CN112877312B 有效 一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法及其应用
1.重组丝氨酸蛋白酶应用于花鲢鱼肉蛋白水解并获得具有抗氧化活性酶解产物的用途,其特征在于,操作步骤如下:
(1)取菌株Planococcus dechangensis XJ11经活化培养后,离心收集菌体,用CTAB法提取Planococcus dechangensis XJ11的基因组DNA;
(2)基于丝氨酸蛋白酶的基因序列,设计特异性PCR扩增上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4,其中上游引物中CATATG和下游引物中CTCGAG分别为BamH I和Xho I酶切位点,pET-22b(+)质粒的上下游同源臂分别为TAAGAAGGAGATATA和GTGGTGGTGGTGGTG;
以步骤(1)中获得的Planococcus dechangensis XJ11基因组DNA为模板,Q5超保真聚合酶为PCR扩增酶,进行扩增丝氨酸蛋白酶基因序列,得到PCR扩增产物;
(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)中PCR扩增产物的大小,利用胶回收的方式将990bp的条带进行回收,得到回收的PCR产物;
(4)利用一步克隆的方法将步骤(3)中回收的PCR产物与线性化后的质粒pET-22b(+)进行连接,构建得到重组表达质粒,并将重组质粒导入大肠杆菌BL-21(DE3)化学感受态细胞中,以获得重组工程菌;
(5)将步骤(4)得到的重组工程菌接种至LB液体培养基中,培养至OD600为0.6~1.0时,加入诱导剂IPTG进行过夜诱导;取诱导后的菌液,离心收集菌体,并将菌体重悬于Tris-HCl缓冲液,得到菌体悬浮液;然后在冰浴条件下对菌体悬浮液进行超声破碎,超声破碎处理后离心收集上清液,利用亲和层析NI-NTA柱对上清液进一步纯化,获得重组丝氨酸蛋白酶;
(6)称取花鲢鱼肉,加入以质量体积比为1:10加入蒸馏水进行匀浆,向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶,浓度为1000~10000U/g蛋白,在35℃酶解5h,离心后收集酶解上清液,获得具有抗氧化活性酶解产物。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述菌株Planococcusdechangensis XJ11保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏日期为2019年1月2日,编号为CGMCC NO.17059。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述活化培养的流程为:从-80℃冰箱中取出甘油保藏的菌株Planococcus dechangensis XJ11,用接种环蘸取菌液,划线于Gibbons固体培养基平板上,将平板倒置于15℃的恒温培养箱中培养48h;培养后用接种环从平板上挑取单菌落,接种至50ml的Gibbons液体培养基中,于15℃,180rpm条件下培养48h,完成活化培养。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述离心的条件为:10000rpm离心2min。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(2)中所述PCR扩增程序如下:预变性:95℃、5min,变性:94℃、30s,退火:55℃、30s,延伸:72℃、15s,终延伸:72℃、10min,34个循环。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(5)中所述重组工程菌的接种量为1%-2%,即占LB液体培养基体积的1%-2%。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(5)中所述培养的条件为:35-37℃,180-200rpm;所述诱导剂IPTG加入后的终浓度为0.5mM;所述过夜诱导的条件为:温度25℃,转速120rpm;所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mM,pH为8.0。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(5)中所述超声破碎的操作为:超声功率40%,超声3s,间隙5s,超声时间共15min;所述超声破碎处理后离心的条件为:温度4℃,10000rpm离心10min。
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