技术领域 [0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本申请基于申请日为 2020 年 8 月 18 日的美国临时专利申请号 63/067,259 的优先权,其全部内容通过引用并入本文。 [0003] 参考以电子方式提交的序列表 [0004] 与申请一起提交的以电子方式作为 ASCII 文本文件(名称:2873_302PC01_SL_ST25.txt;大小:190,325 字节;创建日期:2021 年 8 月 16 日)提交的序列表的内容通过引用整体并入本文。 [0005] 披露领域 [0006] 本公开提供了特异性结合人 PAR-2 的抗体及其抗原结合片段、包含此类抗体及其抗原结合片段的组合物,以及气道疾病(例如,哮喘、慢性阻塞性肺病、特异性结合人 PAR 的抗体-2,包括治疗癌症、皮肤病、口面部肉芽肿、炎性病症,或减轻与各种疾病或病症相关的疼痛;以及它涉及制备和使用其抗原结合片段的方法。 [0007] 披露说明 [0008] G 蛋白偶联受体 (GPCR) 是七次跨膜蛋白家族,通过 G 蛋白激活和随后的第二信使对细胞外刺激作出反应。 蛋白酶激活受体 2(蛋白酶激活受体 2;PAR-2;GPR11;F2RL1)是一种由蛋白酶裂解激活的 A 类 GPCR。 在人类中,通过上游蛋白水解切割揭示 N 末端“束缚配体”(例如,人类中的氨基酸序列 SLIGKV),这允许束缚配体与受体的细胞外环结合并启动信号传导。允许诱导 参见 Hollenberg M.D. 和康普顿 S. J.,药物开发。 研究,59(4):344-349 (2003)]。 PAR-2的N端序列是胰蛋白酶(Hollenberg M.D. and Compton S. J., Drug Dev. Res., 59(4):344-349 (2003)),类胰蛋白酶(Akers, I. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 278:L193-L201 (2000)),组织因子(Larsen, K. S. 等人,J Biol Chem, 285:19959-19966 (2010)),中性粒细胞弹性蛋白酶(Ramachandran, R. 等人) al. al., J Biol Chem., 286:24638-24648 (2011)) 和 matriptase-1 (Milner, J. M. et al., Arthritis Rheum, 62:1955-1966 (2010)),以及半胱氨酸蛋白酶等作为 Thepsin S(Elmariah, S. B. et al., PLoS One, 9(6):e99702 (2014)),木瓜蛋白酶(Liang, G. et al., J Allergy Clin Immunol, 129:1377-1386 (2012)),它可以在几个不同的位点被多种丝氨酸蛋白酶切割,包括 Der p 1(Asosingh, K. et al., J Clin Invest, 128(7):3116-3128 (2018))。 也有报道称,PAR-2 可以被 PAR-1 栓系配体反式激活。 O'Brien, P. J. et al., J Biol Chem, 275:13502-13509 (2000)。 [0009] PAR-2在正常情况下在细胞表面的表达水平非常低。 它是内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞(D'Andrea MR. 等人,J Histochem Cytochem., 46(2):157-64 (1998)),以及那些单核细胞谱系。它在免疫系统细胞上表达,最显着的是巨噬细胞和中性粒细胞(Howells, G. L. et al., Journal of Cell Science, 110:881-887 (1997))。 PAR-2在炎症条件下上调,其过度表达例如哮喘(Knight,D.A.等,J Allergy Clin Immunol,108:797-803(2001)),慢性阻塞性肺病(COPD)(Lee, K. H. et al., Experimental & Molecular Medicine, 50(7):1-9 (2018)), Pulmonary Fibrosis (Wygrecka, M. et al., Am J Respir Crit Care Med, 183:1703-1714 (2011)) 、类风湿性关节炎(Tindell, A. G. et al., Rheumatol Int, 32:3077-3086 (2012))、骨关节炎(Huesa, C. et al., Ann Rheum Dis, 75:1989-1997 (2016))、胰腺炎( Namkung, W. 等人,Gastroenterology 126:1844-1859 (2004)),慢性疼痛(Mrozkova, P., 等人, Physiol Res, 65:357-367 (2016)),特应性皮炎(Lee, S. E. , et al., Yonsei Med J, 51:808-822 (2010) 和慢性瘙痒症(Akiyama, T., et al., Handb Exp Pharmacol, 226:219-235 (2015))小鼠缺乏 PAR-2发展为实验性哮喘(de Boer, J. D. et al., Innate Immun., 20(6):618-625 (2013))和皮炎(Kawagoe, J. et al., Jpn J Pharmacol, 88:77-84 (2002) ))、纤维化(Borensztajn, K. 等人, Am J Pathol 177, 2753-2764 (2010))、肾小球肾炎(Moussa, L. 等人, Am J Pathol 171:800-808 (2007)),以及关节炎的诱导(Busso,N.等人,Arthritis Rheum,56:101-107(2007))。 [0010] 特异性结合人 PAR-2 蛋白的抗体可用于诊断、预防和/或治疗 PAR-2 过表达的疾病。 因此,需要开发能够广泛拮抗人 PAR-2 激活并适合人类给药的强效抗体。 [0011] 本文提供特异性结合人 PAR-2 的分离抗体及其抗原结合片段及其使用方法。 [0012] 一方面,提供了分离的抗体或其抗原结合片段,其特异性结合人 PAR-2 并拮抗 PAR-2 激活配体对 PAR-2 的激活。 此类PAR-2激活配体包括PAR-2束缚配体(顺式或反式); PAR-1 束缚配体; 或可溶性配体但不限于此。 [0013] 在某些方面,它与人 PAR-2 特异性结合,但不与人 PAR-2 N 末端的氨基酸 59-63 结合,以及 (a) PAR-2 激活配体之间的相互作用PAR-2 的细胞外结构域和/或 (b) 一种分离的抗体或其抗原结合片段,可阻断 PAR-2 激活配体对 PAR-2 的激活。 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段不结合人PAR-2的N端。 在某些实施方案中,抗体或其抗原结合片段适合施用于人类受试者。 在某些实施方案中,抗体是人源化抗体。 [0014] 在任何这些方面的一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段具有约 0.1nM 和约 17nM 之间的 IC5tl,如通过 PAR-2 β-抑制蛋白细胞测定所测量的。 ₅₀ 通过可溶性 PAR-2 激活配体抑制人 PAR-2 的激活。 [0015]在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段为约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM、约0.6nM、约0.7nM、约0.8nM、约0.9nM、约1nM,约1.1nM,约1.2nM,约1.3nM,约1.4nM,约1.5nM,约1.6nM,约1.7nM,约1.8nM,约1.9nM,约2nM,2.1nM,约2.2nM,约 2.3 nM、约 2.4 nM、约 2.5 nM、约 2.6 nM、约 2.7 nM、约 2.8 nM、约 2.9 nM、约 3 nM、3.1 nM、约 3.2 nM、约 3.3 nM、约 3.4 nM、约 3.5 nM ,约3.6nM,约3.7nM,约3.8nM,约3.9nM,约4nM,约4.1nM,约4.2nM,约4.3nM,约4.4nM,约4.5nM,约4.6nM,约4.7nM,约4.8 nM nM,约 4.9 nM,约 5 nM,5.1 nM,约 5.2 nM,约 5.3 nM,约 5.4 nM,约 5.5 nM,约 5.6 nM,约 5.7 nM,约 5.8 nM,约 5.9 nM,约 6 nM , 6.1 nM, 约 6.2 nM, 约 6.3 nM, 约 6.4 nM, 约 6.5 nM, 约 6.6 nM, 约 6.7 nM, 约 6.8 nM, 约 6.9 nM, 约 7 nM, 7.1 nM, 约 7.2 nM, 约 7.3 nM , 约 7.4 nM, 约 7.5 nM, 约 7.6 nM, 约 7.7 nM, 约 7.8 nM, 约 7.9 nM, 约 8 nM, 约 8.1 nM, 约 8.2 nM, 约 8.3 nM, 约 8.4 nM, 约 8.5 nM, 约8.6 nM,约 8.7 nM,约 8.8 nM,约 8.9 nM,约 9 nM,9.1 nM,约 9.2 nM,约 9.3 nM,约 9.4 nM,约 9.5 nM,约 9.6 nM,约 9.7 nM,约 9.8 nM,约 9.9 nM、约 10 nM、约 10.1 nM、约 10.2 nM、约 10.3 nM、约 10.4 nM、约 10.5 nM、约 10.6 nM、约 10.7 nM、约 10.8 nM、约 10.9 nM、约 11 nM、约 11.1 nM,约 11.2 nM IC 为约 11.3 nM,约 11.4 nM,约 11.5 nM,约 11.6 nM,约 11.7 nM,约 11.8 nM 或约 11.9 nM ₅₀ 它抑制可溶性PAR-2激活配体与PAR-2的相互作用。 [0016] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段具有约 6 nM 和约 11 nM 之间的 IC,如通过 PAR-2 钙通量细胞测定所测量的。 ₅₀ 抑制 PAR-2 激活配体诱导和胰蛋白酶诱导的细胞钙流动。 在一些实施方案中,细胞是人肺成纤维细胞或上皮细胞。 [0017] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段为约6nM、6.1nM、约6.2nM、约6.3nM、约6.4nM、约6.5nM、约6.6nM、约6.7nM、约6.8nM、约6.9nM。 nM nM,约 7 nM,7.1 nM,约 7.2 nM,约 7.3 nM,约 7.4 nM,约 7.5 nM,约 7.6 nM,约 7.7 nM,约 7.8 nM,约 7.9 nM,约 8 nM,8.1 nM,约8.2 nM,约 8.3 nM,约 8.4 nM,约 8.5 nM,约 8.6 nM,约 8.7 nM,约 8.8 nM,约 8.9 nM,约 9 nM,9.1 nM,约 9.2 nM,约 9.3 nM,约 9.4 nM,约 9.5 nM、约 9.6 nM、约 9.7 nM、约 9.8 nM、约 9.9 nM、约 10 nM、约 10.1 nM、约 10.2 nM、约 10.3 nM、约 10.4 nM、约 10.5 nM、约 10.6 nM、约 10.7 nM,IC 约 10.8 nM 或约 10.9 nM ₅₀ 抑制 PAR-2 激活配体诱导和胰蛋白酶诱导的钙流。 [0018] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段减少至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或至少 98%,如与相同同种型的对照抗体相比。抑制 PAR-2 激活配体诱导的平滑肌细胞收缩。 在一些实施方案中,平滑肌细胞是支气管平滑肌细胞。 [0019] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段减少至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95% 或至少 98%,如与相同同种型的对照抗体相比,抑制食蟹猴肺中性粒细胞增多的诱导。 在一些实施方案中,肺中性粒细胞增多是屋尘螨诱导的肺中性粒细胞增多。 [0020] 在一些方面,提供了特异性结合人 PAR-2 的分离的抗体或其抗原结合片段,其中每个抗体或其抗原结合片段具有 SEQ ID NO: 1 (GFSLX ₁ X ₂ 永兴 ₃ X ₄ X ₅ ), 2 (VIWGNX ₆ NX ₇ YYX ₈ ) 和 3 (WX ₉ GX ₁₀ 康得新 ₁₁ PFDY) 重链互补决定区 1 (VH CDR1)、VH CDR2、VH CDR3 序列和 SEQ ID NO: 4 (X ₁₂ ASQNX ₁₃ YK-X ₁₄ LD), 5 (X ₁₅ X ₁₆ X ₁₇ X ₁₈ X ₁₉ X ₂₀ T) 和 6 (X ₂₁ QHX ₂₂ X ₂₃ GWT),其中: [0021] X ₁ = 天冬酰胺 (N) 或丝氨酸 (S), X ₂ = 丝氨酸 (S) 或酪氨酸 (Y), X ₃ = 甘氨酸 (G) 或丙氨酸 (A),X ₄ = 缬氨酸 (V)、甘氨酸 (G) 或异亮氨酸 (I)、X ₅ = 异亮氨酸 (I) 或丝氨酸 (S),X ₆ = 甘氨酸 (G) 或谷氨酰胺 (Q),X ₇ = 苏氨酸 (T) 或缬氨酸 (V),X ₈ = 天冬酰胺 (N)、丙氨酸 (A)、甘氨酸 (G) 或酪氨酸 (Y)、X ₉ = 精氨酸 (R) 或赖氨酸 (K), X ₁₀ = 酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W) 或苯丙氨酸 (F)、X ₁₁ = 酪氨酸 (Y) 或组氨酸 (H),X ₁₂ = 赖氨酸 (K) 或精氨酸 (R), X ₁₃ = 异亮氨酸 (I) 或缬氨酸 (V),X ₁₄ = 酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W) 或苯丙氨酸 (F)、X ₁₅ = 天冬酰胺 (N) 或天冬氨酸 (D), X ₁₆ = 苏氨酸 (T) 或丙氨酸 (A),X ₁₇ = 天冬酰胺 (N)、丝氨酸 (S) 或酪氨酸 (Y)、X ₁₈ = 丝氨酸 (S)、苏氨酸 (T) 或天冬酰胺 (N)、X ₁₉ = 亮氨酸 (L) 或精氨酸 (R),X ₂₀ = 组氨酸 (H) 或丙氨酸 (A),X ₂₁ = 亮氨酸 (L) 或谷氨酰胺 (Q),X ₂₂ = 天冬酰胺 (N)、甘氨酸 (G) 或组氨酸 (H),以及 X ₂₃ = 丝氨酸 (S) 或组氨酸 (H)。 [0022] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段分别包含SEQ ID NO:10、11、12、16、17和18的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1、CDR2和CDR3序列。 [0023] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列 SEQ ID NO: 20 或 21 的 VH 和含有氨基酸序列 SEQ ID NO: 23、24、25、26 或 27 的 VL做。 [0024]在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO: 20和23的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区; SEQ ID NOs:分别为 21 和 24; SEQ ID NOs:分别为 21 和 25; SEQ ID NOs:分别为 21 和 26; 或分别为 SEQ ID NO:21 和 27。 [0025] 在一些方面,分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中重链可变区包含SEQ ID NO:20或21的氨基酸序列。 [0026] 在一些方面,分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中轻链可变区包含氨基酸序列 SEQ ID NO:23、24、25、26 或27. [0027] 在某些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段对人 PAR-2 具有结合亲和力(Kd 为约 400 pM 至约 1000 pM)。 _D ) 有 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段特异性结合人和食蟹猴PAR-2。 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段对食蟹猴PAR-2具有结合亲和力(K为约4nM至约5nM)。 _D ) 有 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段特异性结合人PAR-2。 [0028] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区。 在一些方面,重链恒定区是选自由人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型组成的组的同种型。 在一些实施方案中,重链恒定区是人IgG4重链恒定区。 在一些实施方案中,重链恒定区是具有一处或多处氨基酸取代的人IgG4重链恒定区。 在一些实施方案中,轻链恒定区是人IgGκ轻链恒定区。 [0029] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区,其中重链恒定区是人IgG4重链恒定区,并且其中轻链恒定区是人IgGκ轻链恒定区。 [0030] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区,其中重链恒定区是包含一个或多个氨基酸取代的人IgG4重链恒定区,其中轻链链恒定区是人IgGκ轻链恒定区。 在一些实施方案中,人 IgG4 重链恒定区具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个氨基酸取代。 [0031] 在一些实施方案中,人 IgG4 重链恒定区包含 S228P 取代(通过 EU 编号)。 在一些实施方案中,人 IgG4 重链恒定区包含末端赖氨酸缺失(K447Δ)(通过 EU 编号)。 在一些实施方案中,人 IgG4 重链恒定区包含 S228P 取代和 K447Δ(按 EU 编号)。 [0032] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或其抗原结合片段。 [0033] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段是全长抗体。 [0034] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。 在一些实施方案中,抗原结合片段是 Fab、Fab'、F(ab')2、单链 Fv (scFv)、二硫键连接的 Fv、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四抗体、三抗体、双抗体、单域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2 或 scFv-Fc。 [0035] 在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段包含经改造以降低效应子功能的Fc结构域。 [0036] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含可检测标记。 [0037] 另一方面,提供了分离的多核苷酸,其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸序列。 在一些实施方案中,核酸分子编码 SEQ ID NO: 20 或 21 的 VH。 [0038] 在一些方面,提供了分离的多核苷酸,其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的核酸分子。 在一些实施方案中,核酸分子编码 SEQ ID NO:23、24、25、26 或 27 的 VL。 [0039] 在一些方面,包含编码 SEQ ID NO: 23、24、25、26 或 27 的轻链可变区的第一核酸分子和编码 SEQ ID NO: 20 或 21 的重链可变区的第二核酸分子提供了分离的多核苷酸。 在一些方面,第一多核苷酸包含编码 SEQ ID NO: 23、24、25、26 或 27 的轻链可变区的核酸分子,和编码 SEQ ID NO: 20 的重链可变区的核酸分子或21 包含第二多核苷酸的分离的多核苷酸的混合物,所述第二多核苷酸包含 [0040] 在一些方面,分离的多核苷酸包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或重链和公开的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子在此提供。 [0041] 在一些方面,提供了包含本文公开的多核苷酸的分离的载体。 [0042] 在一些方面,(a)本文公开的多核苷酸,(b)本文公开的载体,或(c)包含本文公开的第一多核苷酸和本文公开的第二多核苷酸的第一载体。提供了包含所述载体的宿主细胞。 在一些实施方案中,宿主细胞是组织培养的大肠杆菌。 大肠杆菌( 大肠杆菌 ), 假单胞菌 ( 假单胞菌属 ), 芽孢杆菌 ( 杆菌属 ), 链霉菌 ( 链霉菌属 )、酵母、Expi293F 人细胞、C6(大鼠胶质瘤细胞系)、U2OS、Chem-1、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、HeLa、BHK、Hep G2、SP2 /0、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10细胞、植物细胞、昆虫细胞和人类细胞。 在一些实施方案中,宿主细胞是CHO-K1SV细胞。 [0043] 在一些方面,产生结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段的方法包括培养本文公开的宿主细胞以表达本文公开的核酸分子和抗体或其抗原结合片段产生,任选地,其中该方法还包括从培养物中分离抗体或其抗原结合片段。 [0044] 在一些方面,提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段,其特异性结合人 PAR-2 并由本文公开的多核苷酸编码或通过本文公开的方法产生。 [0045] 在一些方面,提供了包含本文公开的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。 [0046] 在一些方面,通过 PAR-2 激活配体进行体外或体内 PAR-2 激活,包括用本文公开的抗体或其抗原结合片段,或药物阻断配体与 PAR-2 的结合此处公开的组合物。提供了一种限制在其中的方法。 [0047] 在某些实施方案中,PAR-2 激活配体是可溶性 PAR-2 激活配体、PAR-2 束缚配体或 PAR-1 束缚配体。 [0048]在一些方面,提供了用于治疗气道疾病的本文公开的抗体或其抗原结合片段。 另一方面,提供了用于缓解疼痛的本文公开的抗体或其抗原结合片段。 另一方面,提供本文公开的抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症。 另一方面,提供了用于治疗皮肤病症的本文公开的抗体或其抗原结合片段。 另一方面,提供了本文公开的用于治疗炎性病症的抗体或其抗原结合片段。 [0049] 在一些方面,提供了治疗患者气道疾病的方法,包括向患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物。 在一些实施方案中,气道疾病选自哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化和肺动脉高压。 [0050] 在一些方面,提供了减轻患者疼痛的方法,包括向患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物。 在一些实施方案中,疼痛是癌痛、关节痛、化疗引起的周围神经病变疼痛、牙痛、膀胱痛、胰腺炎疼痛、肠易激综合征相关疼痛、内脏痛、骨关节炎相关疼痛、类风湿性关节炎相关疼痛、脊髓损伤疼痛和偏头痛。 [0051] 在一些方面,提供了一种治疗患者癌症的方法,包括向患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物。 在一些实施方案中,癌症选自骨癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌或其任意组合。 [0052] 在一些方面,提供了治疗患者皮肤病症的方法,包括向患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物。 在一些实施方案中,皮肤病症与特​​应性皮炎、过敏性接触性皮炎、Netherton综合征、鱼鳞癣、损伤后皮肤屏障/渗透性的恢复、瘙痒症、皮肤癌、皮肤瘙痒症、与黄褐斑相关的色素沉着和白斑相关。来自由色素沉着组成的组。 [0053] 在一些方面,提供了治疗患者的口面部肉芽肿病的方法,包括向患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物。 [0054] 在一些方面,提供了治疗患者的炎性病症的方法,包括向患者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物。 在某些实施方案中,炎性病症是与类风湿性关节炎、骨关节炎、炎症诱导的内脏超敏反应、牙周病或急性冠状病毒感染相关的病理。 [0055] 在某些方面,提供了一种检测样品中 PAR-2 的方法,包括将样品与本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的药物组合物接触。 在一些实施方案中,样品获自人类受试者,任选地其中样品是癌症样品。 在一些实施例中,样品是体外样品。 附图简要说明 [0056] 图 1A 显示了 Ab309 人源化变体的可变重链序列的比对,CDR 加框。 图 1B 显示了 Ab309 人源化变体的可变轻链序列的比对,其中加框定义了 CDR。 图 2 显示了与鼠类抗人 PAR-2 抗体 MAb3949 相比,P24E1102 拮抗 SLIGKV 诱导的 PAR-2 钙流的相对效力。 (参见示例 8。) 图 3A 展示了一项针对食蟹猴中屋尘螨 (HDM) 诱导的中性粒细胞性肺部炎症的研究设计,食蟹猴连续 5 天接受 P24E1102(10 mg/kg)或安慰剂治疗,并接受雾化 HDM 提取物的挑战。 图 3B 显示了支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中性粒细胞计数(p<0.05,二元方差分析检验)。 (参见示例 9。) 图 3C-3E 显示了连续 5 天用 P24E1102(10 mg/kg)或安慰剂处理并用雾化 HDM 提取物攻击的食蟹猴支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中选定的细胞因子含量。 显示了 HDM 诱导的 BALF 中以下细胞因子的水平 (pg/ml):IL-1β(图 3C;p<0.01,双向方差分析检验),IL-6(图 3D;p<0.05,两个-way ANOVA 测试)。和 TNF(图 3E)。 图 4 显示了用载体 P24E1102(5 毫克或 10 毫克)或氟替卡松 (Floc) 治疗后受到蛔虫过敏原攻击的食蟹猴肺阻力的百分比变化。 图 5 显示了急性皮炎模型中 hPAR2 敲入大鼠的耳径大小差异。 大鼠接受载体攻击(对照); 局部用恶唑酮挑战; 施用 P24E1102、MOPC 同种型对照或地塞米松,然后用恶唑酮进行攻击。 抗体治疗并未显着减少该模型中的炎症。 图 6A-6B 显示了 hPAR2 敲入大鼠对咪喹莫特 (IMQ) 的反应,咪喹莫特是一种银屑病和皮炎模型。 雌性和雄性大鼠用载体、咪喹莫特处理,或用 P24E1102 或 MOPC 同种型对照预处理,然后用咪喹莫特处理。 图 6A 显示了可见皮肤损伤的 PASI 评分。 P24E1102 或 MOPC 显示 PASI 评分显着下降。 6B 呈现抓挠发作。 只有 P24E1102 显着减少了划痕并将其降至背景以下的水平。 图7A-7C显示了来自野生型大鼠的DRG神经元在用PAR2激动剂LIGRLO或对照处理后对辣椒素的反应。 LIGRLO 增加了神经元的百分比,这些神经元增加了对第二次辣椒素治疗的反应(~2 倍),而不管阈值致敏设置 (120%-300%)(图 7A)。 LIGRLO 增加了响应第二次辣椒素处理的信号分布(图 7B)(图 7C)。 图8A-8C显示在用PAR2激动剂LIGRLO处理后hPAR2敲入大鼠的DRG神经元对辣椒素的反应。 在 LIGRLO 处理之前,DRG 用载体(“对照”)、500 nM P24E1102 处理。 P24E1102 显着 (p<0.05) 减少了被辣椒素致敏的神经元数量(图 8A)。 响应于用 LIGRLO 处理的第二个信号的分布(图 8B)被 P24E1102(图 8C)降低。 图 9A-9D 显示了用 SLIGKV 或无刺激和增加浓度的 P24E1102 处理的癌细胞 MCF(图 9A)、MDA-MB-231(图 9B)、HepG2(图 9C)或 A549(图 9D)对生存能力的影响. 对 图10A-10H显示SLIGKV诱导与转移一致的细胞形态和行为的变化,其被P24E1102逆转。 图10A-10D是未经处理的细胞(图10A)、SLIGKV(图10B)、具有500nM P24E1102的SLIGKV(图10C)或经具有2000nM P24E1102的SLIGKV处理的细胞(图10D)的图像。 P24E1102 在 SLIGKV 存在下的剂量依赖性抑制通过具有突起的细胞的百分比(图 10E)、每个细胞的平均长出物数(图 10F)、如分散细胞数所示的细胞迁移(图 10E) 来证明。 10G) 和细胞簇。量化总面积 (图 10H)。 实施发明的具体细节 [0057]本文提供特异性结合人 PAR-2 并表现出本文公开的一种或多种特性的抗体(例如,人源化抗体)及其抗原结合片段。 此类抗体或其抗原结合片段可用于治疗可能增加 PAR-2 和/或可能通过 PAR-2 激活配体拮抗 PAR-2 激活而改善的疾病或病症(例如,气道疾病、皮肤病、疼痛缓解、口面部肉芽肿、炎症和癌症)。 此类抗人 PAR-2 抗体及其抗原结合片段能够,例如,阻断 PAR-2 激活配体与 PAR-2 胞外结构域之间的相互作用,并抑制 PAR-2由 PAR-2 激活配体激活。激活可以被阻断。 本文提供了表现出这些活性的示例性抗人 PAR-2 抗体。 [0058] 还提供了编码此类抗体及其抗原结合片段的分离的核酸(多核苷酸),例如互补DNA(cDNA)。 还提供了包含编码此类抗体及其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)的载体(例如,表达载体)和细胞(例如,宿主细胞)。 还提供了制备此类抗体及其抗原结合片段的方法。 [0059] 另一方面,本文提供了使用此类抗体的方法,例如,以调节 PAR-2 活性。 可以调节 PAR-2 活性,例如,通过 PAR-2 激活配体拮抗 PAR-2 激活。 在某些方面,本文提供的抗人 PAR-2 抗体用于阻断 PAR-2 激活配体与人 PAR-2 的结合。 [0060] 另一方面,本文提供的抗人 PAR-2 抗体用于阻断 PAR-2 激活配体与 PAR-2 胞外结构域之间的相互作用。 此类PAR-2激活配体包括PAR-2束缚配体(顺式或反式); PAR-1 束缚配体; 或可溶性配体但不限于此。 另一方面,本文提供的抗人 PAR-2 抗体可用于治疗与 PAR-2 表达增加和/或 PAR2 激活增加和/或 PAR-2 相关的疾病或病症。通过 PAR-2 激活配体激活。(例如,气道疾病、皮肤病、癌症、口面部肉芽肿病、炎症以及与各种疾病或病症相关的疼痛)可以通过拮抗来改善。 [0061] 在一些方面,这些疾病或病症包括哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺动脉高压、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、内瑟顿综合征、鱼鳞病、损伤后皮肤屏障/渗透性的恢复、瘙痒症、皮肤癌、皮肤瘙痒、黄褐斑相关色素沉着、白斑相关色素沉着、癌痛、关节痛、化疗引起的周围神经病变疼痛、牙痛、膀胱痛、胰腺炎疼痛、肠易激综合征相关疼痛、内脏痛、骨关节炎相关疼痛、偏头痛、类风湿性关节炎相关疼痛、脊髓损伤疼痛、骨癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和乳腺癌。 还提供了相关的组合物(例如药物组合物)、试剂盒和方法。 [0062] 为了便于理解本公开,定义了许多术语和短语。 在整个详细描述中呈现了额外的定义。 [0063] 一、术语 [0064] 在本公开全文中,术语单一实体指的是一个或多个所讨论的实体; 例如,“抗体”被理解为表示一种或多种抗体。 因此,术语单数、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。 [0065] 此外,如本文所用,“和/或”应被视为两个指定特征或组件中的每一个的具体公开,其中一个具有或不具有另一个。 因此,本文中用在短语如“A和/或B”中的术语“和/或”表示“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。 )旨在包括。 同样,在诸如“A、B 和/或 C”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括以下各个方面:A、B 和 C; A、B或C; A或C; A或B; B或C; A和C; 甲和乙; B和C; A(单独); B(单独); 和 C(单独)。 [0066] 应当理解,在本文的各方面以语言“包含”来描述的情况下,还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”来描述的类似方面。 [0067] 如本文所用,术语“包含”、“包含”、“涉及”、“涉及”、“具有”及其组合表示“包括但不限于”。 [0068] 如本文所用,术语“由……组成”是指“包括并限于”。 [0069] 如本文所用,术语“基本上由...组成”是指组合物的特定材料,或方法的特定步骤,以及不实质性影响材料或方法的基本特征的额外材料或步骤。 [0070] 如本文所用,当用于修饰数值或数值范围时,术语“约”和“大约”意指偏差大于或小于该数值或范围的10%是意图所引用的值或范围。表示它仍然在意义之内 在本文的各方面以“大约”或“大约”数值或范围的语言描述的情况下,应当理解,还提供了涉及该特定数值或范围的其他类似方面。 [0071] 除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员普遍理解的相同含义。 参见,例如,生物医学和分子生物学简明词典,Juo,Pei-Show,第 2 版,2002,CRC 出版社; [细胞和分子生物学词典,第 3 版,1999,学术出版社]; [the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press] 为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。 [0072] 单位、前缀和符号以国际单位制 (SI) 接受的形式表示。 数字范围包括定义该范围的数字。 除非另有说明,否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。 本文提供的标题不限制本公开内容的各个方面,这些方面可以通过参考整个说明书而获得。 因此,下面直接定义的术语通过参考整个说明书来更完整地定义。 [0073] 术语“蛋白酶激活受体 2”、“PAR-2”、“G 蛋白偶联受体 11”、“GPR11”、“凝血因子 II 受体样 1”、“凝血酶受体样 1”或“F2RL1” "指的是相同的 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 超家族成员。 [0074] 如本文所用,术语“PAR-2”是指哺乳动物PAR-2多肽,包括但不限于天然PAR-2多肽和PAR-2多肽的亚型。 “PAR-2”包括全长未加工的 PAR-2 多肽以及细胞内加工产生的各种形式的 PAR-2 多肽。 PAR-2或其任何变体和同种型可以从天然表达它的细胞或组织中分离,或者可以使用本领域熟知的和/或本文描述的技术重组产生。 [0075]如本文所用,术语“人PAR-2”是指包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的多肽; S或F在SEQ ID NO:28的位置21,N或S在位置30,R或Q在位置270,T或A在位置291;SEQ ID NO:28的天然存在的变体; SEQ ID NO:28 的加工形式,包括但不限于缺少其信号肽的 SEQ ID NO:28。 不含信号肽的人PAR-2的氨基酸序列由SEQ ID NO:109的氨基酸序列表示。 “PAR-2 多核苷酸”或“PAR-2 核酸分子”是指编码任何 PAR-2 的多核苷酸,包括本文所述的那些。 [0076] 术语“抗体”是指靶向可变区中至少一个抗原识别位点的靶标,例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合(例如,糖蛋白)免疫球蛋白分子的统称,是指能特异性识别并与之结合的免疫球蛋白分子。 本文所用的术语“抗体”包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和任何其他免疫球蛋白分子,只要该抗体表现出所需的生物学活性即可。 根据重链恒定域(称为 alpha、delta、epsilon、gamma 和 mu)的特性,抗体可分为五种主要免疫球蛋白类别中的任何一种:IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM,或其亚基, 分别. 类别 (isotype) (例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2)。 不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维组织。 抗体可以是裸抗体、融合蛋白的一部分,或与另一种分子如毒素、放射性同位素、可检测标记等缀合。 [0077] 术语“抗体片段”是指抗体的一部分。 如本文所用,“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合区”是指抗体的保留特异性结合抗原(例如,人PAR-2)的能力的部分。指一个或多个片段。 已经提出抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。 抗体的术语“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例,例如,本文描述的抗PAR-2抗体,包括(i)Fab片段,由VL、VH组成的单价片段, CL 和 CH1 结构域; (ii) F(ab')2 片段,包含两个在铰链区通过二硫键连接的 Fab 片段的二价片段; (iii) 由 VH 和 CH1 结构域组成的 Fd 片段; (iv) 由抗体单臂的 VL 和 VH 结构域和二硫键连接的 Fv (sdFv) 组成的 Fv 片段; (v) 由 VH 结构域组成的 dAb 片段(Ward 等,(1989)Nature 341:544-546); (vi) 分离的互补决定区 (CDR) 或 (vii) 两个或多个分离的 CDR 的组合,其可任选地通过合成接头连接。 此外,尽管 Fv 片段的两个结构域 VL 和 VH 由不同的基因编码,但使用重组方法 VL 和 VH 区域配对形成单价分子(称为单链 Fv (scFv))可以通过允许将其制成单个蛋白质链的合成接头; 参见,例如,Bird 等,(1988) Science 242:423-426; [Huston et al., (1988) Proc. 国家队。 学院。 科学。 美国 85:5879-5883)。 此类单链抗体也旨在包含在抗体的术语“抗原结合片段”内。 使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段,并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的实用性。 抗原结合片段可以通过重组 DNA 技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。 [0078] 术语“PAR-2 抑制剂”和“PAR-2 拮抗剂”可互换使用。 每一种都是可检测地抑制 PAR-2 的至少一种功能的分子。 相反,“PAR-2 激动剂”是一种可检测地增加 PAR-2 的至少一种功能的分子。 由 PAR-2 抑制剂引起的抑制不需要完全,只要使用测定法可检测到即可。 可以使用 PAR-2 功能的任何测定法,其示例在本文中提供。 PAR-2 可被 PAR-2 抑制剂抑制或被 PAR-2 激动剂增强的功能实例包括蛋白酶激活的配体结合、下游信号传导等。 PAR-2 抑制剂和 PAR-2 激动剂类型的例子包括小分子和调节 PAR-2 活性的 PAR-2 结合多肽,例如抗原结合蛋白(例如,PAR-2抑制性抗原结合蛋白)、抗体、抗体片段和抗体衍生物。 例如,WO 2006/127379、WO 2006/127396、US8927503、WO 2012/1010453、WO 2014/020350、WO 2016/154075、WO 2010/017086、WO 2011/001695、WO 2018/1458 US201828、WO 2018/1458 US201828 /148328 和美国 8357367。 [0079] 如本文所用,术语“PAR-2 激活配体”是指与蛋白酶激活受体 2 (PAR-2) 结合并启动 PAR-2 激活和信号传导的配体。 此类PAR-2激活配体包括PAR-2束缚配体(顺式或反式); PAR-1 束缚配体; 或可溶性配体但不限于此。 在这种情况下,如果 PAR2 分子被其自身的 N 末端区域激活,则配体是顺式的。 当 PAR2 被另一个 PAR2 分子上的配体激活时,该配体是反式的。 反式激活也可由作用于例如 PAR2 的 PAR1 配体引起。 [0080] 如本文所用,术语“PAR-2 激活”是指 PAR-2 配体(例如,PAR-2 束缚配体(顺式或反式);PAR-1 束缚配体;或可溶性配体(例如,在合成可溶性 PAR-2 激活配体如 SLIGKV 存在下激活 PAR-2))。 [0081] 本文所用术语“抑制PAR-2激活”是指通过抗PAR-2抗体抑制PAR-2激活。 我知道了 ₅₀ 可用作衡量抗 PAR-2 抗体抑制 PAR-2 激活的效力(即达到 50% 配体抑制的抗 PAR-2 抗体浓度)诱导的PAR-2活性,单位nM)。 [0082] 术语“抗 PAR-2 抗体”、“PAR-2 抗体”和“结合 PAR-2 的抗体”是指具有足够亲和力的抗体,因此它们可用作诊断剂、治疗剂和/或PAR-2活性调节剂。指能够与PAR-2结合的抗体。 抗 PAR-2 抗体与 PAR-2 蛋白的结合程度大于同种型对照抗体或非 PAR-2 靶向抗体与 PAR-2 的结合,如测量的,例如,通过流式细胞术。 抗 PAR-2 抗体与不相关的非 PAR-2 蛋白的结合程度由例如针对 PAR-2 的同种型对照抗体或非 PAR-2 蛋白决定通过流式细胞术测量的靶向抗体。可以等同于组合 在某些实施方案中,抗 PAR-2 抗体仅与 PAR-2 结合,而不与 PAR-1、PAR-3 和 PAR-4 结合。 [0083]“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的均质抗体或抗原结合片段的群体。 这与多克隆抗体相反,多克隆抗体通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体。 术语“单克隆”抗体或其抗原结合片段包括完整和全长单克隆抗体,以及抗体片段(例如 Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链 (scFv) 突变体、包含抗体部分的融合蛋白,以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。 此外,“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指这样的抗体及其以多种方式产生的抗原结合,包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。 [0084] “双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。 双特异性抗体可以通过多种方法产生,包括杂交瘤融合或 Fab' 片段连接。 参见,例如,Songsivlai & Lachmann, Clin。 Exp。 免疫学。 79:315-321 (1990)]; [Kostelny 等人,J. Immunol。 148, 1547-1553 (1992)。 例如,双特异性抗体可包含一个结合 PAR2 受体结合位点的结构域和另一个在蛋白酶切割之前或之后结合 PAR2 的 N 末端部分的结构域。 [0085] 如本文所用,术语“可变区”或“可变域”可互换使用并且在本领域中是常见的。 可变区通常是指抗体的一部分,通常是轻链或重链的一部分,其在抗体之间的序列差异很大,并且用于特定抗体对特定抗原的结合和特异性。 序列的可变性集中在称为互补决定区 (CDR) 的区域,而可变域中高度保守的区域称为框架区 (FR)。 虽然不希望受任何特定机制或理论的束缚,但据信轻链和重链的 CDR 主要负责抗原和抗体的相互作用和特异性。 在一些方面,可变区是人类可变区。 在一些方面,可变区包括啮齿动物或鼠类CDR和人构架区(FR)。 在一些方面,可变区是灵长类动物(例如,非人灵长类动物)可变区。 在一些方面,可变区包括啮齿动物或鼠类CDR和灵长类动物(例如,非人灵长类动物)构架区(FR)。 [0086] 术语“VL”和“VL 结构域”可互换使用,指抗体的轻链可变区。 [0087] 术语“VH”和“VH 结构域”可互换使用,指抗体的重链可变区。 [0088] 术语“Kabat编号”和类似术语是本领域公认的并且指抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基的编号系统。 在某些方面,CDR 可以根据 Kabat 编号系统确定(参见,例如,Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190:382-391 和 Kabat EA 等人,(1991)Sequences of Proteins of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生与公共服务部,NIH 出版物第 91-3242 号)。 [0089] 在 Kabat 等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版中描述了短语“在 Kabat 中对氨基酸位置进行编号”、“Kabat 位置”及其语法变体。 公共卫生服务,国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达 (1991)]是指用于抗体汇编的重链可变域或轻链可变域的编号系统。 使用该编号系统,实际的线性氨基酸序列可能含有更少或更多的氨基酸,对应于可变域的 FR 或 CDR 的缩短或插入。 例如,重链可变结构域在 CDR2 的残基 52 之后(根据 Kabat 的残基 52a)和在重链 FW 残基 82 之后插入的残基(例如,根据 Kabat 的残基 82a、82b 和 82c 等)具有单个氨基酸插入。 ) 可以包括 见表 1。 [0090] 表格1 [0091] [0092] 对于本公开中讨论的所有重链恒定区氨基酸位置,残基编号如 Edelman et al., 1969, Proc. 国家队。 学院。 科学。 美国 63(1):78-85]。 Edelman 等人的 EU 索引在 Kabat 中也有描述 等。 ,1991 年,免疫学感兴趣的蛋白质序列,第 5 版,美国公共卫生服务部,国立卫生研究院,贝塞斯达。 因此,Kabat 1991 中给出了短语“Kabat 中给出的 EU 索引”或“Kabat 的 EU 索引”和“根据 Kabat 中给出的 EU 索引的位置……”及其语法变体。指残基编号基于 Edelman 等人的人类 lgG1 EU 抗体的系统。 [0093] 如本文所用,术语“恒定区”或“恒定域”是可互换的并且在本领域中具有共同的含义。 恒定区是抗体的一部分,它不直接参与抗体与抗原的结合,但能够表现出各种效应子功能,例如与 Fc 受体相互作用,例如光和/的羧基末端部分或重链。 与免疫球蛋白可变结构域相比,免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。 在某些方面,抗体或抗原结合片段包含足以产生抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的恒定区或其部分。 [0094] 如本文所用,术语“重链”在提及抗体时指任何不同类型,例如,基于抗体的氨基酸序列的α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ链恒定域 (γ) 和 mu (μ),它是 IgG 的一个子类,例如 IgG ₁ , 免疫球蛋白 ₂ , 免疫球蛋白 ₃ 和IgG ₄ 它分别产生 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM 类抗体,包括。 重链氨基酸序列是本领域众所周知的。 在一些方面,重链是人重链。 [0095] 如本文所用,术语“轻链”当用于指代抗体时可以指基于恒定域的氨基酸序列的任何不同类型,例如kappa (κ)或lambda (λ)。 轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。 在一些方面,轻链是人轻链。 [0096]“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”是位于免疫系统各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体或经典补体系统的第一组分(指C -抗体重链的末端区域,介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括与 C1q 的结合。 因此,Fc区包括排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如,CH1或CL)的抗体的恒定区。 在 IgG、IgA 和 IgD 抗体同种型中,Fc 区包含两个相同的蛋白质片段,它们源自抗体两条重链的第二个 (CH2) 和第三个 (CH3) 恒定域; IgM 和 IgE Fc 区在每条多肽链上包含三个重链恒定域(CH 域 2-4)。 在 IgG 的情况下,Fc 区包括免疫球蛋白结构域 Cγ2 和 Cγ3 以及 Cγ1 和 Cγ2 之间的铰链。 尽管免疫球蛋白重链 Fc 区的边界可能不同,但人 IgG 重链 Fc 区通常定义为从 C226 或 P230 位氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)到重链的羧基末端。,其中编号遵循与 Kabat 中相同的 EU 索引。 人 IgG Fc 区的 CH2 结构域从约氨基酸 231 延伸至约氨基酸 340,而 CH3 结构域位于 Fc 区中 CH2 结构域的 C 端侧,即从约氨基酸 341 至约IgG 的第 447 位氨基酸被延长 如本文所用,Fc区可以是天然序列Fc,包括任何异型变体或变体Fc(例如,非天然存在的Fc)。 Fc可以指单独的或在包含Fc的蛋白质多肽的上下文中的该区域,例如“包含Fc区的结合蛋白”也称为“Fc融合蛋白”(例如,抗体或免疫粘附)。 . [0097] “天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区相同的氨基酸序列。 天然序列人 Fc 区包括天然序列人 IgGl Fc 区; 天然序列人 IgG2 Fc 区; 天然序列人 IgG3 Fc 区; 和天然序列人 IgG4 Fc 区,及其天然存在的变体。 天然序列 Fc 包括 Fc 的各种同种异型(参见例如 Jefferis 等。 , (2009) 单克隆抗体 1:1; 维达松 G. 等人 . 正面免疫 . 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发布])。 [0098] “Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白Fc区的受体。 结合 IgG 抗体的 FcR 包括 FcγR 家族的受体,包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。 FcγR 家族由三种激活受体(小鼠中的 FcγRI、FcγRIII 和 FcγRIV;人类中的 FcγRIA、FcγRIIA 和 FcγRIIIA)和一种抑制性 (FcγRIIB) 受体组成。 人 IgG1 与大多数人 Fc 受体结合并诱导最强的 Fc 效应子功能。 就其结合的激活 Fc 受体的类型而言,它被认为等同于鼠 IgG2a。 相反,人 IgG4 诱导最小的 Fc 效应子功能。 参见 Vidarsson G. 等人。 前免疫。 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发布)]。 [0099] 抗体的 Fc 区可能包含调节血清半衰期和生物分布的修饰,从而保护 IgG 免于分解代谢,并保护抗体免受新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的影响,FcRn 是一种在维持高血清抗体浓度方面起关键作用的受体。调节相互作用的物质包括但不限于。 这些包括美国专利号 7,083,784 中描述的 M252Y/S254T/T256E 的三重取代。 其他取代可发生在位置250和428(参见例如美国专利号7,217,797)以及位置307、380和434(参见例如PCT公开号WO 00/042072)。 任何类别的抗体都可能省略或去除重链 C 端赖氨酸以降低异质性 (ΔK)。 人 IgG4 中 S228P(EU 编号)的取代可以稳定体内抗体 Fab 臂交换(Labrin 等人 (2009) Nature Biotechnol. 27:8;767-773)。 [0100] “铰链”、“铰链结构域”、“铰链区”或“抗体铰链区”可互换使用,指连接CH1结构域和CH2结构域的重链恒定区的结构域,以及上、中、上部分铰链下部片段(Roux 等人,J. Immunol. 1998 161:4083)。 铰链在抗体的结合区和效应区之间提供了不同程度的灵活性,并且还为两个重链恒定区之间的分子间二硫键提供了一个位点。 如本文所用,对于所有 IgG 同种型,铰链开始于 Glu216 并结束于 Gly237(Roux 等人,1998 J Immunol 161:4083)。 野生型 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 铰链的序列是本领域已知的。 参见,例如,Kabat EA 等。 , (1991) 具有免疫学意义的蛋白质序列,第五版,美国 卫生与公共服务部,NIH 出版物编号 91-3242]; [维达森 G. 等人 . 正面免疫 . 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发表)]。 IgG4 抗体的铰链可以通过突变 S228,例如 S228P 突变来稳定。 见席尔瓦等人。 (2015) S228P 突变可防止体内和体外 IgG4 Fab 臂交换,如结合使用新型定量免疫测定和生理基质制备所证明的那样。 生物化学杂志 . 290(9):5462-9。 [0101] 术语“CH1结构域”是指在重链恒定区的铰链处连接可变区的重链恒定区。 如本文所用,CH1结构域开始于A118并结束于V215。 术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域及其天然存在的变体(例如,同种异型)。 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(包括野生型和同种异型)的CH1结构域序列是本领域已知的。 参见,例如,Kabat EA 等。 , (1991) 同上 ] 和 [Vidarsson G. 等人 . 正面免疫 . 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发表)]。 示例性的 CH1 结构域包括具有改变抗体的生物活性(例如半衰期)的突变的 CH1 结构域,例如美国公开号 20120100140 和美国专利和出版物以及其中引用的 PCT 出版物中所述。 [0102] 术语“CH2结构域”是指与重链恒定结构域中的CH3结构域铰接的重链恒定区。 如本文所用,CH2结构域开始于P238并结束于K340。 术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域及其天然存在的变体(例如,同种异型)。 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(包括野生型和同种异型)的CH2结构域序列是本领域已知的。 参见,例如,Kabat EA 等。 , (1991) 同上 ] 和 [Vidarsson G. 等人 . 正面免疫. 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发表)]。 示例性的 CH2 结构域是具有改变抗体的生物活性(例如,半衰期和/或降低的 Fc 效应子功能)的突变的 CH2,例如在美国公开号 20120100140 和美国专利和出版物以及 PCT 中描述的其中引用的出版物。包含域 [0103] 术语“CH3结构域”指重链恒定区中CH2结构域的C端重链恒定区。 如本文所用,CH3结构域开始于G341并结束于K447。 术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域及其天然存在的变体(例如,同种异型)。 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(包括野生型和同种异型)的CH3结构域序列是本领域已知的。 参见,例如,Kabat EA 等。 , (1991) 同上 ] 和 [Vidarsson G. 等人 . 正面免疫 . 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发表)]。 示例性的CH3结构域包括具有改变抗体的生物学活性例如半衰期的突变的CH3结构域,所述抗体描述于例如美国公开号20120100140和美国专利和出版物以及其中引用的PCT出版物。 [0104] 如本文所用,“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD 和 IgE 抗体)。 [0105] “同种异型”是指特定同种型组内自然发生的变体,这些变体在几个氨基酸上有所不同(参见,例如,Jefferis 等。 , (2009) 单克隆抗体 1:1])。 本文所述的抗体可以是任何同种异型的。 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种异型是本领域已知的。 参见,例如,Kabat EA 等。 , (1991) 同上 ]; [维达森 G. 等人 . 正面免疫 . 5:520(2014年10月20日在线发表)]; [Lefranc 国会议员; 单克隆抗体 1:4, 1-7 (2009)]。 [0106] 短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。 [0107] “分离的抗体”,如本文所用,意在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如,特异性结合 PAR-2 的分离抗体是 PAR-2)。基本上没有抗体特异性结合 2) 以外的抗原。 然而,特异性结合 PAR-2 表位的分离抗体可能与来自不同物种的其他 PAR-2 蛋白具有交叉反应性。 [0108] 术语“嵌合”抗体或其抗原结合片段是指其氨基酸序列来源于两个或多个物种的抗体或其抗原结合片段。 通常,轻链和重链的可变区都是抗体或其抗原结合片段的可变区,抗体或其抗原结合片段源自哺乳动物物种(例如,小鼠、大鼠、兔等),具有所需的特异性、亲和力、而恒定区与源自另一物种(通常是人)的抗体或其抗原结合片段的序列同源,以避免在该物种中引发免疫反应。 [0109] 术语“人源化”抗体或其抗原结合片段是指一种非人(例如鼠)抗体,它是一种特定的免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最少非人(例如鼠)序列的片段,或指抗原结合片段的形式。 通常,人源化抗体或其抗原结合片段以来自互补决定区(CDR)的残基是来自具有以下特征的非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的残基的方式制备所需的特异性、亲和力和容量。(“CDR 移植”)(Jones 等人,Nature 321:522-525 (1986);Riechmann 等人,Nature 332:323-327 (1988);Verhoeyen 等人。 , 科学 239:1534-1536 (1988)。 人源化抗体或其抗原结合片段可以通过在 Fv 构架区和/或被替换的非人残基内替换额外的残基来进一步修饰,以提高抗体或抗原结合的特异性、亲和力和/或能力其片段,和/或可以被优化。 一般而言,人源化抗体或其抗原结合片段将包含至少一个且通常包含基本上所有两个或三个对应于非人免疫球蛋白的CDR区的VH和VL,而FR区全部或基本上都是人免疫球蛋白共有序列。 人源化抗体或其抗原结合片段还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。 用于产生人源化抗体的方法的例子描述于美国专利 5,225,539; 参见 Roguska 等人,Proc。 国家队。 学院。 Sci., USA, 91(3):969-973 (1994)] 和 [Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)。 在一些方面,“人源化抗体”是重新表面化的抗体。 [0110] 术语“人”抗体(HuMAb)或其抗原结合片段是指具有源自人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列或具有与来自人免疫球蛋白基因座的序列相匹配的序列的抗体或抗原结合抗体。片段,其中使用本领域已知的任何技术制备此类抗体或抗原结合片段。 人抗体或其抗原结合片段的定义包括完整或全长抗体及其片段。 [0111] 如本文所用,术语“重组人抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的任何人抗体,例如(a)人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体或其产物。(b)从转化为表达抗体的宿主细胞分离的抗体,例如转染瘤,(c)来自重组、组合人抗体文库、分离的抗体,和(d)通过涉及剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体人免疫球蛋白基因序列与其他 DNA 序列的结合。 此类重组人抗体包含可变区和恒定区,它们利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列,但包括例如在抗体成熟期间发生的后续重排和突变。 如本领域已知的(参见,例如,Lonberg (2005) Nature Biotech. 23 (9) : 1117-1125),可变区包含抗原结合结构域,其可以重新排列以结合外来抗原。它被编码由形成特异性抗体的各种基因。 除了重排之外,可变区还可以通过多个单个氨基酸变化(称为体细胞突变或超突变)进一步修饰,以增加抗体对外来抗原的亲和力。 恒定区将响应于进一步的抗原而改变(即同种型转换)。 因此,响应于抗原编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排和体细胞突变的核酸分子可能与原始核酸分子不具有序列同一性,而是基本上相同或相似(即具有至少 80% 的同一性) ). [0112] “结合亲和力”通常是指分子(例如,抗体或其抗原结合片段)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。 分子 X 与其伴侣 Y 的亲和力通常表示为解离常数 (K _D ) 可以显示。 亲和力是平衡解离常数 (K _D ) 和平衡缔合常数 (K _A)可以用本领域已知的多种方式测量和/或表示,包括但不限于。 钾 _D 是k _off /k _on 而从 K 的商计算 _A 是k _on /k _off 从商计算 k _on 是指例如抗体或其抗原结合片段与抗原结合的速率常数,并且k _off “解离速率常数”是指抗体或其抗原结合片段与例如抗原的解离速率常数。 k _on 和k _off 是本领域技术人员已知的技术,例如BIAcore ^® 或 KinExA ^® 可以由 [0113] “阻断”或“抑制”的抗体在抗体与靶蛋白结合时“阻断”或“抑制”其靶蛋白与一种或多种配体的结合,减少或抑制(部分或完全)和/或者,当抗体与靶蛋白结合时,它会降低或抑制(部分或完全)靶蛋白的一种或多种活性或功能。 [0114] 如本文所用,“表位”是本领域的术语并且指抗体或其抗原结合片段可以特异性结合的抗原的局部区域。 表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位),或者表位可以例如由一个或多个多肽的两个或多个非连续区域形成(构象的、非线性的) , 不连续或不连续的表位)在一起。可以出来 在一些方面,抗体或其抗原结合片段结合的表位通过例如 NMR 光谱、X 射线衍射晶体学研究、ELISA 测定、氢/氘交换与质谱联用(例如,液相色谱法)来确定电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描分析和/或诱变作图(例如,丙氨酸扫描或其他定点诱变作图)。 在 X 射线晶体学的情况下,结晶可以使用本领域已知的任何方法完成(参见,例如,Giege R 等人, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(第 4 部分):339-350; [McPherson A (1990) Eur J Biochem 189:1-23]; [Chayen NE (1997) 结构 5:1269-1274]; [McPherson A (1976) J Biol Chem 251:6300-6303])。 可以使用熟知的 X 射线衍射技术和计算机软件如 X-PLOR(耶鲁大学,1992,Molecular Simulations, Inc.)研究抗体或其抗原结合片段及其抗原的测定。由 Simulations, Inc 发行.; 参见,例如,Meth Enzymol (1985) 第 114 和 115 卷,eds Wyckoff HW 等人, ]; 我们。 2004/0014194) 和 BUSTER(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60;Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A:361-423,ed Carter CW;Roversi P 等人, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)。 可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成诱变作图研究。 参见,例如,Champe M 对诱变技术的描述,包括丙氨酸扫描诱变技术。 等人, (1995) J Biol Chem 270:1388-1394 和 Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244:1081-1085。 [0115] 术语“表位作图”是指鉴定用于抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。 [0116] 与参考PAR-2抗体“结合相同表位”的PAR-2抗体是指与参考PAR-2抗体接触相同PAR-2氨基酸残基的抗体。 PAR-2 抗体与参考 PAR-2 抗体结合相同表位的能力是使用肽扫描诱变或高通量丙氨酸扫描诱变来确定的(参见 Davidson 和 Doranz,2014 Immunology 143, 13- 20).). 在后一种方法中,通过将每个单独的氨基酸残基突变为丙氨酸(或者,如果氨基酸残基是丙氨酸,则突变为另一个)来创建 PAR-2 或其一部分(例如细胞外结构域)的综合突变库残基,例如丝氨酸)并测试每个突变体与抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段的结合。 氨基酸是表位残基,因为它们是结合所必需的,通过丧失免疫反应性来鉴定。 [0117] 如本文所用,术语“特异性结合”、“特异性识别”、“特异性结合”、“特异性识别”、“特异性结合”、“选择性结合”和“选择性结合”在抗体上下文中是相似的术语或其抗原结合片段,并且指抗体与抗原上的预定表位的结合。 通常,抗体是通过 (i) Biacore 抗体产生的,使用预先确定的抗原,例如重组人 PAR-2,作为分析物,抗体作为配体。 ^® 当通过例如 T200 仪器中的表面等离子共振 (SPR) 技术或在抗体与抗原阳性细胞结合的 Scatchard 测定中测定时,大约为 10。 ^-8 米,大约 10 ^-9 M 或大约 10 ^-10 M 甚至更低的平衡解离常数 (K _D )和(ii)以比结合预定抗原或除密切相关的抗原(例如,BSA、酪蛋白)以外的非特异性抗原的亲和力大至少10倍的亲和力结合预定抗原. 因此,“特异性结合人类 PAR-2”的抗体约为 10 ^-8 米,大约 10 ^-9 M 或大约 10 ^-10 M甚至更低的K _D ,它与人 PAR-2(例如,SEQ ID NO:28 或 SEQ ID NO:28 的氨基酸 26-397)结合,也与来自另一个物种的 PAR-2(例如,食蟹猴 PAR- 2). )是指能够结合至.的抗体。 在一些方面,本文公开的抗体或其抗原结合片段不结合人PAR-1、PAR-3或PAR-4。 [0118] 在一些方面,抗PAR-2抗体或其抗原结合片段具有高亲和力(例如,如实施例5中所述),如通过表面等离子共振(SPR)技术测量的,例如,例如约9.9 × 10 ^-10 M,约 9.8 X 10 ^-10 M,约 9.7 X 10 ^-10 M,约 9.6 X 10 ^-10 M,约 9.5 X 10 ^-10 M,约 9.4 X 10 ^-10 M,约 9.3 X 10 ^-10 M,约 9.2 X 10 ^-10 米,约 9.1 X 10 ^-10 米,约 9.0 X 10 ^-10 M,约 8.9 X 10 ^-10 M,约 8.8 X 10 ^-10 M,约 8.7 X 10 ^-10 M,约 8.6 X 10 ^-10 M,约 8.5 X 10 ^-10 M,约 8.4 X 10 ^-10 米,约 8.3 X 10 ^-10 米,约 8.2 X 10 ^-10 米,约 8.1 X 10 ^-10 米,约 8.0 X 10 ^-10 M,约 7.9 X 10 ^-10 M,约 7.8 X 10 ^-10 M,约 7.7 X 10 ^-10 米,约 7.6 X 10 ^-10 M,约 7.5 X 10 ^-10 M,约 7.4 X 10 ^-10 米,约 7.3 X 10^-10 米,约 7.2 X 10 ^-10 米,约 7.1 X 10 ^-10 米,约 7.0 X 10 ^-10 M,约 6.9 X 10 ^-10 M,约 6.8 X 10 ^-10 M,约 6.7 X 10 ^-10 M,约 6.6 X 10 ^-10 M,约 6.5 X 10 ^-10 M,约 6.4 X 10 ^-10 M,约 6.3 X 10 ^-10 M,约 6.2 X 10 ^-10 M,约 6.1 X 10 ^-10 米,约 6.0 X 10 ^-10 M,约 5.9 X 10 ^-10 M,约 5.8 X 10 ^-10 M,约 5.7 X 10 ^-10 M,约 5.6 X 10 ^-10 M,约 5.5 X 10 ^-10 M,约 5.4 X 10 ^-10 米,约 5.3 X 10 ^-10 米,约 5.2 X 10 ^-10 米,约 5.1 X 10 ^-10 米,约 5.0 X 10 ^-10 米,约 4.9 X 10 ^-10 M,约 4.8 X 10 ^-10 M,约 4.7 X 10 ^-10 M,约 4.6 X 10 ^-10 M,约 4.5 X 10 ^-10 M,约 4.4 X 10 ^-10 米,约 4.3 X 10 ^-10 米,约 4.2 X 10 ^-10 米,约 4.1 X 10 ^-10 米,约 4.0 X 10 ^-10 米,约 3.9 X 10 ^-10 米,约 3.8 X 10 ^-10 米,约 3.7 X 10 ^-10 米,约 3.6 X 10 ^-10 米,约 3.5 X 10 ^-10 米,约 3.4 X 10 ^-10 米,约 3.3 X 10 ^-10 米,约 3.2 X 10 ^-10 米,约 3.1 X 10 ^-10 米,约 3.0 X 10 ^-10 米,约 2.9 X 10 ^-10 米,约 2.8 X 10 ^-10 米,约 2.7 X 10 ^-10 米,约 2.6 X 10 ^-10 米,约 2.5 X 10 ^-10 米,2.4×10 ^-10 米,约 2.3 X 10 ^-10 米,约 2.2 X 10 ^-10 米,约 2.1 X 10 ^-10 米,约 2.0 X 10 ^-10 米,约 1.9 X 10 ^-10 米,约 1.8 X 10 ^-10 米,约 1.7 X 10 ^-10 米,约 1.6 X 10 ^-10 米,约 1.5 X 10 ^-10 米,1.4×10 ^-10 米,约 1.3 X 10 ^-10 米,约 1.2 X 10 ^-10 米,约 1.1 X 10 ^-10 米,约 1.0 X 10 ^-10 M,约 9 X 10 ^-11 M,大约 8 X 10 ^-11 M,约 7 X 10 ^-11 M,约 6 X 10 ^-11 M,约 5 X 10 ^-11 M,约 4 X 10 ^-11 M,约 3 X 10 ^-11 M,约 2 X 10 ^-11 M,约 1 X 10 ^-11 M,约 9 X 10 ^-12 M,大约 8 X 10 ^-12 M,约 7 X 10 ^-12 M,约 6 X 10 ^-12 M,约 5 X 10 ^-12 M,约 4 X 10 ^-12 M,约 3 X 10 ^-12 M,约 2 X 10 ^-12 M,约 1 X 10 ^-12 M,约 9 X 10 ^-13 M,或大约 8 X 10 ^-13 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 [0119] 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 9.5 X 10 ^-10 M,约 9.4 X 10 ^-10 M,约 9.3 X 10 ^-10 M,约 9.2 X 10 ^-10 米,约 9.1 X 10 ^-10 米,约 9.0 X 10 ^-10 M,约 8.9 X 10 ^-10 M,约 8.8 X 10 ^-10 M,约 8.7 X 10 ^-10 M,约 8.6 X 10 ^-10 M,约 8.5 X 10 ^-10 M,约 8.4 X 10 ^-10 米,约 8.3 X 10 ^-10 米,约 8.2 X 10 ^-10 米,约 8.1 X 10 ^-10 米,约 8.0 X 10 ^-10 M,约 7.9 X 10 ^-10 M,约 7.8 X 10 ^-10 M,约 7.7 X 10 ^-10 米,约 7.6 X 10 ^-10 M,约 7.5 X 10 ^-10 M,约 7.4 X 10 ^-10 米,约 7.3 X 10 ^-10 米,约 7.2 X 10 ^-10 米,约 7.1 X 10 ^-10 米,约 7.0 X 10 ^-10 M,约 6.9 X 10 ^-10 M,约 6.8 X 10 ^-10 M,约 6.7 X 10 ^-10 M,约 6.6 X 10 ^-10 M,约 6.5 X 10 ^-10 M,约 6.4 X 10 ^-10 M,约 6.3 X 10 ^-10 M,约 6.2 X 10 ^-10 M,约 6.1 X 10 ^-10 米,约 6.0 X 10 ^-10 M,约 5.9 X 10 ^-10 M,约 5.8 X 10 ^-10 M,约 5.7 X 10 ^-10 M,约 5.6 X 10 ^-10 M,约 5.5 X 10 ^-10 M,约 5.4 X 10 ^-10 米,约 5.3 X 10 ^-10 米,约 5.2 X 10 ^-10 米,约 5.1 X 10 ^-10 米,约 5.0 X 10 ^-10 米,约 4.9 X 10 ^-10 M,约 4.8 X 10 ^-10 M,约 4.7 X 10 ^-10 M,约 4.6 X 10 ^-10 M,约 4.5 X 10 ^-10 M,约 4.4 X 10 ^-10 M,或约 4.3 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 [0120] 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 9.5 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 8.5 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 7.5 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 6.5 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 5.5 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 4.5 X 10 ^-10 米中的钾 _D 特异性结合人类 PAR-2。 [0121]本文所用的术语“交叉反应”或“交叉反应性”是指本文所述的抗体结合 PAR-2 直系同源物的能力。 例如,本文描述的结合人 PAR-2 的抗体也可以结合另一种 PAR-2(例如食蟹猴 PAR-2)。 如本文所用,交叉反应性是指在结合测定(例如,SPR、ELISA)中与纯化抗原的特异性反应性或与生理性表达 PAR-2 的细胞的结合或功能性相互作用。可通过检测来测量 用于确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定,例如使用 Biacore® T200 SPR 仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)的 Biacore® 表面等离子体共振 (SPR) 分析,或包括流式细胞术技术。 “与食蟹猴PAR-2发生交叉反应”的抗体是指与食蟹猴PAR-2结合的KD约为10M、约10M或约10M甚至更低的抗体。 在某些方面,这种不与来自非人类物种(例如,小鼠、兔、豚鼠或狗 PAR-2)的 PAR-2 发生交叉反应的抗体在标准结合中表现出与这些蛋白质基本检测不到的结合化验. 表明 [0122] 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段,例如,如通过表面等离子共振 (SPR) 技术测量的(例如,如实施例 5 中所述)约 9.5 X 10 ^-9 M,约 9.4 X 10 ^-9 M,约 9.3 X 10 ^-9 M,约 9.2 X 10 ^-9 米,约 9.1 X 10 ^-9 米,约 9.0 X 10 ^-9 M,约 8.9 X 10 ^-9 M,约 8.8 X 10 ^-9 M,约 8.7 X 10 ^-9 M,约 8.6 X 10 ^-9 M,约 8.5 X 10 ^-9 M,约 8.4 X 10 ^-9 米,约 8.3 X 10 ^-9 米,约 8.2 X 10 ^-9 米,约 8.1 X 10 ^-9 米,约 8.0 X 10 ^-9 M,约 7.9 X 10 ^-9 M,约 7.8 X 10 ^-9 M,约 7.7 X 10 ^-9 米,约 7.6 X 10 ^-9 M,约 7.5 X 10 ^-9 M,约 7.4 X 10 ^-9 米,约 7.3 X 10 ^-9 米,约 7.2 X 10 ^-9 米,约 7.1 X 10 ^-9 米,约 7.0 X 10 ^-9 M,约 6.9 X 10 ^-9 M,约 6.8 X 10 ^-9 M,约 6.7 X 10 ^-9 M,约 6.6 X 10 ^-9 M,约 6.5 X 10 ^-9 M,约 6.4 X 10 ^-9 M,约 6.3 X 10 ^-9 M,约 6.2 X 10 ^-9 M,约 6.1 X 10 ^-9 米,约 6.0 X 10 ^-9 M,约 5.9 X 10 ^-9 M,约 5.8 X 10 ^-9 M,约 5.7 X 10 ^-9 M,约 5.6 X 10 ^-9 M,约 5.5 X 10 ^-9 M,约 5.4 X 10 ^-9 米,约 5.3 X 10 ^-9 米,约 5.2 X 10 ^-9 米,约 5.1 X 10 ^-9 米,约 5.0 X 10 ^-9 米,约 4.9 X 10 ^-9 M,约 4.8 X 10 ^-9 M,约 4.7 X 10 ^-9 米,约 4.6 10 ^-9 M,约 4.5 X 10 ^-9 M,约 4.4 X 10 ^-9 米,约 4.3 X 10 ^-9 米,约 4.2 X 10 ^-9 米,约 4.1 X 10 ^-9 米,约 4.0 X 10 ^-9 米,约 3.9 X 10 ^-9 米,约 3.8 X 10 ^-9 米,约 3.7 X 10 ^-9 米,约 3.6 X 10 ^-9 米,约 3.5 X 10 ^-9 米,约 3.4 X 10 ^-9 米,约 3.3 X 10 ^-9 米,约 3.2 X 10 ^-9 米,约 3.1 X 10 ^-9 米,约 3.0 X 10 ^-9 米,约 2.9 X 10 ^-9 米,约 2.8 X 10 ^-9 米,约 2.7 X 10 ^-9 米,约 2.6 X 10 ^-9 米,约 2.5 X 10 ^-9 米,约 2.4 X 10 ^-9 米,约 2.3 X 10 ^-9 米,约 2.2 X 10 ^-9 米,约 2.1 X 10 ^-9 米,约 2.0 X 10 ^-9 米,约 1.9 X 10 ^-9 米,约 1.8 X 10 ^-9 米,约 1.7 X 10 ^-9 米,约 1.6 X 10 ^-9 米,约 1.5 X 10 ^-9 米,约 1.4 X 10 ^-9 米,约 1.3 X 10 ^-9 米,约 1.2 X 10 ^-9 米,约 1.1 X 10 ^-9 米,约 1.0 X 10 ^-9 M,约 9.9 X 10 ^-10 M,约 9.8 X 10 ^-10 M,约 9.7 X 10 ^-10 M,约 9.6 X 10 ^-10 M,约 9.5 X 10 ^-10 M,约 9.4 X 10 ^-10 M,约 9.3 X 10 ^-10 M,约 9.2 X 10 ^-10 米,约 9.1 X 10 ^-10 米,约 9.0 X 10 _-10 M,约 8.9 X 10 ^-10 M,约 8.8 X 10 ^-10 M,约 8.7 X 10 ^-10 M,约 8.6 X 10 ^-10 M,约 8.5 X 10 ^-10 M,约 8.4 X 10 ^-10 米,约 8.3 X 10 ^-10 米,约 8.2 X 10 ^-10 米,约 8.1 X 10 ^-10 米,约 8.0 X 10 ^-10 M,约 7.9 X 10 ^-10 M,约 7.8 X 10 ^-10 M,约 7.7 X 10 ^-10 米,约 7.6 X 10 ^-10 M,约 7.5 X 10 ^-10 M,约 7.4 X 10 ^-10 米,约 7.3 X 10 ^-10 米,约 7.2 X 10 ^-10 米,约 7.1 X 10 ^-10 米,约 7.0 X 10 ^-10 M,约 6.9 X 10 ^-10 M,约 6.8 X 10 ^-10 M,约 6.7 X 10 ^-10 M,约 6.6 X 10 ^-10 M,约 6.5 X 10 ^-10 M,约 6.4 X 10 ^-10 M,约 6.3 X 10 ^-10 M,约 6.2 X 10 ^-10 M,约 6.1 X 10 ^-10 米,约 6.0 X 10 ^-10 M,约 5.9 X 10 ^-10 M,约 5.8 X 10 ^-10 M,约 5.7 X 10 ^-10 M,约 5.6 X 10 ^-10 M,约 5.5 X 10 ^-10 M,约 5.4 X 10 ^-10 米,约 5.3 X 10 ^-10 米,约 5.2 X 10 ^-10 米,约 5.1 X 10 ^-10 米,约 5.0 X 10 ^-10 米,约 4.9 X 10 ^-10 M,约 4.8 X 10 ^-10 M,约 4.7 X 10 ^-10 M,约 4.6 X 10 ^-10 M,约 4.5 X 10 ^-10 M,约 4.4 X 10 ^-10米,约 4.3 X 10 ^-10 米,约 4.2 X 10 ^-10 米,约 4.1 X 10 ^-10 米,约 4.0 X 10 ^-10 米,约 3.9 X 10 ^-10 米,约 3.8 X 10 ^-10 米,约 3.7 X 10 ^-10 米,约 3.6 X 10 ^-10 米,约 3.5 X 10 ^-10 米,约 3.4 X 10 ^-10 米,约 3.3 X 10 ^-10 米,约 3.2 X 10 ^-10 米,约 3.1 X 10 ^-10 米,约 3.0 X 10 ^-10 米,约 2.9 X 10 ^-10 米,约 2.8 X 10 ^-10 米,约 2.7 X 10 ^-10 米,约 2.6 X 10 ^-10 米,约 2.5 X 10 ^-10 米,2.4×10 ^-10 米,约 2.3 X 10 ^-10 米,约 2.2 X 10 ^-10 米,约 2.1 X 10 ^-10 米,约 2.0 X 10 ^-10 米,约 1.9 X 10 ^-10 米,约 1.8 X 10 ^-10 米,约 1.7 X 10 ^-10 米,约 1.6 X 10 ^-10 米,约 1.5 X 10 ^-10 米,1.4×10 ^-10 米,约 1.3 X 10 ^-10 米,约 1.2 X 10 ^-10 米,约 1.1 X 10 ^-10 米,约 1.0 X 10 ^-10 M,约 9 X 10 ^-11 M,大约 8 X 10 ^-11 M,约 7 X 10 ^-11 M,约 6 X 10 ^-11 M,约 5 X 10 ^-11 M,约 4 X 10 ^-11 M,约 3 X 10 ^-11 M,约 2 X 10 ^-11 M,约 1 X 10 ^-11 M,约 9 X 10 ^-12 M,大约 8 X 10 ^-12 M,约 7 X 10 ^-12 M,约 6 X 10 ^-12 M,约 5 X 10 ^-12 M,约 4 X 10 ^-12 M,约 3 X 10 ^-12 M,约 2 X 10 ^-12 M,约 1 X 10 ^-12 M,约 9 X 10 ^-13 M,或大约 8 X 10 ^-13 以 M 的 KD 与食蟹猴 PAR-2 结合。 [0123] 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 9.5 X 10 ^-9 米中的钾 _D 与食蟹猴 PAR-2 结合。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 8.5 X 10 ^-9 米中的钾 _D 与食蟹猴 PAR-2 结合。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 7.5 X 10 ^-9 米中的钾 _D 与食蟹猴 PAR-2 结合。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 6.5 X 10 ^-9 米中的钾 _D 与食蟹猴 PAR-2 结合。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 5.5 X 10 ^-9 米中的钾 _D 与食蟹猴 PAR-2 结合。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段约为 4.5 X 10 ^-9 米中的钾 _D 与食蟹猴 PAR-2 结合。 [0124] 如果抗体优先结合给定表位或重叠表位,使得参考抗体与该表位的结合在一定程度上被阻断,则称抗体“竞争性抑制”参考抗体与给定表位的结合。 竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法来确定,例如竞争性ELISA测定。 可以说抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合至少 90%、至少 80%、至少 70%、至少 60% 或至少 50%。 [0125] “与另一种抗体竞争结合靶标”的抗体是指抑制(部分或完全)另一种抗体与靶标结合的抗体。 两种抗体是否以及在何种程度上相互竞争以结合靶标,即一种抗体是否以及在何种程度上抑制另一种抗体与靶标的结合,可以通过已知的竞争实验例如Biacore来确定。 ^® 它可以使用表面等离子体共振 (SPR) 分析来确定。 在一些方面,抗体与另一种抗体竞争结合靶标并抑制另一种抗体结合靶标至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。 抑制或竞争水平可能会有所不同,具体取决于哪种抗体是“封闭抗体”(即,首先与靶标孵育的冷抗体)。 竞争测定描述于例如 Ed Harlow 和 David Lane,Cold Spring Harb Protoc; 2006年; doi:10.1101/pdb.prot4277] 或 [Ed Harlow 和 David Lane 的“使用抗体”第 11 章,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,美国 1999]。 如果两种抗体在两个方向上相互阻断至少 50%,即两种抗体“交叉竞争”,即无论是一种抗体还是另一种抗体在竞争实验中首先与抗原接触。 [0126] 用于确定两种抗体是否竞争或交叉竞争结合的竞争性结合测定是通过流式细胞术竞争结合表达 PAR-2 的细胞,例如,如实施例中所述。 其他方法包括:SPR(例如 Biacore ^® )、BLI(生物层干涉法)、固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(Stahli 等。 , 酶学方法 9:242 (1983)]; 固相直接生物素-亲和素 EIA(Kirkland 等。 , J.免疫学 . 137:3614(1986 年)); Solid Phase Direct Labeled Assay, Solid Phase Direct Labeled Sandwich Assay(参见 Harlow 和 Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); 固相直接标记 RIA 使用 1-125 标记(Morel 等。 , 摩尔。 免疫学 . 25(1):7 (1988)); 固相直接生物素-亲和素 EIA(Cheung 等。 , 病毒学 176:546(1990 年)); 并直接标记为RIA。 (莫登豪尔 等。 , 扫描。 J.免疫学 . 32:77(1990))。 [0127] 如本文所用,术语“k _assoc " 或 "k _a "旨在指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率,而本文使用的术语“k” _dis " 或 "k _d "旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用,术语“K _D " 是 k _d 对 k _a 的比率(即k _d /k _a ), 表示为摩尔浓度 (M)。 K代表抗体 _D 值可以使用本领域公认的方法来确定。 抗体K _D 确定 β 的可用方法是表面等离子共振、生物传感器系统,例如 Biacore ^® 、BLI(生物层干涉测量)系统或流式细胞术和 Scatchard 分析。 [0128]如本文所用,IgG抗体的术语“高亲和力”是靶抗原的10%。 ^-8 米以下,10 ^-9 M以下或10 ^-10 “抗体”是指KD为M或更小的抗体。 然而,“高亲和力”结合对于其他抗体同种型可能不同。 例如,与 IgM 同种型的“高亲和力”结合是 10 ^-10 M以下或10 ^-8 “抗体”是指KD为M或更小的抗体。 [0129] 体外或体内测定上下文中的术语“EC” ₅₀ “是指引发最大反应的 50% 反应的药剂的有效浓度,即介于最大反应和基线之间的反应。通常在评估抗体效力时使用该值。抗体或抗原-其结合片段。术语“IC”在体外或体内测定的上下文中使用 ₅₀ “是指抗体或其抗原结合片段的抑制浓度,其抑制对最大反应的 50% 的反应,即最大反应和基线之间的中间水平。通常,该“抑制效力”值评估抗体效力。使用时 [0130] 此处应用于对象的术语“自然发生的”是指可以在自然界中找到该对象的事实。 例如,可以从天然来源分离并且存在于生物体(包括病毒)中且未在实验室中被人类有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。 [0131] “分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。 分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括纯化到不再以自然界中存在的形式存在的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。 在一些方面,分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。 如本文所用,“基本纯”是指至少50%纯(即不含污染物)、至少90%纯、至少95%纯、至少98%纯或至少99%纯的材料纯的。 [0132] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,指任何长度的氨基酸聚合物。 聚合物可以是直链或支链的,可以包含修饰的氨基酸,并且可以被非氨基酸打断。 该术语还包括自然地或通过干预; 例如,通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰,例如与标记组分缀合而修饰的氨基酸聚合物。 该定义还包括含有例如一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。 因为本公开的多肽基于抗体,所以理解在一些方面,多肽可以作为单链或相关链存在。 [0133] 如本文所用,术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。 核酸分子可以是单链或双链的,并且可以是cDNA。 [0134] “保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。 具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。 这些家族包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸),非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸) ). 在某些方面,抗 PAR-2 抗体中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。 鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域众所周知的(参见,例如,Brummell 等。 , 生化 . 32: 1180-1187 (1993)]; [小林 等。 蛋白质工程 . 12(10):879-884 (1999)]; 和[伯克斯 等。 过程。 国家队。 学院。 科学。 美国 94:412-417 (1997)])。 [0135] 两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数量的函数,同时考虑到两个序列的最佳比对需要引入的空位数量和每个空位的长度(即,%序列同一性 = 相同位置数/位置总数 x 100)。 两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成,如下面的非限制性实施例中所述。 [0136] 使用 NWSgapdna.CMP 矩阵和 40、50、60、70 或 80 的间隙权重以及使用 GCG 软件包(worldwideweb)的 1、2、3、4、5 或 6 的长度权重测量两个核苷酸序列之间的百分比同一性. 可以使用 GAP 程序(可在 gcg.com 获得)来确定。 两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也由 E. Meyers 和 Miller (W. Miller) 的算法 (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) 确定。 此外,可以使用 Blossum 62 矩阵或 PAM250 矩阵以及 16、14、12、10、8、6 或 4 的空位权重和 1、2、2、 3、4、5 或 6 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 并入 GCG 软件包(可在 www.gcg.com 获得)的 GAP 程序中,使用它可以使用算法来确定。 [0137] 本文所述的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索,例如以识别相关序列。 此类搜索在 Altschul 等人中有所描述。 (1990) J. 摩尔。 生物学。 215:403-10],使用 NBLAST 和 XBLAST 程序(2.0 版)。 可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索,得分=100,字长=12,以获得与本文描述的核酸分子同源的核苷酸序列。 可以使用 XBLAST 程序进行 BLAST 蛋白质搜索,分数 = 50,字长 = 3,以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。 为了获得用于比较目的的空位比对,使用 Altschul 执行空位 BLAST 等。 , (1997) 核酸研究 . 25(17):3389-3402。 当使用 BLAST 和 gapped BLAST 程序时,可以使用相应程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的默认参数。 参见 worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov。 [0138] 核酸可以全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。 通过标准技术包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术,将核酸与其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞)分离。它是“分离的”当从核酸(例如,染色体的另一部分)或蛋白质中纯化时,或“基本上纯的”。 文学[F. 奥苏贝尔, 等。 ,编辑。 Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing 和 Wiley Interscience,纽约(1987 年)。 [0139] 可以根据提供基因序列的标准技术诱变核酸,例如cDNA。 在编码序列的情况下,这些突变可以根据需要影响氨基酸序列。 特别地,考虑了与天然 V、D、J、常数、开关和本文描述的其他此类序列基本上同源或衍生自其的 DNA 序列(其中“衍生”是指该序列与另一序列相同或从另一序列修饰而来) . 指出)。 [0140] 如本文所用,术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”可以是任何类型的细胞,包括原代细胞、培养细胞或来自细胞系的细胞。 在一些方面,术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的后代或潜在后代。 此类细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲代细胞不同,例如由于可能在后续世代中发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。 [0141] 本文所用的术语“连接”是指两个或多个分子的结合。 连接可以是共价的或非共价的。 连锁也可以是遗传的(即重组融合)。 这种连接可以使用多种本领域公认的技术来实现,例如化学缀合和重组蛋白生产。 [0142] 如本文所用,术语“细胞因子”是指诱导对细胞的多种作用,例如诱导生长或增殖的多种因子中的任何一种。 在本发明的实践中可以单独或组合使用的细胞因子的非限制性实例包括白介素-2 (IL-2)、干细胞因子 (SCF)、白介素-3 (IL-3)、白介素-4 (IL-4)、白介素 6 (IL-6)、白介素 8 (IL-8)、白介素 11 (IL-11)、白介素 12 (IL-12)、白介素 13 (IL-13) , 白细胞介素-15 (IL-15), 白细胞介素-18 (IL-18), 粒细胞集落刺激因子 (G-CSF), 血管内皮生长因子-A (VEGF-A), 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM -CSF) CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNF)、MIP-11、白血病抑制因子(LIF)、c-kit配体、促血小板生成素(TPO)和 flt3 配体。 细胞因子可从例如 Genzyme(美国马萨诸塞州弗雷明汉)、Genentech(美国加利福尼亚州南旧金山)、Amgen(美国加利福尼亚州千橡市)、R&D Systems(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)和 Immunex(美国华盛顿州西雅图)。 尽管并不总是明确说明,但与野生型或纯化的细胞因子(例如,重组产生的或其突变蛋白)具有相似生物活性的分子旨在在本公开的精神和范围内使用。 [0143] 术语“药物制剂”是指一种制剂,其形式允许活性成分的生物活性有效并且不包含对制剂给药对象具有不可接受的毒性的额外成分。 该制剂可以是无菌的。 [0144] 如本文所用,术语“administer”、“administering”、“administration”等可用于将药物(例如抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段)递送至所需的生物作用位点。说明你如何能 可以与本文所述的试剂和方法一起使用的给药技术包括,例如,Goodman 和 Gilman, 这 药理学 治疗学基础 , 当前版本, Pergamon]; 和 [雷明顿的, 制药科学 , 当前版本,麦克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿]。 本文所述抗体的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径(例如通过注射或输注)。 如本文所用,短语“肠胃外给药”是指肠内和局部给药(通常通过注射)以外的给药方式,包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、心室内、玻璃体内、硬膜外和胸骨内注射和输注,以及离体包括我的电穿孔。 或者,本文所述的抗体可以通过非肠胃外途径施用,例如局部、表皮或粘膜施用途径,例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。 也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行给药。 [0145] 如本文所用,术语“受试者”和“患者”可互换使用。 受试者可以是哺乳动物,例如非人类动物(例如,牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、猴子或其他灵长类动物等)。 在一些方面,对象是人。 在一些方面,受试者是食蟹猴。 [0146] 术语“有效剂量”或“有效剂量”定义为足以达到预期效果的药物量,例如抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段。 当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时,药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指减轻疾病症状的严重程度,增加疾病的频率和持续时间-自由期,总生存期(一种促进疾病消退的药物,其证据是从诊断或开始治疗疾病(例如癌症)之日到被诊断患有该疾病的患者仍然活着的时间长度增加,或预防因疾病引起的残疾或无能力。是任意数额 药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”,其单独或与另一种治疗剂联合施用于有发生疾病或患有疾病复发风险的受试者。疾病 抑制疾病发作或复发的任何剂量的药物。 治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发作或复发的能力可以在临床试验期间在人类受试者中评估,在预测人类疗效的动物模型系统中评估,或通过在体外试验中测定药物活性assay. 可以使用技术人员已知的多种方法对其进行评估。 [0147] 举例来说,抗癌剂是促进受试者癌症消退的药物。 在一些方面,治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。 “加速癌症消退”是指单独或与抗肿瘤剂联合施用有效量的药物可减少肿瘤生长或大小、肿瘤坏死、减少至少一种疾病症状的严重程度、疾病的频率和持续时间-自由期导致总体存活率增加、预防因疾病引起的残疾或无能力,或以其他方式改善患者的疾病症状。 此外,与治疗相关的术语“有效性”和“有效性”包括药理学有效性和生理安全性。 药理学有效性是指药物促进患者癌症消退的能力。 生理安全性是指在细胞、器官和/或生物体水平上由药物给药或其他不良生理效应(不良反应)引起的毒性水平。 [0148] 作为治疗肿瘤的实例,治疗有效量或剂量的药物抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20%、至少约40%、至少约60%或至少约80%相对未经治疗的受试者。 在一些方面,治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长,即抑制细胞生长或肿瘤生长100%。 化合物抑制肿瘤生长的能力可以使用下述测定来评估。 或者,可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评估组合物的这种特性,并且这种抑制可以通过技术人员已知的测定法在体外测量。 在本文所述的一些方面,可以观察到肿瘤消退并且可以持续至少约20天、至少约40天或至少约60天的时期。 [0149]诸如“治疗”或“治疗”或“治疗”或“减轻”或“减少”等术语是指与疾病相关的症状、并发症、病症或生化体征的进展、发展、严重性或复发。指指为了逆转、减轻、改善、抑制或减慢或预防或改善总体生存而对受试者实施或通过向受试者施用活性剂而进行的任何类型的干预或过程。 治疗可以针对患有疾病的受试者或没有疾病的受试者(例如,用于预防)。 在一些方面,如果患者表现出以下一项或多项,则根据本文提供的方法成功地“治疗”了受试者:癌细胞计数减少或完全不存在; 减少肿瘤大小; 抑制或不存在癌细胞浸润到外周器官,包括例如扩散到软组织和骨骼的癌症; 抑制或不存在肿瘤转移; 抑制或不存在肿瘤生长; 缓解与特定癌症相关的一种或多种症状; 降低发病率和死亡率; 改善生活质量; 肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力降低; 肿瘤中癌症干细胞的数量或频率减少; 致瘤细胞分化为非致瘤状态; 无进展生存期 (PFS)、无病生存期 (DFS) 或总生存期 (OS) 增加、完全缓解 (CR)、部分缓解 (PR)、疾病稳定 (SD)、进展性疾病 (PD) 减少、时间缩短进展 (TTP),或其任何组合。 [0150] 在一些实施方案中,如果患者表现出以下一项或多项,则根据本文提供的方法成功地“治疗”了受试者:COPD症状的预防或控制、COPD恶化的频率和减少严重程度、健康状况的改善、运动耐量的改善或其任何组合。 参见,例如,拉贝 等人 ., Am J Respir Crit Care Med ., 176:532-555 (2007)。 [0151] 在一些实施方案中,如果患者表现出以下一项或多项,则受试者根据本文提供的方法成功地“治疗”了哮喘:预防或控制哮喘症状、降低哮喘恶化的频率和严重程度、健康状况改善,运动耐量改善,或其任何组合。 参见,例如,Gatheral 等人 ., Cochrane 数据库系统修订版 ., 4(4), (2017). [0152] 术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的一种生理状况,其中细胞群的特征在于不受调节的细胞生长。 此类癌症可包括实体瘤,例如骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、中性粒细胞、小神经胶质细胞或其他先天免疫细胞)侵入肿瘤微环境的实体瘤。 此类癌症的实例包括但不限于成胶质细胞瘤、头颈癌、肾癌(例如,肾透明细胞癌)、胰腺癌和乳腺癌。 癌症可以是“PAR-2阳性癌症”。 该术语指涉及表达 PAR-2 mRNA 或蛋白质的细胞的癌症。 癌症可以是具有“增加的PAR-2”mRNA或蛋白质的癌症。 这是指比相同组织的健康版本具有更多 PAR-2 的癌症(例如,浸润癌症的细胞)。 [0153] 如本文所用,术语“体外”是指不在生物体(例如,动物、植物或微生物)内而是在人工环境中发生的事件,例如试管或反应容器、细胞培养物、培养皿、等等。指的是 [0154] 如本文所用,术语“体内”是指在生物体(例如,动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。 [0155] 如本文所用,术语“ug”和“uM”分别与“μg”和“μM”可互换使用。 [0156] 本文描述的各个方面在下面的小节中进一步详细描述。 本文提供的任何组合物或方法可与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种组合。 [0157] 二。 抗体 [0158] 在一些实施方案中,本文提供特异性结合PAR-2的抗体(例如,单克隆抗体,例如人源化抗体)及其抗原结合片段(例如,人、食蟹猴)。 在一些方面,本文提供特异性结合人PAR-2的抗体(例如,单克隆抗体,例如人源化抗体)及其抗原结合片段。 人、食蟹猴和大鼠 PAR-2 的氨基酸序列是本领域已知的,并且也在本文中分别如 SEQ ID NO: 28、30 和 32 所示提供。 [0159] 人PAR-2(UniProt标识号P55085-1;SEQ ID NO:28)由397个氨基酸(包括一个信号肽)组成,结构上由7个跨膜区、一个胞外N端和一个胞内区组成典型的 A 类 G 蛋白偶联受体超家族成员,末端有一个 C 末端。 在细胞外环 1 和 2 之间有一个二硫键,据信它可以稳定结构并可能有助于信号转导。 PAR-2的晶体结构已经解开。 文学[程 等人 ., 自然 , 545:112-115 (2017),其全部内容通过引用并入本文。 [0160] 下面是一种已知的人类 PAR-2 异构体的氨基酸序列。 [0161] 人类 PAR-2(UniProt ID P55085-1;SEQ ID NO:28) [0162] [0163] 人PAR-2的信号序列对应氨基酸1-25(下划线)。 因此,人PAR-2亚型1的成熟亚型由26至397位氨基酸组成。 [0164] 人类 PAR-2(无信号序列)(SEQ ID NO:109) [0165] [0166] 人PAR-2序列(SEQ ID NO:28)在21位为丝氨酸(S),30位为天冬酰胺(N),270位为精氨酸(R),苏氨酸(T)代表天然序列出现在第 291 位。 在一些实施方案中,考虑了天然存在的变体人 PAR-2 序列,其中第 21 位被苯丙氨酸 (F) 占据。 在一些实施方案中,考虑了其中位置 30 被丝氨酸 (S) 占据的天然变体人 PAR-2 序列。 在一些实施方案中,考虑了其中位置 270 被谷氨酰胺 (Q) 占据的天然变体人 PAR-2 序列。 在一些实施方案中,考虑了其中第 291 位被丙氨酸 (A) 占据的天然变体人 PAR-2 序列。 [0167] 在一些实施例中,人类 PAR-2 序列被认为缺少其信号序列。 例如,人类 PAR-2 序列可以包括 SEQ ID NO:28 的氨基酸 26-397。 [0168] 在一些实施方案中,人 PAR-2 序列被认为缺少其信号序列(SEQ ID NO: 28 的氨基酸 1-25)和前肽序列(SEQ ID NO: 28 的氨基酸 26-36),这可以去除以激活受体。 “人PAR2的N端”是指SEQ ID NO:28的氨基酸1-71。 [0169] SEQ ID NO: 28 所示的人 PAR-2 的其他特征包括约氨基酸 138-149 的胞外结构域 (ECD) 1、约氨基酸 212-235 的 ECD2、约氨基酸 318-的 ECD3 结构域323,跨膜结构域(TM)1来自约氨基酸72-101,TM2来自约氨基酸109-137,TM3来自约氨基酸150-177,TM4来自约氨基酸184-212,TM4来自约氨基酸236-269 TM5、TM6 来自大约氨基酸 278-317,而 TM7 来自大约氨基酸 324-347。 [0170] 食蟹猴 PAR-2(UniProt 标识号 E5FAJ7;SEQ ID NO:30) [0171] [0172] 在一些实施方案中,食蟹猴 PAR-2 序列被认为缺少其信号序列。 例如,食蟹猴PAR-2序列可包括SEQ ID NO:31的氨基酸21-438。 [0173] 食蟹猴PAR-2(无信号序列)(SEQ ID NO:31) [0174] [0175] 大鼠 PAR-2(UniProt ID Q63645;SEQ ID NO:32) [0176] [0177] 在一些实施例中,大鼠 PAR-2 序列被认为缺少其信号序列。 例如,大鼠 PAR-2 序列可以包括 SEQ ID NO:32 的氨基酸 26-397。 [0178] 在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段是人 PAR-2(例如,SEQ ID NO:28 或 SEQ ID NO:28 的氨基酸 26-397,或第 21 位的 S 或 F ) 或在第 30 位具有 N 或 S,在第 270 位具有 R 或 Q,或在第 291 位具有 T 或 A 的前述序列之一)。 [0179] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段结合人PAR-2和食蟹猴PAR-2(例如,SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:30的氨基酸21-438)。 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段结合人 PAR-2 和大鼠 PAR-2(例如,SEQ ID NO:32 或 SEQ ID NO:32 的氨基酸 26-397)。 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段结合人PAR-2、食蟹猴PAR-2和大鼠PAR-2。 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段结合人 PAR-2 但不结合大鼠 PAR-2(例如,SEQ ID NO: 32 或 SEQ ID NO: 32 的氨基酸 26-397) . 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段结合人 PAR-2 和任选地大鼠 PAR-2。 在一些方面,抗体或其抗原结合片段结合人 PAR-2、食蟹猴 PAR-2 和任选的大鼠 PAR-2。 [0180] 可用于本文公开的方法的特定抗体包括 PAR-2,例如人抗体,具有实施例 1-4 中构建的抗体 309-4e、P24E1102、P24E976、P24E1099 和/或 P24E1103 的 CDR 和/或可变区序列., 特异性结合食蟹猴和大鼠PAR-2的抗体(例如单克隆抗体,如人源化抗体)及其抗原结合片段,以及其可变区或CDR序列,至少80%的抗体具有同一性(例如,至少约 85%、至少约 90%、至少约 95%、至少约 96%、至少约 97%、至少约 98%、至少约 99%、或约 100%身份)上午。 309-4e、P24E1102、P24E976、P24E1099 和 P24E1103 的 VH 氨基酸序列分别示于 SEQ ID NOs:20、21、21、21 和 21。 309-4e、P24E1102、P24E976、P24E1099 和 P24E1103 的 VL 氨基酸序列分别示于 SEQ ID NOs:23、24、25、26 和 27。 [0181] 在一些方面,本文所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合人 PAR-2,其中每个抗体或其抗原结合片段具有 SEQ ID NO: 1 (GFSLX ₁ X ₂ 永兴 ₃ X ₄ X ₅ ), SEQ ID NO: 2 (VIWGNX ₆ NX ₇ YYX ₈ ), SEQ ID NO: 3 (WX ₉ GX ₁₀ 康得新 ₁₁ PFDY), SEQ ID NO: 4 (X ₁₂ ASQNX ₁₃ YKX ₁₄ LD), SEQ ID NO: 5 (X ₁₅ X ₁₆ X ₁₇ X ₁₈ X ₁₉ X ₂₀ T)和SEQ ID NO:6(X ₂₁ 青海兴 ₂₂ X ₂₃ GWT)重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3和轻链可变区(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列,其中: [0182] X ₁ = 天冬酰胺 (N) 或丝氨酸 (S), [0183] X ₂ = 丝氨酸 (S) 或酪氨酸 (Y), [0184] X ₃ = 甘氨酸 (G) 或丙氨酸 (A), [0185] X ₄ = 缬氨酸 (V)、甘氨酸 (G) 或异亮氨酸 (I), [0186] X ₅ = 异亮氨酸 (I) 或丝氨酸 (S), [0187] X ₆ = 甘氨酸 (G) 或谷氨酰胺 (Q), [0188] X ₇ = 缬氨酸 (V) 或苏氨酸 (T), [0189] X ₈ = 天冬酰胺 (N)、丙氨酸 (A)、甘氨酸 (G) 或酪氨酸 (Y), [0190] X ₉ = 精氨酸 (R) 或赖氨酸 (K), [0191] X ₁₀ = 酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W) 或苯丙氨酸 (F), [0192] X ₁₁ = 酪氨酸 (Y) 或组氨酸 (H), [0193] X ₁₂ = 赖氨酸 (K) 或精氨酸 (R), [0194] X ₁₃ = 异亮氨酸 (I) 或缬氨酸 (V), [0195] X ₁₄ = 酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W) 或苯丙氨酸 (F), [0196] X ₁₅ = 天冬酰胺 (N) 或天冬氨酸 (D), [0197] X ₁₆ = 苏氨酸 (T) 或丙氨酸 (A), [0198] X ₁₇ = 天冬酰胺 (N)、丝氨酸 (S) 或酪氨酸 (Y), [0199] X ₁₈ = 丝氨酸 (S)、苏氨酸 (T) 或天冬酰胺 (N), [0200] X ₁₉ = 亮氨酸 (L) 或精氨酸 (R), [0201] X ₂₀ = 组氨酸 (H) 或丙氨酸 (A), [0202] X ₂₁ = 亮氨酸 (L) 或谷氨酰胺 (Q), [0203] X ₂₂ = 天冬酰胺 (N)、甘氨酸 (G) 或组氨酸 (H),以及 [0204] X ₂₃ = 丝氨酸 (S) 或组氨酸 (H)。 [0205] 在一些实施例中,X ₁ = 丝氨酸 (S), X ₂ = 丝氨酸 (S), X ₃ = 丙氨酸 (A), X ₃ = 异亮氨酸 (I), X ₅ = 丝氨酸 (S), X ₆ = 谷氨酰胺 (Q), X ₇ = 缬氨酸 (V), X ₈ = 丙氨酸 (A), X ₉ = 赖氨酸 (K), X ₁₀ = 酪氨酸 (Y), X ₁₁ = 酪氨酸 (Y), X ₁₂ = 精氨酸 (R), X ₁₃ = 缬氨酸 (V), X ₁₄ = 色氨酸 (W), X ₁₅ = 天冬酰胺 (N), X ₁₆ = 丙氨酸 (A), X ₁₇ = 天冬酰胺 (N), X ₁₈ = 苏氨酸 (T), X ₁₉ = 精氨酸 (R), X ₂₀ = 丙氨酸 (A), X ₂₁ = 谷氨酰胺 (Q), X₂₂ = 组氨酸 (H) 和 X ₂₃ = 丝氨酸 (S)。 [0206] 在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段结合人 PAR-2 并包含表 2 中所列抗体的六个 CDR(即,三个 VH CDR 和表 2 中所列相同抗体的三个 CDR) .VL CDR)。 [0207] 表 2. 可变重链 CDR (VH CDR) 和可变轻链 CDR (VL CDR) 氨基酸序列 [0208] [0209] 以下 VH CDR 残基用于定义表 2 的 VH CDR:根据 AbM 命名法的重链 CDR1(如 Kabat 编号系统定义的残基 H26、H27、H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34和 H35)。 根据 Kabat 的重链 CDR2,但不包括最后 5 个氨基酸(如 Kabat 编号系统定义的残基 H50、H51、H52、H53、H54、H55、H56、H57、H58、H59 和 H60)。 根据 Kabat 的重链 CDR3(Kabat 编号系统定义的残基 H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100A、H100B、H100C、H101 和 H102)。 以下 VL CDR 残基用于定义表 2 的 VL CDR:根据 Kabat 的轻链 CDR(如 Kabat 编号系统定义的 CDR1 的残基 L24、L25、L26、L27、L28、L29、L30)、L31、 L32、L33 和 L34;CDR2 的残基 L50、L51、L52、L53、L54、L55 和 L56;CDR3 的残基 L89、L90、L91、L92、L93、L94、L96 和 L97)。 [0210] 在一些方面,本文所述的抗体或其抗原结合片段结合人PAR-2并且包含表3中所列抗体的VH和VL(即,表3中所列的相同抗体的VH和VL) . [0211] 表 3:可变重链 (VH) 和可变轻链 (VL) 氨基酸序列 [0212] [0213] 还提供了包含重链和轻链可变区的分离的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段,其中(i)其中重链可变区包含SEQ ID NO:的氨基酸序列: 20、其中轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列; (ii) 其中重链可变区包含 SEQ ID NO: 21 的氨基酸序列并且其中轻链可变区包含 SEQ ID NO: 24 的氨基酸序列; (iii) 其中重链可变区包含 SEQ ID NO: 21 的氨基酸序列并且其中轻链可变区包含 SEQ ID NO: 5 的氨基酸序列; (iv)其中重链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且其中轻链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列; 或 (v) 其中重链可变区包含 SEQ ID NO:21 的氨基酸序列并且其中轻链可变区包含 SEQ ID NO:27 的氨基酸序列。 [0214] 本文提供分离的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中重链可变区与氨基酸序列组成至少约80度角如 SEQ ID NO:20 或 21.%,至少约 85%,至少约 90%,至少约 95%,至少约 96%,至少约 97%,至少约 98%,至少约 99% 或约 100% 相同的氨基酸序列,其中轻链包含:可变区至少约 80%、至少约 85%、至少约 90%、至少约 95%、至少约96%、至少约 97% 的如 SEQ ID NO: 23、24、25、26 或 27 所示的氨基酸序列、至少约 98%、至少约 99% 或约 100% 相同的氨基酸序列. [0215] 在一些方面,本公开提供了分离的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段,其包含: [0216] (a) 分别包含 SEQ ID NO: 20 和 23 的重链和轻链可变区序列; [0217] (b) 分别包含 SEQ ID NO: 21 和 24 的重链和轻链可变区序列; [0218] (c) 分别包含 SEQ ID NO: 21 和 25 的重链和轻链可变区序列; [0219] (d) 分别包含 SEQ ID NO: 21 和 26 的重链和轻链可变区序列; 或者 [0220] (e)分别包含SEQ ID NO:21和27的重链和轻链可变区序列。 [0221] 抗体P24E1102、P24E976、P24E1099和P24E1103的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中给出。 抗体309-4e的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中给出。 抗体 P24E1102 的 VL CDR1、CDR2 和 CDR3 的氨基酸序列分别在 SEQ ID NOs:16、17 和 18 中列出。 抗体P24E976的VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:16、19和18。 抗体 P24E1099 的 VL CDR1、CDR2 和 CDR3 的氨基酸序列分别在 SEQ ID NOs:16、20 和 18 中列出。 抗体 P24E1103 的 VL CDR1、CDR2 和 CDR3 的氨基酸序列分别在 SEQ ID NOs:16、21 和 18 中列出。 抗体 309-4e 的 VL CDR1、CDR2 和 CDR3 的氨基酸序列分别列于 SEQ ID NOs:13、14 和 15。 [0222] 在一些方面,特异性结合人PAR-2的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段包括: [0223] (a) 包含 SEQ ID NO: 10 的氨基酸序列的 VH CDR1 ; [0224] (b) 包含 SEQ ID NO: 11 的氨基酸序列的 VH CDR2 ; [0225] (c)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3; [0226] (d)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL CDR1; [0227] (e)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL CDR2; 和 [0228] (f)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR3。 [0229] 在一些方面,特异性结合人PAR-2的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段包括: [0230] (a) 包含 SEQ ID NO: 10 的氨基酸序列的 VH CDR1 ; [0231] (b) 包含 SEQ ID NO: 11 的氨基酸序列的 VH CDR2 ; [0232] (c)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3; [0233] (d)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL CDR1; [0234] (e)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR2; 和 [0235] (f)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR3。 [0236] 在一些方面,特异性结合人PAR-2的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段包括: [0237] (a) 包含 SEQ ID NO: 10 的氨基酸序列的 VH CDR1 ; [0238] (b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2; [0239] (c) 包含 SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列的 VH CDR3 ; [0240](d)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL CDR1; [0241] (e) 包含 SEQ ID NO:29 的氨基酸序列的 VL CDR2 ; 和 [0242] (f)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR3。 [0243] 在一些方面,特异性结合人PAR-2的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段包括: [0244] (a) 包含 SEQ ID NO: 10 的氨基酸序列的 VH CDR1 ; [0245] (b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2; [0246] (c) 包含 SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列的 VH CDR3 ; [0247] (d)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL CDR1; [0248] (e) 包含 SEQ ID NO:22 的氨基酸序列的 VL CDR2 ; 和 [0249] (f)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR3。 [0250] 在一些方面,特异性结合人PAR-2的抗PAR-2抗体或其抗原结合片段包括: [0251] (a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR1; [0252] (b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH CDR2; [0253] (c)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3; [0254] (d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1; [0255] (e) 包含 SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列的 VL CDR2 ; 和 [0256] (f)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3。 [0257] 在一些方面,本文提供包含重链(HC)和轻链(LC)的抗体。 关于重链,在一些方面,本文所述抗体的重链可以是α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)或mu(μ)重链。 在一些方面,所述抗体的重链可以包括人α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)或μ(μ)重链。 在一些方面,本文描述的特异性结合人 PAR-2 的抗体包含重链,其中 VH 结构域的氨基酸序列包含表 3 中列出的氨基酸序列,其中重链的恒定区包含人γ(γ)重链恒定区的氨基酸序列。 在一些方面,本文描述的特异性结合人 PAR-2 的抗体包含重链,其中 VH 结构域的氨基酸序列包含表 3 中列出的氨基酸序列,其中重链的恒定区包含一个IgG1重链恒定区所含的氨基酸序列。 在一些方面,本文描述的特异性结合人 PAR-2 的抗体包含重链,其中 VH 结构域的氨基酸序列包含表 3 中列出的氨基酸序列,其中重链的恒定区包含IgG2(例如,IgG2a或IgG2b)重链恒定区的氨基酸序列。 在一些方面,本文描述的特异性结合人 PAR-2 的抗体包含重链,其中 VH 结构域的氨基酸序列包含表 3 中列出的氨基酸序列,其中重链的恒定区包含 IgG4 重链恒定区。包含该区域的氨基酸序列。 在一些方面,本文所述的特异性结合人 PAR-2 的抗体包含重链,其中 VH 结构域的氨基酸序列包含表 3 中列出的序列,其中描述了重链的恒定区本文中或它包括本领域已知的人重链的氨基酸。 人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中描述,参见例如美国专利号 5,693,780 和 Kabat EA 等人,(1991),同上,每一篇均通过引用整体并入本文。通过引用并入 [0258] 在一些实施方案中,本文描述的特异性结合人 PAR-2 的抗体可以包括调节血清半衰期和生物分布的修饰,其保护 IgG 免于分解代谢并维持高血清抗体浓度。调节抗体与新生儿相互作用的修饰Fc受体(FcRn)是一种起关键作用的受体,但不限于此。 血清半衰期调节修饰可以发生在 IgG1、IgG2 或 IgG4 的 Fc 区,它们是 M252Y/S254T/T256E 的三重取代(根据 EU 编号系统编号(参见,例如,Edelman,GM 等人,Proc . Natl. Acad., USA 63:78-85 (1969)),如美国专利号 7,083,784 中所述。 其他取代可发生在位置250和428(参见例如美国专利号7,217,797)以及位置307、380和434(参见例如国际公开号WO 00/042072)。 美国公布号 2009/0142340、2009/0068175 和 2009/0092599 中描述了调节与 Fc 受体的结合和这些受体介导的后续功能(包括 FcRn 结合和血清半衰期)的恒定域氨基酸取代的实例。 [0259] 任何类别的抗体都可能省略或去除重链 C 端赖氨酸以降低异质性 (ΔK)。 人 IgG4 中 S228P(EU 编号)的取代可以稳定体内抗体 Fab 臂交换(参见,例如,Labrin 等人,Nature Biotechnol. 27(8)767-773 (2009))),这些取代可以共同-存在于 M252Y/S254T/T256E 和/或 ΔK 修改中。 [0260] 可用于本公开的人重链 IgG4 恒定区包括野生型人 IgG4 (SEQ ID NO: 33)、人 IgG4 (ΔK)、人 IgG4 S228P、人 IgG4 S228P (ΔK)、人 IgG4 228P/252Y/ 254T/256E、人 IgG4 228P/252Y/254T/256E (ΔK))、人 IgG4 252Y/254T/256E 和人 IgG4 252Y/254T/256E (ΔK)。 人重链 IgG4 恒定区(Uniprot ID P01861;SEQ ID NO:33) [0261] [0262] 在一些实施方案中,抗人PAR-2抗体包含人IgG4恒定区,其中IgG4恒定区包含对应于S228P(按EU编号)的氨基酸取代。 在一些实施方案中,抗人PAR-2抗体包含人IgG4恒定区,其中IgG4恒定区包含末端赖氨酸缺失(K447Δ)。 在一些实施方案中,抗人PAR-2抗体包含人IgG4恒定区,其中IgG4恒定区包含对应于S228P(通过EU编号)和末端赖氨酸缺失(K447Δ)的取代(例如,如在 SEQ ID NO: 34 中提供)。 [0263] [0264] 在一些方面,抗人PAR-2抗体包含人IgG1恒定区。 本公开中使用的人重链IgGl恒定区包括野生型人IgGl (SEQ ID NO: 35)、人IgGl (ΔK)、人IgGl 252Y/254T/256E、人IgGl 252Y/254T/256E (ΔK)、人 IgG1 L235A/G237A、人 IgG1 L235A/G237A (ΔK)、人 IgG1 L234A/L235A/G237A 和人 IgG1 L234A/L235A/G237A (ΔK)。 人重链 IgG1 恒定区(Uniprot ID P01857;SEQ ID NO:35): [0265] [0266]在一些实施方案中,抗人PAR-2抗体包含人IgG2恒定区。 可用于本公开的人重链IgG2恒定区选自野生型人IgG2(SEQ ID NO:36)、人IgG2(ΔK)和人IgG2A330S/P331S。 人重链 IgG2 恒定区(Uniprot ID P01859;SEQ ID NO:36): [0267] [0268] 关于轻链,在一些方面,本文描述的抗体的轻链是κ轻链。 [0269] 在一些方面,本文描述的特异性结合人PAR-2的抗体包含轻链,其中VL结构域的氨基酸序列包含表3中列出的序列,其中轻链的恒定区包含人kappa轻链恒定区。包含该区域的氨基酸序列。 在一些实施方案中,本文所述的特异性结合人PAR-2的抗体包含轻链,其中VL结构域的氨基酸序列包含表3中列出的序列,其中轻链的恒定区包含人κ轻链和恒定区的氨基酸序列(例如如SEQ ID NO:37中提供的)。 人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中进行了描述,参见例如美国专利号 5,693,780 和 Kabat EA 等人,(1991) 同上。 [0270] [0271] 在一些方面,本文描述的特异性结合人PAR-2的抗体包含VH结构域和VL结构域,其包含本文描述的任何抗人PAR-2抗体的氨基酸序列,其中恒定区是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 或 IgY 免疫球蛋白分子的氨基酸序列,或人 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 或 IgY 免疫球蛋白分子的恒定区。 在一些方面,本文描述的特异性结合人PAR-2的抗体包含VH结构域和VL结构域,其包含本文描述的任何抗人PAR-2抗体的氨基酸序列,其中恒定区是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 或 IgY 免疫球蛋白分子、任何类别的免疫球蛋白分子(例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2)或任何亚类(例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1、IgA2),例如包括IgG2a、IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。 在一些方面,恒定区是人 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 或 IgY 免疫球蛋白分子、任何类别的免疫球蛋白分子(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2),或氨基酸任何亚类(例如 IgG2a 和 IgG2b)的恒定区序列。 [0272] 人恒定区的非限制性实例已经在本领域中描述,参见例如Kabat EA等人,(1991)同上。 [0273] 二(一)。 示例性 Fc 域 [0274] 恒定区可以被工程化,例如通过重组技术,以去除一种或多种效应子功能。 “效应器功能”是指 Fc 受体或配体与抗体 Fc 区的相互作用,或由此产生的生物化学事件。 示例性的“效应子功能”包括 C1q 结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc 受体结合、FcγR 介导的效应子功能,例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP),以及细胞的下调表面受体(例如,B 细胞受体;BCR)。 此类效应器功能通常需要 Fc 区与结合域(例如抗体可变域)组合。 因此,术语“没有Fc功能的恒定区”包括其中由Fc区介导的一种或多种效应子功能降低或不存在的恒定区。 [0275] 对于一些治疗用途,降低或最小化一种或多种效应器功能可能是有利的。 可以通过不同的方法减少或避免抗体的效应功能。 抗体的效应子功能是缺少 Fc 区的抗体片段(例如,Fab、F(ab') ₂ 、单链 Fvs (scFvs) 或由单体 VH 或 VL 结构域组成的 sdAb)。 或者,所谓的非糖基化抗体与 Fc 区的特定残基相连,以降低抗体的效应功能,同时保留 Fc 区的其他有价值的特性(例如,延长的半衰期和异二聚化)。通过去除糖分。 非糖基化抗体可以,例如,删除或改变糖所附着的残基,酶促去除糖,在存在糖基化抑制剂或糖基化蛋白质的培养细胞中产生抗体。它可以通过表达抗体来产生在没有细胞的细胞中(例如,细菌宿主细胞)。 参见,例如,美国公开号 20120100140。 另一种方法是使用来自 IgG 亚类的 Fc 区,其效应功能降低。 例如,IgG2 和 IgG4 抗体的特征在于具有比 IgG1 和 IgG3 更低水平的 Fc 效应子功能。 在 Fc 部分的 CH2 结构域中最靠近铰链区的残基包含与先天免疫系统效应细胞上的 C1q(补体)和 IgG-Fc 受体(FcγR)高度重叠的结合位点,因此负责抗体。 参见 Vidarsson G. 等人。 前免疫。 5:520(2014 年 10 月 20 日在线发布)]。 因此,Fc效应子功能降低或没有的抗体可以是,例如,包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合Fc区,或铰链区来自 IgG2 和包含 CH2 区的 IgG4A 嵌合 Fc 区(参见,例如,Lau C. et al. J. Immunol. 191:4769-4777 (2013)),或改变的 Fc 效应子功能,例如,减少的 Fc它可以通过创建具有导致功能或无 Fc 功能的氨基酸取代和/或添加和/或缺失的 Fc 区来制备。 这种具有氨基酸取代和/或添加和/或缺失的Fc区是本领域已知的。 参见,例如,美国公开号 20120100140 和其中引用的美国和 PCT 申请,An 等。 , 单克隆抗体 1(6):572-579 (2009)], [王 等。 , 蛋白质细胞 9(1):63-73 (2018)], [谭 等人 ., 抗体 6(3):12 (2017)], [Vafa 等。 , 方法 65:114-126 (2014)] 和 [杜美 等。 , 单克隆抗体 11(8):1341-1350 (2019),其公开内容通过引用整体并入。 对于其他用途,维持或增强一种或多种效应子功能可能是有利的;例如,可能需要杀死在细胞表面表达 PAR-2 的细胞,例如癌细胞。 [0276] 在某些方面,抗 PAR-2 抗体,特别是本文提供的抗人 PAR-2 抗体,可包含 Fc 结构域。 在一些方面,Fc 结构域属于人 IgG1、IgG2、IgG3 和/或 IgG4 同种型。 [0277] 在某些实施方案中,Fc 结构域具有 IgG1 同种型。 在某些方面,抗 PAR-2 抗体包含鼠 IgG1 Fc 结构域。 在某些方面,抗人 PAR-2 抗体包含人 IgG1 Fc 结构域(hlgG1),如在 SEQ ID NO:38 中提供的。 [0278] [0279] 人 IgG1 Fc 结构域(无 C 端赖氨酸残基 (ΔK);SEQ ID NO: 39) [0280] [0281]在一些实施方案中,抗人 PAR-2 抗体的人 IgG1 Fc 结构域结合激活 Fc 受体。 在某些方面,激活的 Fc 受体选自 FcγRI、FcγRIIa 和 IIc,以及 FcγRIIIa 和 IIIb 中的任何一种或多种。 [0282] 在一些实施方案中,抗人 PAR-2 抗体的人 IgG1 Fc 结构域不结合 FcγRIII (CD16) 和/或 C1q 或具有降低的结合。 在一些实施方案中,与野生型人 IgG1 Fc 结构域相比,抗人 PAR-2 抗体的人 IgG1 Fc 结构域分别具有降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体结合活性。 这种效果可以通过某些氨基酸修饰来实现,例如“NSLF”取代,其中人 IgG1 Fc 结构域包含氨基酸取代 N325S 和 L328F(通过 IgG1 Fc 结构域的 EU 编号)(例如,如 SEQ ID NO: 40). ) 可以通过以下方式实现 另一方面,人IgG1 Fc结构域包含对应于K322A(EU编号)的氨基酸取代(例如如SEQ ID NO:41中所提供的)。 [0283] [0284] 下表 4 列出了对人 IgG1 Fc 结构域的示例性修饰。 [0285] 表 4:对人类 IgG1 Fc 结构域的示例性修饰 [0286] [0287] 在本文提供的抗 PAR-2 抗体的某些方面,Fc 结构域具有 IgG2 同种型。 在一些实施方案中,抗人PAR-2抗体包含人IgG2 Fc结构域(hIgG2)。 在一些实施方案中,抗人 PAR-2 抗体的人 IgG2 Fc 结构域结合激活 Fc 受体。 在某些实施方案中,活化Fc受体选自FcγRI、FcγRIIa和IIc以及FcγRIIIa和IIIb中的任何一种或多种。 [0288] 在本文提供的抗 PAR-2 抗体的某些方面,Fc 结构域具有 IgG4 同种型。 在一些实施方案中,抗人 PAR-2 抗体包含人 IgG4 Fc 结构域 (hlgG4)(例如,如 SEQ ID NO:42 中提供的)。 在一些实施方案中,抗人 PAR-2 抗体的人 IgG4 Fc 区结合激活 Fc 受体。 在某些实施方案中,活化Fc受体选自FcγRI、FcγRIIa和IIc以及FcγRIIIa和IIIb中的任何一种或多种。 在某些实施方案中,人IgG4 Fc区包含对应于S228P(通过EU编号)的氨基酸取代(例如如SEQ ID NO:43中所提供的)。 在某些实施方案中,人IgG4 Fc区包含对应于S228P(通过EU编号)的氨基酸取代和末端赖氨酸残基(K447Δ)的缺失(例如如SEQ ID NO:44中所提供的)。 在某些实施方案中,人 IgG4 Fc 区包含 S228P 取代和 L235E 取代(以减少 FcγR 相互作用)。 在某些实施方案中,人 IgG4 Fc 包含 S228P 取代、L235E 取代和末端赖氨酸残基的缺失 (K447Δ)。 [0289] 人 IgG4 Fc 结构域 (hIgG4) [0290] [0291] 具有 S228P 的人 IgG4 Fc 结构域 [0292] [0293] 具有 S228P 和 K447Δ 的人 IgG4 Fc 结构域 [0294] [0295] 在一些方面,可将本文所述的任何恒定区突变或修饰引入本文所述的抗体或其具有两个重链恒定区的抗原结合片段的一个或两个重链恒定区。 [0296] 在一些实施方案中,本文所述的特异性结合人PAR-2的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链,其中(i)重链是下列抗体的VH CDR1、VH CDR2表2和包含VH CDR3氨基酸序列的VH结构域(例如,分别为SEQ ID NO:10、11和12); (ii) 轻链包含 VL 结构域,该结构域包含表 2 中列出的相同抗体的 VL CDR1、VL CDR2 和 VL CDR3 氨基酸序列(例如,分别为 SEQ ID NO:16、17 和 18); (iii) 重链包含人 IgG4 重链恒定域的氨基酸序列或包含对应于 S228P 的氨基酸取代(通过 EU 编号)的人 IgG4 重链恒定域的氨基酸序列,并且末端赖氨酸缺失(K447Δ);进一步包含重链结构域; (iv)轻链进一步包含恒定轻链结构域,其包含人κ轻链恒定结构域的氨基酸序列。 [0297] 在一些实施方案中,本文所述的特异性结合人PAR-2的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链,其中(i)重链包含表中所列抗体的氨基酸序列3(例如,包含SEQ ID NO:21的VH结构域); (ii) 轻链包含 VL 结构域,该结构域包含表 3 中所列相同抗体的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:24); (iii) 重链包含人 IgG4 重链恒定域的氨基酸序列或人 IgG4 重链恒定域的氨基酸序列,其包含对应于 S228P 的氨基酸取代(通过 EU 编号),并且末端赖氨酸缺失(K447Δ);进一步包含重链结构域; (iv)轻链进一步包含恒定轻链结构域,其包含人κ轻链恒定结构域的氨基酸序列。 [0298] 二(二)。 抗PAR-2抗体活性 [0299] 本文描述的特异性结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段可以阻断 PAR-2 上的配体结合位点。 阻断人 PAR-2 与其配体的结合可减少 PAR-2 的信号传导。 PAR-2信号通过G蛋白和β-arrestin。 PAR-2 与各种 Gα 蛋白有关,最显着的是 Gα。 _q , α _i 和Gα _12/13 信号传输通过 这些 G 蛋白可以通过多种途径激活信号传导,包括 ERK、NF-κB、cAMP 和 p85/p110。 参见 Rothmeier, A. S. 和 Ruf, W., 免疫病理学研讨会 , 34:133-149 (2012)]。 β-arrestin 的募集终止 G 蛋白介导的信号转导并启动新的信号转导通路。 参见 Nichols, H. L. 等人 ., Proc Natl Acad Sci 美国 , 109:16660-16665 (2012)]。 β-arrestin 可以通过 Raf 和 ERK 激活信号传导,并触发肌动蛋白重排以影响细胞运动。 参见 Pal, K. 等人 ., 生物化学杂志 , 288:3265-3274 (2013)]。 [0300]在一些方面,本文所述的特异性结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段 (a) 阻断 PAR-2 的胞外结构域与 PAR-2 激活配体的相互作用,并且/ 或 (b) 通过 PAR-2 激活配体阻断 PAR-2 激活,并且不与人 PAR-2 N 末端的氨基酸 59-63 结合。 此类PAR-2激活配体包括PAR-2束缚配体(顺式或反式); PAR-1 束缚配体; 或可溶性配体(例如,合成的可溶性 PAR-2 激活配体,如 SLIGKV(SEQ ID NO:45)、SLIGRL(SEQ ID NO:46)或 2-Furoyl-Leu-Ile-Gly-Arg- Leu -Orn-NH2 三氟乙酸盐 (2-furoyl-LIGRLO) 与 PAR-2 结合的不同蛋白酶(包括例如胰蛋白酶、类胰蛋白酶、组织因子、中性粒细胞弹性蛋白酶和 matriptase)丝氨酸蛋白酶,以及包括组织蛋白酶 S 在内的半胱氨酸蛋白酶, papain 和 Der p) 可以揭示不同的 PAR-2 束缚配体,它们可以结合并激活 PAR-2。PAR-1 配体也可以激活 PAR-2 PAR-1 也可以反式激活 PAR-2。 [0301] 通过PAR-2激活配体拮抗PAR-2激活的抗人PAR-2抗体是例如在PAR-2配体存在下的PAR-2(例如, 合成的可溶性 PAR-2 激活配体如 SLIGKV).-2 激活和抗 PAR-2 抗体对 PAR-2 激活的抑制。 我知道了 ₅₀ 是该系统中抗 PAR-2 抗体抑制 PAR-2 激活的效力(即达到 50% 抑制配体诱导的 PAR- 的抗 PAR-2 抗体浓度) 2 活性,以 nM 为单位)用作度量标准。 [0302] 在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段具有约 0.1 nM 和约 17 nM 之间的 IC50,如通过实施例 2.1 中描述的 PAR-2 β-抑制蛋白细胞测定法测量的。 ₅₀ 抑制细胞内可溶性 PAR-2 激活配体(如 SLIGKV)与 PAR-2 之间的相互作用。 [0303] 在一些方面,本文所述的特异性结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段为约 0.1 nM、约 0.2 nM、约 0.3 nM、约 0.4 nM、约 0.5 nM、约 0.6 nM、约 0.7 nM,约0.8nM,约0.9nM,约1nM,约1.1nM,约1.2nM,约1.3nM,约1.4nM,约1.5nM,约1.6nM,约1.7nM,约1.8nM,约1.9nM,约2nM、2.1nM、约2.2nM、约2.3nM、约2.4nM、约2.5nM、约2.6nM、约2.7nM、约2.8nM、约2.9nM、约3nM、3.1nM、约3.2nM、约 3.3 nM、约 3.4 nM、约 3.5 nM、约 3.6 nM、约 3.7 nM、约 3.8 nM、约 3.9 nM、约 4 nM、约 4.1 nM、约 4.2 nM、约 4.3 nM、约 4.4 nM、约 4.5 nM nM,约 4.6 nM,约 4.7 nM,约 4.8 nM,约 4.9 nM,约 5 nM,5.1 nM,约 5.2 nM,约 5.3 nM,约 5.4 nM,约 5.5 nM,约 5.6 nM,约 5.7 nM,约 5.8 nM、约 5.9 nM、约 6 nM、约 6.1 nM、约 6.2 nM、约 6.3 nM、约 6.4 nM、约 6.5 nM、约 6.6 nM、约 6.7 nM、约 6.8 nM、约 6.9 nM、约 7 nM、7.1 nM、约 7.2 nM、约 7.3 nM、约 7.4 nM、约 7.5 nM、约 7.6 nM、约 7.7 nM、约 7.8 nM、约 7.9 nM、约 8 nM、8.1 nM、约 8.2 nM、约 8.3 nM,约8.4nM,约8.5nM,约8.6nM,约8.7nM,约8.8nM,约8.9nM,约9nM,约9.1nM,约9.2nM,约9.3nM,约9.4nM,约9.5nM,约 9.6 nM、约 9.7 nM、约 9.8 nM、约 9.9 nM、约 10 nM、10.1 nM、约 10.2 nM、约 10.3 nM、约 10.4 nM、约 10.5 nM、约 10.6 nM、约 10.7 nM、约 10.8 nM ,约 10.9 nM、约 11 nM、约 11.1 nM、约 11.2 nM、约 11.3 nM、约 11.4 nM、约 11.5 nM、约 11.6 nM、约 11.7 nM、约 11.8 nM 或约 11.9 nM 的 IC ₅₀ 抑制可溶性 PAR-2 激活配体(例如 SLIGKV)和 PAR-2 之间的相互作用。 抑制可溶性 PAR-2 配体与 PAR-2 之间的相互作用可能与抗人 PAR-2 抗体的剂量相关。 [0304] 在一些方面,本文所述的特异性结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段为约 6 nM 至约 11 nM,如通过实施例 2.2 中所述的 PAR-2 钙通量细胞测定法测量的。的 ₅₀ 将 PAR-2 激活配体诱导和胰蛋白酶诱导的细胞内钙流抑制到一定范围。 [0305] 在一些方面,本文所述的特异性结合人PAR-2的抗体或其抗原结合片段为约6nM、6.1nM、约6.2nM、约6.3nM、约6.4nM、约6.5nM、约6.6nM nM,约6.7nM,约6.8nM,约6.9nM,约7nM,约7.1nM,约7.2nM,约7.3nM,约7.4nM,约7.5nM,约7.6nM,约7.7nM,约7.8nM,约 7.9 nM、约 8 nM、8.1 nM、约 8.2 nM、约 8.3 nM、约 8.4 nM、约 8.5 nM、约 8.6 nM、约 8.7 nM、约 8.8 nM、约 8.9 nM、约 9 nM、9.1 nM、约 9.2 nM、约 9.3 nM、约 9.4 nM、约 9.5 nM、约 9.6 nM、约 9.7 nM、约 9.8 nM、约 9.9 nM、约 10 nM、10.1 nM、约 10.2 nM、约 10.3 nM、约 10.4 nM , IC 为约 10.5 nM、约 10.6 nM、约 10.7 nM、约 10.8 nM 或约 10.9 nM ₅₀ 将 PAR-2 激活配体诱导和胰蛋白酶诱导的细胞内钙流抑制到一定范围。 [0306] 在一些方面,本文所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合人 PAR-2,例如,在不存在抗体或其片段的情况下或在存在相同同种型的对照抗体或其片段的情况下,PAR -2 与激活配体诱导的相比至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 95%、至少 98% 或至少 100%细胞因子的产生(例如,抑制人肺上皮细胞或来自食蟹猴支气管肺泡灌洗液的细胞中 PAR-2 激活配体诱导的粘蛋白产生)。 细胞中 PAR-2 激活配体诱导的粘蛋白产生的抑制可以使用例如实施例 7 中描述的测定来测量。 细胞中 PAR-2 激活配体诱导的粘蛋白产生的抑制可能与抗人 PAR-2 抗体的剂量相关。 [0307] 在一些方面,本文所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合人PAR-2,例如,在不存在抗体或其片段的情况下或在存在相同同种型的对照抗体或其片段的情况下, smooth muscle cells 平滑肌细胞(例如,支气管平滑肌细胞)抑制PAR-2激活配体诱导的收缩。 PAR-2激活配体诱导的肌肉细胞收缩可以使用例如实施例7中描述的测定来测量。 抑制 PAR-2 激活配体诱导的肌肉细胞收缩可能与抗人 PAR-2 抗体的剂量相关。 [0308]在一些方面,本文所述的特异性结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段是肺嗜中性粒细胞,例如,在抗体或其片段不存在或对照抗体或其片段存在的情况下同种型。肺中性粒细胞减少症(例如,它抑制屋尘螨诱导的肺中性粒细胞增多症的诱导)。 [0309] 二(三)。 抗原结合片段 [0310] 在一些方面,提供了本文所述的抗PAR-2抗体的抗原结合片段,例如抗人PAR-2抗体。 示例性抗原结合片段包括但不限于 Fab、Fab'、F(ab')2 和 scFv,其中 Fab、Fab'、F(ab')2 或 scFv 是本文所述的抗体。包括人源PAR-2抗体的一条重链可变区序列和一条轻链可变区序列。 Fab、Fab'、F(ab') 2 或scFv可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生,包括但不限于下文第III部分中讨论的那些。 在一些实施方案中,抗原结合片段,例如Fab、Fab'、F(ab') 2 或scFv,还包含延长抗体体内半衰期的部分。 该部分也称为“半衰期延长部分”。 本领域技术人员已知的任何部分均可用于延长抗原结合片段的半衰期,例如Fab、Fab'、F(ab') 2 或scFv的体内半衰期。 例如,半衰期延长部分可包括Fc区、聚合物、白蛋白或白蛋白结合蛋白或化合物。 聚合物可以是天然的或合成的,任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基、聚氧化亚烷基、多糖、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、甲氧基聚乙二醇、乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。 取代基可包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。 在一些方面,抗原结合片段例如Fab、Fab'、F(ab') 2 或scFv可以通过添加一个或多个C端氨基酸用于连接半衰期延长部分来修饰。 在一些实施方案中,半衰期延长部分是聚乙二醇或人血清白蛋白。 在一些实施方案中,诸如Fab、Fab'、F(ab') 2 或scFv的抗原结合片段与Fc区融合。 [0311] 抗 PAR-2 抗体(例如抗人 PAR-2 抗体)或其抗原结合片段可以与可检测标记或物质融合或缀合(例如,共价或非共价连接) .有。 可检测标记或物质的例子包括酶标记,例如葡萄糖氧化酶; 放射性同位素如碘( ¹²⁵ 我, ¹²¹ 一),碳( ¹⁴ C)、硫( ³⁵ S), 氚 ( ³ H), 铟 ( ¹²¹ 在)和锝( ⁹⁹ TC); 发光标记,例如鲁米诺; 荧光素、罗丹明和生物素等荧光标记物。 此类标记抗体或其抗原结合片段可用于检测PAR-2(如人PAR-2)蛋白。 例如,参见下面的第 IV 和 V 节。 [0312] 三、 抗PAR-2抗体制作 [0313] 特异性结合人PAR-2的抗体及其抗原结合片段可以通过本领域已知的用于合成抗体和抗原结合片段的任何方法制备,例如化学合成或重组表达技术。 除非另有说明,否则本文描述的方法是本领域技术人员在分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及相关领域中的常规方法。人类科技 例如,在本文引用的参考文献中描述了这些技术,并在文献中进行了全面描述。 参见,例如,Sambrook J 等,(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; [Ausubel FM 等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987 年和年度更新)]; [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 & Annual Updates)]; [Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogies: A Practical Approach, IRL Press]; 参见 Birren B 等人,(编辑)(1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版社。 [0314] 在一些方面,人 PAR-2,包括培养本文所述的细胞或宿主细胞(例如,包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞或宿主细胞)。制备抗体或抗原的方法本文提供了特异性结合的结合片段。 在某些实施方案中,使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如,包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞或宿主细胞)来使用抗体或其抗原结合片段。本文提供方法制备特异性结合人PAR-2的抗体或其抗原结合片段的方法,包括表达(例如,重组表达)。 在一些实施例中,细胞是分离的细胞。 在一些实施例中,已将编码多核苷酸引入细胞中。 在一些实施方案中,该方法进一步包括纯化由细胞或宿主细胞表达的抗体或抗原结合片段。 [0315] 可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体或其抗原结合片段,包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术、基于酵母的展示技术或其组合。 例如,单克隆抗体或其抗原结合片段是本领域已知的并且描述于例如Harlow E & Lane D, Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)。]; 使用杂交瘤技术,包括 Hammerling GJ 等人在:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981) 或 Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495] 中教导的技术。 可用于选择和产生本文所述抗体的基于酵母的呈递方法的实例包括,例如,WO2009/036379A2; WO2010/105256; 和 WO2012/009568,每一个都通过引用整体并入本文。 [0316]在一些实施方案中,单克隆抗体或抗原结合片段是由克隆细胞(例如,产生重组抗体或抗原结合片段的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体或抗原结合片段。其中抗体或抗原结合片段与人 PAR-2 特异性结合,如通过例如 ELISA 或本领域已知的或本文提供的实施例中的其他抗原结合测定所确定的。 在一些实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段可以是嵌合或人源化抗体或其抗原结合片段。 在一些方面,单克隆抗体或其抗原结合片段可以是Fab片段或F(ab') 2 片段。 本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段可通过杂交瘤方法制备,例如,如 Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256:495 所述,或例如,其可从例如噬菌体文库中分离使用此处描述的技术。 用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体及其抗原结合片段的其他方法是本领域众所周知的(参见,例如第 11 章:Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第 5 版,Ausubel FM等人, 同上 ] 参考)。 [0317] 本文所述抗体的抗原结合片段可通过本领域技术人员已知的任何技术产生。 例如,本文所述的 Fab 和 F(ab') 2 片段可通过使用酶如木瓜蛋白酶(以产生 Fab 片段)或胃蛋白酶(以产生 F(ab') 2 片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割来制备。产生于 Fab 片段对应于四聚体抗体分子的两个相同臂之一,并包含与重链的 VH 和 CH1 结构域配对的完整轻链。 F(ab')2 片段包含四聚体抗体分子的两个抗原结合臂,在铰链区通过二硫键连接。 [0318] 此外,还可以使用本领域已知的多种噬菌体展示和/或基于酵母的展示方法来产生本文所述的抗体或其抗原结合片段。 在噬菌体展示方法中,蛋白质展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。 特别地,编码VH 和VL 结构域的DNA 序列从动物cDNA 文库(例如受影响组织的人或鼠cDNA 文库)中扩增。 编码 VH 和 VL 结构域的 DNA 通过 PCR 与 scFv 接头重组,并克隆到噬菌粒载体中。 矢量是这样的。 在大肠杆菌中电穿孔,大肠杆菌。 大肠杆菌被辅助噬菌体感染。 这些方法中使用的噬菌体通常是含有 fd 和 M13 的丝状噬菌体,VH 和 VL 结构域通常与噬菌体基因 III 或基因 VIII 重组融合。 表达结合特定抗原的抗体或其抗原结合片段的噬菌体可以被选择或鉴定为抗原,例如使用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠子的抗原。 可用于制备本文所述抗体或片段的噬菌体展示方法的实例包括 Brinkman U 等人,(1995) 免疫学杂志 方法 182:41-50]; [Ames RS 等人,(1995) J 免疫学方法 184:177-186]; [Kettleborough CA 等人,(1994) 欧洲免疫杂志 24:952-958]; [Persic L 等人,(1997) 基因 187:9-18]; [Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57:191-280]; PCT申请号PCT/GB91/001134; 国际公开号 WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401 和 WO 97/13844; 및 미국 특허 번호 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743, 및 5,969,108에 개시된 것이 포함된다. [0319] 人源化抗体或其抗原结合片段可选自任何类别的免疫球蛋白,包括 IgM、IgG、IgD、IgA 和 IgE,以及任何同种型,包括 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4。 [0320] 已经描述了制备多特异性(例如,双特异性抗体)的方法。 参见,例如,美国专利号 7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 参见 6,132,992 和 8,586,713。 [0321] 三(一)。 多核苷酸 [0322] 在某些方面,核苷酸序列包含编​​码本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如可变轻链区和/或可变重链区)的核苷酸序列,其特异性结合人PAR-2。本文是多核苷酸和载体,例如,包含用于在宿主细胞(例如,大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的此类多核苷酸的载体。 [0323] 在一些方面,包含编码特异性结合人 PAR-2 的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列并包含本文所述的氨基酸序列的多核苷酸,以及本文提供的抗体或抗原结合片段与此类抗体或抗原结合片段竞争结合(例如,以剂量依赖性方式)或结合与此类抗体或抗原结合片段相同的表位的片段。 [0324] 本文还提供了分离的多核苷酸,其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的核酸序列。 在一些实施方案中,核酸分子编码 SEQ ID NO: 20 或 21 的 VH。 [0325] 在一些方面,提供了分离的多核苷酸,其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的核酸分子。 在一些实施方案中,核酸分子编码 SEQ ID NO:23、24、25、26 或 27 的 VL。 [0326] 在一些方面,包含编码 SEQ ID NO: 23、24、25、26 或 27 的轻链可变区的第一核酸分子和编码 SEQ ID NO: 20 或 21 的重链可变区的第二核酸分子提供了分离的多核苷酸。 在一些方面,第一多核苷酸包含编码 SEQ ID NO: 23、24、25、26 或 27 的轻链可变区的核酸分子,和编码 SEQ ID NO: 20 的重链可变区的核酸分子或21 包含第二多核苷酸的分离的多核苷酸的混合物,所述第二多核苷酸包含 [0327] 在一些方面,分离的多核苷酸包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或重链和抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子在此披露... [0328]此外,本文提供了试剂盒、载体或试剂盒,其包含(i)包含编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的第一多核苷酸和(ii)包含编码SEQ ID NO:23的核苷酸序列的第二多核苷酸宿主细胞。 此外,本文提供了试剂盒、载体或试剂盒,其包含(i)包含编码SEQ ID NO:21的核苷酸序列的第一多核苷酸和(ii)包含编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的第二多核苷酸宿主细胞。 此外,本文提供了试剂盒、载体或试剂盒,其包含(i)包含编码SEQ ID NO:21的核苷酸序列的第一多核苷酸和(ii)包含编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的第二多核苷酸宿主细胞。 此外,本文提供了试剂盒、载体或试剂盒,其包含(i)包含编码SEQ ID NO:21的核苷酸序列的第一多核苷酸和(ii)包含编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列的第二多核苷酸宿主细胞。 此外,本文提供了试剂盒、载体或试剂盒,其包含(i)包含编码SEQ ID NO:21的核苷酸序列的第一多核苷酸和(ii)包含编码SEQ ID NO:27的核苷酸序列的第二多核苷酸宿主细胞。 在包含此类第一和第二多核苷酸的试剂盒中,第一和第二多核苷酸可以在相同载体或不同载体中。 在包含此类第一和第二多核苷酸的宿主细胞中,第一和第二多核苷酸可以在相同载体或不同载体中。 [0329] 在一些方面,多肽包含三个 VH 结构域 CDR,例如,本文描述的任何一种抗体的 VH CDR1、VH CDR2 和 VH CDR3(参见,例如,表 2),本文提供了编码核苷酸序列的多核苷酸,其中,例如,三个 VH 域 CDR 在一个 VH 的上下​​文中。 在一些方面,多肽包含三个 VL 结构域 CDR,例如,本文描述的任何一种抗体的 VL CDR1、VL CDR2 和 VL CDR3(参见,例如,表 3),本文提供了编码核苷酸序列的多核苷酸,其中,例如,三个 VL 域 CDR 在一个 VL 的上下文中。 在一些方面,(i)包含三个VH域CDR的多肽,例如,本文描述的任何一种抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如,参见表2)(例如,其中三个VH域CDR是在VH的上下文中)和(ii)包含三个VL结构域CDR的多肽,例如本文描述的任何一种抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如(例如,参见表2)(例如,其中三个VL结构域CDR在VL)的上下文中提供了包含编码抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸(或多核苷酸的组合)。 [0330] 在一些方面,多核苷酸是编码重链可变区(例如,包含 SEQ ID NO: 20 或 21 的氨基酸序列的 VH )和重链恒定区的核酸,例如人γ(γ)重链恒定区。包含序列。 [0331] 在一些方面,多核苷酸包含轻链可变区(例如,包含 SEQ ID NO:23、24、25、26 或 27 的氨基酸序列的 VL)和轻链恒定区,例如人κ轻链链恒定区。它包括编码的核酸序列。 [0332] 还包括编码本文所述的抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸,例如,通过密码子/RNA 优化、异源信号序列替换和 mRNA 不稳定元件的消除。本文提供核苷酸。 抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合,用于通过引入密码子变化(例如,由于遗传密码简并而编码相同氨基酸的密码子变化)和/或去除 mRNA 的抑制区域进行重组表达产生优化的核酸编码片段或其结构域(例如,重链、轻链、VH 结构域或VL 结构域)的方法在例如美国专利号5,965,726;5,965,726;5,965,726;5,965,726;和5,965,726中有所描述。 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; 和 6,794,498,其每一个都通过引用整体并入本文。 [0333] 编码本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸可以使用本领域熟知的方法(例如,PCR和其他分子克隆方法)从合适的来源(例如,高分子量克隆)制备。杂交瘤)。 例如,使用可与已知序列的3'和5'末端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用从产生感兴趣的抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA来进行。 此类PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的序列的核酸。 此类PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体或其抗原结合片段的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。 可以将扩增的核酸克隆到用于在宿主细胞中表达和进一步克隆的载体中,例如以产生嵌合和人源化抗体或其抗原结合片段。 [0334] 例如,本文提供的多核苷酸可以是RNA或DNA的形式。 DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA,DNA可以是双链的也可以是单链的。 当单链时,DNA 可以是编码链或非编码(反义)链。 在一些实施方案中,多核苷酸是cDNA或缺乏一个或多个内含子的DNA。 在一些实施例中,多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。 在一些实施方案中,多核苷酸是重组产生的。 在一些实施方案中,多核苷酸是分离的。 在一些方面,多核苷酸基本上是纯的。 在一些实施方案中,多核苷酸是从天然成分中纯化的。 [0335] 三(二)。 细胞和载体 [0336] 在一些方面,包含编码抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段或其结构域的核苷酸序列的多核苷酸用于在宿主细胞(例如,哺乳动物细胞)中重组表达。载体(例如,表达载体) 在此提供。 此外,包含用于重组表达本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段(例如人或人源化抗体或其抗原结合片段)的此类载体的细胞,例如,宿主细胞在此提供。 在一些实施方案中,本文提供了一种产生本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法,包括在宿主细胞中表达此类抗体或其抗原结合片段。 [0337]在一些实施方案中,特异性结合人 PAR-2 的本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如,本文所述的重链或轻链)的重组表达是抗体或其抗原结合片段.它涉及构建包含编码其片段或结构域的多核苷酸的表达载体。 一旦获得编码本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如,重链或轻链可变结构域)的多核苷酸,用于产生抗体或其抗原结合片段的载体在本领域中是已知的。可以使用熟知的技术通过重组DNA技术生产。 因此,本文描述的是通过表达含有编码抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如,轻链或重链)的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。 可以使用本领域技术人员熟知的用于构建包含抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如,轻链或重链)编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体的方法。 这些方法包括,例如,体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。 还提供了可复制载体,其包含编码抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列、重链或轻链、重链或轻链可变结构域、或重链或轻链CDR,可操作地连接至启动子。 此类载体可包括例如编码抗体恒定区或其抗原结合片段的核苷酸序列(参见例如国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036;以及美国专利号5,122,464) ..,可以将抗体或其抗原结合片段的可变结构域克隆到这样的载体中以表达完整的重链、完整的轻链或完整的重链和轻链。 [0338] 可以通过常规技术将表达载体转移到细胞(例如,宿主细胞)中,然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如,P24E1102、P24E976、P24E1099、 P24E1103 或 309-4e、VH、VL、VH 和 VL 的六个 CDR、重链、轻链或包含重链和轻链的抗体或其抗原结合片段)或其结构域(例如对于例如,309-4e 的 P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103 或 VH、VL、VH 和 VL、重链或轻链)。 因此,本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如,P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103 或 309-4e 的六个 CDR,VH 可操作地连接到用于在宿主细胞中表达此类序列的启动子)。 、VH和VL、重链、轻链或抗体或其包含重链和轻链的抗原结合片段)或其结构域(例如,P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103的VH、VL或 309-4e,包含编码 VH 和 VL,重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞在本文中提供。 在一些方面,为了表达双链抗体或其抗原结合片段,分别编码重链和轻链的载体在宿主细胞中共表达以表达总免疫球蛋白,如下详述。 在一些方面,宿主细胞包含本文所述抗体的重链和轻链(例如,P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103,或 309-4e 的重链和轻链)或其结构域(例如,P24E1102、P24E976 ,P24E1099,P24E1103 或 309-4e) 的 VH 和 VL) 含有包含多核苷酸编码的载体。 在一些方面,宿主细胞包含两个不同的载体,第一个载体包含编码本文描述的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸,和本文描述的抗体(例如,P24E1102、P24E976 、P24E1099、P24E1103 或包含 309-4e) 的六个 CDR 的抗体或轻链可变区或编码其结构域的多核苷酸。 在一些方面,第一宿主细胞包含第一载体,所述第一载体包含编码本文所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸,并且第二宿主细胞包含本文所述抗体或抗原-其结合片段(例如,包含P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103或309-4e的六个CDR的抗体或其抗原结合片段)包含编码轻链或轻链可变区的多核苷酸。 在一些方面,重链/重链可变区由与第二细胞的轻链/轻链可变区联合的第一细胞表达以产生本文所述的人PAR-2抗体或其抗原结合片段(例如,P24E1102、包含 P24E976、P24E1099、P24E1103 或 309-4e 的六个 CDR 的抗体或其抗原结合片段。 在一些方面,本文提供包括此类第一宿主细胞和此类第二宿主细胞的宿主细胞群。 [0339] 在一些方面,第一载体包含编码本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段的轻链/轻链可变区的多核苷酸,以及抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段第二个包含编码其抗原结合片段的重链/重链可变区的多核苷酸(例如,包含P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103的CDR的抗体或其抗原结合片段)或 309-4e) 本文提供了载体群体,包括载体。 或者,可以使用能够编码和表达重链和轻链多肽的单一载体。 [0340] 多种宿主表达载体系统用于表达本文所述的抗体及其抗原结合片段(例如,包含 P24E1102、P24E976、P24E1099、P24E1103 或 309-4e 的 CDR 的抗体或其抗原结合片段)。(参见,例如,美国专利No.5,807,715)。 此类宿主表达系统代表一种载体,可从中产生并随后纯化感兴趣的编码序列,而且当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时,原位产生本文所述的抗体或其抗原结合片段。表示能够表达的细胞。 它们是微生物,例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体 DNA、质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转化的细菌(例如,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌( 枯草芽孢杆菌 )); 用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces pichia) 毕赤酵母属 )); 用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统; 用重组病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)感染或用含有抗体编码序列(例如,Ti 质粒)的重组质粒表达载体转化的植物细胞系统(例如,绿藻,如衣藻莱茵藻 ( 莱茵衣藻)); 或含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如,金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如,腺病毒晚期启动子;痘苗病毒 7.5K 启动子)的重组表达构建体 哺乳动物细胞系统(例如,COS(例如, COS1 或 COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa 和 NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、 BSC40、YB/20 和 BMT10 细胞)。 在一些方面,表达本文所述的抗体及其抗原结合片段(例如,包含 hPA-002、hPA-005、hPA-004 或 hPA-001 的 CDR 的抗体或其抗原结合片段)使用的细胞是CHO细胞,例*自CHO GS System TM 或CHO K1SV TM 系统(Lonza)的CHO细胞。 在一些方面,用于表达本文所述抗体的细胞是人类细胞,例如人类细胞系。 在一些方面,哺乳动物表达载体是pOptiVEC TM 或pcDNA3.3。 在某些方面,细菌细胞如大肠杆菌( 大肠杆菌 )或真核细胞(例如哺乳动物细胞)用于表达重组抗体分子,特别是完整的重组抗体分子。 例如,哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞与载体*自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件是抗体的有效表达系统(Foecking MK & Hofstetter H 1986) 基因 45:101-105]; [Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667]。 在一些方面,本文所述的抗体或其抗原结合片段由CHO细胞或NS0细胞产生。 [0341] 此外,可选择调节插入序列表达或以特定所需方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。 蛋白质产物的此类修饰(例如,糖基化)和加工(例如,切割)可能有助于蛋白质的功能。 为此,可以使用具有正确处理初级转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。 此类哺乳动物宿主细胞包括 Expi293F 人细胞、C6(大鼠神经胶质瘤细胞系)、U2OS、Chem-1、CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O 和 T47D , NS0(不产生任何内源性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系),CRL7O3O,COS(例如,COS1 或 COS),PER.C6,VERO,HsS78Bst,HEK-293T,HepG2,SP210,R1.1,B-W , L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 和 HsS78Bst 细胞。 在一些方面,本文描述的抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段(例如,包含 hPA-002、hPA-005、hPA-004 或 hPA 的 CDR 的抗体或其抗原结合片段-001)结合片段)在哺乳动物细胞中产生,例如CHO细胞。 [0342] 当本文所述的抗体或其抗原结合片段通过重组表达产生时,它们可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法产生,例如通过色谱法(例如,离子交换)、亲和力,尤其是对于蛋白 A 后的特定抗原,以及大小柱层析)、离心、差异溶解度或任何其他用于纯化蛋白质的标准技术。 此外,本文所述的抗体或其抗原结合片段可与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合以促进纯化。 [0343] 在一些方面,分离或纯化本文所述的抗体或其抗原结合片段。 通常,分离的抗体或其抗原结合片段基本上不含与分离的抗体或其抗原结合片段具有不同抗原特异性的其他抗体或其抗原结合片段。 例如,在一些方面,本文所述的抗体或其抗原结合片段的制剂基本上不含细胞材料和/或化学前体。 [0344] 四、 双特异性分子 [0345] 本文所述的抗PAR-2抗体可用于形成双特异性分子。 抗 PAR-2 抗体或其抗原结合片段可以衍生化或连接到另一种功能分子,例如另一种肽或蛋白质(例如,另一种抗体或受体的配体)以结合至少两种不同的蛋白质. 可以产生与结合位点或靶分子结合的双特异性分子。 例如,抗 PAR-2 抗体可以与特异性结合任何蛋白质的抗体或 scFv 连接,这些蛋白质可以用作联合治疗的潜在靶点。 本文描述的抗体实际上可以定向或连接到不止一种其他功能分子以产生多特异性分子,该多特异性分子结合多于两个不同的结合位点和/或靶分子; 此类多特异性分子也旨在包括在本文所用的术语“双特异性分子”中。 为了产生本文描述的双特异性分子,本文描述的抗体可以功能性连接至一个或多个其他结合分子,例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物,从而产生双特异性分子(例如,通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他)。 [0346] 因此,本文提供的双特异性分子包含至少一种对 PAR-2 的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。 在本文所述的双特异性分子是多特异性的一些实施方案中,该分子可进一步包含第三结合特异性。 [0347] 在一些实施方案中,本文所述的双特异性分子具有作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段(例如,Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv(scFv),包括) 抗体也可以是轻链或重链二聚体,或其任何最小片段,例如美国专利号 4,946,778(Ladner 等人)中描述的 Fv 或单链构建体。 [0348] 可以使用本领域已知的方法通过缀合组分结合特异性来制备本文所述的双特异性分子。 例如,双特异性分子的每个结合特异性可以单独产生,然后相互缀合。 当结合特异性是蛋白质或肽时,各种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。 参见,例如,Karpovsky 等人。 (1984) J. Exp. 医学。 160: 1686]; [刘,马等。 (1985) 过程。 国家队。 学院。 科学。 美国 82:8648。 Paulus (1985) Behring Ins 中描述了另一种方法。 手套。 不。 78, 118-132]; [布伦南等人。 (1985) 科学 229:81-83)] 和 [Glennie 等人。 (1987) J. 免疫学杂志。 139:2367-2375)。 一些偶联物是 SATA 和 Sulfo-SMCC,均可从 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) 获得。 [0349] 五、药物组合物 [0350]本文提供包含本文所述的抗PAR-2抗体(例如抗人PAR-2抗体)或其抗原结合片段的组合物。 在一些方面,具有所需纯度的抗体或其抗原结合片段可包括例如生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)。它以以下形式存在 可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒。 适用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质,以及助悬剂、增溶剂,它包括可能含有增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。 [0351] 在某些方面,药物组合物包含本文所述的抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体(参见,例如,Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts和比较:Drugfacts Plus,第 20 版(2003 年)] [Ansel 等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第 7 版,Lippencott Williams and Wilkins (2004)] [Kibbe 等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 3 版,Pharmaceutical Press (2000))。 在一些方面,本文所述的药物组合物用作药物。 用于体内给药的组合物可以是无菌的。 这很容易实现,例如,通过无菌过滤膜过滤。 [0352] 本文所述的药物组合物可用于在体内或体外诱导生物学效应。 例如,本文所述的药物组合物可用于阻断 PAR-2 激活配体与 PAR-2 胞外结构域之间的相互作用和/或阻断 PAR-2 对 PAR-2 的激活激活配体。 此类PAR-2激活配体包括PAR-2束缚配体(顺式或反式); PAR-1 束缚配体; 或可溶性配体(例如,合成的可溶性 PAR-2 激活配体,如 SLIGKV、SLIGRL 或 2-呋喃甲酰-LIGRLO)。 [0353] 本文所述的药物组合物可用于治疗疾病或病症,例如可通过 PAR-2 激活配体拮抗 PAR-2 激活来改善的疾病或病症。 [0354] 在一些实施方案中,本文提供的药物组合物用于治疗疾病或病症,例如气道疾病。 气道疾病的实例包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化和肺动脉高压。 [0355] 在一些实施方案中,本文提供的药物组合物用于治疗疾病或病症,例如皮肤病症。 皮肤病的例子包括皮肤炎症、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、Netherton 综合征、鱼鳞病、损伤后皮肤屏障/渗透性的恢复、瘙痒症、皮肤癌、皮肤瘙痒症、与黄褐斑相关的色素沉着以及白斑和相关色素沉着包括但不限于。 [0356] 在一些实施方案中,本文提供的药物组合物用于治疗疾病或病症,例如癌症。 可以如本文提供的那样治疗的癌症的实例包括肿瘤微环境中的实体瘤,例如骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、中性粒细胞、小胶质细胞(在CNS中)或其他先天免疫细胞)。侵入的环境都包括在内。 可以通过本文提供的药物组合物治疗的此类癌症的实例包括但不限于成胶质细胞瘤、头颈癌、肾癌(例如,肾透明细胞癌)、胰腺癌、胃癌和乳腺癌。 其他癌症包括但不限于骨癌、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、结肠直肠癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌和子宫癌。 在一些实施方案中,癌症是造血系统癌症,例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。 在一些实施方案中,癌症可以是早期癌症或晚期癌症。 在一些实施方案中,癌症是原发性肿瘤。 在一些实施方案中,癌症是源自任何上述类型癌症的第二部位的转移性肿瘤。 在一些实施方案中,癌症是PAR-2阳性癌症。 在一些实施方案中,癌症是具有增加的PAR-2(例如,增加的PAR-2 mRNA和/或增加的PAR-2蛋白)的癌症。 [0357] 在一些实施方案中,本文提供的药物组合物用于减轻疼痛。 疼痛的例子包括癌痛、关节痛、化疗引起的周围神经病痛、偏头痛、牙痛、膀胱痛、胰腺炎痛、肠易激综合征相关疼痛、内脏痛相关疼痛、骨关节炎相关疼痛、类风湿性关节炎和脊髓疼痛。损伤疼痛包括但不限于。 [0358] 在一些实施方案中,本文提供的药物组合物用于治疗口面部肉芽肿病。 [0359] 在一些实施方案中,本文提供的药物组合物用于治疗患者的炎性病症。 在某些实施方案中,炎性病症是与类风湿性关节炎、骨关节炎、炎症诱导的内脏超敏反应、牙周病或急性冠状病毒感染相关的病理。 [0360] 六。 用途和方法 [0361] 在多个方面,本文提供了使用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的体外和体内方法。 一方面,提供了一种通过配体抑制PAR-2激活的方法,该方法包括将PAR-2与抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或药物接触其中的组成。。 一方面,提供了一种抑制PAR-2激活配体与PAR-2结合的方法,该方法包括将PAR-2上的配体结合位点与抗人PAR-2结合抗体或其抗原结合片段,或包括用其药物组合物阻断。 另一方面,提供了一种抑制由蛋白酶活性产生的可溶性PAR-1或可溶性PAR-2配体与PAR-2结合的方法,该方法包括将PAR-2上的配体结合位点转化为抗人PAR.-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物。 另一方面,通过 PAR-1 抑制 PAR-2 反式激活包括用抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段或其药物组合物阻断 PAR-2 上的配体结合位点到。 [0362] 另一方面,提供了一种通过PAR-2激活配体拮抗PAR-2激活的方法,该方法包括将PAR-2注射到抗人PAR-2抗体或其抗原中在其一种或多种配体存在下,并接触结合片段或其药物组合物。 示例性配体包括,例如,可溶性 PAR-2 激活配体 SLIGKV、SLIGRL、2-呋喃甲酰-LIGRLO、PAR-2 束缚配体或 PAR-1 束缚配体。 [0363] 通过)。 治疗用途和方法 [0364]一方面,提供了一种在有需要的受试者(例如,人类受试者)体内抑制 PAR-2 激活的方法,该方法包括本文所述的抗人 PAR-2 和给药至受试者抗体或其抗原结合片段,或本文所述的药物组合物。 在一些方面,本文提供了在有需要的受试者(例如人类受试者)体内通过 PAR-2 激活配体抑制 PAR-2 激活的方法。所述的PAR-2抗体或其抗原结合片段,或本文所述的药物组合物。 在某些实施方案中,PAR-2激活配体是可溶性PAR-2激活配体、PAR-2束缚配体或PAR-1束缚配体。 [0365] PAR-2 活性已涉及或涉及多种疾病和病症,包括炎症性疾病、疼痛、胃肠道疾病、神经系统疾病和心血管疾病(参见,例如,Linder 等人 ., J. 免疫学。 165:6504-6510 (2000)]; [维尼奥勒 等人 ., 自然医学 7:821-826 (2001)]; [塞纳克 等人, 杰 . 奥林。 调查 117:636-647 (2007)]; [维尼奥勒, 英国药理学杂志 . 141:1264-1274 (2004)]; [骑士 等人 ., J. 过敏临床。 免疫学。 108:797-803 (2001)]; [施密德林 等人, J.免疫学 . 169:5315-5321 (2002))。 与PAR-2结合的抗体有可能在体内拮抗PAR-2的活性。 因此,抗 PAR-2 抗体可用于治疗和/或改善各种疾病状况。 也参见 US2011/0059095。 [0366] 在一些实施方案中,与 PAR-2 表达增加和/或阻断 PAR-2 胞外结构域和 PAR-2 激活配体之间的相互作用和/或减少 PAR 相关的疾病或病症PAR-2 激活配体本文公开了治疗可通过阻断 PAR-2 激活来改善的疾病或病症(例如气道疾病、皮肤病、癌症、炎症病症、口面部肉芽肿病以及与各种疾病或病症相关的疼痛)的方法). 提供。 此类方法可包括将本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或本文所述的其药物组合物给予有需要的患者(例如,人类患者)。 [0367] 六(a)(1)。 呼吸道疾病 [0368] 在一些方面,本文提供了治疗气道疾病的方法。 此类方法包括向有需要的患者(例如人类患者)施用如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物。 [0369] 在一些实施方案中,患者具有气道疾病的症状,并且施用如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物,如本文所述,以治疗气道病做。 在一些实施方案中,患者有患气道疾病的风险,抗人 PAR-2 抗体、抗原结合片段或药物组合物用于降低气道疾病的风险、延缓气道疾病的发作或预防疾病。 [0370] 可以如本文提供的那样治疗的气道疾病的实例包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化、肺动脉高压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、肺动脉高压、肺血管收缩、急性肺损伤、过敏性支气管肺曲霉菌病、过敏性肺炎、嗜酸性粒细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、肺结核、过敏性间质性肺炎、哮喘样疾病、结节病、反应性气道疾病(或功能障碍)综合征、自闭症、间质性肺病、嗜酸性粒细胞增多症综合征、鼻炎、鼻窦炎和寄生虫肺病,以及病毒引起的病症(例如呼吸道合胞病毒 (RSV)、副流感病毒 (PIV)、鼻病毒 (RV) 和腺病毒)相关的气道高反应性。 [0371] 哮喘 [0372] 哮喘是一种慢性气道炎症性疾病。 慢性炎症与气道高反应性(对某些触发因素的过度气道收缩反应,如病毒、过敏原和运动)有关,这种反应会随着时间和强度而变化,如喘息、呼吸急促、胸闷和/或咳嗽。导致反复发作 症状发作通常广泛但多变,通常与肺部气流阻塞有关,可以是自发的,也可以通过适当的哮喘治疗(例如短效支气管扩张剂)逆转。 参见,例如,Quirt J。 等人 ., 过敏性哮喘临床免疫学 ., 14(增刊 2):50(2018 年)。 [0373] PAR-2 表达存在于哮喘患者的多种气道细胞类型中,例如上皮细胞(Knight, D. A. 等人,J Allergy Clin Immunol, 108:797-803 (2001))、平滑肌细胞(Aubier, M. 等人., J Allergy Clin Immunol, 138: 729-739 (2016)),成纤维细胞(Akers, I. A. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 278:L193-201 (2000)),以及内皮细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞(Miike, S. 等人, J Immunol, 167:6615-6622 (2001))、树突细胞、肥大细胞和单核细胞(Palikhe, N. 等人, PLoS One., 10(12) :e0144500 ( 2015)) 在先天免疫细胞中增加。 PAR-2 激活会刺激各种炎症介质的释放,尤其是胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)(Kouzaki, H. et al., J Immunol, 183:1427-1434 (2009)),以及粘液分泌。( Lee, H. J. et al., PLoS One, 7:e43188 (2012)) 并增加支气管上皮细胞的粘蛋白分泌(Lin, K. et al., Int J Biochem Cell Biol, 40:1379-1388 (2008))。 PAR-2 激活还刺激成纤维细胞和气道平滑肌细胞的增殖和迁移(Berger, P. et al., J Appl Physiol, 91, 1372-1379 (2001);Bagher, M. et al., Cell Communication和信号,16:59 (2018))。 PAR-2 是一种存在于常见过敏原中的外源性蛋白酶(Kawabata, A. & Kawao, N., J Pharmacol Sci 97:20-24 (2005))或响应于哮喘触发而释放的内源性蛋白酶(Cocks, T. M. et al., Nature 398:156-160 (1999))。 气道细胞上的 PAR-2 表达与哮喘严重程度相关(Knight, D. A. et al. J Allergy Clin Immunol, 108:797-803 (2001);Aubier, M. et al., J Allergy Clin Immunol, 138:729 -739 (2016);Palikhe, N. et al., PLoS One., 10(12):e0144500 (2015))。 [0374] 卵清蛋白 (OVA) 诱导的实验性哮喘在 PAR-2-/- 小鼠中显着减少,在经过改造以过度表达 PAR-2 的小鼠中显着增加(Schmidlin, F. 等人, J Immunol, 169: 5315-5321 ( 2002)). 这可以通过施用抗 PAR-2 抗体或 PAR-2 阻断肽来改善(Asaduzzaman, M. et al., Clin Exp Allergy, 45:1844-1855 (2015))。 此外,用小分子抑制剂阻断 PAR-2 可显着改善蟑螂粪便诱导的小鼠实验性哮喘(Nadeem, A. 等人,免疫学 145:391-403 (2015))。 [0375]在一些实施方案中,施用如本文提供的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或如本文提供的其药物组合物,预防哮喘和相关病症例如嗜酸性粒细胞性食管炎、降低风险和/或治疗. 在某些方面,施用抗人 PAR-2 抗体、抗原结合片段或药物组合物可以调节患有哮喘的个体中的一种或多种 PAR-2 活性。 [0376] 慢性阻塞性肺疾病 [0377] 慢性阻塞性肺病 (COPD) 包括一组不同的临床综合征,它们具有呼气气流受限的共同特征。 美国胸科学会根据慢性支气管炎和肺气肿来定义 COPD。 慢性支气管炎的临床症状是过度咳嗽和咳痰; 肺气肿是指由扩大的气腔和肺组织破坏引起的慢性呼吸窘迫。 GOLD 倡议将 COPD 定义为“一种以不完全可逆的气流受限为特征的疾病状态。气流受限通常是进行性的,并且还与肺部对有害颗粒或气体的异常炎症反应有关。”。 哮喘的特征还包括气流阻塞和炎症,还涉及气道对刺激的过度反应; 因此,哮喘患者功能缺陷的可逆性不同于 COPD。 参见,例如,Devine J.F., Am Health 药物福利 ., 1(7):34-42 (2008)。 [0378] COPD 患者的 PAR-2 表达似乎没有增加(Cocks, T. M. & Moffatt, J. D., Pulm 药效学疗法 14:183-191 (2001); 米奥托,D. 等人, 胸部 , 57:146-151 (2002)),并且暴露于香烟烟雾可以增强人支气管上皮细胞中性粒细胞弹性蛋白酶诱导的 IL-8 产生 (Lee, K. H. 等人 ., 实验与分子医学 50:79 (2018)。 中性粒细胞弹性蛋白酶也已被证明可通过 PAR-2 激活诱导人肺上皮细胞释放 MUC5AC,这是一种哮喘/COPD 相关粘蛋白(Zhou, J. 等人 ., 分子细胞生化 , 377:75-85(2013 年))。 PAR-2 介导的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积可能导致 COPD 相关肺纤维化 (Akers, I. A. 等人 ., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol , 278:L193-201 (2000))。 [0379] 在一些方面,施用本文提供的抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段或其药物组合物可以预防、降低风险和/或治疗 COPD . 在一些实施方案中,施用抗人 PAR-2 抗体、抗原结合片段或药物组合物可以调节患有 COPD 的个体中的一种或多种 PAR-2 活性。 [0380] 特发性肺纤维化 [0381] 特发性肺纤维化(IPF)是一种间质性肺病,其特征是肺部慢性、进行性瘢痕形成和普通间质性肺炎的病理特征。 目前的范例提出肺泡上皮细胞损伤是一个关键的启动因素。 参见,例如,Barratt 等人 ., 临床医学杂志 ., 7(8):201 (2018)。 [0382] PAR-2 表达在 IPF 患者的肺上皮中增加(Borensztajn,K. 等人 ., 美国病理学杂志 , 177:2753-2764 (2010))。 PAR-2的表达水平与疾病严重程度相关(Wygrekka, M. 等人 ., Am J Respir Crit Care Med , 183:1703-1714 (2011))和临床特征,例如在胸部计算机断层扫描 (CT) 扫描中观察到的蜂窝状结构 (Park, Y. S. 等人 ., 呼吸内科 107:256-262(2013 年))。 PAR-2-/- 小鼠对实验性肺纤维化的诱导具有抗性 (Borensztajn, K. 等人 ., 美国病理学杂志 , 177:2753-2764 (2010))。 此外,当预防性或治疗性给予时,使用 PAR-2 阻断肽治疗可改善实验性肺纤维化 (Lin, C. 等人 ., 分子医学 , 21:576-583(2015 年))。 [0383] 在一些方面,施用本文提供的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物可以预防IPF、降低风险和/或治疗IPF。 在一些实施方案中,施用抗人 PAR-2 抗体、抗原结合片段或药物组合物可以调节 IPF 个体的一种或多种 PAR-2 活性。 [0384] 六(a)(2)。 皮肤病 [0385] 在一些方面,本文提供了治疗皮肤病症的方法。 此类方法包括向有需要的患者(例如人类患者)施用如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物。 [0386] 在一些实施方案中,患者具有皮肤病症的症状,并且施用如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物,以治疗皮肤状况。 在一些实施方案中,患者有发生皮肤病的风险,抗人 PAR-2 抗体、抗原结合片段或药物组合物用于降低风险、延缓发作或预防皮肤病紊乱。 [0387] 可以如本文提供的那样治疗的皮肤病的例子包括屏障功能障碍病症,例如特应性皮炎(参见,例如,Andersen et al., Pain, 2017 158:1780-1791 (2017));过敏性接触性皮炎、Netherton 综合征(例如, Hovnanian A., Cell Tissue Research, 351:289-300 (2013);Briot 等人,Journal of Investigative Dermatology, 130:2736-2742 (2010)],鱼鳞病(参见,例如,Frateschi 等人,Nat Commun. 18(2):161 (2011)),受伤后皮肤屏障/渗透性恢复(参见文献 Hachem 等人,Journal of Investigative Dermatology 126:2074-2086 (2006)),瘙痒症(例如 Frateschi 等人., Nat Commun. 18(2):161 (2011);Andersen Pain, 158:1780-1791 (2017)],皮肤癌(参见,例如,Henehan et al. Experimental Dermatology, 28:877-885 (2019) )、皮肤瘙痒,与黄褐斑色素沉着相关,以及与白斑相关的色素沉着(参见,例如,Henehan 等人,Experimental Dermatology,28:877-885 (2019))。 [0388] PAR-2 在人体皮肤的各种细胞类型上表达,并在炎症期间增加(Steinhoff, M. et al., Exp Dermatol, 8:282-294 (1999)),它在屏障维护中发挥作用,炎症和瘙痒。(Lee, S. E., et al., Yonsei Med J, 51:808-822 (2010)。PAR-2+ 肥大细胞在特应性皮炎患者的皮肤中显着增加,并且与慢性瘙痒症。一直(Steinhoff, ID。(1999))。 PAR-2 多态性已被确定为特应性的危险因素,并与血清 IgE 和嗜酸性粒细胞计数增加有关(Lee, J. H. 等人,J Allergy Clin Immunol, 128:1326-1334 (2011)),一种疾病-相关多态性也在 PAR-2 激活蛋白酶中得到鉴定(Vasilopoulos, Y. et al., J Invest Dermatol, 123:62-66 (2004);Chien, Y. H. et al., Clinical Reviews in Allergy & Immunology 33 :178 -190 (2007))。 PAR-2-/- 小鼠的实验性过敏性皮炎显着减少(Kawagoe,J. 等。 , 日本药理学杂志 , 88:77-84 (2002))。 PAR-2 表达也与牙周病有关,牙周病是一种可以用 PAR-2 拮抗剂治疗的病症(参见例如 WO 2010/132954)。 [0389] 六(a)(3)。 癌症 [0390] 在一些方面,本文提供了治疗癌症的方法。 治疗癌症的方法包括向有需要的患者(例如,人类患者)施用如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或如本文所述的其药物组合物包括做 在一些实施方案中,本文提供治疗癌症的方法,其中癌症是实体瘤。 实体瘤包括骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、中性粒细胞、小胶质细胞(在中枢神经系统中)或其他先天免疫细胞)浸润到肿瘤微环境中。 可以如本文提供的那样治疗的此类癌症的实例包括但不限于成胶质细胞瘤、头颈癌、肾癌(例如,肾透明细胞癌)、胰腺癌和乳腺癌。 其他癌症包括但不限于卵巢癌、肉瘤、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌和子宫癌。 [0391] 在一些实施方案中,通过本公开的方法治疗的癌症包括但不限于造血系统癌症例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。 在一些实施方案中,通过本公开的方法治疗的癌症可以是早期癌症或晚期癌症。 在一些实施方案中,癌症可以是原发性肿瘤。 在一些实施方案中,癌症可以是源自任何上述类型癌症的在第二部位的转移性肿瘤。 [0392] 在一些实施方案中,通过本公开的方法治疗的癌症是PAR-2阳性癌症。 在一些实施方案中,通过本发明的方法治疗的癌症是具有增加的PAR-2(例如,增加的PAR-2 mRNA和/或增加的PAR-2蛋白)的癌症。 癌症的成功治疗可能包括,例如,肿瘤负荷的降低,或转移率的降低,或肿瘤侵袭的降低,或肿瘤生长速率的降低。 [0393] PAR-2 在多种癌症中过度表达,并与恶性肿瘤、进展和不良预后相关(Schaffner, F. & Ruf, W., 动脉硬化血栓血管生物学 29:1999-2004(2009))。 据报道,PAR-2 信号可增强几种癌细胞系的增殖:胃癌(Miyata,S. 等人,J Biol Chem 275: 4592-4598 (2000)),冒号(Ducroc, R. 等人 ., 生命科学 , 70:1359-1367 (2002)), breast (Matej, R. 等。 , 生理研究 56:475-484 (2007)), 胶质母细胞瘤 (Dutra-Oliveira, A. 等,Biochem Biophys Res Commun。 , 421:221-227 (2012)), 黑色素瘤 (Kempkes, C. 等人,J Invest Dermatol , 132:375-384 (2012)), 前列腺 (Wilson, S. R. 等人 ., 前列腺 60:168-174 (2004)), breast (Ge, L. 等人,J Biol Chem 279:55419-55424 (2004),和冒号 (Zhou, B. 等人 ., Oncol代表 , 25:503-511(2011 年))。 此外,阻断 PAR-2 信号可抑制胰腺癌异种移植模型中的生长 (Iwaki, K. 等人,国际癌症杂志 , 122:658-663(2008 年))。 PAR-2-/- 小鼠在乳腺癌模型中延迟发病并减少转移 (Schaffner, F. 等人,血液 , 116:6106-6113 (2010))。 在体外恶性胶质母细胞瘤细胞系中也有 PAR-2 信号通路阻断的报道(Gessler,F. 等。 , 神经科学 165:1312-1322 (2010))和肝细胞癌细胞系(Kaufmann, R. 等。 , 致癌作用 30:1487-1496 (2009)) 抑制增殖和迁移。 [0394] PAR-2 可能至少部分地通过促进肿瘤细胞迁移、血管生成以及与宿主血管细胞(包括血小板、成纤维细胞和血管内壁的内皮细胞)的相互作用来促进癌症侵袭和转移。 或许抑制PAR-2可以抑制它们。 参见,例如,Wojtukiewicz 等人 ., 癌症转移牧师 , 34:775-796 (2015)。 [0395] 在一些实施方案中,抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物与放射疗法和/或化疗剂联合施用。 [0396] 六(a)(4)。 与各种疾病和/或病症相关的疼痛 [0397] 在一些方面,抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物用于缓解疼痛。 在一些实施方案中,患者具有疾病症状,并且如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物用于治疗与疾病相关的疼痛与疾病和/或病症。给予减轻 [0398] 如本文所述的术语“镇痛”或“镇痛”是指降低受试者所经历的疼痛水平。 例如,Younger 描述了减轻疼痛 等人 ., 当前疼痛头痛代表 ., 13(1):39-43 (2009)。 [0399] 疼痛的例子包括癌痛、关节痛、化疗引起的周围神经病变疼痛、牙痛(参见,例如,Ito, M. et al., Mol Pain 13:1-17 (2017))、膀胱痛、胰腺炎痛(参见,例如,Sharma, A. 等人。 , Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol , 288(2):G388-95 (2005)],肠易激综合征相关疼痛(参见,例如,Suckow 等人,Mol Pain 5:54 (2009);Xu, W. 等人,Evid Based补充 Alternat Med 2018:7048584 (2018)),内脏痛(参见,例如,Vergnolle, N., 药效学杂志 , 141(8): 1264-1274 (2004)]; [Cenac, N., 电流神经药理学 , 11, 598-605 (2013)),骨关节炎相关疼痛、类风湿性关节炎相关疼痛、脊髓损伤疼痛(参见,例如,Yoon, H. 等人, 胶质细胞 , 65(12):2070-2086 (2017)) 和偏头痛。 [0400] 偏头痛 [0401] 啮齿动物模型显示 PAR-2 参与偏头痛。 跨膜 PAR-2 的激活导致局部血管舒张 (Dux, M. 等人 ., 神经科学 , 161:887-894 (2009)),在野生型小鼠中产生偏头痛样行为反应,而 PAR-2-/- 小鼠则不存在,并且可以被舒马普坦或 PAR-2 肽拮抗剂阻断(Hassler , S.N. 等人 ., 头痛:国际头痛杂志 39:111-122(2019 年))。 PAR-2 对神经元细胞和/或肥大细胞的激活也被认为会在动物模型中促进偏头痛样疼痛。 [0402]在一些实施方案中,如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物,如本文所述,用于减轻偏头痛或降低发病率或严重程度或持续时间偏头痛。管理减少 [0403] 关节疼痛 [0404] PAR-2用于骨关节炎(OA)患者(Xiang, Y. 等人, 骨关节炎软骨 , 14:1163-1173 (2006)) 和类风湿性关节炎 (RA) 患者 (Busso, N. 等人 ., 关节炎大黄 56:101-107 (2007))。 PAR-2 蛋白水平与 RA 和 OA 患者的滑膜炎严重程度呈正相关(Tindell, A. G. 等。 , 风湿病指数 , 32(10):3077-3086 (2012))。 此外,单碘乙酸 (MIA) 诱导 (Muley, M. 等人 ., 神经炎症杂志 , 14:168 (2017))和手术诱导(Huesa, C. 等。 , 安大黄 75 :1989-1997 (2016)) 在骨关节炎模型中,PAR-2-/- 小鼠的滑膜炎明显减少,伤害性行为减少,负重改善。 另见 Ferrell, W. R. 等人 ., 临床投资杂志 , 111(1): 35-41 (2003)]; [韦萨,C. 等人 ., 安大黄 , 75(11): 1989-1997 (2016)。 [0405] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻关节痛。 [0406] 化疗引起的周围神经病变 [0407] 疼痛性神经病变是癌症化疗的常见副作用。 由于涉及多个系统,包括 PAR-2 的可能作用(Flatters, S. J. 等人 ., 英国麻醉杂志 , 119:737-749(2017 年))。 在化疗引起的疼痛的实验模型中,PAR-2 阻断肽被用于紫杉醇引起的机械异常性疼痛和热痛觉过敏(Chen,Y. 等人, 神经科学 193:440-451 (2011)),奥沙利铂(Chen, K. 等。 , 神经科学杂志 352 :62-67 (2015); Tian, L. 等人, 跨神经科学 6:111-116 (2015)) 和硼替佐米 (Wang, Q. et al., 生物调节剂和稳态剂杂志 , 31:977-983 (2017)) 逆转诱发的机械痛和冷敏感性。 [0408] 在一些实施方案中,施用如本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物,以减轻与化学疗法诱导的周围神经病相关的疼痛。 [0409] 癌痛 [0410] 癌症通常会产生疼痛,这是影响生活质量的主要因素之一。 疼痛可能直接由癌症引起,也可能起源于神经性疼痛。 参见,例如,Portenoy, R. 等人 ., 疼痛 , 81:129-134 (1999)]; [林,D., 等人 ., 疼痛 , 156(5):923-930 (2015)]; [麦卡洛克,K., 等人 ., 前内分泌(洛桑) , 9:257 (2018)]; [摩根,C.R., 等人 ., J 奥罗法克 疼痛 23(3): 265-74 (2009)。 [0411] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻癌症疼痛。 [0412] 急性和慢性癌痛 [0413] 丝氨酸蛋白酶已被确定为可能的伤害性介质。 膜锚定丝氨酸蛋白酶 TMPRSS2 在癌症患者中显着上调,表达水平与患者的疼痛严重程度相关。 TMPRSS2 可以激活 PAR-2,并且 TMPRSS2 诱导的机械痛觉过敏抑制 PAR-2 ^-/- 小鼠中不存在 (Lam, D. K. 等。 , 疼痛 , 156:923-930(2015 年))。 头颈癌释放丝氨酸蛋白酶 (Lam, D. K. 等人 ., 疼痛 149:263-272(2010 年))。 来自头颈癌细胞培养物的上清液在野生型小鼠中诱导机械异常性疼痛,但 PAR-2 ^-/- 小鼠的情况并非如此(Lam,D. K. 等人 ., 疼痛 149:263-272(2010 年))。 此外,在小鼠的化学诱导头颈癌模型中,癌症诱导的慢性异常性疼痛是 PAR-2 ^-/- 在小鼠中完全不存在(Lam,D. K. 等人 ., 神经科学杂志 32:14178-14183(2012 年))。 [0414] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻急性和慢性癌症疼痛。 [0415] 骨癌痛 [0416] 在肿瘤细胞衍生的骨癌模型中,疼痛行为与坐骨神经和背根神经节中 PAR-2 的上调相关。 在 PAR-2-/- 小鼠中未观察到疼痛行为,并且可以通过在野生型小鼠中鞘内注射 PAR-2 阻断肽来逆转疼痛行为 (Liu, S. 等,欧洲疼痛杂志 , 18:326-337(2014 年))。 在大鼠骨癌模型中,PAR-2 阻断被发现可增强吗啡的镇痛作用 (Bao, Y. 等人 ., Reg Anesth 止痛药 , 40:158-165(2015 年))。 [0417] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻骨癌疼痛。 [0418] 胰腺癌疼痛 [0419] 患有癌症相关疼痛的胰腺癌患者的神经周围肥大细胞数量增加(Demir,I. E. 等。 , 公共科学图书馆一号 8:e60529 (2013)),PAR-2+ 神经元在胰腺癌中增加(Zhu, J. 等。 , 肿瘤靶标 8:61810-61823(2017 年))。 肥大细胞和 PAR-2+ 神经元之间的相互作用与神经性疼痛的发病机制有关(Sakamoto, A. 等人 ., 药效学研究 , 105:84-92(2016 年))。 来自胰腺癌细胞培养物的上清液在大鼠中诱导疼痛行为,通过使用 PAR-2 阻断肽治疗可以减轻疼痛行为,并且通过使用 PAR-2 治疗也可以减轻裸鼠原位胰腺癌模型中的疼痛行为阻断肽减少 (Zhu, J. 等。 , 肿瘤靶标 8:61810-61823(2017 年))。 [0420] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻胰腺癌疼痛。 [0421] 膀胱痛 [0422] 将 PAR-2 激活肽膀胱内注射到小鼠中会引起前列腺素依赖性相关的痛觉过敏 (Tsubota, M. 等人 ., 药理学杂志 , 136:46-49 (2018)),以及鞘内注射 PAR-2 阻断肽可减轻膀胱炎小鼠模型中的膀胱活动过度和疼痛(Chen, D. 等人,Transl Neurosci 7:133-138 (2016 年))。 [0423] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以缓解膀胱疼痛。 [0424] 肠易激综合症 (IBS) [0425] PAR-2 和类胰蛋白酶表达在 IBS 患者的活组织检查中增加(Liang, W. J. 等人 ., 肠道和肝脏 , 10:382-390 (2016)),与健康对照相比,在 IBS 患者的活检培养物的上清液中观察到蛋白水解活性增加 (Cenac, N. 等人 ., 临床投资杂志 , 117:636-647 (2007))。 当结肠内给药时,这些上清液在野生型小鼠而非 PAR-2-/- 小鼠中诱导内脏痛觉过敏和异常性疼痛。 有人提出,核内体中的 PAR-2 可能与 IBS 的持续性疼痛有关(Jimenez-Vargas,N. N. 等。 , Proc Natl Acad Sci 美国 , 115, E7438-e7447 (2018))。 [0426] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻与IBS相关的疼痛。 [0427] 胰腺炎 [0428] PAR-2 由大鼠胸背根神经节(Hoogerwerf, W. A. 等。 , 消化内科 127:883-891 (2004)),并且在实验性慢性胰腺炎大鼠的背根神经节中上调(Zhang, W. 等人 ., 胰腺 , 40: 300-307 (2011))。 向大鼠胰管注射一种 PAR-2 激活肽诱导疼痛行为(Hoogerwerf, W. A. 等。 , 消化内科 127:883-891 (2004))。 PAR-2 上调 TRPA1 (Terada, Y. 等人 ., 药理学杂志 , 123:284-287 (2013) 和 TRPV1(Nishimura, S. 等人,Life Sci 87:643-650 (2010))。 [0429] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻与胰腺炎相关的疼痛。 [0430] 五(一)(5)。 其他疾病和状况 [0431] 可以通过本公开的方法治疗的类风湿病症的实例包括成人和青少年类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、狼疮样综合征、未分化结缔组织病、痛风、骨关节炎、类风湿性多肌痛、血清阴性脊柱关节病(包括强直性脊柱炎)、赖特病、银屑病关节炎和慢性莱姆关节炎。 [0432] 可以通过本公开的方法治疗的其他疾病或病症的实例包括纤维化、关节炎、Still 病和与类风湿性关节炎相关的葡萄膜炎、口面部肉芽肿病(参见,例如,Ketabchi 等人。 口服 Diseases, 13:419-425 (2007)), Guillain-Barré disease, type I diabetes, Graves' disease, Addison's disease, Raynaud's phenomenon (including Raynaud's disease and Raynaud's syndrome), 自身免疫性肝炎, GVHD (graft-versus-host disease) ) ),以及导致随意肌和其他肌肉发炎的疾病(包括皮肌炎、包涵体肌炎、多发性肌炎和淋巴管平滑肌瘤病)。 [0433] 纤维化 [0434] 肺中的 PAR-2 (Wygrekka, M. 等。 , Am J Respir Crit Care Med , 183:703-1714 (2011)), 皮肤 (Cevikbas, F. 等。 , Exp Dermatol , 20:69-71 (2011)), 伸长率 (Liu, H. 等。 , 炎症研究, 59:551-559 (2010))和心脏纤维化(Murray, D. B. 等人, J细胞通讯信号 , 6:45-51(2012 年))。 PAR-2 水平在特发性肺动脉高压中升高,阻断 PAR-2 信号可逆转小鼠实验性肺动脉高压(Kwapiszewska,G. 等人 ., 循环资源 , 110:1179-1191(2012 年))。 PAR-2 ^-/- 小鼠是 CCl ₄ - 防止诱导性肝纤维化(Knight, V. et al., Hepatology, 55:879-887 (2012))。 [0435] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻与纤维化相关的疼痛。 [0436] 关节炎 [0437] PAR-2用于骨关节炎(OA)患者(Xiang, Y. 等人, 骨关节炎软骨 , 14:1163-1173 (2006)) 和类风湿性关节炎 (RA) 患者 (Busso, N. 等人 ., 关节炎大黄 56:101-107 (2007))。 PAR-2 蛋白水平与 RA 和 OA 患者的滑膜炎严重程度呈正相关,炎症也与 OA 患者的 PAR-2 水平相关(Tindell, A. G. 等。 , 风湿病指数 , 32(10):3077-3086 (2012))。 RA 患者中循环 CD14+ 和 CD3+ 细胞上的 PAR-2 表达升高 (Crilly, A. 等。 , 安大黄 , 71:1049-1054(2012 年))。 在 PAR-2 拮抗剂 (Kelso, E. B. 等。 , 关节炎大黄 , 56:765-771 (2007))。 佐剂诱发的慢性关节炎和手术诱发的骨关节炎都是PAR-2 ^-/- 它在小鼠中显着减少(Ferrell,W. R. 等人 ., J 临床投资, 111:35-41(2003 年); 和蔼可亲,N. 等人,J Rheumatol , 38:911-920 (2011))。 [0438] 在一些实施方案中,施用本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以减轻与关节炎相关的疼痛。 [0439] 六(二)。 给药和剂量 [0440] 如本文所提供的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或其药物组合物,如本文所提供的,可以胃肠外、肺内、鼻内、瘤内、病灶内、脑脊髓内、颅内、它可以是通过任何合适的方式给药,包括鞘内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。 肠胃外输注包括肌肉内、静脉内作为推注给药或通过在一段时间内连续输注、动脉内、关节内、腹膜内或皮下给药。 在一些实施方案中,施用是静脉内施用。 在一些方面,施用是皮下的。 [0441] 本文提供的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的适当剂量和给药方案单独使用或与一种或多种其他治疗剂联合使用。具体情况取决于所治疗的疾病、疾病的严重程度和病程、给药途径和其他因素。 [0442] 在一些方面,本文提供用作药物的抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物。 [0443]在一些方面,本文提供抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物用于治疗气道疾病的方法。 在一些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段或其抗原结合用于治疗受试者气道疾病的方法,包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段,或本文提供的药物组合物本文提供片段或药物组合物。 [0444] 在一些方面,本文提供抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物用于治疗皮肤病症的方法。 在一些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段用于治疗受试者皮肤病症的方法,包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物。本文提供片段或药物组合物。 [0445] 在一些方面,本文提供抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物用于治疗癌症的方法。 在一些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段用于治疗受试者癌症的方法,该方法包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物或药物。本文提供组合物。 [0446] 在一些方面,本文提供抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物用于减轻与各种疾病和/或病症相关的疼痛的方法。 在一些方面,本文提供用于减轻受试者中与各种疾病和/或病症相关的疼痛的方法,包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物。本文提供了其抗原结合片段或药物组合物。 [0447] 在一些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物缓解与 PAR-2 表达增加和/或通过 PAR-2 拮抗 PAR-2 激活相关的疾病或病症。激活配体。对于成人,每月一次,持续 2 周,以治疗潜在的疾病或病症(例如,气道疾病、皮肤病、癌症、炎症病症、口面部肉芽肿病以及与各种疾病或病症相关的疼痛),每周给药一次,每周两次,或每周三次或更多次。 在一些实施方案中,可以给予一种或多种具有较短剂量间隔和/或较大剂量水平的“负荷剂量”以更快地将抗体浓度提高至治疗有效水平,随后是较长剂量。可以使用微小的间隔将抗体浓度维持在或接近治疗有效水平。 [0448] 当注射时,本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的有效量范围可为每成人剂量约1mg/m 2 至约20mg/m 2 。 或者,可以施用固定剂量,其中量可以在约5mg/剂至约600mg/剂或约5mg/剂至约2400mg/剂的范围内。 在一些实施方案中,剂量是 15、30、60、180、500、1200 或 2400 毫克。 在一些方面,固定剂量的一个范围是约20mg/剂至约30mg/剂。 [0449] 在一些实施方案中,20-600mg/剂或25mg/剂的固定剂量通过注射重复施用。 当使用注射以外的给药途径时,根据标准医疗实践适当调整剂量。 治疗方案的一个实例是在至少 3 周的时间段内每周一次至三次注射约 20-600 mg 或 20-30 mg 剂量的抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物. 然而,可能需要更长时间的治疗来诱导期望程度的改善。 对于儿科受试者(4-17岁),一种示例性的合适方案是从约0.4mg/kg至高达约25mg/kg的抗体或其抗原-每周施用两次或三次。它需要皮下注射结合片段或药物组合物。 [0450] 在一些实施方案中,本文提供的方法包括每周一次或两次皮下注射约0.5mg至约10mg的抗体或抗原结合片段或其药物组合物。 一些方面涉及肺部给药(例如,通过喷雾器)约3mg或更多的抗体或其抗原结合片段或本文提供的药物组合物,每周给药一次。 [0451] 本文提供的治疗方案的实例包括与 PAR-2 表达增加相关的疾病或病症和/或可通过 PAR-2 激活配体(例如,病、气道疾病、皮肤病、癌症、口面部肉芽肿病、炎性病症和与各种疾病或病症相关的疼痛)以约 1.5 mg 至约 3 mg 的剂量每周一次给药。皮下注射抗体或抗原结合其片段或药物组合物。 持续每周施用本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物,直到实现期望的结果,例如,直到受试者的症状消退。 可以根据需要重新开始治疗,或者可以给予维持剂量。 [0452] 本文提供的治疗方案的其他实例是约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg/千克受试者体重(mg/ kg).mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、或皮下或静脉内施用20mg剂量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。 在一些实施例中,剂量为约0.5mg/kg。 剂量一次或以指定的时间间隔多次施用于受试者,例如每周一次、每月 3 次、每月 2 次、每月一次、每 2 个月一次、每 3 个月一次。一年一次,每 6 个月一次,或一年一次。 治疗持续时间以及剂量和/或治疗频率的任何变化可以在治疗过程中改变或改变以满足受试者的特定需要。 [0453] 六(三)。 联合治疗 [0454] 在一些方面,本公开提供了如本文提供的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段,或如本文提供的其药物组合物,以及用一种或多种其他疗法治疗受试者的方法。 . [0455] 在一些方面,该方法包括施用一种或多种本文所述的PAR-2拮抗剂和一种或多种其他治疗(例如,治疗性或姑息性治疗)。 当该方法涉及对受试者施用不止一种治疗时,施用的顺序、时间、频率、浓度和体积仅受医疗要求和治疗限制的限制,即两种治疗同时、顺序施用,例如应当理解,可以顺序方式、交替方式或根据任何其他方案向对象给药。 [0456] 在某些实施方案中,该方法包括施用一种或多种本文所述的PAR-2拮抗剂和一种或多种用于慢性阻塞性肺病的其他治疗(例如,短效支气管扩张剂(例如,沙丁胺醇、异丙托溴铵、revalbu)、长效支气管扩张剂(例如阿地溴铵、阿福莫特罗、福莫特罗、茚达特罗、噻托溴铵、沙美特罗、乌美溴铵或其组合);使用类固醇(例如氟替卡松或布地奈德) 、沙美特罗和流感替卡松、阿地溴铵和福莫特罗、沙丁胺醇和异丙托铵、福莫特罗和格隆溴铵、格隆溴铵和茚达特罗、奥达特罗和噻托溴铵,或乌美溴铵和维兰特罗);磷酸二酯酶 4 抑制剂;茶碱;和抗生素)。 [0457]在某些实施方案中,该方法包括施用本文所述的一种或多种 PAR-2 拮抗剂和一种或多种其他哮喘治疗方法(例如,吸入皮质类固醇(例如,丙酸氟替卡松、布地奈德、环索奈德)、倍氯米松、莫米松和氟替卡松糠酸盐) 白三烯调节剂(例如孟鲁司特、扎鲁司特和齐留通) 组合吸入剂(氟替卡松-沙美特罗、布地奈德-福尔莫特罗、福莫特罗-莫米松和糠酸氟替卡松-维兰特罗);茶碱;短效 β 受体激动剂(例如沙丁胺醇和瑞沙丁胺醇);抗胆碱药(异丙托铵和硫代托铵);以及口服和静脉注射皮质类固醇(包括但不限于强的松和甲泼尼龙)。 [0458] 在某些实施方案中,该方法包括施用一种或多种本文所述的PAR-2拮抗剂和一种或多种用于特发性肺纤维化的其他治疗(例如,包括但不限于吡非尼酮和尼达尼布)。 [0459] 在某些实施方案中,该方法包括施用一种或多种本文所述的PAR-2拮抗剂和一种或多种肺动脉高压的其他治疗方法(例如血管扩张剂(vasodilator)(例如依前列醇);鸟苷酸晚期环化酶(GSC)刺激剂) (例如 riociguat);内皮素受体拮抗剂(例如波生坦、马西替坦和安立生坦);西地那非;他达拉非;高剂量钙通道阻滞剂(氨氯地平、地尔硫亚胺)和硝苯地平);抗凝剂(例如华法林);地高辛;和利尿剂)。 [0460] 在某些实施方案中,此类联合疗法实现协同或加成效应,例如通过攻击肿瘤中的多个位点或分子靶标。 可与本公开结合使用的组合疗法的类型包括抑制或激活(在适当情况下)单一疾病相关途径中的多个结节、靶细胞中的多种途径和靶组织中的多种细胞类型。 [0461] 六(四)。 检测和诊断用途 [0462] 本文描述的抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段(参见例如第 II 部分)可以通过免疫测定法制备,例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀法或包括蛋白质印迹在内的相关技术。它可用于使用本领域技术人员已知的经典方法测定生物样品中的 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)水平。 合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记例如葡萄糖氧化酶; 放射性同位素如碘( ¹²⁵ 我, ¹²¹ 一),碳( ¹⁴ C)、硫( ³⁵ S), 氚 ( ³ H), 铟 ( ¹²¹ 在)和锝( ⁹⁹ TC); 发光标记,例如鲁米诺; 荧光素、罗丹明和生物素等荧光标记物。 此类标记可用于标记本文所述的抗体或其抗原结合片段。 或者,识别本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段可以被标记并用PAR-2蛋白(例如,人PAR- 2抗体或其抗原结合片段)。2蛋白)水平。 [0463] PAR-2 蛋白(如人 PAR-2 蛋白)表达水平的测定直接测量(如人 PAR-2 蛋白)PAR-2 蛋白(如人 PAR-2 蛋白)水平PAR-2 蛋白)在第一个生物样品中定性或定量测量或估计,例如,通过确定或估计绝对蛋白质水平)或相对(例如,通过比较第二个生物样品中的疾病相关蛋白质水平)。 可以测量或估计第一个生物样本中 PAR-2 蛋白(例如,人类 PAR-2 蛋白)的表达水平,并与标准 PAR-2 蛋白(例如,人类 PAR-2 蛋白)进行比较蛋白质)水平。标准可以通过取自无病症个体的第二个生物样品或通过取无病症个体群体的平均水平来确定。 正如本领域公认的那样,一旦知道了“标准”PAR-2蛋白(例如,人类PAR-2蛋白)水平,就可以重复使用它作为标准进行比较。 [0464] 如本文所用,术语“生物样品”是指从受试者、细胞系、组织或其他细胞来源获得的任何可能表达 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)的生物样品. 从动物(例如,人)获得组织活检和体液的方法是本领域众所周知的。 [0465] 本文所述的抗人PAR-2抗体为本领域技术人员所熟知,可用于标准和预后、诊断、监测和筛选应用,包括基于该描述的体外和体内应用。 用于免疫系统状态和/或免疫应答的体外评估和评估的预后、诊断、监测和筛选测定法和试剂盒是已知的,例如,与各种疾病或病症相关的气道疾病、皮肤病、癌症和疼痛。可用于预测、诊断和监测以评估患者样本,包括患有或疑似患有的患者。 [0466] 本文所述的抗人PAR-2抗体及其抗原结合片段可携带可检测或功能性标记。 在使用荧光标记的情况下,当前可用的显微术和荧光激活细胞分选仪分析(FACS)或本领域已知的方法程序的组合可用于鉴定和量化特异性结合成员。 本文所述的抗人PAR-2抗体或其抗原结合片段可具有荧光标记。 示例性荧光标记包括,例如,反应性和共轭探针,例如氨基香豆素、荧光素和德克萨斯红、Alexa Fluor 染料、Cy 染料和 DyLight 染料。 抗人PAR-2抗体是同位素等放射性标记 ³ H, ¹⁴ C, ³² , ³⁵ , ³⁶ 氯, ⁵¹ 铬, ⁵⁷ 有限公司 ⁵⁸ 有限公司 ⁵⁹ 铁, ⁶⁷ 铜, ⁹⁰ 是, ⁹⁹ , ¹¹¹ 在, ¹¹⁷ 鲁, ¹²¹ 我, ¹²⁴ 我, ¹²⁵ 我, ¹³¹ 我, ¹⁹⁸ 金, ²¹¹ 在, ²¹³ 双, ²²⁵ 空调和 ¹⁸⁶ 重新可以举行。 当使用放射性标记时,本领域有技术可以鉴定和量化抗人 PAR-2 抗体或抗原结合片段与 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR- 2 蛋白质)。可以使用已知和当前可用的计数程序。 如果标记是酶,则可以通过本领域已知的目前使用的任何比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流分析法或气体分析法来完成检测。 这可以通过将抗人 PAR-2 抗体或其抗原结合片段与样品或对照在允许抗体或其抗原结合片段与 PAR- 2 蛋白质(例如,人类 PAR-2 蛋白质)。这可以通过接触样品来实现。 在样品和对照中检测并比较抗体或其抗原结合片段与 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)之间形成的任何复合物。 鉴于本文所述的抗体或其抗原结合片段与人PAR-2的特异性结合,该抗体或其抗原结合片段表达PAR-2蛋白(例如,人PAR-2蛋白)在细胞表面。可用于特异性检测 本文所述的抗体或其抗原结合片段也可用于通过免疫亲和纯化纯化 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)。 [0467]本文还包括可以以检测试剂盒的形式制造的测定系统,用于定量分析 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)的存在程度。 系统或测试试剂盒可以包括标记的组分,例如标记的抗体或抗原结合片段,以及一种或多种另外的免疫化学试剂。 有关例如套件的更多信息,请参见下面的第 VII 节。 [0468] 在一些方面,本文提供了用于体外检测样品中的 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)的方法,包括使样品与抗体或其抗原结合片段接触。 在一些实施方案中,本文提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段用于体外检测样品中的PAR-2蛋白(例如人PAR-2蛋白)的用途。 在一些实施方案中,本文提供的抗体或其抗原结合片段或组合物用于检测受试者中的 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)或从受试者获得的样品在此提供。 在一些实施方案中,本文提供本文提供的抗体或其抗原结合片段以用作诊断。 在一些方面,抗体包括可检测标记。 [0469] 七。 成套工具 [0470] 本文提供的是包含本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段的试剂盒。 在一些实施方案中,本文提供一种药物包装或试剂盒,其包含一个或多个容器,所述容器填充有本文所述药物组合物的一种或多种组分,例如本文提供的一种或多种抗体或其抗原结合片段。 任选地,与这样的容器相关联的可以是规范药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知,该通知被建立、使用或销售人类给药批准。反映 [0471] 本文还提供了可用于检测方法的试剂盒。 在一些方面,试剂盒包含在一个或多个容器中的本文所述的抗体或其抗原结合片段、纯化的抗体或其抗原结合片段。 在一些实施方案中,本文所述的试剂盒包含可用作对照的基本上分离的 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)。 在一些实施方案中,本文所述的试剂盒还包含不与 PAR-2 蛋白(例如人 PAR-2 蛋白)反应的对照抗体或其抗原结合片段。 在一些实施方案中,本文所述的试剂盒包含用于检测抗体或其抗原结合片段与 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)(例如,人PAR-2 蛋白)、抗体或其抗原结合片段可与可检测底物偶联,例如荧光化合物、酶促底物、放射性化合物或发光化合物,或二抗或其抗原识别第一抗体或其抗原结合片段。-结合片段可以缀合至可检测底物)。 在一些实施方案中,本文提供的试剂盒可包括重组产生或化学合成的 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)。 试剂盒中提供的 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)也可以连接到固体支持物上。 在一些实施方案中,上述试剂盒的检测工具包括附着有PAR-2蛋白(例如人PAR-2蛋白)的固体支持物。 此类试剂盒还可以包括未连接的报道分子标记的抗人抗体或其抗原结合片段或抗小鼠/大鼠抗体或其抗原结合片段。 在某些实施方案中,抗体或其抗原结合片段与 PAR-2 蛋白(例如,人 PAR-2 蛋白)的结合可通过所述报道分子标记的抗体或其抗原结合片段的结合来检测.可以 [0472] 八。 例子 [0473] 本节(即第 VIII 节)中的示例仅用于说明而非限制目的。 [0474] 实施例 1:选择性抗 PAR-2 抗体的产生 [0475] 为了产生抗 PAR-2 抗体,在 PAR-2 基因敲除 (KO) 小鼠和大鼠中进行了基因免疫。 将编码人 PAR-2(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列克隆到哺乳动物表达载体中,用于 PAR-2 KO 小鼠和大鼠的免疫。 [0476] F2RL1 (PAR-2) 敲除小鼠是通过将包含潮霉素和新霉素选择基因的构建体插入小鼠的内源性 F2RL1 基因座中产生的。 靶向构建体被电穿孔到 RW4 小鼠胚胎干 (ES) 细胞中。 将构建体呈阳性的 ES 细胞注射到 C57 小鼠囊胚中。 将所得嵌合雄性与雌性回交,并筛选后代的载体种系传递。 将阳性后代杂交以产生纯合基因敲除小鼠。 使用标准技术生成 F2RL1 (PAR-2) 基因敲除大鼠。 通过定量 PCR 证实了动物中 F2RL1 信息的缺失。 [0477] 在 4-12 轮免疫后,使用人 PAR-2 转染的 3T3 细胞测定每只动物的血清抗 PAR-2 效价。 具有阳性血清滴度的动物被用于单克隆抗 PAR-2 抗体的产生。 [0478] 高通量微反应器(例如 US 2016/0252495、US 2016/0252495,从单细胞和含 B 细胞的组织(脾脏、淋巴结、骨髓)中筛选制备抗体分泌血浆和记忆 B 细胞(如美国 9188593 和美国 10087408)。 使用荧光标记的二抗检测分泌抗体与靶标的结合。 筛选试验包括羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记的 PAR-1 表达细胞系,以识别与 PAR-1 或其他非 PAR-2 细胞成分发生交叉反应的抗体。 这些抗体不再考虑。 [0479] 已经鉴定出超过1500个产生PAR-2选择性抗体的细胞。 收集、裂解表达 PAR-2 选择性抗体的单个细胞,并分离细胞 mRNA 以使用逆转录酶合成 cDNA。 使用与啮齿动物抗体可变区互补的引物序列扩增来自每个抗体表达细胞的重链和轻链抗体序列。 编码每个抗体重链和轻链可变区的多核苷酸序列可以使用下一代测序技术来阐明,例如 Illumina MiSeq 下一代测序仪,或如 US 9188593 中所述。 [0480]当对编码每个 PAR-2 选择性抗体的多核苷酸进行测序时,鉴定了编码至少 421 个独特配对抗体重链和轻链序列的多核苷酸。 由这些序列对编码的配对重链和轻链被表达为全长人 IgG4 同种型抗体,并通过流式细胞术评估 PAR-2 结合和选择性。 具体而言,Expi293F 细胞使用制造商的方案使用人 PAR-2(例如,SEQ ID NO:28 或 SEQ ID NO:28 的第 26-397 位氨基酸)、人 PAR-1(SEQ ID NO:47)进行培养. 或哺乳动物编码嵌合分子(SEQ ID NO:48),由 PAR-2 的 N 端残基(残基 1 至 74)融合到 PAR-1 残基 102-425('Nt-PAR-2 ').用表达质粒瞬时转染。 细胞在转染后 36-48 小时用于流式细胞术分析。 使用 Nt-PAR-2 作为靶点可以使与 PAR-2 的 N 末端残基(包括 PAR-2 上的蛋白酶切割位点)结合的抗体被定向到 PAR 上的其他细胞外位点-2,如 PAR-2-activating 可以与结合到配体结合位点的抗体区分开来。 瞬时表达每种不同目标蛋白之一的 Expi293F 细胞在不同强度的单一荧光团编码染料 (Intellisite) 下孵育 10 分钟,高强度为 1/250 稀释,中等强度为 1/1500 稀释。 , 它允许同时分析多个细胞群。 洗涤后,将细胞与未标记的细胞类型按等比例混合,并测定抗体结合。 [0481] 细胞被镀在 96 孔板中 2 x 10。 ⁵ 接种于细胞/孔中。 在用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 进行洗涤步骤后,在 50 μL FACS 缓冲液(0.5% w/v BSA)中以 10 μg/mL 的浓度向每个孔中添加一抗(抗 PAR-2 抗体)在 PBS 中)。加入并孵育 10-15 分钟。 洗涤步骤后,将二级抗体(抗人 Fc-FITC)以 1:200 的稀释度在 50 μL 中加入孔中 10-15 分钟。 洗涤步骤后,将细胞重新悬浮在荧光激活细胞分选 (FACS) 缓冲液中。 在 IntelliCyte iQue 筛选器上进行流式细胞术分析。 在编码器染料阳性细胞的不同强度周围绘制了一个门,并且这些群体彼此分开分析,并且与未标记的细胞分开分析以通过一抗结合。 [0482] 表 5 列出了以可检测水平表达并结合人 PAR-2(SEQ ID NO:28)但不结合人 PAR-1(SEQ ID NO:47)的抗体,如通过流式细胞术分析所确定的那样。 人类 PAR-1: [0483] [0484] 还筛选了人 PAR-2 结合阳性和 PAR-1 结合阴性的抗体,以去除结合在 PAR-2 N 末端内的抗体,其中栓系配体和蛋白酶切割位点是 PAR-2 驻留的 该筛选使用嵌合构建体进行,该构建体由人 PAR-2 N 末端组成,其余蛋白质为人 PAR1、Nt-PAR-2(SEQ ID NO:48)。 未结合 PAR-2 N 末端的抗 PAR-2 抗体在基于细胞的测定中测试了功能。 Nt-PAR-2: [0485] [0486] 表 5:通过流式细胞仪测量的抗 PAR-2 抗体与人 PAR-1、PAR-2 和 Nt-PAR-2 转染细胞在 PAR-1 上的结合 [0487] [0488] [0489] ** + 指平均荧光强度 (MFI) 比单独的二级对照高至少 2 倍的抗体的结合。 [0490] 实例2:拮抗性抗PAR-2抗体的鉴定 [0491] 2.1 筛选抑制β-arrestin信号传导的拮抗剂抗PAR-2抗体 [0492] 筛选抑制β-arrestin信号传导的拮抗剂抗PAR-2抗体,鉴定为对人PAR-2细胞外环具有选择性的各种抗体(与PAR-2正结合,但PAR-2负结合对-1 和与 Nt-PAR-2 的负结合)筛选了它们拮抗 SLIGKV 诱导的 PAR-2 β-arrestin 活性的能力。 具体而言,Tango™ F2RL1-bla U2OS 细胞(Thermo Fisher Scientific)在 128 μL 测定缓冲液(1% 透析 FBS、0.1 mM 非必需氨基酸、25 mM HEPES (pH 7.3)、4 x 10 100 U/mL 青霉素中培养, 100 ug/mL 链霉素, 不含酚红的 DMEM) ⁴ 将细胞/孔接种在 96 孔黑色透明底板中。 抗体以 10 点连续稀释(包括 0 μM 抗体点)的形式添加到细胞中,从 -666 nM 开始,并在补充有 0.5% DMSO 的 16 μL/孔测定缓冲液中按 1/4 连续稀释。 每个浓度在细胞上一式两份或一式三份进行测试。 37°C/5% 二氧化碳 ₂ 在含有 0.5% DMSO 的 16 μL/孔中孵育 30 分钟后,加入浓度为 1 或 2 μM(取决于实验运行)的可溶性 PAR-2 激动剂 SLIGKV (Sigma)(SEQ ID NO:46) ). 被添加到测定缓冲液中的细胞中。 将板在 37°C/5% CO2 下孵育 16 小时。 ₂ 孵化于。 使用制造商的方案将可渗透细胞的 LiveBLAzer™ FRET B/G 底物(Life Technologies)加载到 32 μL/孔的最终体积后,将板在室温下在黑暗中孵育 2 小时,之后将细胞在 Molecular Devices Flex Station 3 读板器上测量荧光(在 410 nm 激发,在 458 nm 和 522 nm 发射,7 个读数/孔)。 在使用无细胞孔减去背景后,使用非线性回归来拟合蓝色/绿色荧光发射与抗体摩尔浓度对数之比的曲线(使用 4 参数逻辑曲线拟合)。 [0493] 表 6 列出了 34 种选定的抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体在 PAR-2 β-arrestin 细胞测定中抑制 PAR-2 信号传导的效力(当进行多个独立测定时,平均值值呈现)。 [0494] 表 6:抗 PAR-2 抗体在 PAR-2 β-arrestin 细胞测定中的效力 [0495] [0496] [0497] 2.2 筛选具有广泛拮抗活性的抗PAR-2胞外环选择性抗体 [0498] 为了筛选具有广泛拮抗剂活性的抗 PAR-2 胞外环选择性抗体,筛选了 8 种抗 PAR-2 胞外环选择性抗体,以进一步评估它们预防胰蛋白酶激活的 PAR-2 的能力。诱导钙流的信号传导。选择了 2 种细胞外环选择性抗体。 Chemiscreen 人类 PAR-2 受体钙优化稳定 CHEM-1 细胞系(Eurofins)用于 PAR-2 钙通量测定。 CHEM-1 PAR-2细胞在100 μL减血清基础培养基(1%热灭活FBS、0.1 mM非必需氨基酸、10 mM HEPES(pH 7.3)、DMEM高糖培养基(4.5 g/ L D-葡萄糖). )) 7.5 x 10 ⁴ 将细胞/孔接种在 96 孔黑色透明底板中。 将板在 37°C/5% CO2 下孵育 20-24 小时。 ₂ 孵化于。 去除培养基后,细胞在 100 μL/孔测定培养基(含 1% w/v BSA 的 HBSS 和 20 mM HEPES)中洗涤,通过抽吸去除。 将在测定缓冲液中用 2.5 mM 丙磺舒重构的 Fluo4NW 染料(Life Technologies)以 100 μL/孔添加到细胞中。 将板在 37°C/5% CO 下孵育 30 分钟。₂ 在黑暗中以 -666 nM 孵育后,以 50 μL/孔的测定培养基将抗体添加到细胞中,作为 1 比 3 连续稀释的 10 点连续稀释(使用 0 μM 抗体),从约 666 nM 开始。 每个浓度在细胞上一式两份或一式三份进行测试。 在室温下在黑暗中孵育 30 分钟后,使用 Molecular Devices FLIPR Tetra(分配高度为 200 μL,分配速率为 75 μL/s)预先测定激动剂胰蛋白酶 (Sigma) 的 EC。 ₈₀ 以 50 μL/孔的浓度添加到测定缓冲液中的细胞中。 使用 FLIPR Tetra(在 470-495 激发,在 515 至 575 发射,激发强度为 20%,产率为 80,曝光时间可变),在添加激动剂后立即测量细胞荧光。 使用非线性回归(使用 4 参数逻辑曲线拟合)拟合最大最小荧光与抗体摩尔浓度对数的曲线。 [0499] 抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体在钙流细胞测定中抑制 PAR-2 信号转导的效力列于表 7(在进行多个独立测定时显示平均值)。 胰蛋白酶的 EC 作为 PAR-2 激活剂 ₈₀ 这些测定是使用 [0500] 表 7:抗 PAR-2 抗体在 PAR-2 钙通量细胞测定中的效力 [0501] [0502] PAR-2 钙流测定用于鉴定三大类抗体:抗体 Ab84、Ab87 和 Ab225 无法抑制胰蛋白酶诱导的钙流; 抗体 Ab1、Ab20、Ab39 和 Ab77 表现出低效抑制; 抗体 309 的 IC 约为 6.7 nM ₅₀ 值能够完全抑制钙通量。 [0503] 2.3 筛选抑制PAR-2激活的A549细胞释放炎性细胞因子的抗体 [0504] 通过夹心酶联免疫吸附测定 (ELISA) 分析 PAR-2 介导的 IL-6 和 IL-8 细胞因子从人 A549 上皮样细胞释放的抑制作用。 贴壁 A549 细胞以 100 μl/孔的浓度在平底 96 孔板中以 2 x 10 个接种在 Ham's F-12K 营养培养基(补充有 10% 胎牛血清)中。 ⁴ 接种于单个细胞/孔中,37°C/5% CO 过夜 ₂ 孵化于。 去除培养基并用 200 μl/孔的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤一次后,将细胞与 100 μl/孔的无血清培养基一起在 37°C /5% CO2 下孵育 24 小时。 ₂ 通过在血清饥饿状态下孵育。 24 小时后,SLIGKV 的 EC 在 100 μM 时从 666.7 nM 开始 ₅₀ 将抗体浓度的半对数系列稀释液以 200 μl/孔的终体积添加到细胞中,并在 37°C/5% CO2 下孵育 24 小时。 ₂ 孵化于。 孵育 24 小时后,收获上清液并使用商业 IL-6 和 IL-8 ELISA 试剂盒评估 IL-6 和 IL-8 细胞因子水平,并使用 SpectraMax 吸光度读数器在 450 nm(减去 570 nm 波长)下测量。),评估吸光度。 减去背景后,PAR-2 介导的 IL-6 和 IL-8 表达水平从标准曲线和 4 参数逻辑曲线拟合,抗体浓度对 IL-6 和 IL 浓度作图-8 被执行。绘制使用 与 Ab87 相比,Ab309 更有效地抑制 A549 细胞释放 IL-6 和 IL-8。 [0505] 实施例 3:强效抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体的人源化 [0506] 强效抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体 309 (Ab309) 的人源化是通过将非人类“供体”抗体可变区的互补决定区 (CDR) 移植到人类“受体”可变区来实现的框架。 使用以下 CDR 残基定义 CDR:根据 AbM 命名法的重链 CDR1(如 Kabat 编号系统定义的残基 H26、H27、H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34 和 H35); 根据 Kabat 的重链 CDR2,但不包括最后 5 个氨基酸(由 Kabat 编号系统定义的残基 H50、H51、H52、H53、H54、H55、H56、H57、H58、H59 和 H60); 根据 Kabat 的重链 CDR3(Kabat 编号系统定义的残基 H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100A、H100B、H100C、H101 和 H102); 和根据 Kabat 的轻链 CDR(CDR1 的残基 L24、L25、L26、L27、L28、L29、L30、L31、L32、L33 和 L34 由 Kabat 编号系统定义;残基 L50 用于 CDR2、L51、L52、L53 、L54、L55 和 L56;以及 CDR3 的残基 L89、L90、L91、L92、L93、L94、L96 和 L97)。 [0507] 如图1A所示,来自抗体309重链可变区的CDR被移植到人抗体可变区中。 如图 1B 所示,来自抗体 309 轻链可变区的 CDR 被移植到人抗体可变区中。 与人类种系序列具有高度同一性的抗体是首选。 [0508] 将人源化抗体可变区转化为重组 IgG4 并进行表达。 具体而言,对每种抗体的可变重链和轻链进行反向翻译和密码子优化。 编码抗体可变区序列的多核苷酸通过基因合成产生。 使用标准限制性内切酶克隆将所有重链可变区克隆到人 IgG4 中(在整个说明书中,术语“IgG4”是指包含 S228P 取代和末端赖氨酸缺失(K447Δ)(根据欧洲索引的残基编号)的人 IgG4)( SEQ ID NO:34)被亚克隆到哺乳动物表达载体编码。 将可变轻链编码序列亚克隆到编码人κ恒定区(SEQ ID NO:37)的哺乳动物表达载体中。 [0509] 使用制造商的方案 (ThermoFisher) 在 Expi293F 细胞中进行重链和轻链质粒的共转染。 通过离心收集细胞培养物上清液,并将抗体捕获在含有蛋白 A 树脂的柱上。 使用 100 mM 乙酸、100 mM 精氨酸 HCl、5 mM 组氨酸、pH 3.5 进行抗体洗脱,并使用碱性缓冲液将所得洗脱液中和至 pH 7-8。 通过凝胶过滤或透析将抗体脱盐到 10 mM 组氨酸盐酸盐、100 mM 精氨酸盐酸盐、pH 6 或 PBS pH 6 中,如有必要,使用 Amicon Ultra-15 离心过滤装置(Merck Millipore))进行浓缩。 [0510] 每种蛋白质(人 PAR-2(例如,SEQ ID NO:28 或 SEQ ID NO:28 的氨基酸 26-397)、人 PAR-1(SEQ ID NO:47)、Nt-PAR-2 (SEQ ID NO: 47) ID: 48)在稳定抗生素标记基因的选择下被电穿孔到C6大鼠细胞系或3T3细胞系中,从而产生人PAR-1、人PAR-2或PAR-1 residues 102-425 ('Nt Cell lines expressing chimeras consists of the N-terminal residues of PAR-2 (residues 1 to 74) fused to -PAR-2') 转染的细胞被用来产生人PAR-2,PAR -1 和 Nt 纯化的人源化抗体使用 -PAR-2 通过流式细胞术评估选择性。 [0511]这些抗体的一个子集(Ab309(亲代鼠抗体)、Ab309-4e、Ab309-6e、Ab309-11e、Ab309-12e、Ab309-4i、Ab309-6i、Ab309-11i 和 Ab309-12i)在实施例 2.1 中进行了描述以上。和 PAR-2 信号在 β-抑制蛋白和/或钙流测定中的抑制,如 2.2 中所述。 人源化抗 PAR-2 胞外环选择性抗体(Ab309、Ab309-4e、Ab309-6e、Ab309-11e、Ab309-12e、Ab309-4i、Ab309-6i、Ab309-11i 和 Ab309-12i)的抑制效力) 列在表 8 中(当进行多个独立测试时,呈现平均值)。 [0512] 表8:人源化抗PAR-2抗体在PAR-2β-arrestin细胞实验和PAR-2钙通量细胞实验中的IC ₅₀ 价值 [0513] [0514] Ab309-4e、Ab309-6e、Ab309-11e 和 Ab309-12e 在该测定中阻断 β-抑制蛋白信号转导的能力相似,并且活性与 Ab309 相似。 [0515] 在测试的四种抗体中,Ab309-4e 和 309-12e 对胰蛋白酶激活的钙流或 β-抑制蛋白活性的抑制作用最强,其效力与亲代未优化抗体 Ab309 相当。 [0516] 实施例4:人源化抗PAR-2胞外环选择性抗体的优化 [0517] 选择人源化抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体 309-4e 进行进一步开发,并构建了一组变体,目的是增强效力并最大限度地减少潜在的免疫原性和制造责任。 [0518] 尽量减少潜在免疫原性的尝试包括在可能的情况下用基于人类种系序列的序列替换啮齿动物序列,以及修改计算机预测的序列以结合人类 MHC II 类分子。 有几种软件程序可用于执行此分析,例如 EpiBase (Lonza) 或 EpiVax。 [0519] 鉴定了与不希望的翻译后变化相关的残基或序列基序,例如糖基化、天冬氨酸异构化、脱酰胺化、氧化,并且通过在选定残基处进行各种氨基酸取代来构建各种变体。 提高抗体效能的尝试包括在预测为溶剂暴露的每个 CDR 残基处用以下每种氨基酸之一进行取代:Y、W、F、K、H、N、D、G 或 L。 预测不会暴露于溶剂的 CDR 残基被替换为 Y 或 G。 此外,合成了一个 CDR 靶向的组合 scFv 文库(Twist Biosciences),克隆到噬菌粒载体 pADL™-22c(Antibody Design Labs)中,并通过多轮选择进行了 PAR-2 噬菌体展示。 PAR-2 结合由 ELISA 评估并由 Biacore 确认。 [0520] 在选择过程中,重组 PAR-2 要么被动吸附到 MaxiSorp 板上,要么通过多组氨酸标签 Dynabeads M-280 链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)或 Sera-Mag SpeedBeads 与 tris-NTA 生物素(Biotechrabbit)和硫酸镍预孵育中性抗生物素蛋白包被的磁性颗粒(GE Healthcare)。 在含有月桂基麦芽糖新戊二醇 (LMNG) 和胆甾醇半琥珀酸酯 (CHS) 的 PBS 或基于 HEPES-NaCl 的缓冲液中进行选择。 使用 100 mM 三乙胺洗脱结合的噬菌体。 随后对单个克隆进行分离、测序和重组 PAR-2 被动吸附到 MaxiSorp 板或捕获到 Nunc 固定化链霉亲和素 96 孔板,该板用 tris-NTA 生物素和硫酸镍(2 μg/ml)预孵育单克隆噬菌体 ELISA。 使用 HRP 缀合的抗 M13 抗体(GE Healthcare)检测结合克隆。 在噬菌体 ELISA 中被认为是 PAR-2 特异性的克隆在表面等离子共振 (SPR) 研究中进一步评估了它们结合重组 PAR-2 的能力,并表现出比亲代 309-4e scFv 慢的解离速率常数。目的是识别克隆 对于这些克隆,使用异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 诱导 scFv 的可溶性表达,并根据标准方法克隆含有可溶性 scFv 的大肠杆菌周质部分,完成,Mini,并通过冷提取使用冰冷的 30 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、20% (w/v) 蔗糖、pH 8.0 含有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物 (Roche) 进行渗透压冲击。 使用 Biacore T200 或 S200 仪器评估 SPR 中与重组 PAR-2 结合的可溶性 scFv。 简而言之,使用标准胺偶联方法将抗血凝素 (HA) 标签抗体(克隆 3F10;Roche)偶联到 S 系列传感器芯片 CM5。 然后,将运行缓冲液(50 mM HEPES、250 mM NaCl、0.1% w/v LMNG、0.025% w/v CHAPS、0.005% CHS、pH 7.4)稀释 1/2 的周质提​​取物中的可溶性 scFv 添加到芯片中.(并通过C端HA标签被抗HA标签抗体捕获),随后注射重组PAR-2(0和2μg/ml)。 所得传感图通过缓冲液减法和参考细胞减法进行双重参考,结合曲线拟合到 1:1 结合模型,使用 Biacore S200 或 T200 评估软件从中得出动力学常数。 [0521] 在每种情况下,人源化抗体变体如上文实施例3所述进行表达和纯化。 对于使用转染细胞的人 PAR-2、PAR-1 和 Nt-PAR-2 的流式细胞术选择性,以及基于 PAR-2 β-arrestin 细胞的选择性,如上文实施例 2.1 所述。纯化的抗体被评估为测定中的效力。 [0522] 表 9 列出了在 β-arrestin 测定中至少在上述优化参数中表现出改善并且与亲本具有相似或更好效力的人源化抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体的变体。 [0523] 表 9:在优化过程中引入抗体 309-4e 的取代和基于 β-抑制蛋白细胞的测定的效力 [0524] [0525] [0526] [0527] [0528] [0529] [0530] ^* 添加 1 μM SLIGKV; ^# 添加了 2 μM SLIGKV [0531] 修饰 Ab309-4e 及其变体以减少潜在的免疫原性表位 [0532] 使用全长抗体 P24E976 进行 MAPPS(MHC II 类相关肽蛋白质组学)测定(ProImmune UK)以鉴定抗体上存在的任何潜在免疫原性表位。 使用一组 12 个供体,从两个携带 DRB1*0101 等位基因的供体中鉴定出位于 P24E976 的 CDR2 中的肽序列 IYNAYSRATGIPAR。 进行了进一步的优化以删除此主题。 [0533]P24E976 的轻链 CDR2 通过用不同的氨基酸替换基序 NAYSRAT 中的每个氨基酸进行修饰,然后对这些变体进行 Epibase® 分析。 鉴定了预测与 DRB1*0101 结合减少的变体。 值得注意的是,通过去除该基序第 52 位的酪氨酸 (Y) 并将其替换为天冬酰胺 (N),预计该肽将不再与 DRB1*0101 结合。 一些新的抗体在 52 位带有 N。 因为这会引入 NS 基序(天冬酰胺脱酰胺的可能性),所以也产生了其他具有 NT 或 NN 的抗体(比 NS125 更不容易脱酰胺)。 轻链52和53位有NS的抗体为P24E1099,NT为P24E1102,NN为P24E1103。 没有对抗体 P24E976 进行其他序列改变。 重链与 P24E976 相同。 [0534] 进一步测试了四种抗 PAR-2 细胞外环选择性抗体(P24E976、P24E1099、P24E1102 和 P24E1103)防止胰蛋白酶激活的 PAR-2 信号诱导钙流的能力,如上文实施例 2.2 所述。我深表歉意. 这四种抗体抑制 PAR-2 介导的炎性细胞因子 IL-6 和 IL-8 释放的效力也如上文实施例 2.3 中所述进行了评估,结果列于表 10 中。 [0535] 表 10:优化的抗 PAR-2 抗体在各种基于细胞的测定中的效力值(IC ₅₀ ) 汇总表 [0536] [0537] 优化的抗 PAR-2 抗体 P24E976、P24E1099、P24E1102 和 P24E1103 在测试的基于细胞的测定中具有相似的效力。 [0538] 实施例 5:优化的抗 PAR-2 抗体的物种交叉反应性 [0539] 来自不同物种的 PAR-2 使用表面等离子共振 (SPR) 测定抗体与重组 PAR-2 的结合,除了人类 PAR-2 被来自食蟹猴、大鼠或小鼠的 PAR-2 取代。测试抗体与-2的结合。 [0540] 如上文实施例3所述转染和收获抗体。 上清液中的抗体在运行缓冲液(50 mM HEPES、250 mM NaCl、0.1% w/v LMNG、0.025% w/v CHAPS、0.005% CHS、pH 7.4)和纯化抗体中稀释 1/50-250在运行缓冲液中稀释至 0.5 ug/mL。 Series S Protein A 芯片与仪器 (Biacore S20) 对接,系统在运行前用运行缓冲液启动 4 次。 重组人PAR-2在运行缓冲液中稀释至0-5 μg/mL。 使用 50 mM NaOH 使表面再生。 抗体在芯片表面上以 20 到 110 个相对单位被捕获。 样品(重组 PAR-2)以 30 μl/min 的速度注射 1 分钟,然后进行 180 秒的解离步骤。 传感图通过缓冲减法和参考细胞减法进行双重引用。 然后使用从曲线拟合得出的动力学常数将结合曲线拟合到 1:1 结合模型。 当仅注射一种浓度的抗原时,抗体解离率(k _d )排名。 平衡解离常数 (K _D )排名。 在所有测试的抗体中,都显示出与人和食蟹猴重组 PAR-2 相当的结合,与大鼠 PAR-2 的临界结合,与小鼠 PAR-2 不结合。 [0541] 使用 PAR-2 制剂通过表面等离子共振 (SPR) 测试 P24E1102 与人、食蟹猴、大鼠和小鼠 PAR-2 的结合。 表11显示,代表性抗体P24E1102以高亲和力结合人和猕猴PAR-2,仅弱结合大鼠PAR-2而无小鼠PAR​​-2。 [0542] 表 11:P24E1102 对人、食蟹猴、小鼠和大鼠 PAR-2 的结合亲和力 [0543] [0544] P24E1102 结合也通过流式细胞术评估,如上文实施例 1 所述,使用瞬时转染到 CHEM-1 细胞中的 PAR-2。 除人类外,还对食蟹猴、小鼠和大鼠、豚鼠、兔和狗进行了PAR-2测试。 P24E1102 与人类和食蟹猴 PAR-2 结合良好,但与所有其他测试物种的结合程度最低。 [0545] 转染到 CHEM-1 细胞系中还允许进行配体诱导的钙通量阻断的功能测试,如上文实施例 2.2 中所述。 P24E1102 阻断瞬时转染人 PAR-2 的 CHEM-1 细胞中配体诱导的钙流,但不阻断转染大鼠、豚鼠或兔 PAR-2 的细胞。 [0546] 此外,如上文实施例 2.1 和 2.2 所述,使用稳定转染人或食蟹猴 PAR-2 并设计用于检测钙流和 β-arrestin 信号的 Nomad® 报告基因系来测试人食蟹猴的结合和功能。 P24E1102 与人类和猕猴 PAR-2 细胞系的结合相似。 TEV-56192 P24E1102 阻断人和猕猴 PAR-2 介导的钙通量。 P24E1102 阻断了人类和食蟹猴 PAR-2 激活的 β-arrestin 信号传导。 [0547] 表 12 显示 P24E1102 对食蟹猴 PAR-2 的功能性抑制在整个效力范围内与人 PAR-2 相似。 [0548] 表 12:人和食蟹猴 PAR-2 的个体 SLIGKV EC ₈₀ P24E1102 阻断钙通量和 β-抑制蛋白信号传导的 IC ₅₀ 价值总结 [0549] [0550] *来自 2 个独立实验的 5 个技术复制的数据摘要。 [0551] P24E1102 也没有显示出与重组人 PAR-1、PAR-3 或 PAR-4 的高于背景的结合。 [0552] 实施例6:人源化和优化的抗PAR-2胞外环选择性抗体的内化 [0553] 选择并评估了代表性抗体 P24E1102 的靶介导内化作用。 A549 细胞在 1 x 10 100 μL 基础培养基(10% FBS、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、Hams F-12K 培养基)中培养。 ⁴ 将细胞/孔接种在 96 孔黑色透明底板中。 细胞在 37°C/5% CO2 下孵育 ₂ 孵育并粘附。 根据制造商的说明,将测试抗体以 3:1 的摩尔过量与 pH 敏感的 IncuCyte 人 FabFluor 红色抗体标记试剂 (Essen Biosciences) 结合 15 分钟。 立即将标记的抗体添加到细胞中,并使用 Incusite S3 每 20 分钟以 10 倍放大倍率成像,并记录相差和红色荧光。 使用 IncuCyte S3 控制器计算总积分红色荧光(荧光区域强度和积分荧光)并根据时间(分钟)作图。 与同种型对照抗体相比,P24E1102 未显示靶标介导的内化到 A549 人上皮细胞中。 [0554] 实施例 7:确定 P24E1102 抗体的结合和功能的基于原代细胞的测定 [0555] 多种人类气道细胞类型作为更具生理相关性的靶标进行了测试,以抑制代表性抗体 P24E1102 的 PAR-2 结合和 PAR-2 功能。 [0556]如上文实施例 1 所述,通过流式细胞术测试 P24E1102 与 A549 人肺上皮细胞系上的 PAR-2 的结合,发现在 1-133 nM 的浓度范围内以剂量依赖性方式结合。 [0557] 测试了 P24E1102 与原代人肺成纤维细胞上的 PAR-2 的结合。 将细胞固定并染色,并通过荧光孔扫描确定平均荧光。 P24E1102 在 1-133 nM 范围内以剂量依赖性方式结合原代人肺成纤维细胞。 [0558] 用 PAR-2 配体刺激的 A549 肺上皮细胞系对钙流和促炎细胞因子 IL-6 和 IL-8 的产生有反应。 P24E1102 抑制 PAR-2 介导的钙流和促炎细胞因子释放的效力如上文实施例 2.2 和 2.3 所述进行了测试。 P24E1102 抑制 PAR-2 激活配体诱导的钙流(IC ₅₀ = 13.2 nM)和 IL-6(IC ₅₀ = 5.0) 和 IL-8 的产生 (4.6 nM),呈剂量依赖性。 [0559] P24E1102 剂量依赖性地阻断杯状细胞样肺上皮 Calu-3 细胞系中 PAR-2 激活配体诱导的哮喘/COPD 相关粘蛋白 MUC5AC 的产生。 [0560] P24E1102 通过原代人支气管平滑肌细胞和原代人肺成纤维细胞阻断 PAR-2 激活配体诱导的钙流。 [0561] 原代人支气管平滑肌细胞在胶原蛋白基质中生长,形成替代肌肉盘,这些肌肉盘响应 PAR-2 配体刺激而收缩。 200 μM 的 PAR-2 配体 SLIGKV 引起大约 17% 的椎间盘收缩,浓度为 10 μg/ml 的 P24E1102 完全消除了这种收缩。 [0562] 据报道,PAR-2 信号转导参与中性粒细胞迁移和激活(Howells,G. L. 等人 ., J Cell Sci., 110 (Pt 7):881-7 (1997); 纳迪姆,A. 等人 ., 化学-生物相互作用 , 304:52-60 (2019); 卢巴科斯,A. 等人 ., FEBS快报 , 435:45-48 (1998))。 在使用来自健康捐献者的新鲜人类全血进行的实验中,P24E1102 不影响 N-甲酰甲硫氨酸-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLF) 或补体成分 5a (C5a) 诱导的中性粒细胞产生活性氧 (ROS)。没有发疯。 在这些实验中,细胞用 P24E1102 或等效同种型对照 (≤338.4 nM) 进行预处理,然后用 fMLF (10 nM) 或 C5a (10 nM) 进行 ROS 刺激。 使用二氢罗丹明 123 测量中性粒细胞中 ROS 的产生,二氢罗丹明 123 是一种可自由扩散的不带电非荧光染料,在存在 ROS 和表面标记物的情况下氧化成荧光 R123 以识别人中性粒细胞 (CD45+CD16+CD14-)。通过流式细胞术检测。 P24E1102 也是大肠杆菌 (E. coli) 或金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 金黄色葡萄球菌 ) (金黄色葡萄球菌 ( 金黄色葡萄球菌 )) 不影响中性粒细胞的吞噬作用。 为了确定 P24E1102 对吞噬作用的影响,来自健康供体的新鲜人全血用 P24E1102 或等效同种型对照(≤338.4 nM)预处理,细胞用 pHrodo™ green E 处理。 大肠杆菌和S。 Aureus BioParticles® 偶联物经过处理。 这些 pHrodo™ 绿色偶联物在中性 pH 值下在细胞外不发荧光,但在酸性 pH 值下,即吞噬体,它们呈绿色荧光(激发/发射 509/533),向感兴趣的群体、嗜中性粒细胞(表面标记物)发出荧光CD45 ⁺ CD16 ⁺ CD14 ^- 使用门控)并使用流式细胞术测量。 [0563] 实施例8:比较抗体与人源化和优化的抗PAR-2细胞外环选择性抗体的比较 [0564] 将拮抗 SLIGKV 诱导的 PAR-2 β-抑制蛋白活性的人源化和优化抗体 P24E1102 的抑制效力与鼠抗人 PAR-2 抗体 MAB3949(R&D Systems,Cheng 等人,如上例 2.1 所述)。 等人 ., 自然 , 545 112-115 (2017))。 还如上文实施例2.2中所述比较了这些抗体拮抗胰蛋白酶诱导的PAR-钙流的效力。 [0565] P24E1102 与 MAB3949 的效力列于表 13(如果进行了多项独立测定,则给出了数值范围)。 [0566] 表 13:各种基于细胞的测定中的效力值(IC ₅₀ ) [0567] [0568] 与 MAB3949 相比,P24E1102 在抑制 PAR-2 介导的 β-抑制蛋白募集和 PAR-2 介导的钙流方面表现出更有效的活性。 与 MAB3949 相比,P24E1102 在钙流测定中也显示出在较高浓度下更完全的抑制,如图 2 所示。 [0569] 实施例9:食蟹猴中性粒细胞性肺部炎症 [0570] 动物中的标准哮喘模型模仿以肺部嗜酸性粒细胞增多和局部细胞因子如 IL-4、IL-5 和 IL-13 为特征的 T2 高内型。 T2 高哮喘存在多种疗法。 以肺部中性粒细胞增多和局部细胞因子(如 IL-1、IL-6 和 TNF)产生为特征的非 T2 高哮喘可占哮喘病例的 50%,代表着未满足的重大医疗需求。 该模型使用已知的哮喘抗原并代表非 T2 高哮喘的特征。 [0571] 连续 5 天每天将食蟹猴暴露于雾化的屋尘螨提取物 (HDM)。 最后一次 HDM 暴露后的第二天,进行支气管肺泡灌洗并评估支气管肺泡灌洗液 (BALF) 的细胞数量和细胞因子含量(图 3A)。 首次接触 HDM 前一天,猴子(n=5/组)通过皮下注射接受 10 mg/kg 的抗 PAR-2 抗体或安慰剂。 [0572] 暴露于 HDM 导致 BALF 嗜中性粒细胞(图 3B)、IL-1β(图 3C)、IL-6(图 3D)和 TNF 增加的趋势(图 3E)显着增加。 [0573] 用抗 PAR-2 治疗显着抑制嗜中性粒细胞(图 3B)、IL-1β(图 3C)、IL-6(图 3D)和 TNF(图 3E)的诱导。 [0574] 实施例 10. P24E1102 显着降低非人类灵长类动物对蛔虫的过敏反应 [0575] 食蟹猴 (Macaca fascicularis) 食蟹猴 )) 作为一种肠道寄生虫,猪蛔虫 ( 猪蛔虫 )被敏感到 这是研究过敏原引起的气道即时哮喘反应的既定模型(Weiszer, I., et al (1968). Ascaris hypersensitivity in the rhesus monkey. I. A model for the study of immediate type hypersensitivity in the primate J. 过敏 . 41:14-22; 摄影机等。 (2018) Toll 样受体 7/8 配体 S28463,抑制 猪蛔虫 -在非人类灵长类动物中诱发的过敏性哮喘。 美国呼吸细胞分子生物学杂志 . 58(1):55-65)。 猴子中的蛔虫暴露会诱导强烈的 Th2 偏向 T 细胞记忆反应和 IgE 水平升高。 随后对蛔虫提取物敏感的猴子进行气道刺激会导致即刻和晚期哮喘反应,随后出现气道嗜酸性粒细胞增多和高反应性。 [0576] 在第 0 天和第 14 天皮下给予食蟹猴 1 mg A. 和 1 mg 明矾佐剂。 在用 Suum 抗原致敏后,在 3 周的过程中每周进行一次吸入蛔虫攻击(第 28 天 5 mg/ml 5 分钟;第 35 和 42 天 5 mg/ml 30 秒)。 根据致敏结果,将猴子分成 4 组,并在蛔虫攻击前 4-7 天给予载体、氟替卡松或 5 mg 和 10 mg 抗 PAR2 抗体 P24E1102。 在约 90 天时,给予蛔虫并用气胸器(3500 系列 [0-35 L/min];Hans Rudolph)和放置在气管插管前的压差传感器 (Validyne) 对肺进行给药。测量阻力。 如表 14 所示,5 mg P24E1102 显着 (p<0.05) 将蛔虫引起的肺阻力降低至与广谱类固醇氟替卡松所达到的水平相当的水平。 然而,10 mg 剂量并没有显着降低肺阻力。 数据分布如图4所示。 当检查个体动物时,10 mg 剂量组中缺乏反应完全可以用两只无反应的动物来解释。 正在进行额外的实验。 如果不包括 10 mg/kg,根据 Tukey 的事后分析,结果也很重要。 [0577] 表 14. 接触过敏原后肺阻力的百分比变化 [0578] [0579] 每只猴子中的数字标准化为过敏原前抵抗。 与车辆相比,P 是具有 LSD 验尸的单向方差分析。 *p<0.05,**p<0.01。 [0580] 这些结果进一步证明,与阻断配体激活的 PAR2 受体位点结合的抗体可以治疗哮喘模型中的急性高反应性,并且预计对人类哮喘患者有效。 [0581] 实施例 11. hPAR2 敲入大鼠皮肤病模型中的 P24E1102 [0582] 背景 [0583] PAR2 和皮肤蛋白酶与特应性皮炎的发病机制有关(Lee, S. E., et al., Yonsei Med J, 51:808-822 (2010),PAR-2 基因敲除小鼠在过敏性皮炎模型中减少了水肿(Kawagoe, J. 等人, 日本药理学杂志 , 88:77-84 (2002)。 PAR2 与慢性瘙痒症(Akiyama, T., et al., Handb Exp Pharmacol, 226:219-235 (2015))和皮肤瘙痒症和炎症(Choi and Nardo, Semin 免疫病理学 (2018) 40(3):249-259)。 据报道,结合 PAR2 的 N 末端结构域并阻断蛋白酶介导的 PAR2 激活的抗体可阻断小鼠瘙痒症模型中的抓挠 (WO2011031695A1)。 [0584] hPAR2敲入大鼠的构建。 [0585] 按照Li et al (2013)描述的方法构建敲入大鼠。 使用 CRISPR-Cas 系统在大鼠中同时产生和种系传递多个基因突变。 文学 [ 纳特生物科技 . 31(8):684-6]。 简而言之,制备了一个小的导向 RNA/CRISP/Cas9 复合体,位于大鼠 F2rl1 基因编码区的侧翼区域,以及一个包含具有适当 5' 和 3' 同源臂的人 F2Rl1 基因编码区的质粒。并共同注射到单细胞期胚胎中,然后转移到假孕雌性大鼠体内。 Cas9 介导的切除和同源重组的组合导致了表达人类 PAR2 的创始动物。 将选定的祖细胞与野生型大鼠回交,并将产生的杂合后代杂交以产生人类 PAR2 纯合动物。 [0586] 恶唑酮引起的急性皮炎 [0587] 恶唑酮(一种有效的半抗原)的多次透皮给药可诱导慢性 Th2 超敏反应,类似于早期人类特应性皮炎的特征。 临床上,该模型的特征是耳朵增厚/水肿、出血、擦伤和苔藓样变。 PAR2 与特应性皮炎的急性和慢性模型有关。 首先进行急性模型,因为这种类型的模型报告了 PAR2 基因敲除小鼠的水肿减少。 [0588] 在致敏阶段的第 0 天(n=8),将恶唑酮经皮给药至人类 PAR2 敲入大鼠的剃毛腹部区域(Owen,2013)。 在第 7 天,大鼠接受单剂量 30 mg/kg P24E1102 IV、30 mg/kg MOPC IV。 从第 7 天到第 9 天每天口服 PO 地塞米松 0.1 mg/kg。 在第 7 天,即给药后 1 小时,大鼠在右耳接受 1.6% 恶唑酮的单次局部给药。 左耳以相同的方式用恶唑酮载体(丙酮/橄榄油)处理。 治疗结果由耳卡尺测量和耳芯重量评估确定。 功效评估基于左右耳卡尺差异和曲线下面积 (AUC) 计算。 [0589] 如图 5 所示,P24E1102 和 MOPC 均不能逆转恶唑酮诱导的大鼠急性皮炎。 由于 P24E1102 在其他疾病模型中显示出疗效,并且之前的皮炎模型表明 PAR2 与皮炎之间存在联系,因此急性皮炎模型中缺乏反应可能反映了这种由 Th1 反应驱动的急性皮炎模型的特定特征。 恶唑酮的多次透皮给药将模型从 Th1 显性模型转变为慢性 Th2 炎症模型。 抗体将在慢性模型中进行重新测试,还将评估其他功效指标,例如抓挠活动。 [0590] 咪喹莫特诱发的银屑病 [0591] 咪喹莫特 (IMQ) 通过激活 Toll 样受体 7 TLR7 和 8 来刺激先天免疫系统。 每天在啮齿动物的背部局部涂抹 IMQ 会诱发类似于斑块状银屑病的炎症性鳞状皮肤损伤。 这些病变表现出表皮增生增加、异常分化、表皮微脓肿中嗜中性粒细胞积聚、新生血管形成,以及由 CD4(+) T 细胞、CD11c(+) 树突状细胞和浆细胞样树突状细胞组成的浸润。 角质形成细胞和 T 细胞可被视为该模型的驱动因素,它们存在于皮肤的表皮层中。 PAR2 在皮肤的表皮层表达,许多能够激活 PAR2 的蛋白酶来自皮肤的内源性来源,包括角质形成细胞和免疫细胞。 [0592] 考虑到这种皮肤状况的复杂性,IMQ 模型被认为是牛皮癣模型,也是特应性皮炎的模型。 此外,由于 IMQ 引起的瘙痒,该模型也可用于研究治疗对抓挠和神经炎症反应的影响。 [0593] 5% Aldara Cream (IMQ)(含 37.5 mg/cm 的凡士林) ² ) 连续 9 天(即第 1 天至第 9 天)应用于大鼠剃光的背部皮肤(N = 5)。 对照大鼠连续 9 天接受载体(凡士林)(N=5)。 IMQ 处理的大鼠在应用凡士林或 IMQ 之前的第 1、3 和 5 天立即接受静脉注射 30 mg/kg 的 P24E1102 或 30 mg/kg MOPC21 同种型对照。 在第 10 天评估大鼠的炎症严重程度和背部皮肤的抓挠行为(图 6A-6B)。 [0594]银屑病面积和严重程度指数 (PASI) 是衡量银屑病皮损皮肤外观(红斑、鳞屑和增厚)严重程度的总体定量总分。 IMQ 处理的大鼠的 PASI 明显高于媒介物处理的大鼠(图 6A),并且在雄性和雌性大鼠中相似。 P24E1102 显着降低了 PASI 分数(未配对学生 T 检验,p<0.05)。 同时,MOPC 也显着降低了 PASI。 这种同种型效应可能是由于一些非特异性非抗原依赖性 mAb 结合,因为 MOPC 在啮齿动物中不具有靶抗原特异性。 为了区分由 PAR2 结合引起的影响与可能由 Fc 部分引起的影响,将在模型中测试 P24E1102 的 F(ab)2 衍生物。 [0595] 抓挠是牛皮癣的常见行为,抓挠可以通过“抓挠发作”来测量,定义为后爪向 IMQ/凡士林治疗区域接触的一个或多个快速运动。 在将刮擦程度量化为 120 分钟观察期内的抓挠发作总数后,对视频录制期间进行被动评分。 在这里,IMQ 比载体增加了更多的抓挠发作(图 6B)。 MOPC 没有显着减少抓挠,但 P24E1102 显着(未配对的学生 T 检验,p<0.05)将抓挠减少到 IMQ 治疗大鼠的水平以下以及载体治疗大鼠的以下水平。 [0596] 这些数据表明 P24E1102 减轻了抓挠行为,这是瘙痒的代表。 许多病症,例如特应性皮炎和牛皮癣,会导致慢性瘙痒症,并且是尚未解决的主要临床问题。 P24E1102 似乎具有针对局部炎症和瘙痒处理敏感性的止痒特性。 [0597] 实施例 12:P24E1102 调节疼痛反应 [0598] PAR2 刺激正向调节野生型大鼠神经元中的辣椒素受体 TRPV1 [0599] 瞬时受体电位阳离子通道亚家族 V 成员 1 (TRPV1)(也称为辣椒素受体和香草素受体 1)可被包括辣椒素在内的多种刺激激活。 [0600] 为了了解 PAR2 和疼痛受体之间的潜在相互作用,从野生型大鼠的脊柱中分离出背根神经节 (DRG)。 分离的 DRG 神经元被镀在涂有聚赖氨酸 + 层粘连蛋白的盖玻片上,并储存在补充有 100 ng/ml NGF 的 F12 培养基中。 电镀后 24-48 小时,使用钙敏感染料 Fura-2 检测钙通量以响应 TRPV1 敏化,有或没有 PAR2 激活。 简而言之,将 DRG 神经元与辣椒素(一种特定的 TRPV1 激动剂)一起孵育 1 分钟,然后测量钙通量。 在 17 分钟的清除期后,DRG 暴露于第二次应用辣椒素 1 分钟,之前有或没有通过 LIGRLO 5 μM 激活 PAR2 2 分钟。 [0601] 加入 50 nm 辣椒素 1 分钟可诱导瞬态钙信号,通过 340 和 380 nm 处的信号比检测。 在 17 分钟的清除期后,第二个辣椒素(50 nm,持续 1 分钟)诱导钙信号触发。 对于每个单独的神经元,与第一个信号相比,第二个钙信号减少、稳定或增加。 如图 7A 所示,添加 LIGRLO 导致神经元数量增加约 2 倍,从而增加了对第二剂辣椒素的反应。 这种增加在致敏阈值范围内(20% 到 300%)是稳定的。 [0602] 图7B和7C显示了DRG神经元响应第二次辣椒素刺激的信号分布。 在没有 LIGRLO 的情况下,大多数 DRG 相对于信号 1 显示出稳定或减弱的信号 2。 当将 5 μM 的 PAR2 激动剂 LIGRLO 添加到 DRG 时,表现出增加的敏感性的神经元数量从 19.5% 增加到 38.5%,更少的 LIGRLO 刺激的神经元表现出降低或稳定的信号水平(独立样本 t 检验,p < 0.05 ). [0603] 这些数据表明 PAR2 激活导致 TRPV1 通道敏感化。 [0604] P24E1102 抑制从 huPAR2 敲入大鼠分离的 DRG 中 LIGRLO 诱导的 TRPV1 致敏。 [0605] 从 huPAR2 敲入大鼠培养的成纤维细胞暴露于 LIGRLO,并在 Fura-2 存在的情况下测试钙流。 P24E1102 以剂量依赖性方式抑制钙流动(数据未显示)。 [0606] DRG 是从 hPAR2 敲入大鼠中分离出来的,在野生型大鼠中进行培养并进行 PAR2 激活的 TRPV1 致敏方案,如上所述。 在 LIGRLO 孵育前 2 小时开始用 P24E1102 (500 nM) 预处理 DRG 神经元,在不存在 P24E110 的情况下,显示对第二次应用辣椒素的反应增加的神经元数量从 22.05% 减少到 11.2%(图 8A)。 个体反应的幅度没有显着降低(数据未显示)。 [0607] 检查反应的分布,与未使用 P24E1102 的神经元相比,使用 P24E1102 处理的神经元对第二次辣椒素刺激的反应减少或稳定(图 8C)(图 8B,非配对 t 检验,p < 0.05)。 [0608] 这些数据表明,与 PAR2 受体位点结合的抗体可阻断配体结合并减轻 PAR2 配体在疼痛反应中的作用。 因此,结合 PAR2 受体位点的抗体可用于治疗疼痛和相关病症。 [0609] 实施例13:PAR2抗体对癌症的抑制 [0610] 抗体和 PAR2 刺激对癌细胞生长的影响 [0611] 为了评估 PAR2 和癌症进展之间的潜在串扰,以下癌细胞系:MCF-7(乳腺癌)(图 9A)、MDA-231(转移性乳腺癌)(图 9B)、Hep-G2(肝癌) (图9C)和A549(肺癌)(图9D)以2000个细胞/孔接种在96孔板中。 接种后 24 小时,用 PAR2 激活肽 SLIGKV (27 μM) 处理细胞,有或没有 2 小时 P24E1102 (0-2000 nM) 预处理。 3-9 天后,用 Hoechst 33342(细胞核)和钙黄绿素(细胞质)对细胞进行活染色。 然后使用高含量显微镜分析增殖和形态学参数。 [0612] 数据(图 9A-9D)显示,与未处理的细胞相比,用 P24E1102 处理的细胞表现出略微降低(~20-40%)的生存力。 这适用于 SLIGKV 处理的细胞和没有 PAR2 刺激的细胞。 在 MCF-7 乳腺癌细胞中观察到最高效果(图 9A)。 [0613] PAR2抗体抑制癌症转移 [0614] 在 SLIGKV (270 μM) 处理后,Hep-G2 细胞表现出与转移潜能一致的形态学变化。 简而言之,在 PAR2 激活(通过 SLIGKV)之后,与未处理的细胞(图 10A)相比,Hep-G2 细胞显示出更多的细胞突起(类似于片状伪足和丝状伪足)(图 10B)。 PAR2 激活还促进细胞脱离和从细胞簇迁移,如 SLIGKV 处理后分散的细胞数量所证明的那样(图 10B)。 P24E1102 以剂量依赖性方式阻断 PAR2 依赖性效应(图 10C、D)。 在 2000 nM 时达到完全抑制(图 10D)。 [0615] P24E1102 在 SLIGKV 存在下的剂量依赖性抑制通过具有突起的细胞的百分比(图 10E)、每个细胞的平均长出物数(图 10F)、如分散细胞数所示的细胞迁移(图 10E) 来证明。 10G) 和细胞簇。量化为总面积 (图 10H)。 [0616]PAR2 与癌症转移有关,包括最近的一项研究表明,PAR2 表达与肝切除术后肝细胞癌患者的较差预后相关(Tsai 等人,蛋白酶激活受体 2 在肝切除术后肝细胞癌中的作用。 医学 2021 年 6 月:57(6):574)。 上述实验首次证明 PAR2 刺激似乎直接刺激转移行为,并且这种转移行为可以通过抑制 PAR2 来阻断,包括抑制配体与 PAR2 的结合。 抑制PAR2抑制癌症转移的能力表明包括P24E1102在内的PAR-2拮抗剂可能对癌症治疗有用。 [0617] 实施例14:PAR2抗体抑制PAR2相关基因表达的诱导 [0618] 使用 Clariom GOScreen 高通量转录组分析评估 PAR2 相关基因表达谱。 简而言之,原代人肺动脉平滑肌细胞 (HPASMC)、原代人真皮成纤维细胞和 A549 人肺癌细胞系单独使用 SLIGKV (400 μM) 或在 P24E1102 (500 nM) 存在的情况下(在 SLIGKV 前 2 小时给药) ). 使用 Afymetrix RNAchip 技术裂解细胞并提取 mRNA 以揭示基因表达模式。 与对照条件(无 SLIGKV 或抗体)相比,HPASMC、真皮成纤维细胞和 A549 细胞中分别有 729、875 和 426 个基因受到 SLIGKV 的影响(至少 +/-2 倍变化)。 浓度为 500 nM 的 P24E1102 显着减少了这些 SLIGKV 驱动的变化,如表 15 所示。 [0619] 表 15. PAR2 激动剂存在下的差异基因表达被 PAR2 抗体逆转 [0620] [0621] 对来自表 15 的差异表达(即 SLIGKV 对比 SLIGKV + P24E1102)数据进一步分析相关疾病途径。 使用 Transcriptome Analysis Console (TAC) 和 DAVID Gene Ontology (GO) 软件分析 Clariom GO Screen 数据。 这允许进行探索性分组分析和鉴定簇或分组之间的基因表达差异。 KEGG、GAD 和 WikiPathway 数据库用于分析。 [0622] HPASMC 中的差异表达基因 [0623] 通路富集分析明确鉴定了 IL-18 信号通路(44 个基因,26 个向上,18 个向下,p=0.008506)。 有大量证据表明 IL-18 在多种感染、代谢或炎症性疾病中发挥作用,例如流感病毒感染、动脉粥样硬化、心肌梗塞、慢性阻塞性肺病或克罗恩病。 (卡普兰斯基。 免疫学 2018 年 1 月;281(1):138-153)。 此外,调节抗氧化蛋白表达的 NRF2 通路(41 个基因,25 个向上,16 个向下,p=0.052)被上调,该抗氧化蛋白可防止损伤和炎症引发的氧化损伤。 [0624] 使用基因关联数据库(DAVID 平台)对 HPASMC 中差异表达的基因进行疾病注释,确定了 26 个与哮喘特异性相关的基因和 14 个与关节炎/类风湿性关节炎相关的基因。 [0625] 人皮肤成纤维细胞中差异表达的基因 [0626] 使用基因关联数据库(DAVID 平台)对人真皮成纤维细胞中差异表达基因进行疾病注释,确定了 16 个与哮喘和病毒|呼吸道合胞病毒感染特异性相关的基因。 [0627] 人皮肤成纤维细胞中差异表达的基因 [0628] A549细胞中差异表达基因的通路富集分析如图11所示。 已经观察到 SLIGKV 介导的 PAR2 激动作用,特别是在与能量代谢、免疫、信号通路癌症和血管调节相关的通路中。 浓度为 500 nM 的 P24E1102 显着减少了每个通路中大多数或所有基因的 SLIGKV 驱动的这些变化。 [0629] A549细胞差异表达基因 [0630] 使用 DAVID 对 A549 中差异表达基因的疾病注释包括肺部疾病、肾脏疾病、代谢疾病、心血管疾病和几种癌症。 有4种肺部疾病:囊性纤维化(8个基因)、普通肺部疾病(8个基因)、哮喘(20个基因)和慢性阻塞性肺病(20个基因)。 P24E1102 完全逆转了这些基因中每一个的差异调节。 结果突出了 P24E1102 治疗这些疾病的潜力。 [0631] 本发明的范围不受本文描述的具体方面的限制。 实际上,根据前面的描述和附图,除了所描述的那些之外,本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。 这样的修改旨在包括在所附权利要求的范围内。 [0632] 提供本文引用的所有参考文献(例如,出版物或专利或专利申请),以便为所有目的将每个单独的参考文献(例如,出版物或专利或专利申请)通过引用整体并入,如同单独地一样。指出,出于所有目的,其全部内容通过引用并入本文。