本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用。本发明利用只有一条靠近待检测位点的引物且在ddNTPs存在的情况进行PCR扩增片段化DNA，产生长度较短的末端带有一个ddNTP的DNA单链池，使得扩增的片段长度集中在80‑120nt，对比不加ddNTPs的方法，本发明使得片段化DNA更充分更全面地扩增出带有待检测位点的短的单链DNA片段，产生的片段长度更短，长度分布更窄。同时在后续的应用Blocker介导的锁式探针技术以及其他杂交探针进行片段化DNA的检测时，检测更准确和更灵敏，能够应用于片段化DNA的相关检测中。