CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 1 - PCT/US2008/011968 人非小细胞肺癌代理人卷号 265-PCT 中的转位和突变体 ROS 激酶 发明领域 本发明一般涉及蛋白质和 与癌症有关的基因,以及癌症的检测、诊断和治疗。 发明背景许多癌症的特征在于细胞信号通路的破坏,其导致细胞过程的异常控制,或细胞不受控制的生长和增殖。 这些中断通常是由特定信号蛋白(如激酶)的活性变化引起的。 在这些癌症中有非小细胞肺癌 (NSCLC)。 NSCLC 是美国癌症死亡的主要原因,约占所有肺癌的 87%。 美国每年约有 151,000 例 NSCLC 新病例,估计仅在美国每年就有超过 120,000 名患者死于该病。 参见“2005 年癌症事实和数据”,美国癌症协会。 NSCLC 包括三种不同的亚型,通常仅在转移后才被发现,因此诊断后两年内的死亡率为 75%。 已知导致具有异常信号活性的激酶融合蛋白的基因易位可直接导致某些癌症。 例如,已经直接证明 BCR-ABL 癌蛋白,一种酪氨酸激酶融合蛋白,是人类慢性粒细胞白血病 (CML) 的致病因子。 在至少 90-95% 的 CML 病例中发现了 BCR-ABL 癌蛋白,它是通过将基因序列从 9 号染色体上的 c-ABL 蛋白酪氨酸激酶易位到 22 号染色体上的 BCR 序列而产生的,从而产生了 - 称为费城染色体。 看,例如 Kurzock 等人,N. Engl。 J. 医学。 319:990-998(1988)。 在急性淋巴细胞白血病和 AML 病例中也观察到易位。 已经描述了导致涉及多种其他癌症的突变或融合蛋白的基因易位。 例如,Falini 等人,Blood 99(2):409-426 (2002),回顾了已知发生在血液癌症中的易位。 迄今为止,仅描述了肺癌中发生的有限数量的基因易位和突变蛋白,包括涉及 Notch3 的 t(15;19) 易位。 参见 Dang 等人,J. Natl。 能。 研究所。 92(/6): 1355-1357 (2000)。 已在小细胞和非小细胞肺癌中发现 RNA 结合蛋白 6 (RBM-6) 表达和/或活性缺陷。 参见 Drabkin 等人,Oncogene 8(16):2589-97(1999)。 然而,迄今为止,尚未描述涉及蛋白激酶的人类 NSCLC 癌症易位。 CD74 是一种完整的膜蛋白,作为 MHC II 类伴侣蛋白发挥作用。 已经描述了由胶质母细胞瘤中的 FIG-ROS del(6)(q21,q21) 易位引起的 ROS 激酶表达缺陷。 参见 Charest 等人,Genes Chromos。 坎克。 37(1):58-71(2003)。 还描述了能够驱动小鼠肿瘤生长的截短形式的 ROS 激酶。 参见 Birchmeier 等人,Mol。 细胞。 生物。 6(9):3109-3115(1986)。 迄今为止,在 ROS 激酶中没有发生已知的激活点突变。 识别人类癌症中的易位和突变是非常可取的,因为它可以导致针对此类融合或突变蛋白的新疗法的开发,以及用于识别具有此类基因易位的患者的新诊断方法。 例如,BCR-ABL 已成为 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 2 - PCT/US2008/011968 治疗白血病疗法开发的目标。 最近,ABL 激酶的小分子抑制剂格列卫(甲磺酸伊马替尼,STI-571)已被批准用于治疗 CML。 这种药物是一类新型抗增殖药物中的第一种,旨在干扰驱动肿瘤细胞生长的信号通路。 这种药物的开发代表了 CML 和 ALL 的传统疗法、化学疗法和放射疗法的重大进步,这些疗法受到众所周知的副作用的困扰,并且由于它们不能专门针对恶性肿瘤的根本原因而往往效果有限。 同样,已经描述了用于特异性检测患者 BCR-ABL 融合蛋白的试剂和方法,以便识别最有可能对靶向抑制剂(如格列卫)作出反应的患者。因此,仍然需要鉴定导致融合或突变蛋白的新基因易位或突变,这些融合或突变蛋白涉及人类癌症(包括肺癌,如 NSCLC)的进展,以及开发用于研究和检测此类癌症的新试剂和方法 融合蛋白。 这种融合蛋白的鉴定,除其他外,将理想地实现用于选择患者进行靶向治疗的新方法,以及用于筛选抑制这种突变/融合蛋白的新药的新方法。 发明概述根据本发明,人类非小细胞肺癌(NSCLC)中的新基因易位(5q32,6q22)导致融合蛋白结合部分CD74与原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体 (ROS) 激酶现已确定。 预计 CD74-ROS 融合蛋白将保留 ROS 酪氨酸激酶活性,并在表达融合蛋白的此类癌症的子集中驱动 NSCLC 的增殖和存活。 因此,本发明部分地提供了分离的多核苷酸和编码所公开的突变ROS多肽的载体、用于检测它们的探针和测定法、分离的突变ROS多肽、重组突变多肽以及用于检测突变ROS多核苷酸和多肽的试剂。 所公开的新突变 ROS 激酶蛋白和 CD74 易位的鉴定使确定生物样品中突变 ROS 多核苷酸或多肽的存在的新方法、筛选抑制突变激酶蛋白的化合物的方法以及抑制 ROS 进展的方法成为可能。 一种以突变型 ROS 多核苷酸或多肽的表达为特征的癌症,它们也由本发明提供。 下面更详细地描述本发明的方面和实施例。 附图说明图1-显示了CD74基因和ROS基因分别在染色体5q和6q上的位置(图A),以及全长CD74和ROS蛋白以及那些CD74-ROS融合蛋白的结构域位置 (面板 B 和 C)。 融合连接发生在 ROS 跨膜结构域上游的第 1853 位残基处。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 3 - PCT/US2008/011968 图2¨为人CD74-ROS融合蛋白(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列(1个字母编码)(top 图),还标明了编码 DNA 序列(SEQ ID NO:2)(下图); CD74 部分的残基加下划线,而 ROS 激酶结构域的残基以粗体显示。 图 3 ¨ 是人 CD74 蛋白(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列(1 个字母代码)(SwissProt 登记号 P04233)(上图),还标明了编码 DNA 序列(SEQ ID NO:4)(基因库登记号 NM_001025159)(下图); 易位中涉及的残基加了下划线。 图4A-是人ROS激酶的氨基酸序列(1个字母代码)(SEQ ID NO:5)(SwissProt登录号P08922); 易位中涉及的残基加了下划线。 图4B-是人ROS激酶的编码DNA序列(SEQ ID NO:6)(GeneBank Accession No.NM_002944); 易位中涉及的残基加了下划线。 图5-RT-PCR检测CD74和ROS易位形成的融合基因的凝胶图; 显示了 CD74-F1(顶部)和 ROS-GSP3(底部)的引物序列(分别为 SEQ ID NO:9 和 10)。 图6-是显示使用2色分离探针通过FISH特异性检测ROS融合/易位(在人NSCLC细胞系和患者中)的图像。 发明详述根据本发明, 导致突变激酶融合蛋白 CD74-ROS 的先前未知的基因易位现已在人类非小细胞肺癌 (NSCLC)(肺癌的一种亚型)中得到鉴定。 易位发生在染色体 (5q32) 和染色体 (6q22) 之间,产生融合蛋白,将 CD74 的 N 末端与原癌基因酪氨酸蛋白激酶 ROS 前体 (ROS) 的跨膜和激酶结构域结合起来。 ,一种 2347 个氨基酸的受体酪氨酸激酶。 由此产生的 CD74-ROS 融合蛋白是一种 703 个氨基酸的蛋白,预计将保留激酶活性并驱动表达融合蛋白的人类 NSCLC 肿瘤亚群的增殖和存活。尽管已经描述了一些导致涉及 ROS 激酶的异常融合蛋白的基因易位,包括胶质母细胞瘤中的 FIG-ROS del(6)(q21,q21) 易位(参见 Charest 等人,(2003),同上)和 作为 ROS 的截短活性形式(参见 Birchmeier 等人,同上),目前公开的 CD74-ROS 易位和融合蛋白是新颖的,并且这种融合激酶是在原发性人类 NSCLC 患者中首次报道的。 CD74 是一种完整的膜蛋白,作为 MHC II 类伴侣蛋白发挥作用。ROS 是一种跨膜受体酪氨酸激酶,属于胰岛素受体亚家族,参与细胞增殖和分化过程。 在人类中,ROS 在各种不同组织的上皮细胞中表达。 已在胶质母细胞瘤以及中枢神经系统肿瘤中发现 ROS 表达和/或激活缺陷。 参见例如 查雷斯特等人。 (2003),同上。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 4 - PCT/US2008/011968 如下文进一步描述,CD74-ROS易位基因和融合蛋白目前已被分离和测序,并产生了用于表达突变激酶蛋白的cDNA。 因此,本发明部分地提供了编码CD74-ROS融合多肽的分离的多核苷酸、与此类多核苷酸杂交的核酸探针,以及利用此类多核苷酸产生重组突变ROS多肽的方法、载体和宿主细胞。 本发明还部分提供了分离的多肽,其包含编码 CD74-ROS 融合多肽的氨基酸序列、重组突变多肽,以及特异性结合和/或检测 CD74-ROS 融合多肽但不结合或检测两者的分离试剂 野生型 CD74 或野生型 ROS。 本发明的这些方面将在下文进一步详细描述,除其他外,将有助于进一步研究由突变 ROS 激酶表达/活性驱动的癌症机制,用于鉴定肺癌和其他以 CD74-ROS 为特征的癌症 易位和/或融合蛋白,以及在下文进一步描述的实施本发明的方法中。 新型 ROS 激酶突变体和易位的鉴定对于以这种易位和/或融合蛋白为特征的疾病(例如 NSCLC)的潜在诊断和治疗具有重要意义。 NSCLC是美国癌症死亡的主要原因,并且在转移之前通常难以诊断,增加了有效治疗或治愈该疾病的难度。 因此,NSCLC 在诊断后两年内的死亡率为 75%。 参见美国癌症协会,同上。 尽管靶向 EGFR 抑制剂目前已获准用于治疗 NSCLC,但预计这种疗法可能对患有表达突变 ROS 激酶(而不是 EGFR 或除了 EGFR)并驱动 疾病,全部或部分。 因此,目前发现的由 NSCLC 中的基因易位产生的 CD74-ROS 融合蛋白有望推动 NSCLC 肿瘤亚群的增殖和存活,从而为准确识别哺乳动物肺癌(如 NSCLC)提供重要的新方法, 以及其他癌症,其中表达 CD74-ROS 融合蛋白或截短的 ROS 激酶。 这些肿瘤最有可能对突变 ROS 激酶的激酶活性抑制剂产生反应。 尽早识别由突变 ROS 激酶驱动的癌症的能力将极大地帮助临床确定哪种治疗或治疗组合最适合特定患者,从而有助于避免开具靶向抑制剂的处方 事实上,其他激酶不是驱动癌症的主要信号分子。 因此,本发明部分地提供了使用融合特异性和突变体特异性试剂检测癌症中 CD74-ROS 易位 (t(5,6)(q32, q22) 和/或融合多肽的存在的方法 此类方法可用于例如鉴定可能对突变蛋白的ROS激酶活性抑制剂作出反应的癌症,例如NSCLC肿瘤。本发明还部分地提供了用于确定化合物是否抑制以CD74-ROS融合多肽为特征的癌症的进展的方法。 本发明进一步提供了一种通过抑制突变多肽的表达和/或活性来抑制表达CD74-ROS融合多肽的癌症进展的方法。 此类方法是 CA 02702686 2015-07-28 WO 2009/051846-5-PCT/US2008/011968,在下文中有更详细的描述。 本领域技术人员已知的任何合适的材料和/或方法都可以用于实施本发明。 然而,描述了优选的材料和方法。 在以下描述和实施例中参考的材料、试剂等可从商业来源获得,除非另有说明。 下面更详细地描述本发明的其他方面、优点和实施例。 本文提及的专利、公开的申请和科学文献确立了本领域技术人员的知识。 此处引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。 同样,术语或词组的本领域理解的定义与本说明书中具体教导的词或词组的定义之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。 如本文所用,以下术语具有指示的含义。 如在本说明书中所使用的,单数形式“a”、“an”和“the”特别地也包括它们所指的术语的复数形式,除非内容另有明确规定。 术语“大约”在本文中用于表示大约、在范围内、粗略地或大约。 当术语“约”与数值范围结合使用时,它通过将边界延伸到所列数值之上和之下来修饰该范围。 一般而言,术语“约”在本文中用于以20%的差异修改高于和低于规定值的数值。 “抗体”或“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白,包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE,包括F.13或其抗原识别片段,包括嵌合抗体、多克隆抗体和单克隆抗体。 适用于产生本发明抗体的肽抗原可根据众所周知的技术设计、构建和使用。 参见,例如,抗体:实验室手册,第 5 章,p. 75-76,Harlow & Lane Eds.,冷泉港实验室 (1988); Czernik,酶学方法,201:264-283(1991); 梅里菲尔德,J. Am。 化学。 社会。 85:21-49(1962))。 本发明还包括具有少于 4 条链的抗体分子,包括单链抗体、骆驼抗体等和抗体的组分,包括重链或轻链。 在一些实施方案中,链中的免疫球可按从5'到3'的顺序包含可变区和恒定区。 可变区可包含三个互补决定区(CDR),具有结构FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的散布框架(FR)区。 本发明还包括重链或轻链可变区、构架区和 CDR。 本发明的抗体可包含重链恒定区,该重链恒定区包含部分或全部CH1区、铰链、CH2和CH3区。 本发明的抗体可以具有1×10-2M或更小的结合亲和力(Ko)。 在其他实施方案中,抗体以 1 x 10-8 M、1 x 10-9 M、1 x 01' M、1 x 1 x 10-'2M 或更小的 Ko 结合。 在某些实施方案中,KD 为 1 pM 至 500 pM、500 pM 至 1 M、1 uM 至 100 nM 或 100 mM 至 10 nM。 本发明的抗体可以来源于任何动物物种,优选哺乳动物。 非限制性示例性天然抗体包括源自人、鸡、山羊和啮齿动物(例如,大鼠、小鼠、仓鼠和兔子)的抗体,包括转基因啮齿动物以产生 CA 02702686 2015-07-28 WO 2009/051846 - 6 -PCT/US2008/011968 人抗体(参见,例如,Lonberg 等人,W093/12227;美国专利号 5,545,806;和 Kucherlapati,等人,W091/10741;美国专利号 6,150,584。天然抗体是抗体 由宿主动物产生,但是本发明还考虑了遗传改变的抗体,其中氨基酸序列与天然抗体的氨基酸序列不同。由于重组 DNA 技术与这一应用的相关性,人们不必局限于天然抗体中发现的氨基酸序列; 可以重新设计抗体以获得所需的特性。 可能的变化有很多,范围从仅改变一个或几个氨基酸到完全重新设计,例如可变区或恒定区。 一般而言,恒定区的变化是为了改善或改变特性,例如补体结合、与膜的相互作用和其他效应器功能。 将改变可变区以改善抗原结合特性。 如本文所用,术语“人源化抗体”是指其中非抗原结合区域中的氨基酸已被替换以更接近于人抗体,同时仍保留原始结合能力的抗体分子。 特别考虑的其他抗体是寡克隆抗体。 如本文所用,短语“寡克隆抗体”是指不同单克隆抗体的预定混合物。 参见,例如,PCT 公布 WO 95/20401; 美国专利号 5,789,208 和 6,335,163。 在一个实施方案中,由针对一个或多个表位的预定抗体混合物组成的寡克隆抗体在单个细胞中产生。 在其他实施方案中,寡克隆抗体包含能够与共同轻链配对以产生具有多种特异性的抗体的多条重链(例如,PCT公开WO 04/009618)。 当需要靶向单个靶分子上的多个表位时,寡克隆抗体特别有用。 鉴于本文公开的测定和表位,本领域技术人员可以产生或选择适用于预期目的和期望需要的抗体或抗体混合物。 针对本发明鉴定的磷酸化位点的重组抗体也包括在本申请中。 这些重组抗体与本申请中的天然抗体具有相同的氨基酸序列或改变了天然抗体的氨基酸序列。 它们可以在任何表达系统中制备,包括原核和真核表达系统或使用噬菌体展示方法(参见,例如,Dower 等人,W091/17271 和 McCafferty 等人,W092/01047 ;美国专利号 5,969,108。 抗体可以通过多种方式进行工程化。它们可以制成单链抗体(包括小型模块化免疫药物或 SM1Ps TM)Fab 和 F(alY)2 片段等。抗体可以是人源化、嵌合化、去免疫化或完全人源化。 许多出版物阐述了许多类型的抗体和改造此类抗体的方法。例如,参见美国专利号 6,355,245;6,180,370;5,693,762;6,407,213;6,548,640;5,565,332;5,225,539;6,103,889;和 25,260 功能等同于上述天然抗体。在某些实施方案中,修饰抗体提供改善的稳定性或/和治疗功效。修饰抗体的例子包括那些具有氨基酸残基的保守取代,以及一个或多个氨基酸缺失或添加的那些 不会显着有害地改变抗原结合 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 7 - PCT/US2008/011968 实用程序。 只要保持治疗效用,替代的范围可以从改变或修饰一个或多个氨基酸残基到完全重新设计一个区域。 本申请的抗体可以进行翻译后修饰(例如,乙酰化和/或磷酸化)或可以进行合成修饰(例如,标记基团的连接)。 具有工程化或变异恒定区或 Fc 区的抗体可用于调节效应子功能,例如抗原依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。 在正常组织中表达亲本单蛋白(表 1)的情况下,此类具有工程化或变异恒定区或 Fc 区的抗体可能有用; 在这些情况下,没有效应子功能的变体抗体可能会引发所需的治疗反应,同时不会损害正常组织。因此,本公开的某些方面和方法涉及具有改变的效应子功能的抗体,其包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。术语“生物活性”是指具有结构、调节或生物化学性质的蛋白质 天然存在的分子的功能。 同样,“免疫活性”是指天然、重组或合成的 CD74-ROS 融合多肽或截短的 ROS 多肽或其任何寡肽在适当的动物或细胞中诱导特异性免疫反应并与特异性抗体结合的能力 . 术语“生物样品”以其最广义使用,是指任何怀疑含有 CD74-ROS 融合或截短的 ROS 多核苷酸或多肽或其片段的生物样品,并且可以包含细胞、从细胞分离的染色体(例如, 中期染色体的扩散),基因组 DNA(在溶液中或结合到固体支持物上,例如用于 Southern 分析),RNA(在溶液中或结合到固体支持物上,例如用于 Northern 分析),cDNA(在溶液中或结合到固体上 支持物)、细胞、血液、尿液、骨髓或组织等的提取物。 除非另有定义,本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。 本文参考了本领域技术人员已知的各种方法和材料。 阐明重组 DNA 技术一般原则的标准参考著作包括 Sambrook 等人,分子克隆:实验室手册,第 2 版,冷泉港实验室出版社,纽约(1989 年); Kaufman et al., Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)。 阐述药理学一般原则的标准参考著作包括 Goodman 和 Gilman 的 The Pharmacological Basis of Therapeutics,第 11 版,McGraw Hill Companies Inc.,纽约(2006 年)。 关于癌症和突变型 ROS 多核苷酸或多肽的“特征在于”是指与其中存在此​​类易位和/或融合多肽的癌症相比,存在 CD74-ROS 基因易位和/或表达的融合多肽的癌症 不存在。 这种融合多肽的存在可以全部或部分地驱动这种癌症的生长和存活。 “共有”是指已重新测序以解析未识别碱基的核酸序列,或已使用 XLPCRTM(Perkin Elmer, Norwalk, CT)在 5' 和/或 3' 方向延伸并重新测序的核酸序列。 已测序,或已使用 GELVIEWTM 片段组装系统(GCG,麦迪逊,威斯康星州)从多个 CA 02702686 的重叠序列组装而成 2010-04-15 WO 2009/051846 - 8 - PCT/US2008/011968 一个因塞特克隆 ,或者已经扩展和组装。 “ROS激酶抑制治疗剂”是指包含一种或多种化学或生物化合物的任何组合物,其直接或间接抑制野生型或截短ROS的表达和/或活性,单独和/或作为ROS的一部分 CD74-ROS 融合蛋白。 “衍生物”指编码CD74-ROS融合多肽的核酸序列或编码的多肽本身的化学修饰。 此类修饰的示例是用烷基、酰基或氨基取代氢。 核酸衍生物将编码保留天然分子的基本生物学特征的多肽。 关于本文公开的多肽、多核苷酸或试剂的“可检测标记”是指化学、生物或其他修饰,包括但不限于荧光、质量、残基、染料、放射性同位素、标记或标签修饰等, 通过它可以检测感兴趣的分子的存在。 关于CD74-ROS融合多肽在生物样品中的“表达”或“表达”是指与其中不显着表达该融合多肽的对照样品相比显着表达。“重同位素标记肽”(与 AQUA 肽可互换使用)是指包含至少一种重同位素标记的肽,适用于蛋白质的绝对定量或检测,如 WO/03016861,“蛋白质的绝对定量和 通过多级质谱法改进其形式”(Gygi 等人),下文将进一步讨论。 关于这种AQUA肽的术语“特异性检测”是指该肽将仅检测和定量含有AQUA肽序列的多肽和蛋白质,而基本上不检测不含有AQUA肽序列的多肽和蛋白质。 “分离的”(或“基本上纯化的”)是指从其自然环境中移出、分离或分开的核酸或氨基酸序列。 它们优选至少60%不含,更优选75%不含,最优选90%或更多不含与它们天然结合的其他组分。 “模拟物”是指一种分子,其结构是根据 CD74-ROS 融合多肽或其部分的结构知识开发的,因此能够影响易位相关蛋白样分子的部分或全部作用 . “突变型 ROS”多核苷酸或多肽意指如本文所述的 CD74-ROS 融合多核苷酸或多肽。 “多核苷酸”(或“核苷酸序列”)是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分,以及基因组或合成来源的 DNA 或 RNA,其可以是单链或双链的,并且代表 有义链或反义链。 “多肽”(或“氨基酸序列”)是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分,以及天然存在或合成的分子。 其中“氨基酸序列”在本文中是指天然存在的蛋白质的氨基酸序列 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 9 - PCT/US2008/011968 分子、“氨基酸序列”和类似术语 诸如“多肽”或“蛋白质”之类的术语并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。 “CD74-ROS 融合多核苷酸”是指从任何物种,特别是哺乳动物,包括牛、绵羊、猪、鼠、马和 优选人,来自任何来源,无论是天然的、合成的、半合成的还是重组的。 “CD74-ROS 融合多肽”是指本文所述的基本上纯化的 CD74-ROS 融合多肽的氨基酸序列,其获自任何物种,特别是哺乳动物,包括牛、绵羊、猪、鼠、马,优选人,来自任何 来源无论是天然的、合成的、半合成的还是重组的。 关于抗体与蛋白质或肽的相互作用的术语“特异性结合”(或“特异性结合”或“特异性结合”)是指相互作用取决于特定结构的存在(即, 蛋白质上的抗原决定簇或表位); 换句话说,抗体识别并结合特定的蛋白质结构,而不是一般的蛋白质。 术语“不结合”关于抗体与非特异性序列或抗原决定簇的结合是指与抗体与抗体特异性抗原决定簇或序列的结合相比基本上不发生反应。 关于序列或探针杂交条件的术语“严格条件”是发生在约 Trõ 负 5°C(低于探针或序列的解链温度 (Tõ,) 5°C)至约 20 C 至低于 Tm 25 C。 典型的严格条件是:在 42°C 的溶液中过夜孵育,该溶液包含:50% 甲酰胺、5 X.SSC(750 mM NaCl、75 mM 柠檬酸三钠)、50 mM 磷酸钠 (pH 7.6)、5X Denhardt 溶液、10% 葡聚糖 硫酸盐和 20 微克/毫升变性的、剪切的鲑鱼精子 DNA,然后在约 65°C 的 0.1X SSC 中洗涤过滤器。正如本领域技术人员所理解的,可以改变杂交的严格性以便 识别或检测相同或相关的多核苷酸序列。CD74-ROS融合多肽多肽的“变体”是指被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。 变体可以具有“保守”变化,其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质,例如用异亮氨酸替代亮氨酸。 .. 更罕见的是,变体可能具有“非保守”变化,例如,用色氨酸替换甘氨酸。 类似的微小变化也可能包括氨基酸缺失或插入,或两者兼而有之。 使用本领域熟知的计算机程序,例如DNASTAR软件,可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或删除而不消除生物学或免疫学活性的指导。 A. 鉴定人 NSCLC 中的突变体 ROS 激酶。 本文公开的新型人类基因易位发生在人类 NSCLC 的染色体 (5q32) 和染色体 (6q22) 之间,并导致两种变体融合蛋白的表达,这些融合蛋白将 CD74 的 N 末端(外显子 1-6)与跨膜和 ROS 的激酶结构域(外显子 34-43)在 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 10 - PCT/US2008/011968 对人类非小细胞肺提取物中的整体磷酸化肽谱的检查中出人意料地被识别出来 癌 (NSCLC) 患者,肺癌的一种亚型。 涉及此易位的染色体、基因和产物如图 1 所示。使用最近描述的从复杂混合物中分离和质谱表征修饰肽的技术阐明了该细胞系的磷酸化谱(参见美国专利公开号 . 20030044848,Rush 等人,“从复杂混合物中分离修饰的肽”(“IAP”技术),如本文实施例 1 中进一步描述。使用磷酸酪氨酸特异性抗体(CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411),鉴定出 NSCLC 患者表达 ROS 激酶(与大多数其他 NSCLC 患者不同,后者不表达)。该筛选鉴定了此中的许多其他活化激酶 患者包括 ROS。通过 5' RACE 分析 5' 到 ROS 的序列,然后确定该激酶融合到 CD74 的 N 末端(参见图 5)。如图 1 的面板 B 所示,CD74-ROS 易位 将 CD74 的 N-末端(氨基酸 1-208)与 ROS(氨基酸 1853-2347)的跨膜和激酶结构域(也参见 SEQ ID NO:1)结合,以产生融合(参见图 1 的 C 组) ). 易位保留了 CD74 的 5'-最跨膜结构域。 得到的 CD74-ROS 融合蛋白包含 703 个氨基酸(参见图 1 的 C 组和图 2(SEQ ID NO:1),预计会保留 ROS 的激酶活性。人类 NSCLC 的整体磷酸肽谱分析和 FISH 分析 B. 分离的多核苷酸 本发明部分地提供了编码 CD74 的分离的多核苷酸。 -ROS 融合多肽、与此类多核苷酸杂交的核苷酸探针,以及利用此类多核苷酸产生重组融合多肽的方法、载体和宿主细胞。除非另有说明,否则通过对本文的 DNA 分子进行测序而确定的所有核苷酸序列均使用自动化方法确定 DNA 测序仪(例*自 Applied Biosystems,Inc. 的 373 型)和本文确定的 DNA 分子编码的多肽的所有氨基酸序列均使用自动肽测序仪确定。 对于通过这种自动化方法确定的任何 DNA 序列,本领域已知,本文确定的任何核苷酸序列可能包含一些错误。 通过自动化确定的核苷酸序列通常至少约90%相同,更通常至少约95%至至少约99.9%与已测序的DNA分子的实际核苷酸序列相同。 实际序列可以通过其他方法更精确地确定,包括本领域熟知的手动DNA测序方法。如本领域还已知的,与实际序列相比,确定的核苷酸序列中的单个插入或缺失将导致核苷酸序列翻译中的移码,使得由确定的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列将完全 与已测序 DNA 分子实际编码的氨基酸序列不同,从此类插入或缺失点开始。 除非另有说明,本文中列出的每个核苷酸序列均表示为 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-11-PCT/US2008/011968 脱氧核糖核苷酸序列(缩写为 A、G、C 和 T)。 然而,核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”是指,对于DNA分子或多核苷酸,是脱氧核糖核苷酸的序列,对于RNA分子或多核苷酸,是指相应的核糖核苷酸序列(A、G、C和U ), 其中指定脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核糖核苷酸 (T) 都被核糖核苷酸尿苷 (U) 替换。 例如,提及具有 SEQ ID NOs:2 序列或使用脱氧核糖核苷酸缩写列出的 RNA 分子意在表示具有这样序列的 RNA 分子,其中 SEQ ID NOs:2 的每个脱氧核糖核苷酸 A、G 或 C 已被 由相应的核糖核苷酸 A、G 或 C 取代,并且每个脱氧核糖核苷酸 T 已被核糖核苷酸 U 取代。在一个实施方案中,本发明提供了一种分离的多核苷酸,其包含与选自下组的序列至少 95% 相同的核苷酸序列 的:(a)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CD74-ROS融合多肽的核苷酸序列; (b) 编码 CD74-ROS 融合多肽的核苷酸序列,其包含 CD74 的 N 端氨基酸序列(SEQ ID NO:3 的残基 1-208)和 ROS 的激酶结构域(SEQ ID NO 的残基 1945-2222) : 5); (c)包含CD74的N端核苷酸序列(SEQ ID NO:4的残基1-624)和ROS的激酶结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:6的残基6032-6865)的核苷酸序列; (d)包含至少六个连续核苷酸的核苷酸序列,其包含CD74-ROS融合多核苷酸的融合连接点(SEQ ID NO:2的残基622-627); (e) 编码包含至少六个连续氨基酸的多肽的核苷酸序列,所述氨基酸包含融合连接点(CD74-ROS 融合多肽的 SEQ ID NO: 1 的残基 208-209 ;和 (f) 与以下任一互补的核苷酸序列 (a)-(e)的核苷酸序列。使用本文提供的信息,例如图2中的核苷酸序列(SEQ ID NO:2),本发明的核酸分子编码本发明的突变ROS多肽 可以使用标准克隆和筛选程序获得,例如使用 mRNA 作为起始材料克隆 cDNA。融合基因也可以在其他肺癌或 CD74-ROS 易位(5q32、6q22)的癌症的 cDNA 文库中鉴定。 发生,或其中缺失或替代易位导致缺乏野生型激酶胞外结构域的截短 ROS 激酶的表达。CD74-ROS 易位基因产物的确定核苷酸序列(SEQ ID NO:2)编码激酶融合 蛋白质 703 个氨基酸(见图 2(SEQ ID NO:1)和图 1)。 CD74-ROS 融合多核苷酸包含野生型 CD74 的核苷酸序列部分(参见图 3(SEQ ID NO:3),其编码该蛋白质的 N 端(外显子 1-6)和核苷酸序列的部分 野生型 ROS(参见图 4(SEQ ID NO:5))编码该蛋白质的跨膜和激酶结构域(外显子 34-43)。参见图 1。如所示,本发明部分提供了成熟形式 CD74-ROS 融合蛋白。根据信号假说,哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号或分泌前导序列,一旦开始生长的蛋白质链穿过粗面内质网的输出,该信号或分泌前导序列就会从成熟蛋白质中切割下来。大多数 mammalian cells and even insect CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 12 - PCT/US2008/011968 细胞以相同的特异性切割分泌蛋白。然而,在某些情况下,分泌蛋白的切割并不完全一致,这 导致蛋白质上有两个或更多成熟物种。此外,长期以来已知分泌蛋白的切割特异性最终由完整蛋白的一级结构决定,也就是说,它是...多肽的氨基酸序列中固有的。 因此,本发明部分地提供了编码成熟 CD74-ROS 融合多肽的核苷酸序列,该融合多肽具有由鉴定为 ATCC 保藏号 ***-**** 的 cDNA 克隆编码的氨基酸序列,该克隆保藏于 根据布达佩斯条约的规定,2006 年 9 月 20 日美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。 具有由保藏的 cDNA 克隆编码的氨基酸序列的成熟 CD74-ROS 多肽是指通过在哺乳动物细胞(例如 COS 细胞,如下所述)中表达完整开放阅读框而产生的这种融合蛋白的成熟形式 由存放在宿主细胞中的载体中包含的克隆的人类 DNA 序列编码。 如所指出的,本发明的多核苷酸可以是RNA形式,例如mRNA,或DNA形式,包括例如通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA。 DNA 可以是双链或单链的。 单链DNA或RNA可以是编码链,也称为有义链,或者它可以是非编码链,也称为反义链。 本发明的分离的多核苷酸是核酸分子、DNA或RNA,它们已经从它们的天然环境中移除。 例如,出于本发明的目的,载体中包含的重组DNA分子被认为是分离的。 分离的DNA分子的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中纯化的(部分或基本上)DNA分子。 分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录物。 根据本发明的分离的核酸分子还包括合成产生的此类分子。 本发明的分离的多核苷酸包括图2所示的DNA分子(SEQ ID NOs:2)、包含图1所示的成熟CD74-ROS融合蛋白的编码序列的DNA分子(SEQ ID NOs:1),以及DNA分子 其包含与上述序列显着不同的序列,但由于遗传密码的简并性,其仍然是本发明的突变 ROS 多肽。 遗传密码在本领域中是众所周知的,因此,对于本领域的技术人员来说,产生这样的简并变体是常规的。 在另一个实施方案中,本发明提供了编码CD74-ROS融合多肽的分离的多核苷酸,其包含包含在上述保藏的cDNA克隆中的CD74-ROS易位核苷酸序列。 优选地,这种核酸分子将编码由保藏的cDNA克隆编码的成熟融合多肽。 在另一个实施方案中,本发明提供了编码 CD74-ROS 融合多肽的分离的核苷酸序列,其包含 CD74 的 N 端氨基酸序列(SEQ ID NO:3 的残基 1-208)和 ROS 的激酶结构域(残基 1945- SEQ ID NO:5 的 2222)。 在一个实施方案中,包含 ROS CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-13-PCT/US2008/011968 的激酶结构域的多肽包含 SEQ ID NO: 5 的残基 1853-2347(参见图 1,B 组) . 在另一个实施方案中,上述CD74的N端氨基酸序列和ROS的激酶结构域分别由包含SEQ ID NO:4的核苷酸1-624和SEQ ID NO:6的核苷酸6032-6865的核苷酸序列编码。 本发明还提供分离的多核苷酸,其包含具有与本发明的突变ROS融合多肽之一互补的序列的核苷酸序列。 此类分离的分子,特别是 DNA 分子,可用作基因作图的探针,通过与染色体的原位杂交,以及用于检测人体组织中 CD74-ROS 融合蛋白或截短的 ROS 激酶多肽的表达,例如通过 Northern 印迹分析 . 本发明还涉及本文所述的分离的核酸分子的片段。本发明的分离的CD74-ROS多核苷酸或截短的ROS多核苷酸的片段是指至少约15个核苷酸的片段,更优选至少约20个核苷酸,还更优选至少约30个核苷酸,甚至更优选,在 至少约 40 个核苷酸长,可用作本文讨论的诊断探针和引物。 当然,根据本发明,长度为约 50-1500 个核苷酸的较大片段也是有用的,如对应于保藏的 cDNA 的大部分(如果不是全部的话)CD74-ROS 核苷酸序列的片段或如图 2 所示 (SEQ ID NO:2)。 例如,长度至少为20个核苷酸的片段是指包括来自片段所源自的相应核苷酸序列的20个或更多个连续碱基的片段。 此类DNA片段的产生对技术人员来说是常规的,并且可以例如通过限制性核酸内切酶切割或通过超声处理剪切可从保藏的cDNA克隆获得或根据本文公开的序列合成的DNA来实现。 或者,此类片段可以直接合成生成。 本发明优选的核酸片段或探针包括编码CD74-ROS易位基因产物的融合连接的核酸分子(参见图1,B和C图)。 例如,在某些优选的实施方案中,本发明的分离的多核苷酸包含包含至少六个连续核苷酸的核苷酸序列/片段,其包含CD74-ROS融合多核苷酸的融合连接点(SEQ ID NO:2的残基622-627)。 在另一个优选的实施方案中,本发明的分离的多核苷酸包含编码多肽的核苷酸序列/片段,所述多肽包含至少六个连续氨基酸,其包含CD74-ROS融合的融合连接点(SEQ ID NO:1的残基208-209) 多肽。 另一方面,本发明提供分离的多核苷酸,其在严格杂交条件下与本文所述的本发明的突变ROS激酶多核苷酸的一部分杂交。 “严格杂交条件”意指在包含以下的溶液中在 42°C 过夜孵育:50% 甲酰胺、5 X.SSC(750 mM NaCl、75 mM 柠檬酸三钠)、50 mM 磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt 溶液, 10% 硫酸葡聚糖和 20 微克/毫升变性、剪切的鲑鱼精子 DNA,然后在 0.1X SSC 中在约 65°C 下清洗过滤器。 CA 02702686 2015-07-28 W02009/051846 - 14- PCT/US2008/011968 作者 与多核苷酸的“部分”杂交的多核苷酸意指与至少约15个核苷酸(nt)杂交的多核苷酸(DNA或RNA),更优选至少约20nt,还更优选至少约30nt ,甚至更优选参考多核苷酸的约30-70nt。 这些可用作诊断探针和引物(例如用于 PCR),如上文和下文更详细讨论的。 当然,与参考多核苷酸的较大部分杂交的多核苷酸(例如,图 2 中描述的成熟 CD74-ROS 融合多核苷酸(SEQ ID NO:2),例如,长度为 50-750 nt 的部分,或者甚至与 参考多核苷酸的全长也可用作根据本发明的探针,因为多核苷酸对应于保藏的 cDNA 的大部分(如果不是全部的话)核苷酸序列或图 2 中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO: 2).例如,“至少20个核苷酸长度”的多核苷酸的一部分意指来自参考多核苷酸的核苷酸序列的20个或更多个连续的核苷酸。如所指出的,这样的部分在诊断上是有用的或者作为探针 根据常规 DNA 杂交技术或作为引物用于通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增靶序列,如 MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd 中所述。 版,Sambrook, J.、Fritsch, E. F. 和 Maniatis, T., eds., Cold(;普林港实验室出版社,冷泉港,纽约州(1989 年)。当然,仅与 poly A 序列(例如图 2(SEQ ID NO:2)中所示的 CD74-ROS 序列的 3' 末端 poly(A) 区)或与 T ( 或 U) 残基,将不包括在用于与本发明核酸的一部分杂交的本发明的多核苷酸中,因为这样的多核苷酸将与任何含有 poly (A) 片段或补体的核酸分子杂交 其(例如,实际上任何双链 cDNA 克隆)。如所指出的,编码本发明的突变体 ROS 激酶多肽的本发明的核酸分子可以包括但不限于编码氨基酸序列的那些 成熟多肽本身;成熟多肽的编码序列和附加序列,例如编码前导序列或分泌序列的序列,例如前蛋白序列、前蛋白序列或前原蛋白序列;成熟多肽的编码序列 多肽,有或没有上述额外的编码序列,以及额外的非编码序列,包括例如但不限于内含子和非编码 5' 和 3 序列,例如转录的非翻译序列 在转录、mRNA 加工中的作用,包括剪接和聚腺苷酸化信号,例如——核糖体结合和 mRNA 的稳定性; 编码额外氨基酸的额外编码序列,例如提供额外功能的氨基酸。 因此,编码多肽的序列可以与标记序列融合,例如编码促进融合多肽纯化的肽的序列。 在本发明该方面的某些优选实施方案中,标记氨基酸序列是六组氨酸肽,例如pQE载体(Qiagen,Inc.)中提供的标签,其中许多是可商购的。 如 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-15-PCT/US2008/011968 描述于 Gentz 等人,Proc. 国家队。 学院。 科学。 USA 86:821-824 (1989),例如,六组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。 “HA”标签是另一种可用于纯化的肽,它对应于源自流感血凝素蛋白的表位,Wilson et al., Cell 37:767 (1984) 对此进行了描述。 如下所述,其他此类融合蛋白包括 CD74-ROS 融合多肽本身在 N-或 C-末端与 Fc 融合。 本发明进一步涉及本发明的核酸分子的变体,其编码本文公开的CD74-ROS融合多肽或截短的ROS激酶多肽的部分、类似物或衍生物。 变体可以自然发生,例如天然等位基因变体。 “等位变体”是指占据生物体染色体上给定基因座的基因的几种替代形式之一。 见,例如 GENES H, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)。 可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。 此类变体包括通过核苷酸取代、缺失或添加产生的那些。 取代、缺失或添加可涉及一个或多个核苷酸。 变体可以在编码区、非编码区或两者中改变。 编码区的改变可能产生保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。 其中特别优选的是沉默取代、添加和缺失,它们不改变本文公开的突变ROS激酶多肽的性质和活性(例如激酶活性)。 在这方面还特别优选的是保守取代。 本发明的进一步实施方案包括分离的多核苷酸,其包含至少90%相同的核苷酸序列。 在本发明的一些实施方案中,核苷酸与本发明的突变体 ROS 多核苷酸(例如,编码具有 图 2 中所示的完整氨基酸序列(SEQ ID NO:1;或编码 CD74 的 N 端和 ROS 的激酶结构域的核苷酸序列(参见图 1,B 组;以及图 3 和 4);或 与此类示例性序列互补的核苷酸)。通过具有与编码突变ROS激酶多肽的参考核苷酸序列至少例如95%“相同”的核苷酸序列的多核苷酸意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同,除了多核苷酸序列可能 编码突变 ROS 多肽的参考核苷酸序列的每 100 个核苷酸包含多达五个点突变。 换句话说,为了获得具有与参考核苷酸序列至少 95% 相同的核苷酸序列的多核苷酸,参考序列中最多 5% 的核苷酸可以被删除或替换为另一个核苷酸,或者多个核苷酸最多 参考序列中总核苷酸的5%可以插入到参考序列中。 参考序列的这些突变可能发生在参考核苷酸序列的 5" 末端位置或这些末端位置之间的任何位置,单独散布在参考序列的核苷酸之间或参考序列内的一个或多个连续组中。CA 02702686 2010 -04-15 WO 2009/051846 - 16 - PCT/US2008/011968 作为实际问题,任何特定核酸分子是否至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同于, 例如,图2所示的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)或上述保藏的cDNA克隆的核苷酸序列可以使用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8)常规确定 对于 Unix,Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711。Bestfit 使用 Smith 和 Waterman 的局部同源算法,Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981),找到最佳片段 两个序列之间的同源性。 当使用 Bestfit 或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参考 CD74-ROS 融合多核苷酸序列例如 95% 相同时,当然设置参数使得百分比 同一性是在参考核苷酸序列的全长上计算的,并且允许参考序列中核苷酸总数的高达 5% 的同源性缺口。 本发明在其范围内包括与图 2 中所示的核酸序列(SEQ ID NO:2)或核苷酸至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的核酸分子 SEQ ID NO:2的625-2172,或保藏的cDNA的核酸序列,无论它们是否编码具有ROS激酶活性的多肽。 这是因为即使特定核酸分子不编码具有 ROS 激酶活性的融合多肽,本领域技术人员仍然知道如何使用该核酸分子,例如,作为杂交探针或聚合酶链式反应 (PCR) 引物。 不编码具有激酶的多肽的本发明核酸分子的用途尤其包括,(1)在cDNA文库中分离CD74-ROS易位基因或其等位变体; (2) 原位杂交(例如,“FISH”)到中期染色体扩散以提供 CD74-ROS 易位基因的精确染色体定位,如 Verma 等人,HUMAN CHROMOSOMES:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press 中所述, 纽约(1988); Northern Blot分析用于检测特定组织中CD74-ROS融合蛋白mRNA的表达。 在本发明中还有与本发明的突变型ROS激酶多肽或保藏的cDNA的核酸序列具有至少95%同一性的序列的核酸分子,其实际上编码具有ROS激酶活性的融合多肽。 此类活性可能与本文公开的 CD74-ROS 融合蛋白(全长蛋白、成熟蛋白或保留激酶活性的蛋白片段)的活性相似,但不一定相同,如在特定 生物测定。 例如,ROS 的激酶活性可以通过确定其磷酸化一种或多种含酪氨酸的肽底物的能力来检查,例如“Src 相关肽”(RRLIEDAEYAARG),它是许多受体和非受体酪氨酸激酶的底物。由于遗传密码的简并性,本领域普通技术人员将立即认识到大量核酸分子具有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99 与保藏的cDNA的核酸序列或图2中所示的核酸序列(SEQ ID NO:2)相同%的将编码具有ROS激酶活性的融合多肽。 事实上,由于这些核苷酸序列的简并变体都编码相同的多肽,这对于 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 17 - PCT/US2008/011968 技术人员来说是清楚的,即使不进行上述比较 化验。 本领域将进一步认识到,对于不是简并变体的此类核酸分子,合理数目也将编码保留ROS激酶活性的多肽。 这是因为技术人员完全了解不太可能或不太可能显着影响蛋白质功能的氨基酸取代(例如,用第二个脂肪族氨基酸替换一个脂肪族氨基酸)。 例如,Bowie 等人在“Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,” Science 247: 1306-1310(1990) 中提供了有关如何进行表型沉默氨基酸替代的指导,其中描述了两个主要 研究氨基酸序列变化耐受性的方法。 熟悉此类技术的熟练技术人员还了解哪些氨基酸变化可能在蛋白质的特定位置是允许的。 例如,大多数隐藏的氨基酸残基需要非极性侧链,而表面侧链的很少特征通常是保守的。 其他此类表型沉默替代描述于 Bowie 等人,同上,以及其中引用的参考文献。 可以使用本领域熟知且普遍可用的DNA测序方法来实施本发明的任何多核苷酸实施方案。 这些方法可以使用诸如 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段、SEQUENASE(美国生物化学公司,克利夫兰,俄亥俄州)、Taq 聚合酶(Perkin Elmer)、耐热 T7 聚合酶(Amersham,Chicago,IL)等酶,或重组聚合酶的组合 和校对核酸外切酶,例如由 Gibco BRL(马里兰州盖瑟斯堡)销售的 ELONGASE 扩增系统。 优选地,该过程用诸如 Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.)、Peltier Thermal Cycler (PTC200 ;MJ Research, Watertown, MA) 和 ABI 377 DNA 测序仪 (Perkin Elmer) 的机器自动化。 编码本发明的突变体ROS多肽的多核苷酸序列可以利用部分核苷酸序列和使用本领域已知的各种方法来延伸以检测上游序列例如启动子和调节元件。 例如,一种可以采用的方法,“限制位点”PCR,使用通用引物来检索与已知基因座相邻的未知序列(Sarkar,G.,PCR Methods Applic. 2:318-322(1993))。 特别地,基因组DNA首先在存在引物到接头序列和特异于已知区域的引物的情况下被扩增。 示例性引物是本文实施例4中描述的那些。 然后使用相同的接头引物和第一轮内部的另一特异性引物对扩增序列进行第二轮 PCR。 每轮 PCR 的产物都使用适当的 RNA 聚合酶进行转录,并使用逆转录酶进行测序。 反向 PCR 也可用于使用基于已知区域的不同引物来扩增或延伸序列(Triglia 等人,Nucleic Acids Res. 16:8186(1988))。 引物可使用 OLIGO 4.06 引物分析软件(National Biosciences Inc., Plymouth, Min.)或其他合适的程序设计,长度为 22-30 个核苷酸,GC 含量为 50% 或更高,并且 在大约 68-72°C 的温度下与目标序列退火。该方法使用几种限制酶在基因的已知区域中生成合适的片段。 然后通过分子内连接将片段环化并用作 PCR 模板。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 18 - PCT/US2008/011968 另一种可以使用的方法是捕获 PCR,它涉及与人类和酵母人工染色体 DNA 中已知序列相邻的 DNA 片段的 PCR 扩增(Lagerstrom 等人) al., PCR Methods Applic. I: 111-119 (1991))。在该方法中,还可以使用多重限制性内切酶消化和连接,在进行 PCR 之前将工程化的双链序列放入 DNA 分子的未知部分。 另一种可用于检索未知序列的方法描述于 Parker 等人,Nucleic Acids Res. 19:3055-3060(1991))。 此外,人们可以使用 PCR、嵌套引物和 PROMOTERFINDER 文库来遍历基因组 DNA(Clontech,Palo Alto,Calif.)。 此过程避免了筛选文库的需要,并且有助于查找内含子/外显子连接点。 筛选全长 cDNA 时,最好使用经过大小选择以包含较大 cDNA 的文库。 此外,随机启动的文库更可取,因为它们将包含更多包含基因 5' 区域的序列。 对于寡聚 d(T) 文库不能产生全长 cDNA 的情况,使用随机引物文库可能尤其可取。 基因组文库可用于将序列延伸到 5' 和 3' 非转录调控区。 可商购的毛细管电泳系统可用于分析大小或确认测序或PCR产物的核苷酸序列。 特别地,毛细管测序可以使用用于电泳分离的可流动聚合物、激光激活的四种不同荧光染料(一种用于每个核苷酸),以及通过电荷耦合器件相机检测发射的波长。 可以使用适当的软件(例如 GENOTYPERTm 和 SEQUENCE NAVIGATORTm,Perkin Elmer)将输出/光强度转化为电信号,并且可以由计算机控制从样品加载到计算机分析和电子数据显示的整个过程。 毛细管电泳尤其适用于对特定样品中可能含量有限的小 DNA 片段进行测序。 C. 载体和宿主细胞。 本发明还提供包含本发明的分离的多核苷酸的重组载体、用重组载体基因工程化的宿主细胞,以及通过重组技术产生重组CD74-ROS多肽或其片段。 可以使用诸如感染、转导、转染、转染、电穿孔和转化的众所周知的技术将重组构建体引入宿主细胞中。 载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。 逆转录病毒载体可能具有复制能力或复制缺陷。 在后一种情况下,病毒繁殖通常只发生在互补的宿主细胞中。 可以将多核苷酸连接至含有用于在宿主中繁殖的选择标记的载体。 通常,将质粒载体引入沉淀物中,例如磷酸钙沉淀物,或引入带电脂质的复合物中。 如果载体是病毒,可以使用适当的包装细胞系在体外包装它,然后转导到宿主细胞中。 本发明可以用包含针对感兴趣的多核苷酸的顺式作用控制区的载体来实施。 适当的反式作用因子可由宿主提供,由互补载体提供或由载体本身提供 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 19 - PCT/US2008/011968 在引入宿主后。 在这方面的某些优选实施方案中,载体提供特异性表达,其可以是可诱导的和/或细胞类型特异性的(例如,那些可由易于操作的环境因素诱导的,例如温度和营养添加剂)。 包含本发明的 CD74-ROS 多核苷酸或截短的 ROS 多核苷酸的 DNA 插入物应可操作地连接到合适的启动子,例如噬菌体 λ PL 启动子、大肠杆菌 lac、trp 和 tac 启动子、SV40 早期和晚期启动子 和逆转录病毒 LTR 的启动子,仅举几例。 其他合适的启动子是技术人员已知的。 表达构建体将进一步包含用于转录起始、终止的位点,以及在转录区域中用于翻译的核糖体结合位点。 由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选地包括在开始处的翻译起始和适当位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。如所指出的,表达载体将优选包括至少一种选择标记。 此类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。 适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞,例如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞; 真菌细胞,例如酵母细胞; 果蝇S2、贪夜蛾Sf9等昆虫细胞; 动物细胞,如 CHO、COS 和 Bowes 黑色素瘤细胞; 和植物细胞。 用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。 优选用于细菌的载体包括 pQE70、pQE60 和 pQE-9,可从 Qiagen 获得; pBS 载体、Phagescript 载体、Bluescript 载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A,可从 Stratagene 获得; 和 ptrc99a、pKK223-3、pKI(233-3、pDR540、pRIT5,可从 Pharmacia 获得。优选的真核载体是可从 Stratagene 获得的 pWLNEO、pSV2CAT、p0G44、pXT1 和 pSG;以及可从 Pharmacia 获得的 pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL。 其他合适的载体对于技术人员来说是显而易见的。适用于本发明的已知细菌启动子包括大肠杆菌lad I和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λ PR和PL启动子 合适的真核启动子包括 CMV 立即早期启动子、HSV 胸苷激酶启动子、早期和晚期 SV40 启动子、逆转录病毒 LTR 的启动子,例如 Rous 肉瘤病毒 (RSV) 的启动子,和金属硫蛋白启动子, 例如小鼠金属硫蛋白-I 启动子。在酵母、酿酒酵母中,可以使用许多含有组成型或诱导型启动子(例如 α 因子、酒精氧化酶和 PGH)的载体。有关评论,请参见 Ausubel 等人。 (1989) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grant etal., Methods Enzymol. 153:516-544(1997)。 可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法将构建体引入宿主细胞。 此类方法在许多标准实验室手册中都有描述,例如 Davis 等人,分子生物学中的基本方法 (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY) (1986)。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 20 - PCT/US2008/011968 高等真核生物对编码本发明的CD74-ROS融合多肽的DNA的转录可通过将增强子序列插入载体而增加。 增强子是 DNA 的顺式作用元件,通常长约 10 至 300 bp,在给定宿主细胞类型中起到增加启动子转录活性的作用。 增强子的例子包括 SV40 增强子,它位于复制起点的 100 到 270 碱基对的后期,巨细胞病毒早期启动子增强子,复制起点后期的多瘤增强子和腺病毒增强子。 为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、周质空间或细胞外环境中,可以将适当的分泌信号掺入所表达的多肽中。 信号可以是多肽的内源性信号或者它们可以是异源信号。 多肽可以以修饰的形式表达,例如融合蛋白(例如GST-融合蛋白),并且不仅可以包括分泌信号,还可以包括额外的异源功能区。 例如,可以在多肽的 N 末端添加一个额外的氨基酸区域,特别是带电荷的氨基酸,以提高在宿主细胞中、在纯化过程中或在随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。 此外,可以将肽部分添加到多肽中以促进纯化。 可以在最终制备多肽之前去除这些区域。 向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、提高稳定性和促进纯化等是本领域熟悉和常规的技术。 优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的异源区域,其可用于溶解蛋白质。例如,EP-A-0 464 533(加拿大对应文件 2045869)公开了融合蛋白,其包含免疫球蛋白分子恒定区的各个部分以及另一种人类蛋白质或其部分。 在许多情况下,融合蛋白中的 Fc 部分完全有利于用于治疗和诊断,因此导致例如改善的药代动力学特性(EP-A 0232 262)。 另一方面,对于某些用途,希望能够在以所述有利方式表达、检测和纯化融合蛋白之后删除Fc部分。 当 Fc 部分被证明是治疗和诊断的障碍时,例如当融合蛋白用作免疫抗原时,就是这种情况。 例如,在药物发现中,人类蛋白质,例如 hIL5- 已经与 Fc 部分融合,用于高通量筛选分析以鉴定 hIL-5 的拮抗剂。 参见 Bennett 等人,Journal of Molecular Recognition 8:52-58(1995)和 Johanson 等人,The Journal of Biological Chemistry 270(16):9459-9471(1995)。 CD74-ROS多肽可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化,包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。 最优选地,使用高效液相色谱法(“HPLC”)进行纯化。 本发明的多肽包括天然纯化产物、化学合成过程的产物和通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物,包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。 根据 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-21-PCT/US2008/011968 重组生产程序中使用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。 此外,本发明的多肽还可以包括初始修饰的甲硫氨酸残基,在一些情况下作为宿主介导过程的结果。 因此,在一个实施方案中,本发明提供了一种通过在适合融合多肽表达的条件下培养重组宿主细胞(如上所述)并回收该多肽来产生重组CD74-ROS融合多肽的方法。 适于宿主细胞生长和从此类细胞表达重组多肽的培养条件是本领域技术人员众所周知的。 参见,例如,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel FM 等人,编辑,第 2 卷,第 16 章,Wiley Interscience。 .. D. 分离的多肽。 本发明还部分地提供了分离的CD74-ROS融合多肽及其片段。 在一个实施方案中,本发明提供了一种分离的多肽,其包含与选自以下的序列至少95%相同的氨基酸序列:(a)编码CD74-ROS融合多肽的氨基酸序列,其包含以下氨基酸序列 序列号:1; (b) 编码 CD74-ROS 融合多肽的氨基酸序列,其包含 CD74 的 N 端氨基酸序列(SEQ ID NO:3 的残基 1-208)和 ROS 的激酶结构域(SEQ ID NO:3 的残基 1945-2222) 序列号:5); (c) 编码多肽的氨基酸序列,该多肽包含至少六个连续氨基酸,包含 CD74-ROS 的融合连接点(SEQ ID NO: 1 的残基 208-209 或 SEQ ID NO: 3 的残基 208-209) 融合多肽; 在一个优选的实施方案中,本发明提供了一种分离的CD74-ROS融合多肽,其具有由上述保藏的cDNA(ATCC保藏号***-****)编码的氨基酸序列。 在另一个优选的实施方案中,提供了本发明的重组突变体多肽,其可以使用如上所述的重组载体或重组宿主细胞产生。 本领域将认识到CD74-ROS融合多肽的一些氨基酸序列可以改变而不显着影响突变蛋白的结构或功能。 如果考虑到这种序列差异,应该记住,蛋白质上会有决定活性的关键区域(例如 ROS 的激酶结构域)。通常,可以替换形成三级结构的残基,前提是使用执行相似功能的残基。 在其他情况下,如果改变发生在蛋白质的非关键区域,则残基的类型可能完全不重要。 因此,本发明进一步包括CD74-ROS融合多肽的变体,其表现出显着的ROS激酶活性或包括CD74和ROS蛋白质的区域,例如下面讨论的蛋白质部分。 这样的突变体包括缺失、插入、倒位、重复和类型取代(例如,用一个亲水性残基代替另一个,但通常不是强亲水性的强疏水性残基)。 小的变化或这种“中性”氨基酸取代通常对活性几乎没有影响。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 22 - PCT/US2008/011968 通常被视为保守取代的是脂肪族氨基酸 Ala、Val、Leu 和 Ile 之间的替换; 羟基残基Ser和Thr的互换,酸性残基Asp和Glu的互换,酰胺残基Asn和Gin的互换,碱性残基Lys和Arg的互换以及芳族残基Phe、Tyr的互换。 本领域技术人员已知的保守氨基酸取代的实例是:芳香族:苯丙氨酸色氨酸酪氨酸; 疏水性:亮氨酸异亮氨酸缬氨酸; 极性:谷氨酰胺天冬酰胺; 基本:精氨酸赖氨酸组氨酸; 酸性:天冬氨酸谷氨酸; 小:丙氨酸丝氨酸苏氨酸蛋氨酸甘氨酸。 如上文详细指出的,关于哪些氨基酸变化可能表型沉默(即,不太可能对功能具有显着有害影响)的进一步指导可以在 Bowie 等人,Science 247,同上中找到。 本发明的多肽优选地以分离的形式提供,并且优选地是基本上纯化的。 可通过 Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988) 中描述的一步法基本上纯化本发明的重组产生的 CD74-ROS 融合多肽。 本发明的多肽包括图2的CD74-ROS融合多肽(SEQ ID NOs:1)(无论是否包括前导序列),由保藏的cDNA克隆编码的融合多肽(ATCC No.***- ****),编码CD74-ROS融合多肽的氨基酸序列包含CD74的N端氨基酸序列(SEQ ID NO:5的残基1-208)和ROS的激酶结构域(残基1945-2222) SEQ ID NO: 7 的残基),以及编码包含至少六个连续氨基酸的多肽的氨基酸序列,其包含 CD74-ROS 融合多肽的融合连接点(SEQ ID NO: 1 的残基 208-209),以及 与上述那些具有至少90%相似性,更优选至少95%相似性,还更优选至少96%、97%、98%或99%相似性的多肽。 两个多肽的“%相似性”是指通过使用 Bestfit 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive)比较两个多肽的氨基酸序列产生的相似性分数 , Madison, Wis. 53711) 和确定相似性的默认设置。 Bestfit 使用 Smith 和 Waterman 的局部同源算法(Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981))来寻找两个序列之间的最佳相似性片段。 多肽的氨基酸序列与本发明的突变 ROS 多肽的参考氨基酸序列至少例如 95%“相同”是指多肽的氨基酸序列与参考序列相同,除了 CD74-ROS融合多肽的参考氨基酸序列的每100个氨基酸中,多肽序列可以包括多达五个氨基酸改变。 换句话说,为了获得具有与参考氨基酸序列至少 95% 相同的氨基酸序列的多肽,参考序列中最多 5% 的氨基酸残基可以被删除或被另一个氨基酸取代,或者 最多可将参考序列中总氨基酸残基的 5% 的氨基酸数插入参考序列中。参考序列的这些改变可能发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 23 - PCT/US2008/011968 末端位置或这些末端位置之间的任何位置,单独散布 在参考序列中的残基之间或参考序列内的一个或多个连续组中。 当使用 Bestfit 或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参考序列例如 95% 相同时,参数当然被设置为使得同一性百分比被计算超过 参考氨基酸序列的全长以及参考序列中氨基酸残基总数最多 5% 的同源性缺口是允许的。 本发明的CD74-ROS融合多肽可用作SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱上的分子量标记,例如,使用本领域技术人员熟知的方法。 如下文进一步详细描述的,本发明的多肽还可用于产生融合多肽特异性试剂,例如多克隆抗体和单克隆抗体,其可用于如下所述的检测突变ROS多肽表达的测定或作为激动剂和拮抗剂 能够增强或抑制突变的 ROS 蛋白功能/活性。 此外,此类多肽可用于酵母双杂交系统以“捕获”CD74-ROS融合多肽结合蛋白,其也是根据本发明的候选激动剂和拮抗剂。 酵母二杂交系统描述于 Fields 和 Song,Nature 340:245-246 (1989)。 在另一个方面,本发明提供了一种肽或多肽,其包含本发明多肽的携带表位的部分,即包含CD74-ROS融合多肽变体的融合连接的表位。该多肽部分的表位具有免疫原性或抗原性 本发明多肽的表位。 “免疫原性表位”被定义为当整个蛋白质是免疫原时引发抗体反应的蛋白质的一部分。 这些免疫原性表位被认为局限于分子上的几个位点。 另一方面,抗体可以结合的蛋白质分子区域被定义为“抗原表位”。 蛋白质的免疫原性表位的数量通常少于抗原性表位的数量。 参见,例如,Geysen 等人,Proc。 国家队。 学院。 科学。 美国 8/:3998-4002 (1983)。 下面进一步详细描述本发明的融合多肽特异性抗体的产生。 由带有抗原表位的肽或多肽产生的抗体可用于检测模拟蛋白质,针对不同肽的抗体可用于追踪经历翻译后加工的蛋白质前体的各个区域的命运。 肽和抗肽抗体可用于模拟蛋白质的各种定性或定量测定,例如在竞争测定中,因为已经表明即使是短肽(例如,约 9 个氨基酸)也可以结合并取代蛋白质。 免疫沉淀测定中较大的肽。 参见,例如,Wilson 等人,Cell 37:767-778 (1984),第 777 页。本发明的抗肽抗体也可用于纯化模拟蛋白,例如,通过吸附层析,使用众所周知的方法 艺术。 下文更详细地描述了免疫学测定形式。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 24 - PCT/US2008/011968 重组突变 ROS 激酶多肽也在本发明的范围内,并且可以使用本发明的融合多核苷酸产生,如 B 部分所述 多于。 例如,本发明提供了一种通过在适合融合多肽表达的条件下培养重组宿主细胞(如上所述)并回收该多肽来产生重组CD74-ROS融合多肽的方法。 适于宿主细胞生长和从此类细胞表达重组多肽的培养条件是本领域技术人员众所周知的。 E、突变体特异性试剂用于实施所公开方法的突变体 ROS 多肽特异性试剂包括融合多肽特异性抗体和 AQUA 肽(重同位素标记的肽),对应于 CD74-CD74- ROS 融合多肽在生物样品中的表达。 融合多肽特异性试剂是能够特异性结合、检测和/或量化生物样品中表达的CD74-ROS融合多肽的存在/水平的任何生物或化学试剂。 该术语包括但不限于下文讨论的优选抗体和AQUA肽试剂,并且等效试剂在本发明的范围内。 抗体。 适用于实施本发明方法的试剂包括CD74-ROS融合多肽特异性抗体。 本发明的融合特异性抗体是特异性结合本发明的CD74-ROS融合多肽(例如SEQ ID NO:1)但基本上不结合野生型CD74或野生型ROS的一种或多种分离的抗体 . 其他合适的试剂包括特异性结合野生型 ROS 蛋白序列胞外结构域中表位的表位特异性抗体(该结构域不存在于本文公开的截短 ROS 激酶中),因此能够检测存在(或不存在) ) 样品中的野生型 ROS。 人 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体也可以结合其他哺乳动物物种(例如鼠或兔)中高度同源和等同的表位肽序列,反之亦然。 可用于实施本发明方法的抗体包括(a)单克隆抗体,(b)特异性结合靶多肽(例如CD74-ROS融合多肽的融合接头)的纯化多克隆抗体,(c)如(a)中所述的抗体 )-(b) 以上结合其他非人类物种(例如小鼠、大鼠)中等价和高度同源的表位或磷酸化位点,和 (d) 以上 (a)-(c) 的片段结合抗原(或 更优选地,表位)由本文公开的示例性抗体结合。本文使用的术语“抗体”指所有类型的免疫球蛋白,包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆的或 多克隆抗体,并且可以是任何来源的物种,包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人,或者可以是嵌合抗体。参见,例如,M. Walker 等人,Molec. Immunol. 26:403- 11(1989);Morrision 等人,Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81:6851 (1984);Neuberger 等人,Nature 312:604 (1984))。 抗体可以是重组单克隆抗体,根据美国专利 No. No. CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 25 - PCT/US2008/011968 4,474,893(阅读)或美国专利。 No. 4,816,567 (Cabilly et al.) 抗体也可以是根据美国专利 No. 4,816,567 中公开的方法制备的化学构建的特异性抗体。 No. 4,676,980 (Segel et al.) 本发明的 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体的优选表位位点是基本上由人 CD74-ROS 融合多肽序列的约 11 至 17 个氨基酸组成的肽片段(SEQ ID 否:1) 哪个片段包含融合连接点(它出现在第一个和第二个融合蛋白变体的残基 208 处(参见图 1(图 C)和图 7(下图))。应当理解,特异性结合的抗体 包含CD74-ROS融合多肽的融合连接的更短或更长的肽/表位在本发明的范围内。本发明不限于使用抗体,而是包括等效分子,例如蛋白质结合结构域或核酸适体 ,其以融合蛋白或截短蛋白特异性方式结合与可用于本发明方法的CD74-ROS融合多肽特异性抗体或ROS截短点表位特异性抗体基本上相同的表位。 参见,例如,Neuberger 等人,Nature 312:604(1984)。 此类等同的非抗体试剂可适当地用于下文进一步描述的本发明的方法中。 可根据标准技术通过免疫合适的动物(例如兔、山羊等)来产生用于实施本发明方法的多克隆抗体。)与包含所需融合蛋白特异性表位的抗原(例如融合连接,从动物收集免疫血清,从免疫血清中分离多克隆抗体,并根据已知程序纯化具有所需特异性的多克隆抗体。 抗原可以是包含所需表位序列的合成肽抗原,根据众所周知的技术选择和构建。参见,例如,ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p. 75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988);Czernik,Methods In Enzymology,201:264-283 (1991);Merrifield,J. Am. Chem. Soc. 85:21-49 (1962))。 可以如下文进一步描述的筛选和分离如本文所述产生的多克隆抗体。 单克隆抗体也可以有益地用于本发明的方法,并且可以根据众所周知的Kohler和Milstein技术在杂交瘤细胞系中产生。 自然 265:495-97(1975); 科勒和米尔斯坦,Eur。 J.免疫学。 6: 511(1976); 另请参阅分子生物学中的当前协议,Ausubel 等人。 编辑。 (1989)。 如此产生的单克隆抗体具有高度特异性,并提高了本发明提供的测定方法的选择性和特异性。 例如,可以将含有适当抗原的溶液(例如包含 CD74-ROS 融合多肽的融合连接的合成肽)注射到小鼠体内,并且在足够的时间后(与常规技术保持一致),处死小鼠并取脾脏。 获得的细胞。 然后通过将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,通常在聚乙二醇存在下,使脾细胞永生化,产生杂交瘤细胞。 例如,兔融合杂交瘤可以如 1997 年 10 月 7 日授予 C. Knight 的美国专利第 5,675,063 号中所述产生。然后杂交瘤细胞在合适的选择培养基中生长,例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT ), CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 26 - PCT/US2008/011968 和筛选具有所需特异性的单克隆抗体的上清液,如下所述。 可以通过沉淀、离子交换或亲和层析等常规方法从组织培养上清液中回收分泌的抗体。 单克隆 Fab 片段也可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中产生。 参见,例如,W. Huse, Science 246:1275-81 (1989); Mullinax 等人,Proc。 国家科学院。 科学。 87:8095(1990)。 如果一种同种型的单克隆抗体更适合特定应用,则可以通过从初始融合中选择来直接制备特定的同种型,或者通过使用同胞选择技术从分泌不同同种型单克隆抗体的亲本杂交瘤中进行二次制备以分离 类别转换变体(Steplewski 等人,Proc. Nat'l. Acad. Sci.,82:8653(1985);Spira 等人,J. 1mmunol. Methods,74:307(1984))。 单克隆抗体的抗原结合位点可通过 PCR 克隆,单链抗体可在大肠杆菌中作为噬菌体展示重组抗体或可溶性抗体产生(参见,例如,ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS,1995,Humana Press,Sudhir Paul 编辑。 )更进一步,美国专利。 美国专利号 5,194,392,Geysen (1990) 描述了一种检测或..确定单体(氨基酸或其他化合物)序列的一般方法,该单体(氨基酸或其他化合物)是与 感兴趣的抗体的特定互补位(抗原结合位点)。 更一般地,该方法涉及检测或确定单体序列,该序列是与感兴趣的特定受体的配体结合位点互补的配体的拓扑等价物。 同样,美国专利。 第 5,480,971 号,Houghten 等人。 (1996) 公开了线性 C1-C6-烷基全烷基化寡肽和此类肽的集合和文库,以及使用此类寡肽集合和文库来确定优先结合感兴趣的受体分子的全烷基化寡肽的序列的方法。 因此,本发明的带有表位的肽的非肽类似物也可以通过这些方法常规地制备。 可用于本发明方法的抗体,无论是多克隆抗体还是单克隆抗体,都可以根据标准技术针对表位和融合蛋白特异性进行筛选。看,例如 Czernik 等人,酶学方法,201:264-283 (1991)。 例如,可以通过 ELISA 针对肽文库筛选抗体,以确保对所需抗原的特异性,以及如果需要,仅与本发明的 CD74-ROS 融合多肽而不是与野生型 CD74 或野生型 ROS 的反应性 . 抗体也可以通过针对含有靶蛋白的细胞制剂的蛋白质印迹法进行测试,以确认仅与所需靶标的反应性,并确保与涉及 ROS 的其他融合蛋白没有明显的结合。 融合蛋白特异性抗体的产生、筛选和使用是本领域技术人员已知的,并且已经被描述。 参见,例如,美国专利公开号 20050214301,Wetzel 等人,2005 年 9 月 29 日。用于本发明方法的融合多肽特异性抗体可能与其他融合蛋白中的相似融合表位或与 形成融合连接的野生型 CD74 和野生型 ROS 中的表位。 这并不意外,因为大多数抗体表现出一定程度的交叉反应性,并且抗肽抗体通常会与与免疫肽具有高度同源性或同一性的表位发生交叉反应。 参见,例如,Czernik,同上。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 27 - PCT/US2008/011968 与其他融合蛋白的交叉反应很容易通过蛋白质印迹法与已知分子量的标记物一起表征。 可以检查交叉反应蛋白的氨基酸序列以鉴定与抗体结合的 CD74-ROS 融合多肽序列高度同源或相同的位点。 不需要的交叉反应可以通过在肽柱上使用抗体纯化进行负选择来去除(例如选择出结合野生型 CD74 和/或野生型 ROS 的抗体)。 可用于实施本文公开的方法的本发明的 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体理想地对人融合多肽具有特异性,但不仅限于结合人类物种本身。 本发明包括抗体的生产和使用,这些抗体也结合其他哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、猴)中的保守和高度同源或相同的表位。 其他物种中高度同源或相同的序列可以通过标准序列比较,例如使用 BLAST,与本文公开的人 CD74-ROS 融合多肽序列(SEQ ID NOs:1)容易地鉴定。 在本发明的方法中使用的抗体可以进一步表征并验证用于特定测定形式,例如FC、IHC和/或ICC。 在此类方法中使用 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体在下文 F 部分中进一步描述。 抗体也可以有利地与荧光染料(例如 Alexa488、PE)或标记物(例如量子点)结合,以用于多参数分析以及其他信号转导(磷酸-AKT、磷酸-Erk 1/2)和/或 细胞标记物(细胞角蛋白)抗体,如下文 F 节所述。 在实施本发明的方法时,也可以使用针对这些野生型蛋白质的抗体(磷酸特异性或总抗体)有利地检查给定生物样品中野生型CD74和/或野生型ROS的表达和/或活性。 例如,CSF 受体磷酸化位点特异性抗体是可商购的(参见 CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly MA, 2005/06 Catalogue, #'s 3151、3155 和 3154 ;以及 Upstate Biotechnology, 2006 Catalogue, #06- 457). 此类抗体也可根据标准方法产生,如上文所述。 人类 CD74 和 ROS 的氨基酸序列已公布(参见图 3 和 4,以及参考的 SwissProt 登录号),以及来自其他物种的这些蛋白质的序列。 在生物样品(例如肿瘤样品)中检测野生型 CD74 和野生型 ROS 表达和/或激活,以及 CD74-ROS 融合多肽表达,可以提供有关融合蛋白是否单独驱动肿瘤,或是否 野生型 ROS 也被激活并驱动肿瘤。 此类信息在临床上可用于评估是否靶向融合蛋白或野生型蛋白或两者,或可能最有利于抑制肿瘤的进展,以及选择合适的治疗剂或其组合。对野生型 ROS 激酶细胞外结构域特异的抗体(不存在于本文公开的截短 ROS 激酶中)可能特别适用于确定突变 ROS 激酶的存在/不存在。 应当理解,在上述方法的实践中可以使用不止一种抗体。 例如,一种或多种 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体连同一种或多种对另一种激酶、受体或激酶底物具有特异性的抗体,这些激酶、受体或激酶底物被怀疑在或可能在 CD74-ROS 融合的癌症中被激活 CA 02702686 2015-07-28 WO 2009/051846 -28-PCT/US2008/011968 同时用于检测包含来自此类癌症的细胞的生物样品中此类其他信号分子的活性。 本领域的技术人员将理解本发明的CD74-ROS融合多肽及其上述融合连接表位携带片段可以与免疫球蛋白(IgG)的部分恒定结构域组合,产生嵌合多肽,这些 融合蛋白促进纯化并显示增加的体内半衰期。 例如,对于由人 CD4 多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白,这已得到证明(EPA 394,827;Traunecker 等人,Nature 331:84) - 86(1988))。 由于 IgG 部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白也可以比单独的单体 CD74-ROS 融合多肽更有效地结合和中和其他分子(Fountoulakis 等人,J Biochem 270:3958-3964(1995) ). Heavy- Isotom Labeled Pc tides A UA Pe )title)。 用于实施所公开方法的 CD74-ROS 融合多肽特异性试剂还可包含重同位素标记的肽,适用于对生物样品中表达的 CD74-ROS 融合多肽进行绝对定量。 已经描述了用于复杂混合物中蛋白质 (AQUA) 绝对定量的 AQUA 肽的生产和使用。 参见 WO/03016861,“通过多级质谱法对蛋白质及其修饰形式进行绝对定量”,Gygi 等人。 还有 Gerber 等人。 过程。 国家队。 学院。 科学。 美国 100:6940-5 (2003)。 AQUA 方法采用将已知量的至少一种重同位素标记的肽标准品(具有可通过 LC-SRM 色谱法检测的独特特征)引入消化的生物样品中,以便通过与肽标准品比较来确定, 生物样品中具有相同序列和蛋白质修饰的肽的绝对量。 简而言之,AQUA 方法学分为两个阶段:肽内标的选择和验证以及方法开发; 并使用经过验证的肽内部标准来检测和量化样品中的目标蛋白质。 该方法是一种强大的技术,可用于检测和量化复杂生物混合物(例如细胞裂解物)中的给定肽/蛋白质,并且可用于量化药物处理后蛋白质磷酸化的变化,或量化 不同生物状态下蛋白质水平的差异。 通常,为了开发合适的内标,目标蛋白质序列中的特定肽(或修饰肽)是根据其氨基酸序列和用于消化的特定蛋白酶来选择的。 然后通过固相肽合成生成肽,这样一个残基被含有稳定同位素 (1'5N) 的相同残基取代。 结果是一种肽,其化学性质与其通过蛋白水解形成的天然对应物相同,但通过 7-Da 质量转移可通过 MS 轻松区分。 然后通过 LC¨MS/MS 评估新合成的 AQUA 内标肽。 该过程通过反相色谱、电离效率和通过碰撞诱导解离提供有关肽保留的定性信息。选择天然和内标肽组的信息丰富的碎片离子,然后进行专门监测 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 29 - PCT/US2008/011968 作为色谱保留的函数快速连续地形成 基于肽标准品独特特征的选择反应监测 (LC¨SRM) 方法。 AQUA 策略的第二阶段是测量复杂混合物中蛋白质或修饰蛋白质的量。 全细胞裂解物通常通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离,并切除与蛋白质迁移一致的凝胶区域。 该过程之后是在 AQUA 肽和 LC¨SRM 分析存在的情况下进行凝胶内蛋白水解。 (参见 Gerber et al. supra.)AQUA 肽被掺入复杂的肽混合物中,该混合物通过用蛋白水解酶消化全细胞裂解物获得,并如上所述进行免疫亲和纯化。 通过消化(例如胰蛋白酶消化)形成的天然肽的保留时间和碎裂模式与之前测定的 AQUA 内标肽相同; 因此,使用 SRM 实验的 LC-MS/MS 分析可以直接从极其复杂的肽混合物中对内标和分析物进行高度特异性和灵敏的测量。 由于添加了绝对量的 AQUA 肽(例如 250 fmol),曲线下面积的比率可用于确定原始细胞裂解物中蛋白质或蛋白质磷酸化形式的精确表达水平。 此外,随着天然肽的形成,凝胶内消化过程中存在内标,因此从凝胶片中提取肽的效率、样品处理过程中的绝对损失(包括真空离心)以及引入 LC¨MS 系统过程中的变异性 不影响天然和 AQUA 肽丰度的确定比率。 AQUA 肽标准品是针对先前通过 IAP-LC-MS/MS 方法在目标蛋白质中鉴定的已知序列开发的。 如果该位点被修饰,则可以开发一种在该位点内掺入特定残基的修饰形式的 AQUA 肽,并开发掺入未修饰形式的残基的第二种 AQUA 肽。 以这种方式,这两种标准可用于检测和量化生物样品中修饰和未修饰形式的位点。 肽内标也可以通过检查蛋白质的一级氨基酸序列和确定蛋白酶切割产生的肽的边界来产生。 或者,蛋白质实际上可以用蛋白酶消化,然后可以对产生的特定肽片段进行测序。 合适的蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、hepsin)、金属蛋白酶(例如 PUMP1)、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶等。靶蛋白内的肽序列根据一种选择 或更多标准来优化肽作为内标的使用。 优选地,选择肽的大小以最小化肽序列将在其他非靶蛋白中的别处重复的机会。 因此,肽优选至少约6个氨基酸。 肽的大小也经过优化以最大化电离频率。 因此,不优选长于约20个氨基酸的肽。 优选的范围是大约7至15个氨基酸。 还选择了在质谱分析期间不太可能发生化学反应的肽序列,因此避免了包含半胱氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的序列。 可以选择不包括目标区域的修饰区域的肽序列,以便可以使用肽内标来确定所有形式的蛋白质的量。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 30 - PCT/US2008/011968 或者,可能需要包含修饰氨基酸的肽内标以仅检测和定量靶蛋白的修饰形式。 修饰和未修饰区域的肽标准品可以一起使用,以确定特定样品中修饰的程度(即确定修饰形式代表蛋白质总量的多少部分)。 为了 ..例如,已知在特定位点磷酸化的蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式的肽标准品可用于量化样品中磷酸化形式的量。 使用一种或多种标记的氨基酸标记肽(即标记是肽的实际部分)或不太优选地,标记可以在根据标准方法合成后附上。 优选地,标签是基于以下考虑选择的改变质量的标签:质量应该是唯一的,以将 MS 分析产生的片段质量转移到具有低背景的光谱区域; 离子质量特征组分是标记部分的一部分,其在 MS 分析中优选表现出独特的离子质量特征; 标记的组成原子的质量总和优选与所有可能氨基酸的片段唯一不同。 因此,标记的氨基酸和肽很容易通过所得质谱中的离子/质量模式与未标记的氨基酸和肽区分开来。 优选地,离子质量特征组分赋予与20种天然氨基酸中的任何一种的残基质量不匹配的蛋白质片段的质量。 标签在 MS 的碎片条件下应该是稳健的,并且不会发生不利的碎片。 标记化学在一系列条件下应该是有效的,特别是变性条件下,标记的标签最好在所选的 MS 缓冲系统中保持可溶性。 标记优选不抑制蛋白质的电离效率并且不具有化学反应性。 标记可以包含两种或更多种同位素不同物质的混合物,以在每个标记的片段位置产生独特的质谱图。 稳定的同位素,例如 2H、'3C、'5N、'0、'80 或 34S,是优选的标记。也可以制备掺入不同同位素标记的肽内标对。优选的氨基酸残基中含有 可以掺入重同位素标记,包括亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。肽内标根据其质荷比 (m/z) 进行表征,最好还根据它们在色谱柱上的保留时间进行表征( 例如 HPLC 柱)。选择与相同序列的未标记肽共洗脱的内标作为最佳内标。然后通过任何合适的方法(例如碰撞诱导解离 (CID))对肽进行片段化来分析内标 使用例如氩气或氦气作为碰撞气体。然后分析碎片,例如通过多级质谱法(MS")以获得碎片离子谱,从而获得肽碎片特征。 优选地,肽片段在m/z比值上具有显着差异,使得每个片段对应的峰能够很好地分离,并且获得对于目标肽唯一的特征。 如果在第一阶段没有获得合适的片段签名,则执行额外的 MS 阶段,直到获得唯一的签名。 MS/MS 和 MS3 谱图中的碎片离子通常对感兴趣的肽具有高度特异性,并且与 LC 方法结合使用时,可以采用高选择性的方法来检测和量化目标 CA 02702686 2010-04-15 W02009/051846 -31 - PCT/US2008/011968 复杂蛋白质混合物中的肽/蛋白质,例如细胞裂解物,包含数千或数万种蛋白质。 任何可能含有感兴趣的靶蛋白/肽的生物样品都可以进行分析。 优选使用粗制或部分纯化的细胞提取物。 通常,样品含有至少 0.01 mg 的蛋白质,通常浓度为 0.1-10 mg/mL,并且可以调节至所需的缓冲液浓度和 pH 值。 然后将对应于待检测/定量的靶蛋白的已知量的标记肽内标,优选约10飞摩尔添加至生物样品,例如细胞裂解物。 然后用一种或多种蛋白酶消化加标样品一段合适的时间以允许消化。 然后进行分离(例如通过 HPLC、反相 HPLC、毛细管电泳、离子交换色谱等)以将标记的内标及其相应的目标肽与样品中的其他肽分离。 微毛细管 LC 是首选方法。然后通过监测 MS 中选定的反应来检查每个分离的肽。 这涉及使用通过表征肽内标获得的先验知识,然后要求 MS 连续监测目标肽和内标的 MS/MS 或 MS 谱图中的特定离子。洗脱后, 计算肽标准和目标肽峰的曲线下面积 (AUC)。这两个面积的比率提供了绝对定量,可以针对分析中使用的细胞数量和蛋白质的分子量进行归一化,以提供 每个细胞的蛋白质拷贝的精确数量。Gygi 等人和 Gerber 等人在上文中描述了 AQUA 方法的更多细节。如上所述,可能需要生产 AQUA 内部肽标准(重同位素标记的肽), 以检测本发明的突变ROS多肽内的任何定量的任何独特位点(例如,CD74-ROS融合多肽内的融合连接)。例如,可以制备对应于CD74-ROS融合的融合连接序列的AQUA磷酸肽 可以为 CD74-ROS 融合连接生产多肽标准品,此类标准品在 AQUA 方法中用于检测和量化融合连接(即 CD74-ROS 融合多肽)在生物样品中的存在。 例如,本发明的示例性AQUA肽包含氨基酸序列LVGDDF,其对应于CD74-ROS融合多肽的第二(短)变体中紧邻融合连接点每一侧的三个氨基酸。 应当理解,也可以构建包含融合连接序列(及其下游或上游的额外残基)的更大的AQUA肽。 类似地,可以备选地构建包含少于该序列的所有残基的更小的AQUA肽(但仍包含融合连接点本身)。 这种更大或更短的 AQUA 肽在本发明的范围内,并且优选的 AQUA 肽的选择和生产可以如上所述进行(参见 Gygi 等人,Gerber 等人,同上)。 核酸探针。 本发明提供的融合特异性试剂还包括适用于检测CD74-ROS多核苷酸的核酸探针和引物,如上文B部分中详细描述的。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-32-PCT/US2008/011968 此类探针在诸如荧光原位杂交(FISH)或PCR扩增等测定中的具体用途描述于下文F部分。 本发明还提供了一种用于检测生物样品中 CD74-ROS 融合多核苷酸和/或多肽的试剂盒,该试剂盒包含至少一种本发明的融合多核苷酸或多肽特异性试剂,以及一种或多种二级试剂 试剂。 在试剂盒中使用的合适的二级试剂是本领域技术人员所熟悉的,并且例如包括缓冲液、可检测的二级抗体或探针、激酶、活化剂、激酶底物等。 F. 诊断应用和化验形式。 本发明的方法可以以本领域技术人员已知的多种不同的测定形式进行。 免疫测定。 用于实施本发明方法的免疫测定可以是同质免疫测定或异质免疫测定。 在均相测定中,免疫反应通常涉及突变 ROS 多肽特异性试剂(例如 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体)、标记的分析物和感兴趣的生物样品。 抗体与标记分析物结合后,标记产生的信号会直接或间接发生变化。 免疫反应及其程度的检测均在均相溶液中进行。 可以使用的免疫化学标记包括自由基、放射性同位素、荧光染料、酶、噬菌体、辅酶等。 也可以有利地使用半导体纳米晶体标记或“量子点”,并且已经很好地描述了它们的制备和使用。 一般参见 K. Barovsky, Nanotech。 法律与公共汽车。 /(2):第 14 条 (2004) 和其中引用的专利。在异质测定方法中,试剂通常是生物样品、突变型 ROS 激酶多肽特异性试剂(例如抗体)和用于产生可检测信号的合适方法。 可以使用如下进一步描述的生物样品。 抗体通常固定在支持物上,例如珠子、板或载玻片,并与怀疑含有液相抗原的样品接触。 然后将载体与液相分离,并使用产生信号的装置检查载体相或液相的可检测信号。 该信号与生物样品中分析物的存在有关。 产生可检测信号的方法包括使用放射性标记、荧光标记、酶标记、量子点等。 例如,如果要检测的抗原含有第二结合位点,则结合该位点的抗体可以与可检测基团缀合,并在分离步骤之前添加到液相反应溶液中。 固体支持物上存在可检测基团表明测试样品中存在抗原。 合适的免疫测定的例子是放射免疫测定、免疫荧光法、酶联免疫测定等。 可用于实施本文公开的方法的免疫测定形式及其变体是本领域众所周知的。 一般参见 E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.); 另见,例如,美国专利。 第 4,727,022 号(Skold 等人,“Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application”); 美国专利 No. 4,659,678 (Forrest et al., CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 33 - PCT/US2008/011968 “Immunoassay of Antigens”); 美国专利 第 4,376,110 号(David 等人,“使用单克隆抗体进行免疫测定”)。 适用于形成试剂-抗体复合物的条件是本领域技术人员众所周知的。 见身份证。 CD74-ROS 融合多肽特异性单克隆抗体可用于“双位点”或“三明治”测定,单个杂交瘤细胞系用作标记的单克隆抗体和结合的单克隆抗体的来源。 此类测定描述于美国专利No. 第 4,376,110 号。 可检测试剂的浓度应足以使 CD74-ROS 融合多肽的结合与背景相比是可检测的。 根据已知技术,例如沉淀,可将用于实施本文公开的方法的抗体缀合至适用于诊断测定的固体支持物(例如,珠子、板、载玻片或由诸如乳胶或聚苯乙烯的材料形成的孔) . 抗体或其他 CD74-ROS 融合多肽结合试剂同样可以与可检测基团结合,例如放射性标记(例如 35S、1251、1310、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)和荧光标记(例如荧光素) 基于细胞的测定,如流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光(IF)在实践本发明的方法中是特别理想的,因为这样的测定形式是临床适用的, 允许在体内检测突变的 ROS 多肽表达,并避免因操纵从例如肿瘤样品获得的细胞以获得提取物而导致的活性人为变化的风险。因此,在一些优选的实施方案中,本发明的方法是 以流式细胞术 (FC)、免疫组织化学 (IHC) 或免疫荧光 (IF) 测定形式实施。流式细胞术 (FC) 可用于确定突变 ROS 多肽在哺乳动物肿瘤之前、期间和期间的表达。 在用靶向抑制 ROS 激酶活性的药物治疗后。 例如,如果需要,可以通过流式细胞术分析来自细针抽吸物的肿瘤细胞的CD74-ROS融合多肽表达和/或活化,以及鉴定癌细胞类型的标志物等。 流式细胞术可根据标准方法进行。 看,例如 Chow 等人,Cytometry(临床细胞术通讯)46:72-78(2001)。 简而言之,举例来说,可以采用以下细胞计数分析方案:在 37°C 下用 2% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟,然后在冰上在 90% 甲醇中透化 0 分钟。然后可以用初级 CD74-ROS 融合多肽特异性抗体对细胞进行染色,洗涤并用荧光标记的二抗进行标记。 然后根据所用仪器的特定方案在流式细胞仪(例如 Beckman Coulter FC500)上分析细胞。 这种分析将鉴定肿瘤中表达的 CD74-ROS 融合多肽的水平。 用 ROS 抑制疗法治疗肿瘤后的类似分析将揭示表达 CD74-ROS 融合多肽的肿瘤对 ROS 激酶靶向抑制剂的反应性。 免疫组织化学 (IHC) 染色也可用于确定在用靶向抑制 ROS 激酶活性的药物治疗之前、期间和之后突变 ROS 激酶多肽在哺乳动物癌症(例如 NSCLC)中的表达和/或活化状态。 IHC可以根据众所周知的技术进行CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 34 - PCT/US2008/011968。 参见,例如,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,第 10 章,Harlow & Lane Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。 简而言之,举例来说,石蜡包埋的组织(例*自活组织检查的肿瘤组织)通过先用二甲苯然后用乙醇脱石蜡组织切片来制备用于免疫组织化学染色; 在水中水化,然后在 PBS 中; 通过在柠檬酸钠缓冲液中加热载玻片来暴露抗原; 在过氧化氢中孵育切片; 在封闭溶液中封闭; 抗CD74-ROS融合多肽一抗和二抗孵育玻片; 最后根据制造商的说明使用 ABC 亲和素/生物素方法进行检测。 免疫荧光 (IF) 测定法也可用于确定在用靶向抑制 ROS 激酶活性的药物治疗之前、期间和之后哺乳动物癌症中 CD74-ROS 融合多肽的表达和/或活化状态。 IF可根据众所周知的技术进行。 参见,例如,J.M. polak 和 S. Van Noorden (1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY,第 2 版; 皇家显微镜学会显微镜手册 37,BioScientific/Springer-Verlag。 简而言之,举例来说,患者样本可以固定在多聚甲醛中,然后用甲醇固定,用马血清等封闭溶液封闭,用抗 CD74-ROS 融合多肽的一抗孵育,然后用荧光染料标记的二抗孵育 例如 Alexa 488,并用落射荧光显微镜进行分析。 上述测定中使用的抗体可以有利地与荧光染料(例如 Alexa488、PE)或其他标记(例如量子点)结合,以用于多参数分析以及其他信号转导(EGFR、磷酸化 AKT、 磷酸 Erk 1/2) 和/或细胞标记物(细胞角蛋白)抗体。 用于测量突变 ROS 激酶多肽的多种其他方案,包括酶联免疫吸附测定 (ELISA)、放射免疫测定 (RIA) 和荧光激活细胞分选 (FACS),在本领域中是已知的,并为诊断提供了基础 CD74-ROS 融合多肽表达水平改变或异常。 CD74-ROS 融合多肽表达的正常值或标准值是通过在适合复合物形成的条件下,将取自正常哺乳动物受试者(优选人)的体液或细胞提取物与抗 CD74-ROS 融合多肽的抗体结合来建立的。 标准复合物形成的量可以通过多种方法定量,但优选通过光度法方法。 将来自活检组织的受试者、对照和疾病样品中表达的 CD74-ROS 融合多肽的量与标准值进行比较。 标准值和受试者值之间的偏差建立了诊断疾病的参数。 肽和核苷酸分析。 类似地,可制备用于检测/定量包含来自肿瘤的细胞的生物样品中表达的突变体ROS多肽的AQUA肽并用于标准AQUA测定,如上文E部分中详细描述的。 因此,在本发明方法的一些优选实施方案中,CD74-ROS融合多肽特异性试剂包含重同位素标记的磷酸肽(AQUA肽),其对应于包含CD74-ROS融合多肽融合接头的肽序列,如所述 以上 E 节。CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 35 - PCT/US2008/011968 用于实施本发明方法的突变体 ROS 激酶多肽特异性试剂也可以是 mRNA、寡核苷酸或 DNA 探针,它们可以直接杂交,和 检测、融合或截断生物样品中的多肽表达转录物。 此类探针在上面的 B 部分中有详细讨论。 简而言之,举例来说,福尔马林固定、石蜡包埋的患者样品可以用荧光素标记的 RNA 探针进行探测,然后用甲酰胺、SSC 和 PBS 洗涤并用荧光显微镜分析。 编码突变 ROS 激酶多肽的多核苷酸也可用于诊断目的。 可以使用的多核苷酸包括寡核苷酸序列、反义RNA和DNA分子以及PNA。 多核苷酸可用于检测和定量活检组织中的基因表达,其中CD74-ROS融合多肽或截短的ROS多肽的表达可能与疾病相关。 诊断测定可用于区分 CD74-ROS 融合多肽的缺失、存在和过度表达,并监测治疗干预期间 CD74-ROS 融合多肽水平的调节。 在一个优选的实施方案中,与能够检测编码CD74-ROS融合多肽或截短的ROS激酶多肽或密切相关分子的多核苷酸序列(包括基因组序列)的PCR探针杂交可用于鉴定核酸=编码突变ROS的序列 多肽。 此类探针的构造和使用在上面的 B 部分中进行了描述。 探针的特异性,无论它是由高度特异性的区域制成的,例如,融合连接处的 10 个独特的核苷酸,还是较低特异性的区域,例如 3' 编码区,以及杂交或扩增的严格性(最大 、高、中或低)将确定探针是否仅识别天然存在的编码突变 ROS 激酶多肽、等位基因或相关序列的序列。 探针也可用于相关序列的检测,并且应优选包含来自任何突变ROS多肽编码序列的至少50%的核苷酸。 本发明的杂交探针可以是 DNA 或 RNA,来源于 SEQ ID NOs: 2 的核苷酸序列,最优选包含融合连接点,或来源于包括启动子、增强子元件和天然存在的 CD74 的内含子的基因组序列和 ROS多肽,如上文B部分中进一步描述的。 本发明的 CD74-ROS 融合多核苷酸或截短的 ROS 多核苷酸可用于 Southern 或 Northern 分析、斑点印迹或其他基于膜的技术; PCR技术; 或在试纸、针、ELISA 或芯片检测中,利用来自患者活组织检查的液体或组织来检测突变 ROS 激酶多肽表达的改变。 这样的定性或定量方法是本领域众所周知的。 在一个特定方面,编码突变体 ROS 多肽的核苷酸序列可用于检测各种癌症(包括肺癌,包括 NSCLC)的激活或诱导的测定。 突变体 ROS 多核苷酸可以通过标准方法标记,并在适合形成杂交复合物的条件下添加到来自患者的体液或组织样品中。 经过一段合适的孵育期后,清洗样品,对信号进行定量并与标准值进行比较。 如果活检或提取样品中的信号量与 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 36 - PCT/US2008/011968 中的可比对照样品相比有显着变化,则核苷酸序列已与中的核苷酸序列杂交 样本中编码 CD74-ROS 融合多肽或截短的 ROS 激酶多肽的核苷酸序列水平发生改变表明存在相关疾病。 此类测定还可用于在动物研究、临床试验或监测个体患者的治疗中评估特定治疗方案的功效。 为了提供以突变ROS多肽表达为特征的疾病的诊断基础,建立了正常或标准的表达概况。这可以通过在适合杂交或扩增的条件下,将取自动物或人类的正常受试者的体液或细胞提取物与编码 CD74-ROS 融合多肽或截短的 ROS 激酶多肽的序列或其片段组合来实现 . 标准杂交可以通过将从正常受试者获得的值与从其中使用已知量的基本上纯化的多核苷酸的实验获得的值进行比较来量化。 可以将从正常样品获得的标准值与从具有疾病症状的患者的样品获得的值进行比较。 标准值和受试者值之间的偏差用于确定疾病的存在。 一旦确定了疾病并启动了治疗方案,就可以定期重复杂交测定以评估患者中的表达水平是否开始接近在正常患者中观察到的水平。 从连续测定中获得的结果可用于显示从几天到几个月的时间段内的治疗效果。 本发明的突变体ROS多核苷酸的额外诊断用途可涉及聚合酶链式反应(PCR)的使用,这是本领域技术人员标准的另一种优选测定形式。 参见,例如,MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd。 版,Sambrook, J.、Fritsch, E. F. 和 Maniatis, T. 编,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州(1989 年)。 PCR 寡聚体可以化学合成、酶促产生或从重组来源产生。 寡聚体将优选地由两个核苷酸序列组成,一个具有有义方向(5'到3'),另一个具有反义方向(3'到5'),在优化的条件下用于鉴定特定基因或条件。 相同的两个寡聚体、嵌套的寡聚体组、或什至简并的寡聚体库可以在不太严格的条件下用于检测和/或定量密切相关的 DNA 或 RNA 序列。 也可用于定量 CD74-ROS 融合多肽或截短的 ROS 激酶多肽表达的方法包括放射性标记或生物素化核苷酸、对照核酸的共扩增,以及将实验结果内插到其上的标准曲线(Melby 等人, J. Immunol. Methods,159:235-244(1993);Duplaa 等人,Anal. Biochem. 229-236(1993))。 通过以 ELISA 形式运行测定可以加快多个样品的定量速度,其中感兴趣的低聚物以各种稀释度存在,分光光度法或比色法响应提供快速定量。 在本发明的另一个实施方案中,本发明的突变体ROS多核苷酸可用于产生可用于绘制天然存在的基因组序列的杂交探针。 可以使用众所周知的技术将序列映射到特定染色体或 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-37-PCT/US2008/011968 染色体的特定区域。 此类技术包括荧光原位杂交 (FISH)、FACS 或人工染色体构建,例如酵母人工染色体、细菌人工染色体、细菌 P1 构建或单染色体 cDNA 文库,如 Price, C. M., Blood Rev. 7 所述: 127-134 (1993), 和 Trask, B. J., Trends Genet。 7:149-154(1991)。 在一个优选的实施方案中,使用 FISH(如 Verma 等人 HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988) 中所述)并且可以。 与其他物理染色体作图技术和遗传图谱数据相关联。 遗传图谱数据的例子可以在 1994 年的 Genome Issue of Science (265: 1981f) 中找到。 编码 CD74-ROS 融合多肽或截短 ROS 多肽的基因在物理染色体图谱上的位置与特定疾病或特定疾病易感性之间的相关性可能有助于界定与该遗传疾病相关的 DNA 区域。 本发明的核苷酸序列可用于检测正常、携带者或患病个体之间基因序列的差异。 染色体制备物的原位杂交和物理作图技术(例如使用已建立的染色体标记的连锁分析)可用于扩展遗传图谱。通常,将基因放置在另一种哺乳动物(例如小鼠)的染色体上可能会揭示相关标记,即使特定人类染色体的数量或臂未知。 可以通过物理映射将新序列分配给染色体臂或其部分。 这为使用定位克隆或其他基因发现技术寻找疾病基因的研究人员提供了有价值的信息。 一旦通过与特定基因组区域的遗传连锁粗略定位了疾病或综合征,例如 AT 到 11q22-23(Gatti 等人,Nature 336:577-580(1988)),映射到该区域的任何序列都可能 代表相关或调节基因以供进一步研究。 本发明的核苷酸序列也可用于检测由于易位、倒位等在正常、携带者或患病个体之间的染色体位置差异。 生物样品可用于实施本发明方法的生物样品可获自任何哺乳动物,其中存在或可能存在或发展以存在CD74-ROS融合多肽为特征的癌症。 在一个实施例中,哺乳动物是人,并且人可以是ROS抑制疗法的候选者,用于治疗肺癌,例如肺癌。 非小细胞肺癌。 人类候选者可以是目前正在用ROS激酶抑制剂治疗或考虑用ROS激酶抑制剂治疗的患者。 在另一个实施例中,哺乳动物是大型动物,例如马或牛,而在其他实施例中,哺乳动物是小型动物,例如狗或猫,已知所有这些动物都会发展成癌症,包括肺癌。 任何包含来自哺乳动物癌症的细胞(或细胞提取物)的生物样品都适用于本发明的方法。 在一个实施方案中,生物样品包括从肿瘤活检中获得的细胞。 根据标准临床技术,可从发生在哺乳动物器官中的原发性肿瘤或已转移到其他组织中的继发性肿瘤获得活组织检查。 在另一个实施方案中,生物样品包含从细针获得的细胞 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 38 - PCT/US2008/011968 从肿瘤中取出的抽吸物,并且用于获得此类抽吸物的技术在 art(参见 Cristallini 等人,Acta Cytol. 36(3):416-22(1992))生物样品还可以包含从积液(例如胸腔积液)中获得的细胞。 胸腔积液(在胸腔肺外形成并含有癌细胞的液体)已知在许多晚期肺癌(包括非小细胞肺癌)患者中形成,这种积液的存在预示着预后不良和生存期短 时间。 用于获得胸腔积液样品的标准技术已经被描述并且在本领域中是众所周知的(参见 Sahn,Clin Chest Med. 3(2):443-52 (1982))。 循环肿瘤细胞也可以使用肿瘤标记物、细胞角蛋白标记物或如所述的其他阴性选择方法从血清中获得(参见 Ma 等人,Anticancer Res. 23(1A): 49-62 (2003))。 白血病患者可能特别喜欢血清和骨髓样本。 已在胶质母细胞瘤中观察到 ROS 的异常表达。 参见 Charest 等人,同上。 生物样品可包含来自癌症的细胞(或细胞提取物),其中表达和/或激活CD74-ROS融合多肽或截短的ROS激酶多肽,但不表达和/或激活野生型ROS激酶。 或者,样品可包含来自癌症的细胞,其中表达和/或激活突变型 ROS 多肽和野生型 ROS 激酶,或者其中表达和/或激活野生型 ROS 激酶和/或 CD74,但突变型 ROS 多肽 不是。 可以根据标准技术制备前述生物样品的细胞提取物,无论是粗制的还是部分(或完全)纯化的,并且用于本发明的方法中。 或者,包含全细胞的生物样品可用于优选的测定形式,例如免疫组织化学(IHC)、流式细胞术(FC)和免疫荧光(IF),如上文进一步描述的。 这种全细胞测定的优势在于它们最大限度地减少了对肿瘤细胞样本的操作,从而降低了改变细胞体内信号/激活状态和/或引入伪信号的风险。全细胞检测也是有利的,因为它们仅表征肿瘤细胞中的表达和信号,而不是肿瘤和正常细胞的混合物。 在实施所公开的确定化合物是否抑制以CD74-ROS易位和/或融合多肽为特征的肿瘤进展的方法中,也可以有利地使用包含来自哺乳动物异种移植物(或骨髓移植物)的细胞的生物样品。 优选的异种移植物(或移植受体)是小型哺乳动物,例如小鼠,它们携带表达突变 ROS 激酶多肽的人类肿瘤(或白血病)。 携带人类肿瘤的异种移植物在本领域中是众所周知的(参见 Kal, Cancer Treat Res. 72: 155-69 (1995)),并且充分描述了携带人类肿瘤的哺乳动物异种移植物的产生(参见 Winograd 等人,In Vivo. 1 (1): 1-13 (1987))。 类似地,骨髓移植模型的产生和使用也得到了很好的描述(参见,例如,Schwaller 等人,EMBO J. 17:5321-333 (1998);Kelly 等人,Blood 99:310-318 (2002)) . “以”CD74-ROS易位和/或融合多肽为特征的癌症是指与不存在此类易位和/或融合多肽的癌症相比,存在此类突变ROS基因和/或表达的多肽的癌症 展示。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 39 - PCT/US2008/011968 在评估包含来自哺乳动物癌症肿瘤的细胞的生物样品中突变 ROS 多核苷酸的存在或多肽表达时,对照样品代表这样的易位的细胞 和/或融合蛋白不发生可能理想地用于比较目的。 理想地,对照样品包含来自特定癌症(例如NSCLC)的子集的细胞,其代表其中不发生突变(例如CD74-ROS易位)和/或不表达融合多肽的子集。 比较对照样品与测试生物样品中的水平从而鉴定突变多核苷酸和/或多肽是否存在。 或者,由于 CD74-ROS 融合多核苷酸和/或多肽可能不存在于大多数癌症中,因此可以采用类似地不表达突变 ROS 多肽(或含有突变多核苷酸)的任何组织作为对照。 下文描述的方法对于以突变型 ROS 多核苷酸和/或多肽为特征的癌症以及与其相关的治疗决策具有有价值的诊断效用。 例如,生物样品可获自先前未被诊断为患有以CD74-ROS易位和/或融合多肽为特征的癌症,也未接受此类癌症治疗的受试者,并且该方法用于 诊断性地将此类受试者中的肿瘤鉴定为属于其中存在/表达突变 ROS 多核苷酸和/或多肽的肿瘤子集(例如 NSCLC 肿瘤)。 或者,生物样品可获自已被诊断为患有由一种类型的激酶如EFGR驱动的癌症并且一直在接受治疗如EGFR抑制剂疗法(例如Tarceva,IressaTM)的受试者 此类癌症的特征,本发明的方法用于鉴定受试者的肿瘤是否也以 CD74-ROS 易位和/或融合多肽为特征,并因此可能对现有疗法和/或是否替代或 额外的 ROS 激酶抑制疗法是理想的或必要的。本发明的方法也可用于监测在用包含 ROS 激酶抑制治疗剂或 可以在初步评估或手术监测程序之后或之前进行这种诊断测定。本发明的鉴定方法可以有利地用作诊断以鉴定患有由CD74驱动的癌症例如NSCLC的患者 -ROS 融合蛋白,患者最有可能对以抑制 ROS 激酶活性为目标的疗法产生反应。 选择此类患者的能力也将有助于临床评估未来 ROS 靶向治疗的疗效,以及未来为患者开具此类药物的处方。 诊断。选择性地识别其中存在 CD74-ROS 易位和/或融合多肽的癌症的能力使重要的新方法能够准确识别此类肿瘤以用于诊断目的,以及获得有助于确定此类肿瘤是否可能发生的信息。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 40 - PCT/US2008/011968 对靶向不同激酶的抑制剂作为单一给药时可能对抑制 ROS 的治疗组合物有反应,或可能部分或完全无反应 治疗癌症的药物。 因此,在一个实施方案中,本发明提供了一种用于检测癌症中突变 ROS 多核苷酸和/或多肽的存在的方法,该方法包括以下步骤: (a) 从患有癌症的患者获得生物样品; (b)利用至少一种检测本发明的突变体ROS多核苷酸或多肽的试剂来确定CD74-ROS融合多核苷酸和/或多肽是否存在于生物样品中。 在一些优选的实施方案中,癌症是肺癌,例如非小细胞肺癌(NSCLC)。 在其他优选的实施方案中,突变体ROS激酶多肽的存在鉴定出可能对包含至少一种ROS激酶抑制治疗剂的组合物有反应的癌症。 在一些优选的实施方案中,本发明的诊断方法以流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光(IF)测定形式实施。 在另一个优选实施例中,检测CD74-ROS融合多肽的活性。 在其他优选的实施方案中,本发明的诊断方法以荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链反应(PCR)测定形式实施。 本发明进一步提供了确定化合物是否抑制以CD74-ROS融合多核苷酸或多肽为特征的癌症的进展的方法,所述方法包括确定所述化合物是否抑制所述CD74-ROS的表达和/或活性的步骤 融合在所述癌症中。 在一个优选的实施方案中,使用至少一种检测本发明的CD74-ROS融合多核苷酸或多肽的试剂来确定CD74-ROS融合多肽的表达和/或活性的抑制。 适用于抑制 ROS 激酶活性的化合物在下文 G 部分中有更详细的讨论。 用于实施本发明方法的突变型 ROS 多核苷酸探针和多肽特异性试剂在上文 B 和 D 部分中有更详细的描述。 在一个优选实施例中,CD74-ROS融合多肽特异性试剂包括融合多肽特异性抗体。 在另一个优选的实施方案中,融合多肽特异性试剂包含重同位素标记的磷酸肽(AQUA 肽),其对应于 CD74-ROS 融合多肽的融合接头。 上述本发明的方法还可以任选地包括测定水平的步骤 表达或激活其他激酶,如野生型 ROS 和 EGFR,或所述生物样品中的其他下游信号分子。 分析给定生物样品中 CD74-ROS 融合多肽的表达/激活和其他激酶和通路的表达/激活可以提供关于哪些激酶和通路正在驱动疾病以及哪种治疗方案的有价值的信息 因此可能是最有益的。 化合物筛选。 本文所述的新型 CD74-ROS 融合多肽的发现也使得能够开发抑制这些突变 ROS 蛋白活性的新化合物,特别是它们的 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 41 - PCT/US2008/011968 ROS 激酶活性。 因此,本发明还部分地提供了一种用于确定化合物是否抑制以 CD74-ROS 融合多核苷酸和/或多肽为特征的癌症的进展的方法,所述方法包括确定所述化合物是否抑制表达和/或表达的步骤。 /或所述CD74-ROS融合多肽在所述癌症中的活性。 在一个优选的实施方案中,CD74-ROS融合多肽的表达和/或活性的抑制使用至少一种检测本发明的突变ROS多核苷酸和/或突变ROS多肽的试剂来确定。上文已经描述了本发明的优选试剂。 适用于抑制 ROS 激酶活性的化合物在下文 G 部分中有更详细的描述。 该化合物例如可以是激酶抑制剂,例如小分子或抗体抑制剂。 它可能是一种泛激酶抑制剂,对几种不同的激酶具有活性,或者是一种激酶特异性抑制剂。 ROS 激酶抑制化合物在下文 G 节中有更详细的讨论。 可以在用抑制剂治疗之前和之后采集患者生物样品,然后使用上述方法分析抑制剂对 ROS 激酶活性的生物学效应,包括下游底物蛋白的磷酸化。 这种药效学测定可用于确定可能优于最大耐受剂量的药物的生物活性剂量。 通过展示药物作用机制,此类信息也可用于提交药物批准。 下文 G 部分进一步描述了鉴定具有此类所需抑制特性的化合物。 G. 癌症的治疗性抑制。 根据本发明,现已表明CD74-ROS融合多肽存在于至少一个人类NSCLC亚组中。 因此,其中表达 CD74-ROS 融合蛋白的哺乳动物癌症(例如 NSCLC)的进展可以通过抑制 ROS 激酶在此类癌症中的活性而在体内得到抑制。 可以通过使癌症(例如肿瘤)与 ROS 激酶抑制治疗剂接触来抑制以表达突变 ROS 激酶为特征的癌症中的 ROS 活性。 因此,本发明部分地提供了通过抑制癌症中ROS激酶的表达和/或活性来抑制表达CD74-ROS融合多肽的癌症的进展的方法。 ROS激酶抑制治疗剂可以是包含至少一种生物或化学化合物的任何组合物,其在体内直接或间接抑制ROS激酶的表达和/或活性,包括下文描述的示例性类别的化合物。 此类化合物包括直接作用于 ROS 激酶本身,或作用于修饰 ROS 活性的蛋白质或分子,或通过抑制 ROS 表达间接作用的治疗剂。 此类组合物还包括仅包含单一 ROS 激酶抑制化合物的组合物,以及包含多种治疗剂(包括针对其他 RTK 的那些)的组合物,其还可以包括非特异性治疗剂,如化学治疗剂或一般转录抑制剂。 小分子抑制剂。 在一些优选的实施方案中,用于实施本发明方法的ROS抑制治疗剂是靶向的小分子抑制剂。 小分子靶向抑制剂是一类 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 42 - PCT/US2008/011968 分子,通常通过特异性且通常不可逆地结合到催化位点来抑制其靶酶的活性 酶,和/或与 ATP 结合裂缝或酶内的其他结合位点结合,从而阻止酶采用其活性所必需的构象。 示例性的小分子靶向激酶抑制剂是格列卫(伊马替尼,STI-571),它抑制 CSFIR 和 BCR-ABL,其特性已得到充分描述。 参见 Dewar 等人,Blood 105(8):3127-32 (2005)。 小分子抑制剂可以使用 X 射线晶体学或 ROS 激酶三维结构的计算机建模来合理设计,或者可以通过化合物库的高通量筛选来发现以抑制 ROS。 这样的方法在本领域中是众所周知的,并且已经被描述过。 ROS 抑制的特异性可以通过例如检查此类化合物抑制一组激酶中的 ROS 活性但不抑制其他激酶活性的能力和/或通过检查生物样品中 ROS 活性的抑制来确认,该生物样品包含 NSCLC 肿瘤细胞,如上所述。 此类筛选方法在下文进一步描述。 抗体抑制剂。用于本发明方法的 ROS 激酶抑制治疗剂也可以是靶向抗体,其特异性结合 ROS 活性所需的关键催化或结合位点或结构域,并通过阻断配体、底物或次级分子接近和抑制激酶。 /或阻止酶采用其活性所必需的构象。 人源化靶标特异性抗体的生产、筛选和治疗用途已得到充分描述。 参见 Merluzzi 等人,Adv Clin Path。 4(2): 77-85 (2000)。 商业技术和系统,例如 Morphosys, Inc. 的人类组合抗体库 (HuCAL),可用于高通量生成和筛选人源化靶标特异性抑制抗体。 已经描述了多种抗受体激酶靶向抗体的产生及其用于抑制靶向受体活性的用途。 看,例如 美国专利公开号 20040202655,“用于治疗癌症的 IGF-I 受体抗体”,2004 年 10 月 14 日,Morton 等人; 美国专利公开号 20040086503,“人类抗表皮生长因子受体单链抗体”,2004 年 4 月 15 日,Raisch 等人; 美国专利公开号 20040033543,“使用针对 EGFr 的抗体治疗肾癌”,2004 年 2 月 19 日,Schwab 等。 在。 用于产生和使用受体酪氨酸激酶活性抑制抗体的标准化方法是本领域已知的。 参见,例如,欧洲专利号 EP1423428,“Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods of Screening for and Uses Theref”,2004 年 6 月 2 日,Borges 等人。 噬菌体展示方法也可用于产生 ROS 特异性抗体抑制剂,噬菌体文库构建和重组抗体选择的方案在众所周知的参考文本 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 中提供,Colligan 等人。 (编辑),John Wiley & Sons, Inc.(1992-2000),第 17 章,第 17.1 节。 另见美国专利第 6,319,690 号,2001 年 11 月 20 日,Little 等人; 美国专利号 6,300,064,2001 年 10 月 9 日,Knappik 等; 美国专利号 5,840,479,1998 年 11 月 24 日,Little 等人; 美国专利公开号 20030219839,2003 年 11 月 27 日,Bowdish 等人。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 43 - PCT/US2008/011968 可以产生展示在噬菌体表面上的抗体片段文库(参见例如美国专利 6,300,064,2001 年 10 月 9 日,Knappik 等人) 并筛选与受体蛋白酪氨酸激酶(如 ROS)的可溶性二聚体形式的结合。 结合用于筛选的可溶性二聚体形式的 RTK 的抗体片段被鉴定为用于阻断细胞中靶 RTK 的组成型激活的候选分子。 参见欧洲专利号 EP1423428,Borges 等人,同上。 然后可以进一步筛选在如上所述的抗体文库筛选中鉴定的结合 ROS 的靶向抗体阻断 ROS 活性的能力,包括体外激酶测定和体内细胞系和/或肿瘤。 ROS 抑制可以通过例如检查此类抗体治疗剂抑制一组激酶中的 ROS 激酶活性但不抑制其他激酶活性的能力和/或通过检查生物样品中 ROS 活性的抑制来确认,该生物样品包含 癌细胞,如上所述。 上文进一步描述了筛选此类化合物以抑制 ROS 激酶的方法。 间接抑制剂。 用于实施所公开方法的ROS抑制化合物还可以是通过抑制ROS激酶本身以外的蛋白质或分子的活性来间接抑制ROS活性的化合物。 这种抑制治疗剂可以是靶向抑制剂,调节关键调节激酶的活性,这些激酶磷酸化或去磷酸化(并因此激活或失活)ROS 本身,或干扰配体的结合。 与其他受体酪氨酸激酶一样,ROS 通过衔接蛋白和下游激酶网络调节下游信号。 因此,ROS 活性对细胞生长和存活的诱导可以通过靶向这些相互作用或下游蛋白质来抑制。 ROS 激酶活性也可以通过使用抑制 ROS 采取其活性构象所必需的活化分子结合的化合物来间接抑制。 例如,已经描述了抗PDGF抗体的生产和使用。 看到我们。专利公开号 20030219839,“抗 PDGF 抗体和生产工程化抗体的方法”,Bowdish 等人。 抑制配体 (PDGF) 与受体结合可直接下调受体活性。 ROS 活性的间接抑制剂可以使用 ROS 三维结构的 X 射线晶体学或计算机建模进行合理设计,或者可以通过化合物库的高通量筛选发现以抑制关键的上游调节酶和/或必要的结合分子,从而导致 抑制 ROS 激酶活性。 这样的方法在本领域中是众所周知的,并且已经被描述过。 此类治疗剂对 ROS 的抑制可以通过例如检查化合物在一组激酶中抑制 ROS 活性而非其他激酶活性的能力和/或通过检查生物样品中 ROS 活性的抑制来确认 包含癌细胞,例如 NSCLC细胞,如上所述。 下文进一步描述了鉴定抑制以CD74-ROS易位和/或融合多肽和/或截短的ROS多核苷酸和/或多肽为特征的癌症的化合物的方法。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 44 - PCT/US2008/011968 反义和/或转录抑制剂。 ROS 抑制治疗剂还可包含反义和/或转录抑制化合物,其通过阻断编码 ROS 的基因和/或 CD74-ROS 融合基因的转录来抑制 ROS 激酶活性。 已经描述了通过用于治疗癌症的反义疗法抑制各种受体激酶,包括 VEGFR、EGFR 和 IGFR,以及 FGFR。 参见,例如,美国专利号 6,734,017; 6, 710,174, 6,617,162; 6,340,674; 5,783,683; 5,610,288。 可以根据已知技术设计、构建和使用反义寡核苷酸作为针对靶基因的治疗剂。 看,例如 Cohen, J.,药效学趋势。 科学。 10(11):435-437(1989); Marcus-Sekura,肛门。 生化。 172:289-295(1988); 温特劳布,H.,科学。 是。 第 40-46 页(1990 年); Van Der Krol 等人,BioTechniques 6(10):958-976(1988); Skorski 等人,Proc。 国家队。 学院。 科学。 美国 (1994) 91:4504-4508。 最近描述了使用 EGFR 的反义 RNA 抑制剂在体内抑制人癌生长。 参见美国专利公开号“Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth In vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from a Pol III Promoter”,2004 年 3 月 11 日,He 等。 类似地,ROS抑制治疗剂包含至少一种针对哺乳动物ROS基因的反义寡核苷酸(参见图4(SEQ ID NO:8)或CD74-ROS融合多核苷酸或截短的ROS多核苷酸(参见图2(SEQ ID NO:2)) 或截短的可根据上述方法制备。包含抑制 ROS 的反义化合物的药物组合物可如下文进一步描述制备和施用。小干扰 RNA.小干扰 RNA 分子 (siRNA) 组合物,其抑制翻译并因此抑制活性, RNA 干扰,以及通过引入包含与编码靶标的 mRNA 互补的序列的外源小双链 RNA 分子,选择性地沉默靶标蛋白表达。 蛋白质,已被很好地描述。参见例如美国专利公开号 20040038921,“Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene”,2004 年 2 月 26 日,Kreutzer 等人; 美国专利公开号 20020086356,“RNA 序列特异性 RNA 干扰介质”,2003 年 6 月 12 日,Tuschl 等人; 美国专利出版物 20040229266,“RNA Interference Mediating Small RNA Molecules”,2004 年 11 月 18 日,Tuschl 等人。 在。 例如,如实施例3中所述,可以在表达融合蛋白的人NSCLC细胞系中实现siRNA介导的CD74-ROS融合蛋白表达沉默。 双链 RNA 分子 (dsRNA) 已被证明可以在称为 RNA 干扰 (RNAi) 的高度保守的调节机制中阻断基因表达。 简而言之,RNAse III Dicer 将 dsRNA 加工成约 22 个核苷酸的小干扰 RNA (siRNA),其作为指导序列以通过 RNA 诱导的沉默复合物 RISC 诱导靶标特异性 mRNA 切割(参见 Hammond 等人,Nature (2000) ) 404: 293-296)。RNAi 涉及催化型反应,由此通过连续切割较长的 dsRNA 产生新的 siRNA。 因此,与反义不同,RNAi 以非化学计量方式降解靶 RNA。 当施用于细胞或生物体时,CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 45 - PCT/US2008/011968 外源 dsRNA 已显示通过 RNAi 指导内源信使 RNA (mRNA) 的序列特异性降解。 多种靶标特异性 siRNA 产品,包括用于在哺乳动物细胞中表达和使用的载体和系统,现已上市。 看,例如 Promega, Inc. (www.promega.com); Dharmacon, Inc. (www.dharmacon.com)。 有关 dsRNA 用于 RNAi 的设计、构建和使用的详细技术手册可供使用。 看,例如 Dharmacon 的《RNAi 技术参考与应用指南》; Promega 的“RNAi:基因沉默指南”。 ROS-抑制siRNA产品也可商购,并且可适当地用于本发明的方法中。 看,例如 Dharmacon, Inc., Lafayette, CO(目录号 M-003162-03,MU-07 到 -10(siGENOMETm SMARTselection 和 SMARTpool siRNA)。最近已经确定,长度小于 49 个核苷酸,优选 19 个核苷酸的小 dsRNA -25 个核苷酸,包含至少一个与目标 mRNA 序列的一部分基本相同的序列,并且 dsRNA 最佳地在末端具有至少一个 1-4 个核苷酸的突出端,在介导哺乳动物中的 RNAi 中最有效。参见 U.S. 专利公开号 20040038921,Kreutzer 等人,同上;美国专利公开号 20040229266,Tuschl 等人,同上。此类 dsRNA 的构建及其在药物制剂中的用途以在体内沉默靶蛋白的表达, 在此类出版物中有详细描述。如果哺乳动物中要靶向的基因序列已知,则可以生成例如 21-23 nt RNA 并测试它们在哺乳动物细胞中介导 RNAi 的能力,例如 人类或其他灵长类动物细胞。如果需要,可以在适当的动物模型中测试那些显示介导 RNAi 的 21-23 nt RNA 分子,以进一步评估其体内有效性。 已知的靶位点,例如根据对其他核酸分子(例如核酶或反义分子)的研究确定为有效靶位点的靶位点,或已知与疾病或病症相关的靶位点,例如含有突变或 缺失,也可用于设计靶向这些位点的 siRNA 分子。 或者,可以合理设计/预测有效 dsRNA 的序列,例如通过使用计算机折叠算法筛选感兴趣的靶 mRNA 的靶位点。 可以使用定制的 Perl 脚本或商业序列分析程序(例如 Oligo、Mac Vector 或 GCG Wisconsin Package)将目标序列在计算机上解析为所有片段或特定长度子序列的列表,例如 23 个核苷酸片段。 可以使用各种参数来确定哪些位点是目标 RNA 序列中最合适的目标位点。 这些参数包括但不限于二级或三级 RNA 结构、靶序列的核苷酸碱基组成、靶序列不同区域之间的同源性程度或靶序列在 RNA 转录物中的相对位置。 基于这些确定,可以选择 RNA 转录本内的任意数量的靶位点来筛选 siRNA 分子的功效,例如通过使用体外 RNA 切割测定、细胞培养或动物模型。 参见,例如,美国专利公开号 20030170891,2003 年 9 月 11 日,McSwiggen J。用于识别和选择 RNAi 目标位点的算法最近也已被 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846-46-PCT/US2008/ 011968 描述。 参见美国专利公开号 20040236517,“Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA”,2004 年 11 月 25 日,Drlica 等人。 常用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔和显微注射以及病毒方法(Graham et at. (1973) Virol. 52:456 ;McCutchan et al., (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41: 351;Chu 等人(1987),Nucl. Acids Res. 15:1311;Fraley 等人(1980),J. Biol. Chem. 255:10431;Capecchi(1980),Cell 22:479)。 也可以使用阳离子脂质体将 DNA 引入细胞(Feigner 等人(1987),Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413)。市售阳离子脂质制剂包括 Tfx 50 (Promega) 或 Lipofectamin 200 (Life Technologies)。 或者,可使用病毒载体将 dsRNA 递送至细胞并介导 RNAi。 参见美国专利公开号 20040023390,“siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors”,2004 年 2 月 4 日,Davidson 等人。 哺乳动物细胞中用于 RNAi 的转染和载体/表达系统是可商购的并且已经被很好地描述。 看,例如 Dharmacon, Inc., DharmaFECT”系统;Promega, Inc., siSTRIKE”U6 Hairpin 系统; 另见 Gou 等人。 (2003) 二月。 548、113-118; Sui, G. 等人。 基于 DNA 载体的 RNAi 技术抑制哺乳动物细胞中的基因表达 (2002) Proc。 国家队。 学院。 科学。 99,5515-5520; 于等。 (2002) 过程。 国家队。 学院。 科学。 99,6047-6052; Paul, C. 等人。 (2002) 自然生物技术 19, 505-508; 麦克马纳斯等人。 (2002) RNA 8, 842-850。 然后可以通过向哺乳动物施用包含dsRNA的药物制剂来实现使用制备的dsRNA分子在哺乳动物中的siRNA干扰。 药物组合物以足以抑制靶基因表达的剂量施用。 dsRNA 通常可以每天​​每公斤体重少于 5 mg dsRNA 的剂量给药,并且足以抑制或完全抑制靶基因的表达。 通常,合适剂量的 dsRNA 将在每天每千克受体体重 0.01 到 2.5 毫克的范围内,优选在每天每千克体重 0.1 到 200 微克的范围内,更优选在每天每千克体重 0.1 毫克的范围内。 每天每公斤体重至100微克,甚至更优选在每天每公斤体重1.0至50微克的范围内,并且最优选在每天每公斤体重1.0至25微克的范围内。 包含dsRNA的药物组合物例如使用本领域公知的缓释制剂每天一次或以多个亚剂量给药。 此类药物组合物的制备和给药可根据标准技术进行,如下文进一步描述。 如上所述,通过制备包含治疗有效量的此类 dsRNA 的药物制剂,并将该制剂施用于患有表达 CD74-ROS 的癌症的人类受试者,此类 dsRNA 然后可用于抑制癌症中的 ROS 表达和活性 融合蛋白或截短的 ROS 激酶多肽,例如,通过直接注射到肿瘤。 最近描述了使用 siRNA 抑制剂对其他受体酪氨酸激酶(例如 VEGFR 和 EGFR)的类似抑制作用。 参见美国专利公开号 20040209832,2004 年 10 月 21 日,McSwiggen 等人; 美国专利公开号 20030170891,2003 年 9 月 11 日,McSwiggen; 美国专利公开号 20040175703,2004 年 9 月 9 日,Kreutzer 等人。 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 47 - PCT/US2008/011968 治疗组合物; 行政。 可用于实施本发明方法的 ROS 激酶抑制治疗组合物可通过本领域已知的任何方式施用于哺乳动物,包括但不限于口服或腹膜途径,包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮 、气道(气溶胶)、直肠、阴道和局部(包括口腔和舌下)给药。 对于口服给药,ROS 抑制治疗剂通常以片剂或胶囊剂、粉末剂或颗粒剂、或水溶液或悬浮液的形式提供。 口服片剂可包括与药学上可接受的赋形剂混合的活性成分,例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。 合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖,而玉米淀粉和海藻酸是合适的崩解剂。 粘合剂可包括淀粉和明胶,而润滑剂(如果存在)通常为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。 如果需要,片剂可以用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣,以延迟在胃肠道中的吸收。口服胶囊包括其中活性成分与固体稀释剂混合的硬明胶胶囊和其中活性成分与水或油如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。 对于肌内、腹膜内、皮下和静脉内使用,本发明的药物组合物通常以无菌水溶液或悬浮液形式提供,缓冲至合适的pH和等渗性。 合适的水性载体包括林格氏溶液和等渗氯化钠。 载体可仅由水性缓冲液组成(“仅”是指不存在可能影响或介导 ROS 抑制治疗药物摄取的辅助剂或包囊物质)。 此类物质包括例如胶束结构,例如脂质体或衣壳,如下所述。 水悬浮液可以包括悬浮剂例如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄芪胶,以及润湿剂例如卵磷脂。 适用于水悬浮液的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。 ROS激酶抑制治疗组合物还可以包括包封制剂以保护治疗剂(例如dsRNA化合物)免于从体内快速消除,例如控释制剂,包括植入物和微囊化递送系统。 可使用可生物降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。 制备此类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。 这些材料也可以从 Alza Corporation 和 Nova Pharmaceuticals, Inc. 商购获得。脂质体悬浮液(包括靶向感染细胞的脂质体,具有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作药学上可接受的载体。 这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备,例如,如美国专利No. 5, 777, 36中所描述的。 第 4,522,811 号; PCT 公开号 WO 91/06309; 和欧洲专利出版物 EP-A-43075。 包囊制剂可包含病毒外壳蛋白。 病毒外壳蛋白可以源自或与病毒相关,例如多瘤病毒,或 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 48 - PCT/US2008/011968 它可以是部分或完全人工的。 例如,外壳蛋白可以是多瘤病毒的病毒蛋白1和/或病毒蛋白2,或其衍生物。 ROS 抑制组合物还可以包含递送载体,包括脂质体,用于向受试者给药、载体和稀释剂及其盐,和/或可以存在于药学上可接受的制剂中。 例如,Akhtar et at., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139 中描述了用于递送核酸分子的方法; 反义寡核苷酸治疗的递送策略,编辑。 Akbtar, 1995, Maurer et at., 1999, Mat. 会员 生物学,16, 129-140; 霍夫兰和黄,1999 年,Handb。 Exp。 药理学,137, 165-192; 和 Lee 等人,2000 年,ACS Symp。 序号 752、184-192。 Beigelman 等人,美国专利。 美国专利号 6,395,713 和 Sullivan 等人的 PCT WO 94/02595 进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。 这些方案可用于递送几乎任何核酸分子。 可以通过本领域技术人员已知的多种方法将 ROS 抑制治疗剂施用于哺乳动物肿瘤,包括但不限于通过离子电渗疗法包裹在脂质体中,或通过掺入其他载体,例如水凝胶, 环糊精、可生物降解的纳米胶囊和生物粘附微球,或通过蛋白质载体(O'Hare 和 Normand,国际 PCT 公开号 WO 00/53722)。 或者,治疗剂/载体组合通过直接注射或通过使用输液泵局部递送。 组合物的直接注射,无论是皮下、肌肉内还是皮内,都可以使用标准的针头和注射器方法,或通过无针头技术,例如 Conry 等人,1999,Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337 和 Barry 等人,国际 PCT 公开号 WO 99/3 1262。ROS 激酶抑制治疗剂的药学上可接受的制剂包括上述化合物的盐,例如,酸加成盐,例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐和苯磺酸盐。 药理学组合物或制剂是指适合于施用(例如全身施用)到细胞或患者(包括例如人)中的形式的组合物或制剂。 合适的形式部分取决于用途或进入途径,例如口服、透皮或注射。 此类形式不应阻止组合物或制剂到达靶细胞。 例如,注入血流中的药物组合物应该是可溶的。 其他因素是本领域已知的,并且包括诸如毒性和阻止组合物或制剂发挥其作用的形式的考虑。 导致全身吸收的给药途径(即药物在血流中的全身吸收或蓄积,然后分布到整个身体)是理想的,包括但不限于:静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌肉内。 这些给药途径中的每一种都将 ROS 抑制治疗剂暴露于可及的患病组织或肿瘤。 药物进入循环的速率已被证明是分子量或大小的函数。 使用包含本发明化合物的脂质体或其他药物载体可以潜在地将药物定位在例如某些组织类型中,例如网状内皮系统(RES)的组织。 可促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞表面结合的脂质体制剂也是有用的。 这种 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 49 - PCT/US2008/011968 方法可以通过利用巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别异常细胞(例如癌症)的特异性来增强药物向靶细胞的递送 细胞。 “药学上可接受的制剂”是指允许本发明的核酸分子有效分布在最适合其所需活性的物理位置的组合物或制剂。 适用于与本发明的核酸分子一起配制的药剂的非限制性实例包括:P-糖蛋白抑制剂(例如 Pluronic P85),它可以增强药物进入 CNS(Jolliet-Riant 和 Tillement,1999,Fundam.Clin . 药理学, 13, 16-26); 可生物降解的聚合物,例如用于脑内植入后持续释放递送的聚(DL-丙交酯-乙交酯)微球(Emerich 等人,1999,Cell Transplant,8, 47-58)(Alkermes, Inc. Cambridge, MA); 以及负载的纳米颗粒,例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的纳米颗粒,它们可以将药物输送穿过血脑屏障并可以改变神经元摄取机制 (Prog Neuro-psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)。 用于本发明方法的 ROS 抑制化合物的递送策略的其他非限制性实例包括描述于 Boado 等人,1998,J。 医药。 科学, 87, 1308-1315; Tyler 等人,1999,FEBS Lett.,421,280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; 博阿多,1995 年,进阶版。 药物递送修订版,15,73-107; Aldrian-Herrada 等人,1998,核酸研究,26,4910-4916; 和 Tyler 等人,1999 年,PNAS USA., 96, 7053-7058。 包含含有聚(乙二醇)脂质的表面修饰的脂质体(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)的治疗组合物也可适当地用于本发明的方法中。 这些制剂提供了一种增加药物在靶组织中积累的方法。 这类药物载体抵抗单核吞噬系统(MPS 或 RES)的调理作用和消除,从而能够延长血液循环时间并增强封装药物的组织暴露(Lasic etal. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata 等人,Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011)。 此类脂质体已显示选择性地在肿瘤中积聚,可能是通过外渗和捕获在新血管化的靶组织中(Lasic 等人,Science 1995, 267, 1275-1276;Oku 等人,1995,Biochim. Biophys. Acta, 1238 , 86-90).长循环脂质体增强了 DNA 和 RNA 的药代动力学和药效学,特别是与已知在 MPS 组织中积累的常规阳离子脂质体相比(Liu 等人,J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi 等人,国际 PCT 公开号 WO 96/10391;Ansell 等人,国际 PCT 公开号 WO 96/10390;Holland 等人,国际 PCT 公开号 WO 96/10392)。 与阳离子脂质体相比,长循环脂质体也可能在更大程度上保护药物免受核酸酶降解,因为它们能够避免在具有代谢侵袭性的 MPS 组织(如肝脏和脾脏)中积累。 治疗组合物可以包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的所需化合物。 用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知的,并且在例如 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro ed. 1985) 中有所描述。 例如,可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。 这些包括苯甲酸钠、CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 50 - PCT/US2008/011968 山梨酸和对羟基苯甲酸酯。 此外,还可使用抗氧化剂和助悬剂。 药物有效剂量是预防、抑制发生或治疗(一定程度上减轻症状,优选减轻所有症状)疾病状态所需的剂量。 药学有效剂量取决于疾病的类型、所用的组合物、给药途径、接受治疗的哺乳动物的类型、所考虑的特定哺乳动物的身体特征、同时用药以及本领域技术人员可知晓的其他因素 医术会认。 通常,根据带负电荷的聚合物的效能施用0.1mg/kg和100mg/kg体重/天之间的量的活性成分。 每天每公斤体重约 0.1 毫克至约 140 毫克的剂量水平可用于治疗上述病症(每位患者每天约 0.5 毫克至约 7 克)。 可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据所治疗的宿主和特定给药方式而变化。 剂量单位形式通常包含约1mg至约500mg的活性成分。 可以理解,任何特定患者的具体剂量水平取决于多种因素,包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径和速率 排泄、药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。 为了对非人类动物给药,还可以将组合物添加到动物饲料或饮用水中。 可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物,使得动物在其饮食中摄入治疗适当量的组合物。 将组合物作为预混物加入饲料或饮用水中也很方便。 用于实施本发明的 ROS 抑制治疗剂可包含如上所述的单一化合物,或多种化合物的组合,无论是在同一类抑制剂(即抗体抑制剂)中,还是在不同类(即抗体抑制剂和 小分子抑制剂)。 这种化合物的组合可以增加抑制表达融合蛋白的癌症进展的总体治疗效果。 例如,治疗组合物可以是小分子抑制剂,例如单独的STI-571(Gleevec),或与其他靶向ROS活性的Gleevec类似物和/或EGFR的小分子抑制剂,例如TarcevaTM或IressaTM组合。 除了一种或多种靶向抑制剂之外,治疗组合物还可以包含一种或多种非特异性化学治疗剂。 最近已显示此类组合在许多癌症中提供协同肿瘤杀伤作用。 可以如下所述评估此类组合在体内抑制ROS活性和肿瘤生长的有效性。 突变体 ROS 激酶抑制化合物的鉴定。本发明还部分提供了确定化合物是否抑制以 CD74-ROS 易位和/或融合多肽为特征的癌症进展的方法,通过确定化合物是否抑制 CD74-ROS 融合多肽在 癌症。 在一些优选的实施方案中,通过检查包含来自骨髓、血液或肿瘤的细胞的生物样品 CA 02702686 2015-07-28WO 2009/051846-51-PCT/US2008/011968 来确定对活性的抑制。 在另一个优选实施方案中,使用至少一种本发明的突变体ROS多核苷酸或多肽特异性试剂测定ROS活性的抑制。 测试的化合物可以是如上所述的任何类型的治疗剂或组合物。 用于评估化合物的体外和体内功效的方法在本领域中是公认的和已知的。 例如,可以使用其中ROS激酶被激活的细胞或细胞提取物测试组合物在体外抑制ROS的能力。 可以使用一组化合物来测试化合物对 ROS 的特异性(相对于其他靶标,例如 EGFR 或 PDGFR)。 另一种可用于药物筛选的技术提供了高通量筛选对目标蛋白质具有合适结合亲和力的化合物,如公开的 PCT 申请 WO84/03564 中所述。 在这种应用于突变 ROS 多肽的方法中,大量不同的小测试化合物在固体基质(如塑料针或其他一些表面)上合成。 测试化合物与突变型 ROS 多肽或其片段反应,并洗涤。 然后通过本领域熟知的方法检测结合的突变多肽(例如CD74-ROS融合多肽)。 纯化的突变 ROS 多肽也可以直接包被到平板上用于上述药物筛选技术。 或者,非中和抗体可用于捕获肽并将其固定在固体支持物上。 一种在体外被发现是有效的 ROS 活性抑制剂的化合物然后可以在体内检查其抑制表达 CD74-ROS 融合多肽的癌症进展的能力,例如使用含有人类 NSCLC 肿瘤的哺乳动物异种移植物,这些肿瘤是 由 CD74-ROS 融合蛋白驱动。 在这个过程中,已知由 CD74-ROS 融合蛋白驱动的细胞系被皮下放置在小鼠体内。 然后细胞长成肿瘤块,可以用肉眼观察。 然后可以用药物治疗小鼠。 可以从外部观察药物治疗对肿瘤大小的影响。 然后处死小鼠并取出肿瘤用于 IHC 和蛋白质印迹分析。 类似地,可以通过标准方法制备哺乳动物骨髓移植物,以检查表达突变ROS激酶的血液肿瘤中的药物反应。 通过这种方式,可以在最接近患者的生物环境中观察到药物的作用。 药物改变肿瘤细胞或周围基质细胞信号的能力可以通过磷酸化特异性抗体的分析来确定。 药物在诱导细胞死亡或抑制细胞增殖方面的有效性也可以通过使用细胞凋亡特异性标记物(例如裂解的半胱天冬酶 3 和裂解的 PARP)进行分析来观察。 这些化合物的毒性和治疗效果可以通过细胞培养或实验动物的标准药物程序来确定,例如,用于确定 L050(对 50% 的人口致死的剂量)和 ED50(对 50% 的人口治疗有效的剂量) 人口)。 毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,它可以表示为 LD50/ED50 的比值。 优选表现出高治疗指数的化合物。 提供以下实施例仅是为了进一步说明本发明,而不是CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 52 - PCT/US2008/011968旨在限制其范围,除非在所附权利要求中提供。 本发明包括本文教导的方法的修改和变化,这对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。实施例 1 通过全磷酸肽分析鉴定来自 NSCLC 患者的 ROS 激酶活性使用最近描述的用于分离和质谱表征修饰肽的强大技术检查了包括 CS042 在内的几个人类 NSCLC 患者中激酶激活的全磷酸化分布 复杂的混合物(“IAP”技术,参见 Rush 等人,同上)。 IAP 技术使用磷酸酪氨酸特异性抗体(CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411)进行,以从 NSCLC 细胞系的提取物中分离并随后表征含磷酸酪氨酸的肽。 具体而言,采用 IAP 方法有助于鉴定 NSCLC 患者中活化的酪氨酸激酶,以鉴定该疾病的新驱动因素。 磷酸肽免疫沉淀。 总共 0.5 g 肿瘤组织在尿素裂解缓冲液(20mM HEPES pH 8.0、9M 尿素、1 mM 钒酸钠、2.5 mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸盐)中以 1.25 x 108 细胞/m1 匀浆和裂解,然后超声处理。 通过以 20,000 x g 离心清除经超声处理的裂解物,并如前所述还原和烷基化蛋白质(参见 Rush 等人,Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101 (2005))。 用 20 mM HEPES pH 8.0 将样品稀释至 2M 的最终尿素浓度。 以 1:100 v/v 的比例将胰蛋白酶(1 mg/m1 在 0.001 M HCl 中)添加到澄清的裂解物中。 样品在室温下消化过夜。 消化后,将裂解物酸化至终浓度为 1% TFA。 如前所述使用 Sep-Pak C18 柱进行肽纯化(参见 Rush 等人,同上)。 纯化后,合并所有洗脱液(含 8%、12%、15%、18%、22%、25%、30%、35% 和 40% 乙腈的 0.1% TFA)并冻干。 将干燥的肽重新悬浮于 1.4 ml MOPS 缓冲液(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2、10 mM Na2HPO4、50 mM NaCl)中,并通过以 12,000 x g 离心 10 分钟去除不溶性物质。 将来自腹水的磷酸酪氨酸单克隆抗体 P-Tyr-100(Cell Signaling Technology)以 4 mg/ml 珠子非共价偶联到蛋白 G 琼脂糖珠子(Roche)上,在 4 C 下过夜。偶联后,将抗体-树脂洗涤两次 用 PBS 和 3 次用 MOPS 缓冲液。 将固定化抗体(40 /41,160 头猪)以 1:1 的比例加入 MOPS IP 缓冲液中,添加到溶解的肽级分中,并将混合物在 4°C 下孵育过夜。固定化抗体珠用 MOPS 缓冲液洗涤 3 次,然后 用 ddH20 两次。 通过每次与 40 μl 0.1% TFA 孵育 20 分钟,将肽从珠子上洗脱两次,然后合并级分。 通过 LC-MS/MS 质谱分析。 IP 洗脱液 (40 μl) 中的肽被浓缩并使用 Stop and Go 萃取头 (StageTips) 与洗脱的抗体分离(参见 Rappsilber 等人,Anal. Chem., 75(3): 663-70 (2003))。 肽是 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 53 - PCT/US2008/011968 用 1 I 的 60% MeCN、0.1% TFA 到 7.6 yl 的 0.4% 乙酸/0.005% 七氟丁酸( 氢氟酸)。 使用带有惰性进样阀 (Dionex) 的 Famos 自动进样器将样品加载到填充有 Magic C18 AQ 反相树脂 (Michrom Bioresources) 的 10 cm x 75 ym PicoFrit 毛细管柱(新物镜)上。 该色谱柱采用 45 分钟线性梯度的乙腈在 0.4% 乙酸、0.005% HFBA 中以 280 nl/min 的流速(Ultimate,Dionex)进行开发。 使用 LCQ Deca XP Plus 离子阱质谱仪(ThermoFinnigan)以数据相关的方式收集串联质谱,使用前四方法,动态排除重复计数为 1,重复持续时间为 0.5 分钟。 数据库分析和分配。 使用 TurboSequest (ThermoFinnigan)(在作为 BioWorks 3.0 的一部分提供的 Sequest Browser 包(v. 27,rev. 12)中)评估 MS/MS 谱图。 使用 Sequest Browser 程序 CreateDta 从原始数据文件中提取单个 MS/MS 谱图,设置如下:底部 MW,700; 最高分子量,4,500; 最小离子数,20; 最小 TIC,4 x 105; 和前体电荷状态,未指定。 从样品注入前的原始数据文件的开头到洗脱梯度的末尾提取光谱。 lonQuest 和 VuDta 程序未用于进一步选择用于 Sequest 分析的 MS/MS 谱图。使用以下 TurboSequest 参数评估 MS/MS 谱图:肽质量耐受性,2.5; 碎片离子耐受性,0.0; 每次修饰的最大差异氨基酸数,4; 大众型父母,平均; 质量型碎片,平均值; 内部切割位点的最大数量,10; 在相关分析中考虑了 b 和 y 离子中水和氨的中性损失。 除了从弹性蛋白酶消化物中收集的光谱外,指定了蛋白水解酶。 对 2004 年 8 月 24 日发布的 NCBI 人类数据库进行了搜索,其中包含 27,175 种允许氧化蛋氨酸 (M+16) 和磷酸化 (Y+80) 作为动态修饰的蛋白质。 在蛋白质组学研究中,需要仅基于对一个实验结果中单个肽的观察来验证蛋白质鉴定,以表明该蛋白质实际上存在于样品中。 这导致了用于验证尚未被普遍接受的肽分配的统计方法的发展,以及用于发表蛋白质和肽鉴定结果的指南(参见 Can 等人,Mol. Cell Proteomics 3:531-533(2004 年) )),在本示例中遵循了这些。 然而,由于免疫亲和策略将磷酸化肽与未磷酸化肽分开,因此通常只能观察到蛋白质中的一种磷酸肽,因为许多磷酸化蛋白质只有一个酪氨酸磷酸化位点。 出于这个原因,使用额外的标准来验证磷酸肽分配是合适的。 如果满足以下任何附加标准,则分配可能是正确的:(i) 将相同的序列分配给具有不同电荷状态的共洗脱离子,因为 MS/MS 谱图随电荷状态发生显着变化; (ii) 由于不完全蛋白水解或使用胰蛋白酶以外的蛋白酶导致的序列重叠,该位点存在于多个肽序列环境中; (iii) 由于同源但不相同的蛋白质亚型,该位点存在于不止一种肽序列环境中; (iv) 该位点是 CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 54 - PCT/US2008/011968 由于物种间同源但不相同的蛋白质,在不止一个肽序列背景中发现; (v) 通过 MS/MS 分析对应指定序列的合成磷酸肽验证的位点,因为离子阱质谱仪产生高度可重现的 MS/MS 光谱。 最后一个标准通常用于确认特别感兴趣的新站点分配。 Sequest 进行的所有光谱和所有序列分配都被导入到关系数据库中。 按照保守的两步过程接受或拒绝分配的序列。 在第一步中,通过过滤 XCorr 值至少为 1.5 的电荷状态为 +1、2.2 为 +2 和 3.3 为 +3 的 XCorr 值选择高得分序列分配的子集,允许最大 RSp 值为 10 . 如果满足以下任何标准,则拒绝此子集中的分配:(i) 谱图包含至少一个无法映射到 指定序列作为 a、b 或 y 离子,作为中性损失水或氨从 b 或 y 离子产生的离子,或作为多质子化离子; (ii) 光谱不包含相当于至少六个不间断残基的一系列 b 或 y 离子; 或 (iii) 在我们进行的所有研究中至少有五次未观察到该序列(由于不完全蛋白水解或使用胰蛋白酶以外的蛋白酶而导致的重叠序列除外)。 在第二步中,如果低分光谱与另一项研究中收集的高分光谱高度相似,则接受得分低于阈值的分配,该研究模拟了真实的参考库搜索策略。 所有支持最终分配序列列表(此处未显示)的光谱都经过至少三位科学家的审查,以确定其可信度。 上述 IAP 分析鉴定了许多酪氨酸磷酸化蛋白,其中大部分是新的。 在酪氨酸磷酸化激酶中,有几种检测到的激酶在其他 NSCLC 细胞系(未发表的数据)中通过 MS 分析通常检测不到,包括 ROS 激酶。实施例 2 CD74-ROS 融合基因的分离和测序鉴于在 NSCLC 患者中检测到活化形式的 ROS 激酶的存在,在编码 ROS 激酶结构域的序列上进行 cDNA 末端的 5' 快速扩增,以确定是否 存在嵌合 ROS 转录物。 互补 DNA 末端的快速扩增 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 用于从 C5045 细胞系中提取 RNA。 使用 DNeasy Tissue Kit (Qiagen) 提取 DNA。 使用 5' RACE 系统(Invitrogen)进行 cDNA 末端的快速扩增,引物 ROS-GSP1 用于 cDNA 合成,ROS-GSP2 和 ROS-GSP3 用于嵌套 PCR 反应。 PCR 测定 对于 RT-PCR,使用 SuperScriptTM III 第一链合成系统 (Invitrogen) 和 oligo (dT)20 从 2.5 tsg 总 RNA 合成第一链 cDNA。 然后,使用引物对 CD74-F1 和 ROS-GSP3 扩增 CD74-ROS 融合基因: ROS-GSP1:ACCCTTCTCGGTTCTTCGTTTCCA(SEQ ID NO:7) ROS-GSP2:GCAGCTCAGCCAACTC'TTTGTCTT(SEQ ID NO:8) ROS-GSP3: TGCCAGACAAAAGGTCAGTGGGATT (SEQ ID NO: 9) CD74-Fl: GCAGAATGCCACCAAGTATGGCAA (SEQ ID NO: 10) CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 55 - PCT/US2008/011968 所得产物的序列分析显示 ROS 的 c 端融合到 CD74 基因的 N 端(见图 1,B 和 C)。 CD74-ROS 融合基因符合读框,将 CD74 的前 208 个氨基酸与 ROS 的最后 495 个氨基酸融合(参见图 1,B 组),产生融合蛋白。 CD74位于染色体5q32,而ROS位于染色体6q22。 因此,融合基因是由 t(5;6)(q32;q22) 创建的。 通过对 RNA 的逆转录酶-PCR 证实了 CD74 和 ROS 的融合。 参见图 5 实施例 3 使用 FISH 测定法检测人类癌症样品中 CD74-ROS 融合蛋白的表达 描述。 参见,例如,Verma 等人。 人类染色体:基本技术手册,Pergamon Press,New York, N.Y. (1988)。 检查了 200 多个石蜡包埋的人 NSCLC 肿瘤样本。 为了分析涉及 ROS 的重排,设计了双色分离探针。 近端探针(BAC 克隆 RP1-179P9)和两个远端探针(BAC 克隆 RP11-323017、RP1-94G16)分别用 Spectrum Orange dUTP 或 Spectrum Green dUTP 标记。 根据制造商说明 (Vysis) 进行以下修改,通过切口平移和使用 FFPE 组织切片的间期 FISH 对探针进行标记。 简而言之,将石蜡包埋的组织切片重新水化,并在 0.01M 柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0) 中进行微波抗原修复 11 分钟。 切片在 37°C 下用蛋白酶(4mg/ml 胃蛋白酶,2000-3000U/mg)消化 25 分钟,脱水并在 37°C 下与 FISH 探针杂交 18 小时。 洗涤后,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI;mg/ml)在 Vectashield 封固剂(Vector Laboratories, Burlingame, CA)中用于核复染。 ROS 重排探针在野生型序列中 ROS 基因断点的两侧包含两个不同标记的探针(参见图 4B 和图 1)。 杂交时,天然 ROS 区域将显示为橙色/绿色融合信号,而该位点的重排(如 CD74-ROS 融合蛋白中发生的那样)将导致单独的橙色和绿色信号。 FISH 分析显示,在所研究的样本人群中,这种 ROS 突变的发生率很低。 123 个肿瘤中有两个或 1.6% 的肿瘤含有融合突变。 然而,鉴于全球 NSCLC 的高发病率(仅在美国每年就有超过 151,00 例新病例),预计会有大量患者携带这种突变 ROS,这些患者可能会受益于 ROS 抑制治疗 政权。 实施例 4 使用 PCR 测定法检测人类癌症样品中突变型 ROS 激酶的表达 可以使用基因组或逆转录酶 (RT) 聚合酶链反应检测人类癌症样品中截短的 ROS 激酶和/或 CD74-ROS 融合蛋白的存在 (PCR),如前所述。 参见,例如,Cools 等人,N. Engl。 J. 医学。 348:1201-1214(2003 年)。 简而言之,例如,可以使用标准技术从患有NSCLC的患者获得肿瘤或胸腔积液样品。构建了针对截短的ROS激酶或CD74-ROS CA 02702686 2010-04-15 WO 2009/051846 - 56 - PCT/US2008/011968融合蛋白的PCR探针。 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 可用于从肿瘤或胸腔积液样本中提取 RNA。 可使用 DNeasy Tissue Kit (Qiagen) 提取 DNA。 对于 RT-PCR,第一链 cDNA 由例如 2.5 yg 总 RNA 合成,使用例如带有寡核苷酸 (dT)20 的 SuperScriptTM III 第一链合成系统(Invitrogen)。 然后,使用引物对扩增 CD74-ROS 融合基因,例如 CD74-F1 和 ROS-GSP3。 这样的分析将鉴定患有以截短的ROS激酶(和/或CD74-ROS融合蛋白)的表达为特征的癌症的患者,该患者是使用ROS抑制治疗剂进行治疗的候选者。