCTTCTCCTTGATT TTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTCATTCTCT CTTCCTGCAGTGTTTTGCATACATCAGAAGCTAGGTACATAAG TTAAATGATTGAGAGTTGGCTGTATTTAGATTTATCACTTTTTA ATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTCTTTCTGTTTTTTTTTTTT GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTAATTTCACA TGCTCTAAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCCTGGAAAC TCCAGGTCCATTCTGTTTAAATCCCTAAGAATGTCAGAATTAA AATAACAGGGCTATCCCGTAATTGGAAATATTTCTTTTTTCAG GATGCTATAGTCAATTTAGTAAGTGACCACCAAATTGTTATTT GCACTAACAAAGCTCAAAACACGATAAGTTTACTCCTCCATCT CAGTAATAAAAATTAAGCTGTAATCAACCTTCTAGGTTTCTCT TGTCTTAAAATGGGTATTCAAAAATGGGGATCTGTGGTGTATG TATGGAAACACATACTCCTTAATTTACCTGTTGTTGGAAACTG GAGAAATGATTGTCGGGCAACCGTTTATTTTTTATTGTATTTTA TTTGGTTGAGGGATTTTTTTATAAACAGTTTTACTTGTGTCATA TTTTAAAATTACTAACTGCCATCACCTGCTGGGGTCCTTTGTTA GGTCATTTTCAGTGACTAATAGGGATAATCCAGGTAACTTTGA AGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGCCTTTAGC TTTGACAGTTCTTAATTAAGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCAT AAATTTCTCTTTTTGAAAAAAAGAAAGCATTTGTACTAAGCTC CTCTGTAAGACAACATCTTAAATCTTAAAAGTGTTGTTATCAT GACTGGTGAGAGAAGAAAACATTTTGTTTTTATTAAATGGAGC ATTATTTACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTAGATCCCACATCG TATAAATATCTATTAACCATTCTAAATAAAGAGAACTCCAGTG TTGCTATGTGCAAGATCCTCTCTTGGAGCTTTTTTGCATAGCAA TTAAAGGTGTGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTTGCAGTGATT TGA A GACCA A A GTTGTTTTA CA GCTGTGTTA C CGTTA A A GGTT TTTTTTTTTATATGTATTAAATCAATTTATCACTGTTTAAAGCTT TGAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTTTTTATTTAAAAAA AAACATAACTTTGTAAATATTACCCTGTAATATTATATATACTT AATAAAACATTTTAAGCTATTTTGTTGGGCTATTTCTATTGCTG C​​TACAGCAGACCACAAGCACATTTCTGAAAAATTTAATTTATT AATGTATTTTTAAGTTGCTTATATTCTAGGTAACAATGTAAAG AATGATTTAAAATATTAATTATGAATTTTTTGAGTATAATACCC AATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTTTTAATTAAAAGTTTTAA ATCAGTCCAA Homo sapiens CD47 4 GGGGAGCAGGCGGGGGAGCGGGCGGGAAGCAGTGGGAGCGCCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 名称 SEQ ID NO:序列分子(CD47),GCGTGCGCGCGGCCGTGCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCCTGT 转录变体 2.GACGCGCGGCGGCGGTCGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCG mRNA GCTGCTGCTCCAGACACCTGCGGCGGCGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGATGTGGCCCCTGGTAGCGGCGCTGTTGCTG NCBI Reference GGCTCGGCGTGCTGCGGATCAGCTCAGCTACTATTTAATAAAA Sequence: CAAAATCTGTAGAATTCACGTTTTGTAATGACACTGTCGTCAT NM_198793.3 TCCATGCTTTGTTACTAATATGGAGGCACAAAACACTACTGAA GTATACGTAAAGTGGAAATTTAAAGGAAGAGATATTTACACC TTTGATGGAGCTCTAAACAAGTCCACTGTCCCCACTGACTTTA GTAGTGCAAAAATTGAAGTCTCACAATTACTAAAAGGAGATG CCTCTTTGAAGATGGATAAGAGTGATGCTGTCTCACACACAGG AAACTACACTTGTGAAGTAACAGAATTAACCAGAGAAGGTGA AACGATCATCGAGCTAAAATATCGTGTTGTTTCATGGTTTTCTC CAAATGAAAATATTCTTATTGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATA CTCCTGTTCTGGGGACAGTTTGGTATTAAAACACTTAAATATA GATCCGGTGGTATGGATGAGAAAACAATTGCTTTACTTGTTGC TGGACTAGTGATCACTGTCATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTT TCGTCCCAGGTGAATATTCATTAAAGAATGCTACTGGCCTTGG TTTAATTGTGACTTCTACAGGGATATTAATATTACTTCACTACT ATGTGTTTA GT A CA GCGA TTGGATTA A CCTCCTTCGTCATTGCC ATATTGGTTATTCAGGTGATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTG GACTGAGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCAATGCATGGCCC TCTTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACAATTAC TTGGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGCTTCCAATCAGAAGAC TATACAACCTCCTAGGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCC GATTTGGAGAGTAGTAAGACGTGAAAGGAATACACTTGTGTTT AAGCACCATGGCCTTGATGATTCACTGTTGGGGAGAAGAAAC AAGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAGACCCTTACGTGATT GTTAGTTAAGTTTTTATTCAAAGCAGCTGTAATTTAGTTAATAA AATAATTATGATCTATGTTGTTTGCCCAATTGAGATCCAGTTTT TTGTTGTTATTTTTAATCAATTAGGGGCAATAGTAGAATGGAC AATTTCCAAGAATGATGCCTTTCAGGTCCTAGGGCCTCTGGCC TCTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGTGATAACTACTTA GCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCTATGAAAACCAGT GGCTTCCATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCACAGCAGCTTT GGGCAGTTATGGCAGTATGGCATTAGCTGAGAGGTGTCTGCCA CTTCTGGGTCAATGGAATAATAAATTAAGTACAGGCAGGAATT TGGTTGGGAGCATCTTGTATGATCTCCGTATGATGTGATATTG ATGGAGATAGTGGTCCTCATTCTTGGGGGTTGCCATTCCCACA TTCCCCCTTCAACAAACAGTGTAACAGGTCCTTCCCAGATTTA GGGTACTTTTATTGATGGATATGTTTTCCTTTTATTCACATAAC CCCTTGAAACCCTGTCTTGTCCTCCTGTTACTTGCTTCTGCTGT ACAAGATGTAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAACATGGTCTAGTG ACACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGGAGCCAGACTTGTTCTC AGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAGCTATGGTTG TAACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAAAAATCTA CAGTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATGAAAAAAGCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence CAAGATTGAAATTTGAACTATGAGTCTCCTGCATGGCAACAAA ATGTGTGTCACCATCAGGCCAACAGGCCAGCCCTTGAATGGG GATTTATTACTGTTGTATCTATGTTGCATGATAAACATTCATCA CCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCCCCTTCCCCTATGAT TGAAAAGTAAACAAAACCCACATTTCCTATCCTGGTTAGAAGA AAATTAATGTTCTGACAGTTGTGATCGCCTGGAGTACTTTTAG ACTTTTAGCATTCGTTTTTTACCTGTTTGTGGATGTGTGTTTGT ATGTGCATACGTATGAGATAGGCACATGCATCTTCTGTATGGA CAAAGGTGGGGTACCTACAGGAGAGCAAAGGTTAATTTTGTG CTTTTAGTAAAAACATTTAAATACAAAGTTCYTTATTGGGTGG AATTATATTTGATGCAAATATTTGATCACTTAAAACTTTTAAA ACTTCTAGGTAATTTGCCACGCTTTTTGACTGCTCACCAATACC CTGTAAAAATACGTAATTCTTCCTGTTTGTGTAATAAGATATTC ATATTTGTAGTTGCATTAATAATAGTTATTTCTTAGTCCATCAG ATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATGCCAAATTGATTGTCATATTT CATGTTGGGACCAAGTAGTTTGCCCATGGCAAACCTAAATTTA TGACCTGCTGAGGCCTCTCAGAAAACTGAGCATACTAGCAAG ACAGCTCTTCTTGAAAAAAAAAATATGTATACACAAATATATA CGTATATCTATATATACGTATGTATATACACACATGTATATTCT TCCTTGATTGTGTAGCTGTCCAAAATAATAACATATATAGAGG GAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCCTGCAGCACT TTTTCCTTCTGAAAATATTTACATTTTGCTAACCTAGTTTGTTA CTTTAAAAATCAGTTTTGATGAAAGGAGGGAAAAGCAGATGG ACTTGAAAAAGATCCAAGCTCCTATTAGAAAAGGTATGAAAA TCTTTATAGTAAAATTTTTTATAAACTAAAGTTGTACCTTTTAA TATGTAGTAAACTCTCATTTATTTGGGGTTCGCTCTTGGATCTC ATCCATCCATTGTGTTCTCTTTAATGCTGCCTGCCTTTTGAGGC ATTCACTGCCCTAGACAATG CCACCAGAGATAGTG G G GGAAA TGCCAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTGTCAGCTTC TCTGGATAAGTGACCACAGAAGCAGGAGTCCTCCTGCTTGGGC ATCATTGGGCCAGTTCCTTCTCTTTAAATCAGATTTGTAATGGC TCCCAAATTCCATCACATCACATTTAAATTGCAGACAGTGTTT TGCACATCATGTATCTGTTTTGTCCCATAATATGCTTTTTACTC CCTGATCCCAGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCAGTTTTATT TATTGTGTGTTCTCACAGTGACACCATTTGTCCTTTTCTGCAAC AACCTTTCCAGCTACTTTTGCCAAATTCTATTTGTCTTCTCCTT CAA A A CATTCTCCTTTGCA GTTCCTCTTCATCTGT GTA GCTGCT CTTTTGTCTCTTAACTTACCATTCCTATAGTACTTTATGCATCT CTGCTTAGTTCTATTAGTTTTTTGGCCTTGCTCTTCTCCTTGATT TTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTTCATTCTCT CTTCCTGCAGTGTTTTGCATACATCAGAAGCTAGGTACATAAG TTA A ATGATTGA GA GTTGGCTGTATTTA GATTTATC A CTTTTTA ATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTCTTTCTGTTTTTTTTTTTT GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTAATTTCACA TGCTCTAAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCCTGGAAAC TCCAGGTCCATTCTGTTTAAATCCCTAAGAATGTCAGAATTAA AATAACAGGGCTATCCCGTAATTGGAAATATTTCTTTTTTCAGCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/ 051594 PCT/US2021/049019 名称 序列号:序列GAGAAATGATTGTCGGGCAACCGTTTATTTTTTATTGTATTTTA TTTGGTTGAGGGATTTTTTTATAAACAGTTTTACTTGTGTCATA TTTTAAAATTACTAACTGCCATCACCTGCTGGGGTCCTTTGTTA GGTCATTTTCAGTGACTAATAGGGATAATCCAGGTAACTTTGA AGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCTGCCTTTAGC TTTGACAGTTCTTAATTAAGATCATTGAAGACCAGCTTTCTCAT AAATTTCTCTTTTTGAAAAAAAGAAAGCATTTGTACTAAGCTC CTCTGTAAGACAACATCTTAAATCTTAAAAGTGTTGTTATCAT GACTGGTGAGAGAAGAAAACATTTTGTTTTTATTAAATGGAGC ATTATTTACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTAGATCCCACATCG TATAAATATCTATTAACCATTCTAAATAAAGAGAACTCCAGTG TTGCTATGTGCAAGATCCTCTCTTGGAGCTTTTTTGCATAGCAA TTAAAGGTGTGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTTGCAGTGATT TGAAGACCAAAGTTGTTTTACAGCTGTGTTACCGTTAAAGGTT TTTTTTTTTATATGTATTA A ATCA ATTTATCACTGTTTA A AGCTT TGAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTTTTTATTTAAAAAA AAACATAACTTTGTAAATATTACCCTGTAATATTATATATACTT AATAAAACATTTTAAGCTATTTTGTTGGGCTATTTCTATTGCTG C​​TACAGCAGACCACAAGCACATTTCTGAAAAATTTAATTTATT AATGTATTTTTAAGTTGCTTATATTCTAGGTAACAATGTAAAG AATGATTTAAAATATTAATTATGAATTTTTTGAGTATAATACCC AATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTTTTAATTAAAAGTTTTAA ATCAGTC leukocyte surface 5 MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRN antigen CD47 VEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSD isoform 4 precursor LINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTAFN [Mus musculus] TDQGSACSYEEEKGGCKLVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGI LTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNAS NCBI Reference GLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVG Sequence: LCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQP NP_034711.1 PRNR leukocyte surface 6 MVVPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVT antigen CD47 NMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEV isoform 3 precursor SQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRV [Homo sapiens] VSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALL VAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYV NCBI Reference FSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGL SLCIAACIPMHGPLLISGLS NP_001369235.1 ILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNE leukocyte surface 7 MVVPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVT antigen CD47 NMEAQNT IEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/ US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence isoform X2 [Homo SQLLKGDASLKMDKSDAVSHIGNYTCEVTELTREGETIIELKYRV sapiens] VSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALL XP_005247966.1 VAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYV FSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGL SLCIAACIPMHGPLLISGLS ILALAQLLGLVYMKFVE PREDIC lED: Homo 8 GTGCGCGCGGCCGTGCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCCTGTGA sapiens CD47 CGCGCGGCGGCGGTCGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGC molecule (CD47), TGCTGCTCCGGACACCTGCGGCGGCGGCGGCGACCCCGCGGC transcript variant GGGCGCGGAGATGTGGCCCCTGGTAGCGGCGCTGTTGCTGGG X11, mRNA CTCGGCGTGCTGCGGATCAGCTCAGCTACTATTTAATAAAACA AAATCTGTAGAATTCACGTTTTGTAATGACACTGTCGTCATTC NCBI Reference CATGCTTTGTTACTAATATGGAGGCACAAAACACTACTGAAGT Sequence: ATACGTAAAGTGGAAATTTAAAGGAAGAGATATTTACACCTTT XM_005247909.2 GATGGAGCTCTAAACAAGTCCACTGTCCCCACTGACTTTAGTA GTGCAAAAATTGAAGTCTCACAATTACTAAAAGGAGATGCCT CTTTGAAGATGGATAAGAGTGATGCTGTCTCACACACAGGAA ACTACACTTGTGAAGTAACAGAATTAACCAGAGAAGGTGAAA CGATCATCGAGCTAAAATATCGTGTTGTTTCATGGTTTTCTCCA AATGAAAATATTCTTATTGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATACT CCTGTTCTGGGGACAGTTTGGTATTAAAACACTTAAATATAGA TCCGGTGGTATGGATGAGAAAACAATTGCTTTACTTGTTGCTG GACTAGTGATCACTGTCATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTC GTCCCAGGTGA ATATTCATTAAAGAATGCTACTGGCCTTGGTT TA ATTGTGA CTTCTA CA GGGATA TTA ATATTACTTCACTACTAT GTGTTTAGTACAGCGATTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCC AT ATTGGTTATTCAGGTGATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTGGA CTGAGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTC TTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACAATTACTT GGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGAATAACTGAAGTGAAGTG ATGGACTCCGATTTGGAGAGTAGTAAGACGTGAAAGGAATAC ACTTGTGTTTAAGCACCATGGCCTTGATGATTCACTGTTGGGG AGAAGAAACAAGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAGACCC TTACGTGATTGTTAGTTAAGTTTTTATTCAAAGCAGCTGTAATT TAGTTAATAAAATAATTATGATCTATGTTGTTTGCCCAATTGA GATCCA GTTITTTGTTGTTATTITTAATCAATTAGGGGCAATAG TAGAATGGACAATTTCCAAGAATGATGCCTTTCAGGTCCTAGG GCCTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGTGA TAACTACTTAGCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCTAT GAAAACCAGTGGCTTCCATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCA CAGCAGCTTTGGGCAGTTATGGCAGTATGGCATTAGCTGAGAG GTGTCTGCCACTTCTGGGTCAATGGAATAATAAATTAAGTACA GGCAGGAATTTGGTTGGGAGCATCTTGTATGATCTCCGTATGA TGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTCATTCTTGGGGGTTGC CATTCCCACATTCCCCCTTCA ACAAACAGTGTAACAGGTCCTT CCCA GA TTTA GGGTA CTTTTA TTGAT GGATATGTTTTCCTTTTA TTCACATAACCCCTTGAAACCCTGTCTTGTCCTCCTGTTACTTG CTTCTGCTGTACAAGATGTAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAACATCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence GGTCTAGTGACACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGGAGCCAGA CTTGTTCTCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAG CTATGGTTGTAACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCAAAAATCTACAGTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATG AAAAAAGCAAGATTGAAATTTGAACTATGAGTCTCCTGCATG GCAACAAAATGTGTGTCACCATCAGGCCAACAGGCCAGCCCT TGAATGGGGATTTATTACTGTTGTATCTATGTTGCATGATAAA CATTCATCACCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCCCCTTC CC CTATGATT GAAAAGTAAACAAAAC C CAC ATTTC CTATC CTG GTTAGAAGAAAATTAATGTTCTGACAGTTGTGATCGCCTGGAG TACTTTTAGACTTTTAGCATTCGTTTTTTACCTGTTTGTGGATGT GTGTTTGTATGTGCATACGTATGAGATAGGCACATGCATCTTC TGTATGGACAAAGGTGGGGTACCTACAGGAGAGCAAAGGTTA ATTTTGTGCTTTTAGTAAAAACATTTAAATACAAAGTTCTTTAT TGGGTGGAATTATATTTGATGCAAATATTTGATCACTTAAAAC TTTTA A A A CTTCTA GGTA ATTTGCCA CGCTTTTTGACTGCTCAC CAATAC CCTGTAAAAATACGTAATTCTTCCTGTTTGTGTAATA AGATATTCATATTTGTAGTTGCATTAATAATAGTTATTTCTTAG TCCATCAGATGTTCCCGTGTGCCTCTTTTATGCCAAATTGATTG TCATA TTTCA TGTTGGGACCA A GTAGTTTGCCCATGGCA A ACC TAAATTTATGACCTGCTGAGGCCTCTCAGAAAACTGAGCATAC TAGCAAGACAGCTCTTCTTGAAAAAAAAAATATGTATACACA AATATATACGTATATCTATATATACGTATGTATATACACACAT GTATATTCTTCCTTGATTGTGTAGCTGTCCAAAATAATAACAT ATATAGAGGGAGCTGTATTCCTTTATACAAATCTGATGGCTCC TGCAGCACTTTTTCCTTCTGAAAATATTTACATTTTGCTAACCT AGTTTGTTACTTTAAAAATCAGTTTTGATGAAAGGAGGGAAAA GCAGATGGACTTGAAAAAGATCCAAGCTCCTATTAGAAAAGG TATGAAAATCTTTATAGTAAAATTTTTTATAAACTAAAGTTGT ACCTTTTAATATGTAGTAAACTCTCATTTATTTGGGGTTCGCTC TTGGATCTCATCCATCCATTGTGTTCTCTTTAATGCTGCCTGCC TTTTGAGGCATTCACTGCCCTAGACAATGCCACCAGAGATAGT GGGGGAAATGCCAGATGAAACCAACTCTTGCTCTCACTAGTTG TCAGCTTCTCTGGATAAGTGACCACAGAAGCAGGAGTCCTCCT GCTTGGGCATCATTGGGCCAGTTCCTTCTCTTTAAATCAGATTT GTAATGGCTCCCAAATTCCATCACATCACATTTAAATTGCAGA CA GTGTTTTGCA CA TCATGTA TCTGTTTTGTCCC A TA ATATGCT TTTTACTCCCTGATCCCAGTTTCTGCTGTTGACTCTTCCATTCA GTTTTATTTATTGTGTGTTCTCACAGTGACACCATTTGTCCTTT TCTGCAACAACCTTTCCAGCTACTTTTGCCAAATTCTATTTGTC TTCTCCTTCAAAACATTCTCCTTTGCAGTTCCTCTTCATCTGTG TAGCTGCTCTTTTGTCTCTTAACTTACCATTCCTATAGTACTTT ATGCATCTCT GCTTAGTTCTATTAGTTTTTTGGC CTTGCTCTT CT CCTTGATTTTAAAATTCCTTCTATAGCTAGAGCTTTTCTTTCTTT CATTCTCTCTTCCTGCAGTGTTTTGCATACATCAGAAGCTAGGT ACATAAGTTAAATGATTGAGAGTTGGCTGTATTTAGATTTATC ACTTTTTAATAGGGTGAGCTTGAGAGTTTTCTTTCTTTCTGTTTCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence TTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTA ATTTCACATGCTCTAAAAACCTTCAAAGGTGATTATTTTTCTCC TGGAAACTCCAGGTCCATTCTGTTTAAATCCCTAAGAATGTCA GAATTAAAATAACAGGGCTATC CC GTAATTGGAAATATTT CTT TTTTCAGGATGCTATAGTCAATTTAGTAAGTGACCACCAAATT GTTATTTGCACTAACAAAGCTCAAAACACGATAAGTTTACTCC TCCATCTCAGTAATAAAAATTAAGCTGTAATCAACCTTCTAGG TTTCTCTTGTCTTAAAATGGGTATTCAAAAATGGGGATCTGTG GTGTATGTATGGAAACACATACTCCTTAATTTACCTGTTGTTG GAAACTGGAGAAATGATTGTCGGGCAACCGTTTATTTTTTATT GTATTTTATTTGGTTGAGGGATTTTTTTATAAACAGTTTTACTT GTGTCATATTTTAAAATTACTAACTGCCATCACCTGCTGGGGT CCTTTGTTAGGTCATTTTCAGTGAC TAATAGGGATAATCCAGG TAACTTTGAAGAGATGAGCAGTGAGTGACCAGGCAGTTTTTCT GCCTTTAGCTTTGAC AGTTCTTAATTAAGAT CATTGAAGACCA GCTTTCTCA TA A A TTTCTCTTTTTGA A AAA AA GA A A GCATTT GT ACTAAGCTCCTCTGTAAGACAACATCTTAAATC TTAAAAGTGT TGTTATCATGACTGGTGAGAGAAGAAAACATTTTGTTTTTATT AAATGGAGCATTATTTACAAAAAGCCATTGTTGAGAATTAGAT CCCACATCGTATAAATATCTATTAACCATTCTAAATAA AGAGA ACTCCAGTGTTGCTATGTGCAAGATCCTCTCTTGGAGCTTTTTT GCATAGCAATTAAAGGTGTGCTATTTGTCAGTAGCCATTTTTTT GCAGTGATTTGAAGACCAAAGTTGTTTTACAGCTGTGTTACCG TTAAAGGTTTTTTTTTTTATATGTATTAAATCAATTTATCACTG TTTAAAGCTTTGAATATCTGCAATCTTTGCCAAGGTACTTTTTT ATTTAAAAAAAAACATAACTTTGTAAATATTACCCTGTAATAT TATATATACTTAATAAAACATTTTAAGCTA Homo sapiens CD47 9 GCAGCCTGGGCAGTGGGTCCTGCCTGTGACGCGCGGCGGCGG molecule (CD47), TCGGTCCTGCCTGTAACGGCGGCGGCGGC TGCTGCTCCGGACA transcript variant 3, CCTGCGGCGGCGGCGGCGACCCCGCGGCGGGCGCGGAGATGT mRNA GGCCCCTGGTAGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCGGCGTGCTGCGG ATCAGCTCAGCTACTATTTAATAAAACAAAATCTGTAGAATTC NCBI Reference AC GTTTTGTAATGACACTGTC GTCATTC CAT GCTTTGTTACTAA Sequence: TATGGAGGCACAAAACACTACTGAAGTATACGTAAAGTGGAA NM_001382306.1 ATTTAAAGGAAGAGATATTTACACCTTTGATGGAGCTCTAAAC AAGTCCACTGTCCCCACTGACTTTAGTAGTGCAAAAATTGAAG TCTCACAATTACTAAAAGGAGATGCCTCTTTGAAGATGGATAA GAGTGATGCTGTCTCACACACAGGAAACTACACTTGTGAAGTA ACAGAATTAACCAGAGAAGGTGAAACGATCATCGAGCTAAAA TATCGTGTTGTTTC ATGGTTTTCTCCAAATGAAAATATTCTTAT TGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATACTCCTGTTCTGGGGACAGT TTGGTATTAAAACACTTAAATATAGATCCGGTGGTATGGATGA GAAAACAATTGCTTTACTTGTTGCTGGACTAGTGATCACTGTC A TTGTCA TTGTTGGAGCCA TTCTTTTCGTCCCA GGTGA A TA TTC A TTA AA GA A TGCT A CTGGCCTTGGTTTA A TTGTGA CTTCTA CA GGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAGCGA TTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGCA 03191806 2023- 3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 Name SEQ ID NO: Sequence ATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTGGACTGAGTCTCTGTATTGC GGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTG AGTATCTTAGCTCTAGCACAATTACTTGGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGCTTCCAATCAGAAGACTATACAACCTCCTAGGAA AGCTGTAGAGGAACCCCTTAATGAATAACTGAAGTGAAGTGA TGGACTCCGATTTGGAGAGTAGTAAGACGTGAAAGGAATACA CTTGTGTTTAAGCACCATGGCCTTGATGATTCACTGTTGGGGA GAAGAAACAAGAAAAGTAACTGGTTGTCACCTATGAGACCCT TACGTGATTGTTAGTTAAGTTTTTATTCAAAGCAGCTGTAATTT AGTTAATAAAATAATTATGATCTATUTTGTTTGCCCAATTGAG ATCCAGTTTTTTGTTGTTATTTTTAATCAATTAGGGGCAATAGT AGAATGGACAATTTCCAAGAATGATGCCITTCAGGTCCTAGGG CCTCTGGCCTCTAGGTAACCAGTTTAAATTGGTTCAGGGTGAT AACTACTTAGCACTGCCCTGGTGATTACCCAGAGATATCTATG AAAACCAGTGGCTTCCATCAAACCTTTGCCAACTCAGGTTCAC A GCA GCTTTGGGCAGTTATGGCA GTATGGCATTA GCTGA GA G GTGTCTGCCACTTCTGGGTCAATGGAATAATAAATTAAGTACA GGCAGGAATTTGGTTGGGAGCATCTTGTATGATCTCCGTATGA TGTGATATTGATGGAGATAGTGGTCCTCATTCTTGGGGGTTGC CATTCCCACATTCCCCCTTCAACAAACAGTGTAACAGGTCCTT CC CAGATTTAGGGTACTTTTATTGAT GGATATGTTTTC CTTTTA TTCACATAACCCCTTGAAACCCTGTCTTGTCCTCCTGTTACTTG CTTCTGCTGTACAAGATGTAGCACCTTTTCTCCTCTTTGAACAT GGTCTAGTGACACGGTAGCACCAGTTGCAGGAAGGAGCCAGA CTTGTTCTCAGAGCACTGTGTTCACACTTTTCAGCAAAAATAG CTATGGTTGTAACATATGTATTCCCTTCCTCTGATTTGAAGGCA AAAATCTACAGTGTTTCTTCACTTCTTTTCTGATCTGGGGCATG AAAAAAGCAAGATTGAAATTTGAACTATGAGTCTCCTGCATG GCAACAAAATGTGTGTCACCATCAGGCCAACAGGCCAGCCCT TGAATGGGGATTTATTACTGTTGTATCTATGTTGCATGATAAA CATTCATCACCTTCCTCCTGTAGTCCTGCCTCGTACTCCCCTTC CCCTATGATTGAAAAGTAAACAAAACCCACATTTCCTATCCTG GTTAGAAGAAAATTAATGTTCTGACAGTTGTGATCGCCTGGAG TACTTTTAGACTTTTAGCATTCGTTTTTTACCTGTTTGTGGATGT 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ATTTAAAAAAAAACATAACTTTGTAAATATTACCCTGTAATAT TATATATACTTAATAAAACATTTTAAGCTATTTTGTTGGGCTAT TTCTATTGCTGCTACAGCAGACCACAAGCACATTTCTGAAAAA TTTAATTTATTAATGTATTTTTAAGTTGCTTATATTCTAGGTAACAATGTAAAGAATGATTTAAAATATTAATTATGAATTTTTTGA GTATAATACCCAATAAGCTTTTAATTAGAGCAGAGTTTTAATTT AAAAGTTTTAAATCAGTCCAA 9. 实施例 1001301 本部分(即第 9 部分)中的实施例以说明的方式提供,而非以限制的方式提供。 9.1 实施例 1:肾小球细胞上的人 CD47 表达与通过人 CD47-SIRPa 途径避免蛋白尿相关 1001311 检查狒狒巨噬细胞是否与人巨噬细胞类似地吞噬猪内皮细胞 (EC)。 我们发现人类和狒狒巨噬细胞吞噬猪内皮细胞的能力相似。 引人注目的是,当猪 EC 和足细胞表达人 CD47/人 CD55 而不是人 CD46/人 CD55 而没有人 CD47 时,这种反应显着降低(图 1A 和图 1C)。 使用来自人 CD47/人 CD55 Tg GalT-K0 供体的移植物,我们发现即使没有 CTLA4-Ig 治疗,在肾小球细胞上高表达人 CD47 的 GalT-K0 猪肾也能最大限度地减少蛋白尿的发生。 1001321 我们使用人类、狒狒、恒河猴和食蟹猴巨噬细胞进一步检查了 GalT-K0 EC 的吞噬作用。 虽然人类和狒狒巨噬细胞吞噬猪 EC 和足细胞的能力相似且具有攻击性,但恒河猴和食蟹猴巨噬细胞吞噬 GalTKO EC 的能力明显低于观察到的狒狒或人类巨噬细胞(图 2A 和图 2D)。 1001331 上述讨论的结果表明,猪和狒狒之间的物种不相容性在异种 KTx 后蛋白尿的发展中起着重要作用,并且与人类相关,并且预防蛋白尿发展的策略对于猪的成功至关重要 human xenotransplantation.CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 9.2 实施例 2:人 CD47 在肾小管细胞上的高表达导致与 TSP-1 上调相关的水肿:1001341 虽然已知 CD47 结合 SlRPa 并阻断 其激活后,CD47 还与 TSP1(CD47-TSP-1 通路)结合,抑制血管细胞中的一氧化氮信号并诱导先天免疫反应的激活和细胞增殖或凋亡。 在我们的血管化胸腺叶加肾异种移植(“VT+K XTx”)模型中,一只狒狒接受了具有肾小球细胞特异性表达人 CD47 的 GalT-K0 肾脏,在没有 CTLA4-Ig 的情况下维持肾异种移植 128 天(直到 移植物超出了可用空间),没有排斥或蛋白尿的证据。 相比之下,接受 VT+K 移植的狒狒在所有细胞(包括肾小管细胞)上都高表达人类 CD47,但由于全身皮下和气管水肿而没有血清 Cre 或蛋白尿增加而被安乐死。 这些狒狒在术后第一周还进一步表现出高水平的嵌合现象(15-30% T 细胞嵌合现象)。 随后,出现全身性水肿,血清中 IL-6 水平升高。 在 POD 50 和 53 时切除的肾移植物显示肾小管萎缩和间质细胞浸润,表明 TSP-1 介导了肾移植物的炎症反应。 值得注意的是,肾移植血管的中层显示出 TSP-1 的上调。还发现全身性水肿伴随着血清中 IL-6 水平的升高。 1001351 基于这些发现,我们每周添加一次抗 IL6r 抗体,直到 POD 42。抗 IL-6R 抗体似乎抑制了炎症变化并延长了狒狒的存活时间,而没有早期炎症事件或蛋白尿。 虽然猪移植物的指数增长或药物相关的副作用触发了受体狒狒的安乐死,但我们证实在上述时间点没有明显的移植物排斥迹象、体外猪特异性无反应和新狒狒 T 细胞的发育。 图 3 显示了在 POD 187 时切除的肾移植物的 sCre 水平(图 3A)和组织学发现(图 3B)。 9.3 实施例 3-人 CD47 基因在小型猪 1001361 中的足细胞特异性表达 在足细胞特异性启动子(即 nephrin 启动子)的控制下表达人 CD47 的微型猪。 将选择含有随机整合载体的 1001371 成纤维细胞,该载体由猪肾病蛋白启动子表达的人 CD47 组成(图 4)。 该 CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 载体的启动子区域将包括相邻 Kirrel2 启动子的上游部分,因此将包含组织特异性表达所需的所有元件。为了增加特异性表达的可能性,nephrin 基因的内含子 1 和外显子 2 的一个短片段也将被包括在内,编码成熟形式的人类 CD47 的序列连接到所得的 nephrin 前导肽。 已将载体整合到转录允许基因组位置的细胞的选择将基于来自普遍存在的 PGK 启动子的 GFP 表达。 1001381 将在第二个三个月的克隆胎儿中筛选人类 CD47 基因的适当表达。 预计 GFP 会广泛表达。 然而,人类 CD47 表达(在细胞表面和/或通过 RNA 分析测量)将仅限于所需克隆的肾脏。 从具有所需表达谱的胎儿分离的成纤维细胞将用于在第二轮核移植中产生猪。 1001391 来自这些猪的肾脏将在狒狒移植中进行评估。 测试这些动物的 TSP1 激活(通过 RT-PCR 测量)。 还测试这些动物的蛋白尿。 9.4 实施例 4 肾小球特异性表达对蛋白尿的影响 1001401 为了显示人 CD47 的肾小球特异性表达对异种移植物耐受性的影响,产生了在肾脏肾小球中特异性表达人 CD47 的小型猪。 来自这些猪的肾脏被移植到狒狒体内,连同来自不同的微型猪的骨髓也被移植到狒狒体内,这种微型猪也表达人类 CD47。 作为比较,将广泛表达人 CD47 的猪的肾脏和骨髓,或在骨髓中表达人 CD47 而不是肾脏的猪的肾脏和骨髓移植到狒狒体内。 通过测量移植后的尿蛋白浓度来评估蛋白尿。 10. 等同物 1001411 尽管本发明是参照其特定实施例详细描述的,但应理解,功能上等同的变化也在本发明的范围内。 事实上,除了本文所示和描述的那些之外,本发明的各种修改对于本领域技术人员来说根据前述CA 03191806 2023-3-6 WO 2022/051594 PCT/US2021/049019 描述和附图将变得显而易见。 这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。 本领域的技术人员仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同物。 这些等同物旨在包含在所附权利要求中。 1001421 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本说明书,其程度就好像每个单独的出版物、专利或专利申请都具体且单独地指明通过引用整体并入本文一样。 CA 03191806 2023-3-6

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