CN115926134A
审中
一种阳离子聚酯及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本申请涉及核酸递送材料技术领域，特别是涉及一种阳离子聚酯及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]基于核酸药物递送的基因疗法被认为将引领生物医药的第三次产业变革。其中，相较于DNA或病毒载体等其它技术，mRNA技术具有高效性、安全性高、生产周期更短、生产成本更低等优势。mRNA技术已经在新冠疫苗领域一战成名，并且，还有望为癌症和免疫疾病等多个领域带来新方法。然而，由于mRNA分子的不稳定性及体内递送效率低等原因，该技术的应用一直受到限制。要实现mRNA技术的广泛应用，就需要有合适的递送载体将其递送至体内，才能有可实用的效果。目前商业化成功的递送技术主要是Moderna和Biotech等公司所用的基于可电离阳离子脂质的脂质纳米颗粒(LNP)技术。虽然LNP已被广泛用于新冠疫苗；但是，LNP相对低效率和显著副作用的不足，极大的限制其应用范围。因此如何开发新的高效无毒的递送系统依然是抑制mRNA技术发展的瓶颈问题。
[0003]美国耶鲁大学之前报道了一种可用于DNA和mRNA递送的生物可降解阳离子聚酯及其制备方法。该制备方法基于体外合成生物学技术，通过固定化脂肪酶催化3种单体聚合得到线性聚合物，对其直接使用或进行端基修饰，即可以用于DNA和mRNA递送的生物可降解阳离子聚酯。相比于商业试剂，耶鲁大学的阳离子聚酯具有更高的转染效率和更低的毒性。然而，该阳离子聚酯转染效率依然不够，并且，需要用有毒有机溶剂溶解，使其难以用于实际临床。
[0004]因此，如何研发转染效率更高、无毒或毒性更低的核酸递送材料仍然是本领域的研究重点和难点。
发明内容
[0005]本申请的目的是提供一种新的阳离子聚酯及其制备方法和应用。
[0006]为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
[0007]本申请的第一方面公开了一种阳离子聚酯，其为单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物，并且超支化聚合物的端基具有基团E修饰；单体P为环内酯；单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体M为含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。
[0008]需要说明的是，P、S、M三种单体聚合得到线性聚合物和端基的基团E修饰，是耶鲁大学已经报道过的技术；本申请在此基础上研究发现，在三种单体中再加入一种单体T，或者，直接采用单体T替换单体M，能够聚合得到一种新的具有超支化结构的聚合物，即本申请的新的阳离子聚酯。并且，研究发现，本申请的阳离子聚酯用于核酸递送时，不仅能够显著提高基因转染效率，而且细胞毒性更低，能够更好的满足临床使用。
[0009]本申请的一种实现方式中，单体P为脂肪链长度6至35的环内酯。
[0010]本申请的一种实现方式中，单体P选自但不仅限于环己内酯、环十二烷内酯、环十五烷内酯和环十六烷内酯中的至少一种。
[0011]本申请的一种实现方式中，单体S为碳链长度3至18的有机酸。
[0012]本申请的一种实现方式中，单体S选自但不仅限于己二酸、癸二酸和1,2,3-丙烷三甲酸中的至少一种。
[0013]本申请的一种实现方式中，单体M为碳链长度4至36的含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物。
[0014]本申请的一种实现方式中，单体M选自但不仅限于二乙醇胺、甲基二乙醇胺和乙基二乙醇胺中的至少一种。
[0015]本申请的一种实现方式中，单体T为碳链长度4至54的含有三个或三个以上羟基的化合物。
[0016]本申请的一种实现方式中，单体T选自但不仅限于三羟甲基丙烷、3-(羟甲基)-1,5-戊二醇、三乙醇胺、N,N,N’,N’-四羟乙基乙二胺中的至少一种。
[0017]本申请的一种实现方式中，提供基团E修饰的端基修饰化合物E为E1至E26中的至少一种。
[0018]优选的，端基修饰化合物E为E1至E10、E12、E14至E21、E25、E26中的至少一种。
[0019]更优选的，端基修饰化合物E为E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25、E26中的至少一种。
[0020]需要说明的是，本申请采用端基修饰化合物E1至E26进行端基修饰的阳离子聚酯都具有较好的转染效率和较低的细胞毒性；尤其是，E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25、E26端基修饰的阳离子聚酯转染效率明显优于其他端基修饰的阳离子聚酯，也明显优于当前效率最高的商业转染试剂LipoMM。
[0021]本申请的一种实现方式中，阳离子聚酯为式一所示结构的超支化聚合物；
[0022]式一
[0023]
[0024]其中，x、y、z为1至200的独立整数，
[0025]n为0至200的整数，
[0026]j、k为0至30的整数，
[0027]l、m、o、p、q为1至20的独立整数，
[0028]Rx为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；
[0029]J为氢，R1为端基修饰化合物E提供的基团E修饰，此时没有R2；或者，J为羰基，此时R1和R2两者都是端基修饰化合物E提供的基团E修饰；
[0030]式一中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为P或S，后续连接其他单体形成超支化结构。
[0031]其中，连接其他单体是指，例如，后续按照式一的顺序连接单体，在分支结构的基础上再形成支化结构，如此循环，形成类似树枝状的超支化结构。
[0032]需要说明的是，本申请的R1和/或R2为端基修饰化合物E提供的基团E修饰，在端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基基团E修饰时，端基修饰化合物E会减少一个氢，形成基团E结合在超支化聚合物的端基。在采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)作为偶联剂时，会同时在式一所示的超支化聚合物的两端都形成基团E的端基修饰；此时为了将基团E连接到超支化聚合物上，在端基R2的位置处，CDI会提供一个羰基用于连接基团E和超支化聚合物；R1位置处仍然是端基修饰化合物E会减少一个氢，形成基团E，直接与超支化聚合物连接。
[0033]还需要说明的是，在只有单体P、S与单体T聚合形成超支化聚合物时，即n为0，此时J如果为羰基，羰基一端连接R2，另一端连接单体T的羟基，形成端基的基团E修饰。可以理解，这种情况下，式一所述通式的结构会适应性的调整，即单体T在末端，与羰基J相连。
[0034]本申请的一种实现方式中，阳离子聚酯的数均分子量为1-30k；优选为2-20k。
[0035]本申请的第二方面公开了本申请的阳离子聚酯的制备方法，包括将各单体和催化剂加入溶剂中，在惰性气氛中依序进行第一阶段聚合反应和第二阶段聚合反应，反应完成后，去除催化剂，获得超支化聚合物；然后，在偶联剂的作用下，采用端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基修饰，获得端基具有基团E修饰的阳离子聚酯；其中，第一阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度50～1000mbar，反应时间12～24h；第二阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度1-30mbar，反应时间12～72h。
[0036]本申请的一种实现方式中，单体P和单体S的摩尔比为0.1:10～4:1，单体M和单体S的摩尔比为0:10～20:10，单体T和单体S的摩尔比为0.1:10～20:10。
[0037]本申请的一种实现方式中，催化剂为固定化脂肪酶。
[0038]本申请的一种实现方式中，固定化脂肪酶的用量为各单体总质量的3-50wt％。
[0039]本申请的一种实现方式中，溶剂为二苯醚、正十二烷、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、二甲基乙酰胺和邻苯二甲醚中的至少一种。
[0040]本申请的一种实现方式中，溶剂的用量为各单体总质量的100-500wt％。
[0041]本申请的一种实现方式中，去除催化剂，具体包括，反应结束后用过滤装置对反应液进行过滤，收集滤液；获得超支化聚合物，具体包括，向滤液中加入正己烷，使超支化聚合物析出，离心，去上清液，沉淀加入二氯甲烷溶解，再加入正己烷使超支化聚合物析出，离心，去上清液，重复采用二氯甲烷溶解、正己烷析出、离心至少2次；最后，将沉淀干燥，即获得超支化聚合物。
[0042]本申请的一种实现方式中，偶联剂为N,N’-羰基二咪唑、碳化二亚胺类、磷正离子类和脲正离子类中的至少一种。
[0043]本申请的一种实现方式中，碳化二亚胺类包括但不限于二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
[0044]本申请的一种实现方式中，磷正离子类包括但不限于苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；脲正离子类包括但不限于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸。
[0045]本申请的一种实现方式中，偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为2:1～50:1；优选的，偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为4:1～15:1；另外，偶联剂和端基修饰化合物E的摩尔比为5:1～1:10。
[0046]本申请的一种实现方式中，采用端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基修饰，具体包括，将超支化聚合物溶于二氯甲烷中，加入偶联剂，在惰性气氛中，室温搅拌至少10h，将反应液浓缩后，加入至少3倍体积的乙醚，离心，去除沉淀，获得上清液；将去除上清液中的溶剂，将干燥的产物加入二氯甲烷中溶解，在搅拌下加入端基修饰化合物E，室温反应至少10h，获得端基具有基团E修饰的超支化聚合物，即本申请的阳离子聚酯。
[0047]本申请的一种实现方式中，本申请的制备方法还包括，在加入端基修饰化合物E室温反应结束后，向反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相；重复加等体积去离子水、涡旋、离心分层、除去上层水相操作至少3次；最后，加入至少3倍体积的正己烷，涡旋、离心，去上清液，将沉淀物干燥，即获得端基具有基团E修饰的超支化聚合物，即本申请的阳离子聚酯。
[0048]本申请的第三方面公开了本申请的阳离子聚酯在核酸药物递送中的应用。
[0049]本申请的一种实现方式中，核酸药物包括但不仅限于mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA。
[0050]需要说明的是，本申请的关键在于，研究发现了一种新的核酸药物递送材料，即本申请的阳离子聚酯；采用本申请的阳离子聚酯进行核酸递送，不仅转染效率高，而且细胞毒性小，能够更好的满足临床使用需求。可以理解，本申请的阳离子聚酯由于其细胞毒性小，不仅能够用于核酸递送，也能够用于其他类似的、需要向细胞内递送物质的操作。
[0051]本申请的一种实现方式中，核酸药物递送包括，采用所述阳离子聚酯包裹核酸药物，将其递送到细胞内。
[0052]本申请的一种实现方式中，细胞的种类包括但不限于HEK293T、A549、HeLa、U87、HUVEC、Jurkat、RAW264.7、iPSC和MSC。
[0053]本申请的第四方面公开了一种核酸递送颗粒，包括包裹材料和包裹于包裹材料内的核酸；包裹材料为本申请的阳离子聚酯或者包裹材料中至少包含本申请的阳离子聚酯；核酸为mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA中的至少一种。
[0054]需要说明的是，本申请的核酸递送颗粒，由于采用本申请的阳离子聚酯，不仅能够提高转染效率，而且对细胞毒性较小，具有更好的临床应用前景。可以理解，本申请核酸递送颗粒的关键在于采用本申请的阳离子聚酯，至于具体的包埋方法和核酸递送方法可以参考现有技术。
[0055]还需要说明的是，本申请的包裹材料可以根据包裹层的不同设计或需求，还包含本申请阳离子聚酯以外的其他材料，在此不作具体限定。可以理解，只要含有本申请的阳离子聚酯，都可以在一定程度上提高转染效率并减小细胞毒性。
[0056]本申请的一种实现方式中，核酸递送颗粒的粒径为30-500nm。
[0057]本申请的第五方面公开了一种核酸药物递送的试剂盒，包括以下组分中的至少一种：
[0058](a)本申请的阳离子聚酯；
[0059](b)本申请的核酸递送颗粒。
[0060]需要说明的是，本申请的核酸药物递送的试剂盒，可以是已经包埋好的某种特定核酸药物的试剂盒，也可以是本申请的阳离子聚酯，使用者根据需求自行设计和包埋相应的核酸药物。可以理解，本申请试剂盒的关键在于含有本申请的阳离子聚酯或核酸递送颗粒，至于核酸递送所需的其他常规试剂，例如一些脂质或聚合物材料等，可以参考现有技术或市售购买获得。当然，为了使用方便，也可以将部分试剂组合到本申请的试剂盒中，在此不作具体限定。
[0061]本申请的第六方面公开了一种在核酸药物递送中提高转染效率的方法，包括采用本申请的阳离子聚酯或者含有本申请阳离子聚酯的包裹材料，对核酸药物进行包裹，形成核酸递送颗粒，利用核酸递送颗粒对核酸药物进行细胞转染。
[0062]需要说明的是，本申请的方法，关键在于采用本申请的阳离子聚酯提高转染效率；本申请的一种实现方式中，本申请阳离子聚酯的mRNA递送效率显著优于原有的线性聚合物及现有最佳商用mRNA转染试剂，且细胞毒性更低。并且，本申请阳离子聚酯可溶于乙醇，可更好的用于临床，具有极大的实际应用前景。可以理解，本申请提高转染效率的方法，其关键在于使用本申请的阳离子聚酯，至于细胞转染的其他操作和试剂，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。
[0063]还需要说明的是，本申请提高转染效率的方法，可以直接采用本申请的阳离子聚酯作为包裹材料，也可以在现有的包裹材料中添加本申请的阳离子聚酯；可以理解，只要含有本申请的阳离子聚酯都能不同程度的提高转染效率。
[0064]本申请的阳离子聚酯，或者本申请的核酸递送颗粒，或者本申请的试剂盒能够用于核酸药物递送的疾病治疗；例如，在体内施用核酸药物时，可以采用本申请的阳离子聚酯或者含有本申请阳离子聚酯的包裹材料，对核酸药物进行包裹，形成核酸递送颗粒，利用核酸递送颗粒进行核酸药物递送；或者，直接使用本申请的核酸递送颗粒对核酸药物进行递送。
[0065]需要说明的是，本申请的施用方法，其关键在于采用阳离子聚酯或核酸递送颗粒进行核酸药物递送，至于体内递送的具体操作以及所需要的其他辅助材料，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。
[0066]由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0067]本申请的阳离子聚酯，在单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体的基础上增加单体T，利用单体T与其他单体聚合获得一种新的具有超支化结构的聚合物。本申请的阳离子聚酯可溶于乙醇，用于核酸递送时，不仅能够显著提高转染效率，而且细胞毒性更低，能够更好的满足临床使用需求。
附图说明
[0068]图1是本申请实施例中超支化聚合物及端基基团E修饰的合成路线图；
[0069]图2是本申请实施例中HBPA-E14-3在进行端基修饰前后的谱图；
[0070]图3是本申请实施例中HBPA-E14-1和PACA-E14的GPC谱图；
[0071]图4是本申请实施例中HBPA-E14-1和PACA-E14的端基修饰E14的定量图；
[0072]图5是本申请实施例中HBPA-E14-2和mRNA的复合物的粒径测试结果；
[0073]图6是本申请实施例中不同HBPA-E在A549和HEK 293T细胞中的mRNA转染效率测试结果；
[0074]图7是本申请实施例中CDI和DIC两种不同修饰方法修饰的HBPA-E14-3及其在不同质量比条件时的mRNA转染效率测试结果；
[0075]图8是本申请实施例中不同HBPA-E在HEK 293T细胞中的DNA转染效率测试结果；
[0076]图9是本申请实施例中修饰26种不同端基E的HBPA-E在A549细胞中的mRNA转染效率测试结果；
[0077]图10是本申请实施例中聚合物和mRNA的复合物在A549细胞模型中的毒性测试结果；
[0078]图11是本申请实施例中HBPA-E在活体的mRNA转染效果测试结果。
具体实施方式
[0079]现有商用的基因递送材料转染效率不足，且毒性较大，极大的限制了基于核酸药物递送的基因疗法的广泛应用。尽管有研究报道，基于体外合成生物学技术，通过固定化脂肪酶催化P、S、M三种单体聚合得到的可生物降解的线性聚合物，具有较高的转染效率和更低的细胞毒性；但是，该线性聚合物的转染效率依然不理想，且制备的基因递送材料因需要用有毒有机溶剂溶解而难以用于实际临床。
[0080]本申请创造性的在原有三种单体聚合的基础上，增加一种新的单体T，或者利用单体T替换单体M，从而制备得到一种具有超支化结构的新型阳离子聚酯。具体的，本申请的阳离子聚酯为单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物，并且超支化聚合物的端基具有基团E修饰；单体P为环内酯；单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体M为端基含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。
[0081]本申请的阳离子聚酯，其基因转染效率显著提高，显著优于原有的线性聚合物及现有最佳商用mRNA转染试剂，且细胞毒性更低。更为重要的是，本申请的阳离子聚酯可溶于乙醇，不需要用有毒的有机溶剂溶解，易于工业放大且能够更好的满足临床使用需要，具有极大的实际应用前景。
[0082]下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0083]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0084]实施例
[0085]一、超支化聚合物(HBPA)及端基基团E修饰(HBPA-E)的合成
[0086](1)HBPA合成
[0087]本例先采用P、S、M和T四种单体聚合形成的超支化聚合物(HBPA)，然后再对HBPA进行端基基团E修饰，获得HBPA-E。具体的，本例的单体P采用环十五烷内酯(PDL)，单体S采用癸二酸(SA)，单体M采用甲基二乙醇胺(MDEA)，单体T采用三乙醇胺(TEA)，HBPA合成路线如图1的(a)图所示，本例设计了七个试验和两个对照，按照表1中四种单体P(PDL)/S(SA)/M(MDEA)/T(TEA)的投料摩尔比将原料加入圆底烧瓶中，并按总原料质量的10Wt％加入固定化脂肪酶(CALB)，最后加入原料200Wt％的二苯醚。将反应体系用氩气置换3次后，60mbar下搅拌加热至90℃反应24小时，接着2.1mbar压力下继续反应48小时。反应结束后将反应液过滤除去脂肪酶。滤液加正己烷，涡旋、离心后，倒去上清液，沉淀加二氯甲烷溶解，再加正己烷使其析出，离心，倒去上清液。上述操作重复3次。将沉淀物真空干燥一天得到HBPA。其中，两个对照合成的聚合物为线性聚合物PACA。
[0088]表1不同投料比合成的聚合物及其修饰E14的产物表征
[0089]
[0090]表1中，“a”是根据1H-NMR结果计算，“b”是根据GPC结果。
[0091](2)端基基团E修饰
[0092]本例按照表1所示，采用端基修饰化合物E14，分别采用两种不同的端基修饰方法，即分别用N,N’-羰基二咪唑(CDI)和二异丙基碳二亚胺(DIC)做偶联剂，进行聚合物的端基修饰。
[0093]修饰方法一：用CDI做偶联剂，合成路线如图1的(b)图所示，取250mg HBPA溶于5mL超干二氯甲烷(DCM)，搅拌下加入40eq的CDI。将反应体系用氩气置换3次后，室温搅拌过夜。将反应液浓缩至3mL，加3倍体积乙醚，涡旋、离心，除去沉淀物。将上清液减压旋干，加超干DCM溶解，再搅拌下加40eq的E14，室温反应24小时。反应结束后，往反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相。再加等体积去离子水，重复上述操作5次。向下层的二氯甲烷溶液中加3倍体积正己烷，涡旋、离心。将沉淀物真空干燥一天得到HBPA-E14。对于对照1则是获得PACA-E14。
[0094]修饰方法二：用DIC做偶联剂，合成路线如图1的(c)图所示，取250mg HBPA溶于5mL超干DCM中，搅拌下加入40eq的DIC和40eq的E14。将反应体系用氩气置换3次后，室温搅拌过夜。反应结束后，往反应液加等体积去离子水，涡旋、离心，除去上层水相。再加等体积去离子水，重复上述操作3次。再往下层二氯甲烷相加3倍体积正己烷，涡旋、离心。将沉淀物用少量乙醇洗涤，再真空干燥一天得到HBPA-E14，例如试验4制备获得的HBPA-E14-3-DIC。对于对照2则是得到PACA-E14-DIC。
[0095]用类似试验3的方法，本例进一步采用除E14以外的，E1至E26的25种端基修饰化合物对HBPA进行端基修饰，合成其他的HBPA-E。
[0096]E1至E26的26种端基修饰化合物如下：
[0097]
[0098]二、HBPA和HBPA-E的结构表征
[0099]HBPA和HBPA-E可以通过1H-NMR表征其分子结构。结果如表1所示，部分结果如图2所示。图2分别为试验2的HBPA在进行端基修饰前后的谱图，即HBPA-3和HBPA-E14-3的1H-NMR谱图，溶剂为CDCl3。谱图中，PDL单元的特征峰为f(δ≈4.08ppm)，SA单元的特征峰为b(δ≈1.60ppm)，MDEA单元的特征峰为g(δ≈4.20ppm)，TEA单元的特征峰为h(δ≈2.85ppm)。TEA单元的存在表明该聚合物结构符合预期设想，可能存在超支化的结构，而特征峰k(δ≈2.22ppm)可以证明端基已经成功修饰基团E。通过计算各特征峰的积分面积可以换算得到聚合物各重复单元的比例，结果表明通过CDI修饰得到的HBPA-E14-3，其P/S/M/T重复单元摩尔比分别为1:9:4.5:1.9，和1:9:6:2的投料比很接近。这说明该反应中各单体原料反应都基本反应完全，反应效率非常高。其它1H-NMR结果如表1所示。结果显示，即使随着T投料的不断增加，酶催化的反应都接近完全，且反应可以非常可控的得到超支化聚合物，而不会产生交联。
[0100]试验显示，单体M的降低对超支化聚合物的影响较小；因此，本例进一步的研究了将单体M的比例降到0的情况，即直接用单体P、单体S和单体T三种单体进行聚合物反应，具体的，投料摩尔比P:S:T＝1:9:6，其余步骤和参数都与“(1)HBPA合成”相同。结果显示，P、S和T三种单体也能够获得具有超支化结构的聚合物，而不产生交联。P、S和T三种单体获得的超支化聚合物，与P、S、M和T四种单体获得的超支化聚合物，两者具有类似的理化特性。
[0101]同时，通过GPC来表征HBPA-E的分子量及分布。GPC测量是利用Waters 1515色谱柱及2414折光指数(RI)检测器在35℃下进行。流动相为含有0.1％LiBr的DMF，流速1mL/min，用线性聚甲基丙烯酸甲酯标样做标准品。结果如表1所示，部分结果如图3所示。图3分别为试验3的HBPA-E14-1和对照1的PACA-E14的GPC谱图。图3的结果显示，超支化HBPA-E14-1和线性PACA-E14的GPC谱图都为单峰，数均分子量Mn分别为8296和8769Da，PDI分别为4.12和1.97。二者的分子量接近，但PDI差异明显。这表明HBPA-E14-1和PACA-E14存在结构上的显著差异，应该是源于HBPA支化的结构。其它HBPA-E14的PDI如表1所示，都和HBPA-E14-1类似。
[0102]另外，本例将表1制备的HBPA-E14和PACA-E14溶于乙醇，测试其溶解性。结果如表1所示。表1的结果显示，本例支化的HBPA-E都很容易溶于乙醇，溶解性都大于25mg/mL，而线性PACA-E难溶于乙醇，溶解性都小于10mg/mL。
[0103]最后，本例通过茚三酮法定量数均分子量相似的HBPA-E14(Mn＝8769)和PACA-E14(Mn＝8296)端基修饰的E14含量。具体方法如下：1、配制茚三酮显色剂：称取200mg的茚三酮，溶于9mL乙醇，加乙醇定容到10mL，配成20mg/mL的茚三酮乙醇溶液。2、样品测定：各取约10mg的HBPA-E14和PACA-E14样品，配成5mg/mL的乙醇溶液，各取100μL分别与200μL茚三酮乙醇溶液混合均匀，置于摇床上60℃加热振荡10min，冷却至室温，各取200μL测其570nm处的吸光度值，并将其吸光度值换算成端基E14的相对浓度。结果如图4所示，PACA-E14中端基E14的相对浓度是1，而在相同材料浓度时，HBPA-E14-1的端基E14的相对浓度是3.01，表明其端基E14含量接近PACA-E14的3倍。考虑到两者的分子量非常接近，HBPA-E14-1端基含量显著高于PACA-E14应该是因其支化结构造成，这也再一次验证了HBPA的支化结构。
[0104]三、材料和mRNA复合物的表征
[0105]在制备得到聚合物材料HBPA-E14-2之后，将其和Firefly Luciferase mRNA(N1-Me-Pseudo UTP，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按不同的质量比混合并测定其复合物的直径，同时也用PACA-E14和mRNA的复合物作为对照。具体的，将聚合物材料HBPA-E14-2和PACA-E14分别溶于乙醇和DMSO中制成25mg/mL的聚合物溶液，然后将不同量的聚合物溶液加入一定体积的pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡。同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，最终得到聚合物和mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1的复合物溶液。HBPA-E14-2和PACA-E14分别做以上质量比的对照试验。HBPA-E14-2和PACA-E14的用量根据质量比进行计算，例如，聚合物和mRNA质量比为25:1，则取25mg/mL的聚合物溶液20μL，即500μg聚合物加入980μL的pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡；同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，即得到聚合物和mRNA的质量比为25:1。
[0106]在25℃下通过粒度仪(Malvern Panalytical Zetasizer Pro)测试复合物的粒径。结果如图5所示，图5的横坐标为聚合物和mRNA的质量比，纵坐标为复合物的粒径，单位为nm。
[0107]图5的结果显示，HBPA-E14-2/mRNA复合物在质量比为25:1时，直径超过300nm，而在质量比50:1-200:1时，直径显著降低且逐渐趋于稳定，都为100-200nm。这说明在质量比大于50:1后，HBPA-E14-2和mRNA的复合趋于稳定。PACA-E14和mRNA也表现出类似的结果。
[0108]四、HBPA-E在体外细胞的mRNA和DNA转染效率测试
[0109]在得到HBPA-E和表达荧光素酶(luciferase)的mRNA或DNA(Firefly LuciferaseDNA，广州艾基生物技术有限公司)的复合物后，本例在不同的细胞模型中测试其转染效率。细胞转染的具体方法如下：将A549及HEK293T等细胞(ATCC)接种于48孔细胞培养板中(2.5×104/孔)，细胞在37℃且含有5％CO2的DMEM中培养12h贴壁后，更换DMEM培养基(250μL/孔)，加入待测样品及阳性对照分别培养24h(mRNA)或48h(DNA)，按最终每孔2μg/mL mRNA计算加入样品。待测材料和mRNA或DNA的复合物制备方法同“三、材料和mRNA复合物的表征”。mRNA转染的阳性对照采用赛默飞的Lipofectamine MessengerMAX(LipoMM)，DNA转染的阳性对照采用Lipofectamine 2000(Lipo2k)。
[0110]细胞转染后裂解及发光效果测试的具体方法如下：细胞在转染24小时(mRNA)或者48小时(DNA)后，将孔板中的培养基吸掉，之后放在-80℃冰箱10分钟。取出孔板放置到4℃，取40μL裂解液到48孔板，覆盖底面，静置5min，再取280μL测试液到48孔板，然后取160μL混合物到黑色酶标仪板，最后用排枪取40μL D-Luciferin加入每个孔。常温反应2分钟之后放入酶标仪测试560nm发光。
[0111]不同HBPA-E在A549和HEK 293T细胞中的mRNA和DNA转染效率测试结果如图6至图9所示。各具体试验设计如下：
[0112]本例测试了对照1、试验1、试验2、试验3、试验5、试验6和试验7的聚合物分别与mRNA按聚合物:mRNA质量比为75:1复合后，分别在A549和HEK293T细胞中的mRNA转染效率，结果如图6所述。
[0113]图6的结果显示，在A549细胞中，所有的超支化材料都表现出比商业对照LipoMM显著更高的mRNA转染效果，且远高于线性PACA-E14的转染效果。其中HBPA-E14-3的转染效率最高，接近LipoMM的4倍。而线性PACA-E14则比LipoMM效果要更弱一些。HEK293T细胞的转染结果和A549结果是一致的。这说明超支化聚合物对mRNA的细胞转染效果相比线性聚合物有显著提高，也优于当前效率最高的商业转染试剂，这个效果也在不同的细胞上得到验证。考虑到这种超支化聚合物还可以溶于乙醇，其在体外和体内mRNA转染都具有巨大的应用潜力。
[0114]同时本例也测试了用CDI和DIC两种不同修饰方法修饰的HBPA-E14-3及其在不同质量比条件时的mRNA转染效率，具体的，本例分别测试了CDI修饰的HBPA-E14-3，即试验3的聚合物与mRNA按聚合物:mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1复合后在A549中的转染效率，以及DIC修饰的HBPA-E14-3-DIC，即试验4的聚合物与mRNA按聚合物:mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1复合后在A549中的转染效率；结果如图7所示。
[0115]图7的结果显示，在A549细胞上，通过两种方式修饰的HBPA-E14-3在质量比为50:1～100:1之间都具有显著高于LipoMM的转染效率，只是通过CDI修饰的材料相比DIC修饰的材料效果更佳。而质量比为25:1时则没有表现出转染效率。这些结果说明两种修饰方法都是可行的。同时mRNA在25:1时还没有充分复合好，而在高于50:1后mRNA已经复合，这和粒度仪测试的复合物粒径的测试的结果一致。
[0116]另外本例也测试了不同HBPA-E在HEK 293T细胞中的DNA转染效率，具体的，分别测试了对照1、试验1、试验2、试验3、试验5、试验6和试验7的聚合物分别与DNA按聚合物:DNA质量比为75:1复合后，在HEK 293T细胞中的DNA转染效率，结果如图8所示。
[0117]图8的结果显示，所有的超支化材料都表现出比商业对照Lipo2k显著更高的DNA转染效果，且远高于线性PACA-E14的转染效果，其中HBPA-E14-2的转染效率最高。这说明超支化聚合物材料也可用于DNA转染。
[0118]最后，本例还测试了修饰26种不同端基修饰化合物对端基进行基团E修饰的HBPA-E在A549细胞中的mRNA转染效率，具体的，测试了E1至E26这26种端基修饰化合物进行端基修饰的26种HBPA-E分别与mRNA按聚合物:mRNA质量比为75:1复合后，分别在A549细胞中的mRNA转染效率，结果如图9所示。
[0119]图9的结果显示，不同端基修饰对mRNA转染效率有影响，其中有多种端基修饰的HBPA-E表现出显著比LipoMM更高的转染效率，如E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25及E26等。除E11、E13、E22、E23和E24修饰的聚合物对mRNA的转染效率明显低于LipoMM以外，E8、E17、E18和E21修饰的聚合物对mRNA的转染效率与LipoMM相当，其余端基修饰的聚合物对mRNA的转染效率都高于LipoMM。
[0120]五、细胞毒性测试
[0121]本例在A549细胞模型中测试其HBPA-E/mRNA复合物的细胞毒性。细胞毒性测试具体方法如下：将A549细胞接种于96孔细胞培养板中(1×104/孔)，细胞培养12h贴壁后，更换DMEM培养基，分别加入待测样品PACA-E14、HBPA-E14-3及阳性对照LipoMM的mRNA复合物分别培养24h，其中，PACA-E14或HBPA-E14-3，与mRNA的质量比为50:1。按最终每孔培养液中mRNA浓度依次为0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/mL加入样品。24h后每孔加入10μL的CCK8检测试剂，用酶标仪检测450nm的吸收。结果如图10所示。
[0122]图10的结果显示，对照LipoMM复合物表现出明显的细胞毒性，在mRNA浓度为2μg/mL细胞生存率只有50％，且随着mRNA浓度增加，毒性显著增加。与此相比，线性PACA-E14复合物的毒性显著降低，但也表现出一定的细胞毒性，其在mRNA浓度2μg/mL时细胞生存率达到70％。而与这两者相比，超支化HBPA-E14-3复合物的毒性进一步降低，其在mRNA浓度2μg/mL时细胞生存率超过80％。该结果表明超支化HBPA-E14-3相比于商业转染试剂和线性PACA-E14具有更高的生物相容性，也具有更大的体内应用前景。
[0123]六、HBPA-E在活体的mRNA转染效果测试
[0124]本例测试了HBPA-E14-3在活体的mRNA转染效果，具体方法如下：4～6周龄C57小鼠(体重约20g)购自广东省医学实验动物中心，并在SPF(specific pathogen-free)环境级别监控及饲养。将HBPA-E14-3/mRNA复合物分别通过肺部给药(用肺部喷雾针插入气管给药，5μg剂量)和气管内滴入给药(5μg剂量)注入小鼠体内，观察其在体内的荧光素酶表达效果，以生理盐水作为空白对照。结果如图10所示。其中，HBPA-E14-3/mRNA复合物中，HBPA-E14-3与mRNA的质量比为50:1。
[0125]图11中，横坐标“Control”表示空白组，“肺部给药mRNA(5μg)”表示直接采用mRNA进行肺部给药，“肺部给药(5μg)”表示采用HBPA-E14-3/mRNA复合物进行肺部给药，“气管内滴入(5μg)”表示采用HBPA-E14-3/mRNA复合物进行气管内滴入给药。
[0126]图11的结果显示，直接mRNA肺部给药和空白组都没有检测到荧光，而HBPA-E14-3/mRNA复合物不同给药途径都显示出显著的荧光素酶表达效果，其中肺部给药是气管内滴入的递送效率的2倍。这些结果都说明这种超支化聚合物/mRNA复合物可以在活体内实现mRNA递送，具有巨大的活体应用前景。
[0127]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
[0024]其中，x、y、z为1至200的独立整数，
[0025]n为0至200的整数，
[0026]j、k为0至30的整数，
[0027]l、m、o、p、q为1至20的独立整数，
[0028]Rx为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；
[0029]J为氢，R1为端基修饰化合物E提供的基团E修饰，此时没有R2；或者，J为羰基，此时R1和R2两者都是端基修饰化合物E提供的基团E修饰；
[0030]式一中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为P或S，后续连接其他单体形成超支化结构。
[0031]其中，连接其他单体是指，例如，后续按照式一的顺序连接单体，在分支结构的基础上再形成支化结构，如此循环，形成类似树枝状的超支化结构。
[0032]需要说明的是，本申请的R1和/或R2为端基修饰化合物E提供的基团E修饰，在端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基基团E修饰时，端基修饰化合物E会减少一个氢，形成基团E结合在超支化聚合物的端基。在采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)作为偶联剂时，会同时在式一所示的超支化聚合物的两端都形成基团E的端基修饰；此时为了将基团E连接到超支化聚合物上，在端基R2的位置处，CDI会提供一个羰基用于连接基团E和超支化聚合物；R1位置处仍然是端基修饰化合物E会减少一个氢，形成基团E，直接与超支化聚合物连接。
[0033]还需要说明的是，在只有单体P、S与单体T聚合形成超支化聚合物时，即n为0，此时J如果为羰基，羰基一端连接R2，另一端连接单体T的羟基，形成端基的基团E修饰。可以理解，这种情况下，式一所述通式的结构会适应性的调整，即单体T在末端，与羰基J相连。
[0034]本申请的一种实现方式中，阳离子聚酯的数均分子量为1-30k；优选为2-20k。
[0035]本申请的第二方面公开了本申请的阳离子聚酯的制备方法，包括将各单体和催化剂加入溶剂中，在惰性气氛中依序进行第一阶段聚合反应和第二阶段聚合反应，反应完成后，去除催化剂，获得超支化聚合物；然后，在偶联剂的作用下，采用端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基修饰，获得端基具有基团E修饰的阳离子聚酯；其中，第一阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度50～1000mbar，反应时间12～24h；第二阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度1-30mbar，反应时间12～72h。
[0036]本申请的一种实现方式中，单体P和单体S的摩尔比为0.1:10～4:1，单体M和单体S的摩尔比为0:10～20:10，单体T和单体S的摩尔比为0.1:10～20:10。
[0037]本申请的一种实现方式中，催化剂为固定化脂肪酶。
[0038]本申请的一种实现方式中，固定化脂肪酶的用量为各单体总质量的3-50wt％。
[0039]本申请的一种实现方式中，溶剂为二苯醚、正十二烷、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、二甲基乙酰胺和邻苯二甲醚中的至少一种。
[0040]本申请的一种实现方式中，溶剂的用量为各单体总质量的100-500wt％。
[0041]本申请的一种实现方式中，去除催化剂，具体包括，反应结束后用过滤装置对反应液进行过滤，收集滤液；获得超支化聚合物，具体包括，向滤液中加入正己烷，使超支化聚合物析出，离心，去上清液，沉淀加入二氯甲烷溶解，再加入正己烷使超支化聚合物析出，离心，去上清液，重复采用二氯甲烷溶解、正己烷析出、离心至少2次；最后，将沉淀干燥，即获得超支化聚合物。
[0042]本申请的一种实现方式中，偶联剂为N,N’-羰基二咪唑、碳化二亚胺类、磷正离子类和脲正离子类中的至少一种。
[0043]本申请的一种实现方式中，碳化二亚胺类包括但不限于二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
[0044]本申请的一种实现方式中，磷正离子类包括但不限于苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；脲正离子类包括但不限于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸。
[0045]本申请的一种实现方式中，偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为2:1～50:1；优选的，偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为4:1～15:1；另外，偶联剂和端基修饰化合物E的摩尔比为5:1～1:10。
[0046]本申请的一种实现方式中，采用端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基修饰，具体包括，将超支化聚合物溶于二氯甲烷中，加入偶联剂，在惰性气氛中，室温搅拌至少10h，将反应液浓缩后，加入至少3倍体积的乙醚，离心，去除沉淀，获得上清液；将去除上清液中的溶剂，将干燥的产物加入二氯甲烷中溶解，在搅拌下加入端基修饰化合物E，室温反应至少10h，获得端基具有基团E修饰的超支化聚合物，即本申请的阳离子聚酯。
[0047]本申请的一种实现方式中，本申请的制备方法还包括，在加入端基修饰化合物E室温反应结束后，向反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相；重复加等体积去离子水、涡旋、离心分层、除去上层水相操作至少3次；最后，加入至少3倍体积的正己烷，涡旋、离心，去上清液，将沉淀物干燥，即获得端基具有基团E修饰的超支化聚合物，即本申请的阳离子聚酯。
[0048]本申请的第三方面公开了本申请的阳离子聚酯在核酸药物递送中的应用。
[0049]本申请的一种实现方式中，核酸药物包括但不仅限于mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA。
[0050]需要说明的是，本申请的关键在于，研究发现了一种新的核酸药物递送材料，即本申请的阳离子聚酯；采用本申请的阳离子聚酯进行核酸递送，不仅转染效率高，而且细胞毒性小，能够更好的满足临床使用需求。可以理解，本申请的阳离子聚酯由于其细胞毒性小，不仅能够用于核酸递送，也能够用于其他类似的、需要向细胞内递送物质的操作。
[0051]本申请的一种实现方式中，核酸药物递送包括，采用所述阳离子聚酯包裹核酸药物，将其递送到细胞内。
[0052]本申请的一种实现方式中，细胞的种类包括但不限于HEK293T、A549、HeLa、U87、HUVEC、Jurkat、RAW264.7、iPSC和MSC。
[0053]本申请的第四方面公开了一种核酸递送颗粒，包括包裹材料和包裹于包裹材料内的核酸；包裹材料为本申请的阳离子聚酯或者包裹材料中至少包含本申请的阳离子聚酯；核酸为mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA中的至少一种。
[0054]需要说明的是，本申请的核酸递送颗粒，由于采用本申请的阳离子聚酯，不仅能够提高转染效率，而且对细胞毒性较小，具有更好的临床应用前景。可以理解，本申请核酸递送颗粒的关键在于采用本申请的阳离子聚酯，至于具体的包埋方法和核酸递送方法可以参考现有技术。
[0055]还需要说明的是，本申请的包裹材料可以根据包裹层的不同设计或需求，还包含本申请阳离子聚酯以外的其他材料，在此不作具体限定。可以理解，只要含有本申请的阳离子聚酯，都可以在一定程度上提高转染效率并减小细胞毒性。
[0056]本申请的一种实现方式中，核酸递送颗粒的粒径为30-500nm。
[0057]本申请的第五方面公开了一种核酸药物递送的试剂盒，包括以下组分中的至少一种：
[0058](a)本申请的阳离子聚酯；
[0059](b)本申请的核酸递送颗粒。
[0060]需要说明的是，本申请的核酸药物递送的试剂盒，可以是已经包埋好的某种特定核酸药物的试剂盒，也可以是本申请的阳离子聚酯，使用者根据需求自行设计和包埋相应的核酸药物。可以理解，本申请试剂盒的关键在于含有本申请的阳离子聚酯或核酸递送颗粒，至于核酸递送所需的其他常规试剂，例如一些脂质或聚合物材料等，可以参考现有技术或市售购买获得。当然，为了使用方便，也可以将部分试剂组合到本申请的试剂盒中，在此不作具体限定。
[0061]本申请的第六方面公开了一种在核酸药物递送中提高转染效率的方法，包括采用本申请的阳离子聚酯或者含有本申请阳离子聚酯的包裹材料，对核酸药物进行包裹，形成核酸递送颗粒，利用核酸递送颗粒对核酸药物进行细胞转染。
[0062]需要说明的是，本申请的方法，关键在于采用本申请的阳离子聚酯提高转染效率；本申请的一种实现方式中，本申请阳离子聚酯的mRNA递送效率显著优于原有的线性聚合物及现有最佳商用mRNA转染试剂，且细胞毒性更低。并且，本申请阳离子聚酯可溶于乙醇，可更好的用于临床，具有极大的实际应用前景。可以理解，本申请提高转染效率的方法，其关键在于使用本申请的阳离子聚酯，至于细胞转染的其他操作和试剂，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。
[0063]还需要说明的是，本申请提高转染效率的方法，可以直接采用本申请的阳离子聚酯作为包裹材料，也可以在现有的包裹材料中添加本申请的阳离子聚酯；可以理解，只要含有本申请的阳离子聚酯都能不同程度的提高转染效率。
[0064]本申请的阳离子聚酯，或者本申请的核酸递送颗粒，或者本申请的试剂盒能够用于核酸药物递送的疾病治疗；例如，在体内施用核酸药物时，可以采用本申请的阳离子聚酯或者含有本申请阳离子聚酯的包裹材料，对核酸药物进行包裹，形成核酸递送颗粒，利用核酸递送颗粒进行核酸药物递送；或者，直接使用本申请的核酸递送颗粒对核酸药物进行递送。
[0065]需要说明的是，本申请的施用方法，其关键在于采用阳离子聚酯或核酸递送颗粒进行核酸药物递送，至于体内递送的具体操作以及所需要的其他辅助材料，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。
[0066]由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0067]本申请的阳离子聚酯，在单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体的基础上增加单体T，利用单体T与其他单体聚合获得一种新的具有超支化结构的聚合物。本申请的阳离子聚酯可溶于乙醇，用于核酸递送时，不仅能够显著提高转染效率，而且细胞毒性更低，能够更好的满足临床使用需求。
附图说明
[0068]图1是本申请实施例中超支化聚合物及端基基团E修饰的合成路线图；
[0069]图2是本申请实施例中HBPA-E14-3在进行端基修饰前后的谱图；
[0070]图3是本申请实施例中HBPA-E14-1和PACA-E14的GPC谱图；
[0071]图4是本申请实施例中HBPA-E14-1和PACA-E14的端基修饰E14的定量图；
[0072]图5是本申请实施例中HBPA-E14-2和mRNA的复合物的粒径测试结果；
[0073]图6是本申请实施例中不同HBPA-E在A549和HEK 293T细胞中的mRNA转染效率测试结果；
[0074]图7是本申请实施例中CDI和DIC两种不同修饰方法修饰的HBPA-E14-3及其在不同质量比条件时的mRNA转染效率测试结果；
[0075]图8是本申请实施例中不同HBPA-E在HEK 293T细胞中的DNA转染效率测试结果；
[0076]图9是本申请实施例中修饰26种不同端基E的HBPA-E在A549细胞中的mRNA转染效率测试结果；
[0077]图10是本申请实施例中聚合物和mRNA的复合物在A549细胞模型中的毒性测试结果；
[0078]图11是本申请实施例中HBPA-E在活体的mRNA转染效果测试结果。
具体实施方式
[0079]现有商用的基因递送材料转染效率不足，且毒性较大，极大的限制了基于核酸药物递送的基因疗法的广泛应用。尽管有研究报道，基于体外合成生物学技术，通过固定化脂肪酶催化P、S、M三种单体聚合得到的可生物降解的线性聚合物，具有较高的转染效率和更低的细胞毒性；但是，该线性聚合物的转染效率依然不理想，且制备的基因递送材料因需要用有毒有机溶剂溶解而难以用于实际临床。
[0080]本申请创造性的在原有三种单体聚合的基础上，增加一种新的单体T，或者利用单体T替换单体M，从而制备得到一种具有超支化结构的新型阳离子聚酯。具体的，本申请的阳离子聚酯为单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物，并且超支化聚合物的端基具有基团E修饰；单体P为环内酯；单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体M为端基含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。
[0081]本申请的阳离子聚酯，其基因转染效率显著提高，显著优于原有的线性聚合物及现有最佳商用mRNA转染试剂，且细胞毒性更低。更为重要的是，本申请的阳离子聚酯可溶于乙醇，不需要用有毒的有机溶剂溶解，易于工业放大且能够更好的满足临床使用需要，具有极大的实际应用前景。
[0082]下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0083]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0084]实施例
[0085]一、超支化聚合物(HBPA)及端基基团E修饰(HBPA-E)的合成
[0086](1)HBPA合成
[0087]本例先采用P、S、M和T四种单体聚合形成的超支化聚合物(HBPA)，然后再对HBPA进行端基基团E修饰，获得HBPA-E。具体的，本例的单体P采用环十五烷内酯(PDL)，单体S采用癸二酸(SA)，单体M采用甲基二乙醇胺(MDEA)，单体T采用三乙醇胺(TEA)，HBPA合成路线如图1的(a)图所示，本例设计了七个试验和两个对照，按照表1中四种单体P(PDL)/S(SA)/M(MDEA)/T(TEA)的投料摩尔比将原料加入圆底烧瓶中，并按总原料质量的10Wt％加入固定化脂肪酶(CALB)，最后加入原料200Wt％的二苯醚。将反应体系用氩气置换3次后，60mbar下搅拌加热至90℃反应24小时，接着2.1mbar压力下继续反应48小时。反应结束后将反应液过滤除去脂肪酶。滤液加正己烷，涡旋、离心后，倒去上清液，沉淀加二氯甲烷溶解，再加正己烷使其析出，离心，倒去上清液。上述操作重复3次。将沉淀物真空干燥一天得到HBPA。其中，两个对照合成的聚合物为线性聚合物PACA。
[0088]表1不同投料比合成的聚合物及其修饰E14的产物表征
[0089]
[0090]表1中，“a”是根据1H-NMR结果计算，“b”是根据GPC结果。
[0091](2)端基基团E修饰
[0092]本例按照表1所示，采用端基修饰化合物E14，分别采用两种不同的端基修饰方法，即分别用N,N’-羰基二咪唑(CDI)和二异丙基碳二亚胺(DIC)做偶联剂，进行聚合物的端基修饰。
[0093]修饰方法一：用CDI做偶联剂，合成路线如图1的(b)图所示，取250mg HBPA溶于5mL超干二氯甲烷(DCM)，搅拌下加入40eq的CDI。将反应体系用氩气置换3次后，室温搅拌过夜。将反应液浓缩至3mL，加3倍体积乙醚，涡旋、离心，除去沉淀物。将上清液减压旋干，加超干DCM溶解，再搅拌下加40eq的E14，室温反应24小时。反应结束后，往反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相。再加等体积去离子水，重复上述操作5次。向下层的二氯甲烷溶液中加3倍体积正己烷，涡旋、离心。将沉淀物真空干燥一天得到HBPA-E14。对于对照1则是获得PACA-E14。
[0094]修饰方法二：用DIC做偶联剂，合成路线如图1的(c)图所示，取250mg HBPA溶于5mL超干DCM中，搅拌下加入40eq的DIC和40eq的E14。将反应体系用氩气置换3次后，室温搅拌过夜。反应结束后，往反应液加等体积去离子水，涡旋、离心，除去上层水相。再加等体积去离子水，重复上述操作3次。再往下层二氯甲烷相加3倍体积正己烷，涡旋、离心。将沉淀物用少量乙醇洗涤，再真空干燥一天得到HBPA-E14，例如试验4制备获得的HBPA-E14-3-DIC。对于对照2则是得到PACA-E14-DIC。
[0095]用类似试验3的方法，本例进一步采用除E14以外的，E1至E26的25种端基修饰化合物对HBPA进行端基修饰，合成其他的HBPA-E。
[0096]E1至E26的26种端基修饰化合物如下：
[0097]
[0098]二、HBPA和HBPA-E的结构表征
[0099]HBPA和HBPA-E可以通过1H-NMR表征其分子结构。结果如表1所示，部分结果如图2所示。图2分别为试验2的HBPA在进行端基修饰前后的谱图，即HBPA-3和HBPA-E14-3的1H-NMR谱图，溶剂为CDCl3。谱图中，PDL单元的特征峰为f(δ≈4.08ppm)，SA单元的特征峰为b(δ≈1.60ppm)，MDEA单元的特征峰为g(δ≈4.20ppm)，TEA单元的特征峰为h(δ≈2.85ppm)。TEA单元的存在表明该聚合物结构符合预期设想，可能存在超支化的结构，而特征峰k(δ≈2.22ppm)可以证明端基已经成功修饰基团E。通过计算各特征峰的积分面积可以换算得到聚合物各重复单元的比例，结果表明通过CDI修饰得到的HBPA-E14-3，其P/S/M/T重复单元摩尔比分别为1:9:4.5:1.9，和1:9:6:2的投料比很接近。这说明该反应中各单体原料反应都基本反应完全，反应效率非常高。其它1H-NMR结果如表1所示。结果显示，即使随着T投料的不断增加，酶催化的反应都接近完全，且反应可以非常可控的得到超支化聚合物，而不会产生交联。
[0100]试验显示，单体M的降低对超支化聚合物的影响较小；因此，本例进一步的研究了将单体M的比例降到0的情况，即直接用单体P、单体S和单体T三种单体进行聚合物反应，具体的，投料摩尔比P:S:T＝1:9:6，其余步骤和参数都与“(1)HBPA合成”相同。结果显示，P、S和T三种单体也能够获得具有超支化结构的聚合物，而不产生交联。P、S和T三种单体获得的超支化聚合物，与P、S、M和T四种单体获得的超支化聚合物，两者具有类似的理化特性。
[0101]同时，通过GPC来表征HBPA-E的分子量及分布。GPC测量是利用Waters 1515色谱柱及2414折光指数(RI)检测器在35℃下进行。流动相为含有0.1％LiBr的DMF，流速1mL/min，用线性聚甲基丙烯酸甲酯标样做标准品。结果如表1所示，部分结果如图3所示。图3分别为试验3的HBPA-E14-1和对照1的PACA-E14的GPC谱图。图3的结果显示，超支化HBPA-E14-1和线性PACA-E14的GPC谱图都为单峰，数均分子量Mn分别为8296和8769Da，PDI分别为4.12和1.97。二者的分子量接近，但PDI差异明显。这表明HBPA-E14-1和PACA-E14存在结构上的显著差异，应该是源于HBPA支化的结构。其它HBPA-E14的PDI如表1所示，都和HBPA-E14-1类似。
[0102]另外，本例将表1制备的HBPA-E14和PACA-E14溶于乙醇，测试其溶解性。结果如表1所示。表1的结果显示，本例支化的HBPA-E都很容易溶于乙醇，溶解性都大于25mg/mL，而线性PACA-E难溶于乙醇，溶解性都小于10mg/mL。
[0103]最后，本例通过茚三酮法定量数均分子量相似的HBPA-E14(Mn＝8769)和PACA-E14(Mn＝8296)端基修饰的E14含量。具体方法如下：1、配制茚三酮显色剂：称取200mg的茚三酮，溶于9mL乙醇，加乙醇定容到10mL，配成20mg/mL的茚三酮乙醇溶液。2、样品测定：各取约10mg的HBPA-E14和PACA-E14样品，配成5mg/mL的乙醇溶液，各取100μL分别与200μL茚三酮乙醇溶液混合均匀，置于摇床上60℃加热振荡10min，冷却至室温，各取200μL测其570nm处的吸光度值，并将其吸光度值换算成端基E14的相对浓度。结果如图4所示，PACA-E14中端基E14的相对浓度是1，而在相同材料浓度时，HBPA-E14-1的端基E14的相对浓度是3.01，表明其端基E14含量接近PACA-E14的3倍。考虑到两者的分子量非常接近，HBPA-E14-1端基含量显著高于PACA-E14应该是因其支化结构造成，这也再一次验证了HBPA的支化结构。
[0104]三、材料和mRNA复合物的表征
[0105]在制备得到聚合物材料HBPA-E14-2之后，将其和Firefly Luciferase mRNA(N1-Me-Pseudo UTP，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按不同的质量比混合并测定其复合物的直径，同时也用PACA-E14和mRNA的复合物作为对照。具体的，将聚合物材料HBPA-E14-2和PACA-E14分别溶于乙醇和DMSO中制成25mg/mL的聚合物溶液，然后将不同量的聚合物溶液加入一定体积的pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡。同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，最终得到聚合物和mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1的复合物溶液。HBPA-E14-2和PACA-E14分别做以上质量比的对照试验。HBPA-E14-2和PACA-E14的用量根据质量比进行计算，例如，聚合物和mRNA质量比为25:1，则取25mg/mL的聚合物溶液20μL，即500μg聚合物加入980μL的pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡；同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，即得到聚合物和mRNA的质量比为25:1。
[0106]在25℃下通过粒度仪(Malvern Panalytical Zetasizer Pro)测试复合物的粒径。结果如图5所示，图5的横坐标为聚合物和mRNA的质量比，纵坐标为复合物的粒径，单位为nm。
[0107]图5的结果显示，HBPA-E14-2/mRNA复合物在质量比为25:1时，直径超过300nm，而在质量比50:1-200:1时，直径显著降低且逐渐趋于稳定，都为100-200nm。这说明在质量比大于50:1后，HBPA-E14-2和mRNA的复合趋于稳定。PACA-E14和mRNA也表现出类似的结果。
[0108]四、HBPA-E在体外细胞的mRNA和DNA转染效率测试
[0109]在得到HBPA-E和表达荧光素酶(luciferase)的mRNA或DNA(Firefly LuciferaseDNA，广州艾基生物技术有限公司)的复合物后，本例在不同的细胞模型中测试其转染效率。细胞转染的具体方法如下：将A549及HEK293T等细胞(ATCC)接种于48孔细胞培养板中(2.5×104/孔)，细胞在37℃且含有5％CO2的DMEM中培养12h贴壁后，更换DMEM培养基(250μL/孔)，加入待测样品及阳性对照分别培养24h(mRNA)或48h(DNA)，按最终每孔2μg/mL mRNA计算加入样品。待测材料和mRNA或DNA的复合物制备方法同“三、材料和mRNA复合物的表征”。mRNA转染的阳性对照采用赛默飞的Lipofectamine MessengerMAX(LipoMM)，DNA转染的阳性对照采用Lipofectamine 2000(Lipo2k)。
[0110]细胞转染后裂解及发光效果测试的具体方法如下：细胞在转染24小时(mRNA)或者48小时(DNA)后，将孔板中的培养基吸掉，之后放在-80℃冰箱10分钟。取出孔板放置到4℃，取40μL裂解液到48孔板，覆盖底面，静置5min，再取280μL测试液到48孔板，然后取160μL混合物到黑色酶标仪板，最后用排枪取40μL D-Luciferin加入每个孔。常温反应2分钟之后放入酶标仪测试560nm发光。
[0111]不同HBPA-E在A549和HEK 293T细胞中的mRNA和DNA转染效率测试结果如图6至图9所示。各具体试验设计如下：
[0112]本例测试了对照1、试验1、试验2、试验3、试验5、试验6和试验7的聚合物分别与mRNA按聚合物:mRNA质量比为75:1复合后，分别在A549和HEK293T细胞中的mRNA转染效率，结果如图6所述。
[0113]图6的结果显示，在A549细胞中，所有的超支化材料都表现出比商业对照LipoMM显著更高的mRNA转染效果，且远高于线性PACA-E14的转染效果。其中HBPA-E14-3的转染效率最高，接近LipoMM的4倍。而线性PACA-E14则比LipoMM效果要更弱一些。HEK293T细胞的转染结果和A549结果是一致的。这说明超支化聚合物对mRNA的细胞转染效果相比线性聚合物有显著提高，也优于当前效率最高的商业转染试剂，这个效果也在不同的细胞上得到验证。考虑到这种超支化聚合物还可以溶于乙醇，其在体外和体内mRNA转染都具有巨大的应用潜力。
[0114]同时本例也测试了用CDI和DIC两种不同修饰方法修饰的HBPA-E14-3及其在不同质量比条件时的mRNA转染效率，具体的，本例分别测试了CDI修饰的HBPA-E14-3，即试验3的聚合物与mRNA按聚合物:mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1复合后在A549中的转染效率，以及DIC修饰的HBPA-E14-3-DIC，即试验4的聚合物与mRNA按聚合物:mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1复合后在A549中的转染效率；结果如图7所示。
[0115]图7的结果显示，在A549细胞上，通过两种方式修饰的HBPA-E14-3在质量比为50:1～100:1之间都具有显著高于LipoMM的转染效率，只是通过CDI修饰的材料相比DIC修饰的材料效果更佳。而质量比为25:1时则没有表现出转染效率。这些结果说明两种修饰方法都是可行的。同时mRNA在25:1时还没有充分复合好，而在高于50:1后mRNA已经复合，这和粒度仪测试的复合物粒径的测试的结果一致。
[0116]另外本例也测试了不同HBPA-E在HEK 293T细胞中的DNA转染效率，具体的，分别测试了对照1、试验1、试验2、试验3、试验5、试验6和试验7的聚合物分别与DNA按聚合物:DNA质量比为75:1复合后，在HEK 293T细胞中的DNA转染效率，结果如图8所示。
[0117]图8的结果显示，所有的超支化材料都表现出比商业对照Lipo2k显著更高的DNA转染效果，且远高于线性PACA-E14的转染效果，其中HBPA-E14-2的转染效率最高。这说明超支化聚合物材料也可用于DNA转染。
[0118]最后，本例还测试了修饰26种不同端基修饰化合物对端基进行基团E修饰的HBPA-E在A549细胞中的mRNA转染效率，具体的，测试了E1至E26这26种端基修饰化合物进行端基修饰的26种HBPA-E分别与mRNA按聚合物:mRNA质量比为75:1复合后，分别在A549细胞中的mRNA转染效率，结果如图9所示。
[0119]图9的结果显示，不同端基修饰对mRNA转染效率有影响，其中有多种端基修饰的HBPA-E表现出显著比LipoMM更高的转染效率，如E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25及E26等。除E11、E13、E22、E23和E24修饰的聚合物对mRNA的转染效率明显低于LipoMM以外，E8、E17、E18和E21修饰的聚合物对mRNA的转染效率与LipoMM相当，其余端基修饰的聚合物对mRNA的转染效率都高于LipoMM。
[0120]五、细胞毒性测试
[0121]本例在A549细胞模型中测试其HBPA-E/mRNA复合物的细胞毒性。细胞毒性测试具体方法如下：将A549细胞接种于96孔细胞培养板中(1×104/孔)，细胞培养12h贴壁后，更换DMEM培养基，分别加入待测样品PACA-E14、HBPA-E14-3及阳性对照LipoMM的mRNA复合物分别培养24h，其中，PACA-E14或HBPA-E14-3，与mRNA的质量比为50:1。按最终每孔培养液中mRNA浓度依次为0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/mL加入样品。24h后每孔加入10μL的CCK8检测试剂，用酶标仪检测450nm的吸收。结果如图10所示。
[0122]图10的结果显示，对照LipoMM复合物表现出明显的细胞毒性，在mRNA浓度为2μg/mL细胞生存率只有50％，且随着mRNA浓度增加，毒性显著增加。与此相比，线性PACA-E14复合物的毒性显著降低，但也表现出一定的细胞毒性，其在mRNA浓度2μg/mL时细胞生存率达到70％。而与这两者相比，超支化HBPA-E14-3复合物的毒性进一步降低，其在mRNA浓度2μg/mL时细胞生存率超过80％。该结果表明超支化HBPA-E14-3相比于商业转染试剂和线性PACA-E14具有更高的生物相容性，也具有更大的体内应用前景。
[0123]六、HBPA-E在活体的mRNA转染效果测试
[0124]本例测试了HBPA-E14-3在活体的mRNA转染效果，具体方法如下：4～6周龄C57小鼠(体重约20g)购自广东省医学实验动物中心，并在SPF(specific pathogen-free)环境级别监控及饲养。将HBPA-E14-3/mRNA复合物分别通过肺部给药(用肺部喷雾针插入气管给药，5μg剂量)和气管内滴入给药(5μg剂量)注入小鼠体内，观察其在体内的荧光素酶表达效果，以生理盐水作为空白对照。结果如图10所示。其中，HBPA-E14-3/mRNA复合物中，HBPA-E14-3与mRNA的质量比为50:1。
[0125]图11中，横坐标“Control”表示空白组，“肺部给药mRNA(5μg)”表示直接采用mRNA进行肺部给药，“肺部给药(5μg)”表示采用HBPA-E14-3/mRNA复合物进行肺部给药，“气管内滴入(5μg)”表示采用HBPA-E14-3/mRNA复合物进行气管内滴入给药。
[0126]图11的结果显示，直接mRNA肺部给药和空白组都没有检测到荧光，而HBPA-E14-3/mRNA复合物不同给药途径都显示出显著的荧光素酶表达效果，其中肺部给药是气管内滴入的递送效率的2倍。这些结果都说明这种超支化聚合物/mRNA复合物可以在活体内实现mRNA递送，具有巨大的活体应用前景。
[0127]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
