[0001] 减少烟气污染的方法和组合物 [0002] 发酵饮料 [0003] 相关申请的交叉引用 [0004] 本申请根据 35 U.S.C. 2021 年 10 月 8 日提交的题为“用于减少发酵饮料中烟味的方法和组合物”的美国临时申请第 63/254,042 号的第 119(e) 节,其全部公开内容通过引用整体并入本文。 [0005] 对电子序列表的引用 [0006] 电子序列表(B 150970005WO00-SEQ-CEW.xml;大小:77,000 字节;创建日期:2022 年 10 月 6 日)的内容通过引用整体并入本文。 [0007] 背景 [0008] 将葡萄和啤酒花暴露在烟雾中会分别导致由暴露的葡萄和啤酒花生产的葡萄酒和啤酒受到烟熏污染,并带有木烟、灰烬、药用和烧烤肉等不良感官特征。 随着近年来野火发生的频率和持续时间的增加,这种被称为烟雾污染的现象已成为酿酒商——以及最近的酿酒商——的一个主要问题。 关于葡萄酒行业经济损失的报告各不相同,但据估计,由于未收割的葡萄、未酿造的葡萄酒或被认为不适合销售的葡萄酒,每年损失达数十亿美元。 仅 2020 年的野火造成的损失就可能使加利福尼亚的葡萄酒行业损失高达 37 亿美元(Mobley, E.“如果没有联邦政府对野火的援助,加利福尼亚的葡萄酒行业可能会崩溃,葡萄酒商说”旧金山纪事报。(2021 年 9 月 23 日))。 [0009] 概括 [0010] 本公开至少部分涉及能够减少发酵产品中的挥发性酚类(例如与烟味相关的挥发性酚类)的基因修饰酵母细胞,及其在生产发酵饮料(例如啤酒、葡萄酒)中的使用方法 和烈酒,以及包含乙醇的组合物。 本公开的方面涉及生产发酵产品的方法,包括使基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)与包含至少一种可发酵糖和一种或多种与烟味相关的非挥发性酚苷的培养基接触,从而水解 一种或多种非挥发性酚苷产生一种或多种挥发性酚类; 其中所述经遗传修饰的细胞包含编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因。 [0011] 在一些实施方案中,接触至少在第一发酵过程期间进行以产生包含挥发性酚类的第一发酵产物。 在一些实施例中,该方法还包括从第一发酵产品中去除一种或多种挥发性酚类以产生第二发酵产品。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是葡糖苷酶或鼠李糖苷酶。 在一些实施方案中,葡糖苷酶是β-D-葡糖苷酶或鼠李糖苷酶是α-L-鼠李糖苷酶。 [0012]在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶来源于棘孢曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、Thermomicrobia PRI-1686、假丝酵母、多粘芽孢杆菌、油橄榄, 酿酒酵母、橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌、Oenococcus oeni、Prunis dulcis Bacillus circulans 或中华根瘤菌。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶选自由以下组成的组:衍生自棘齿曲霉的RhaB、衍生自棘齿曲霉的RhaA、衍生自土曲霉的AtRha、衍生自构巢曲霉的AndRha、衍生自黑曲霉的AngRha、衍生自曲霉属的AorhaA oryzae,来自植物乳杆菌NCC245的RhaB1,来自植物乳杆菌NCC245的RhaB2,来自嗜酸乳杆菌的LpRaml,来自Thermomicrobia PRI-1686的RhmA,来自Thermomicrobia PRI-1686的RhmB,来自Candida molischiana的bgln,来自多粘芽孢杆菌的bglA, 来自油橄榄的OepGLU、来自酿酒酵母的EGH1、来自橙色嗜热子囊菌IFO9748的Tabgl1、来自米曲霉的AoBGL1、来自黑曲霉的AnBGL1、来自里氏木霉的TrBGL2、来自里氏木霉的TrBGL1、来自粗糙脉孢菌的BGL1、BGL2 来自粗糙脉孢菌的bglH、来自米曲霉的bglH、来自酒球菌的OoBgl、来自桃李属的Ph691、来自桃李属的Ph692、来自环状芽孢杆菌的BsBglA、或来自中华根瘤菌的SmBgl。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶包含与SEQ ID NO:1-28中任一个所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的序列。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶包含SEQ ID NO:1-28中任一个所示的氨基酸序列。 在一些实施例中,具有糖苷酶活性的酶包含分泌信号。 在一些实施方案中,分泌信号是选自下组的肽:SED1、MATa、MATa前序、TFP5-1、TFP1-4、TFP10、TFP23、SUC2、SRL1和KSH1。 在一些实施方案中,信号序列包含SEQ ID NOs:29-36和50-54中任一个所示的氨基酸序列。 [0013] 在一些实施例中,从第一发酵产品中去除一种或多种挥发性酚包括过滤第一发酵产品。 在一些实施例中,过滤包括使第一发酵产品经受反渗透。 在一些实施例中,从第一发酵产品中去除一种或多种挥发性酚包括使第一发酵产品与澄清剂接触。 在一些实施例中,澄清剂是活性炭或环糊精聚合物。 在一些实施方案中,从第一发酵产品中去除一种或多种挥发性酚包括使第一发酵产品与具有O-甲基转移酶活性的酶接触。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶是重组的、纯化的O-甲基转移酶。 在一些实施方案中,将重组的、纯化的O-甲基转移酶添加到第一发酵产品中。 在一些实施方案中,该方法进一步包括将S-腺苷甲硫氨酸添加到培养基或第一发酵产物中。 [0014]在一些实施例中,经修饰的细胞进一步包含编码具有O-甲基转移酶活性的酶的第二异源基因; 从第一发酵产物中去除一种或多种挥发性酚包括产生一种或多种甲基化挥发性酚(也称为甲基醚)。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的第二异源基因来源于阔叶蠓、番茄、刺蔷薇、罗勒、枇杷、火炬松、草莓、粟酒裂殖酵母或秀丽百日草。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶选自由以下组成的组:源自Silene latifolia的SIGOMT4、源自Solanuma lycopersicum的SIOMT1、源自Solanuma lycopersicum的SIOMT4、源自Solanuma lycopersicum的SICTOMT1、源自Rosa hybrida的RhOOMT1、源自RhOOMT2 来自 Rosa hybrida,EOMT1 来自 Ocimum basilicum,EjOMTl 来自 Eriobotrya japonica,AEOMT 来自火炬松,FaOMT 来自 Fragaria ananassa,SpCOMT 来自 Schizosaccharomyces pombe,COMF1 来自罗勒,ZeCAOMT 来自 Zinnia elegans。 [0015] 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含与SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的序列。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列。 [0016] 在一些实施例中,与烟味相关的一种或多种非挥发性酚糖苷包括糖苷、龙胆双糖苷和/或芸香糖苷。 在一些实施方案中,一种或多种挥发性酚包括愈创木酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、苯酚、4-甲基愈创木酚、丁香酚和/或4-甲基丁香酚。 在一些实施方案中,一种或多种甲基化挥发性酚包括藜芦醇(1,2-二甲氧基苯)和/或3-甲基苯甲醚。 [0017] 在一些实施方案中,酵母细胞属于酵母属。 在一些实施方案中,酵母细胞属于酿酒酵母(S.cerevisiae)种。 在一些实施方案中,酵母细胞是酿酒酵母加州艾尔酵母菌株 WLP001、EC-1118、Elegance、Red Star Cote des Blancs、Epemay II、London Ale III、Augustiner、W-34/70、Andechs、D254、RC212、 或 BO213。 在一些实施方案中,酵母细胞属于巴斯德酵母(S. pastorianus)种。 [0018] 在一些实施例中,在至少一种糖源中提供至少一种可发酵糖。 在一些实施例中,可发酵糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。 在一些实施方案中,与由不表达异源基因的对应细胞产生的发酵产物相比,发酵产物包含降低水平的一种或多种非挥发性酚糖苷。 在一些实施例中,发酵产品是发酵饮料。 在一些实施例中,发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、酒柜、汽酒、硬苏打水、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。 [0019] 在一些实施例中,糖源包括麦芽汁、葡萄汁、果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。 在一些实施方案中,果汁是从至少一种选自葡萄、苹果、蓝莓、黑莓、覆盆子、醋栗、草莓、樱桃、梨、桃子、油桃、橙子、菠萝、芒果、 和百香果。 在一些实施例中,糖源是麦芽汁并且该方法还包括产生培养基,其中产生培养基包括:(a)使多个谷粒与水接触; (b) 煮沸或浸泡 水和谷物来生产麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到麦芽汁中以产生带啤酒花的麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到培养基中。 在一些实施例中,糖源是葡萄汁,并且该方法还包括生产培养基,其中生产培养基包括压碎多个水果以生产葡萄汁。 在一些实施例中,该方法还包括从葡萄汁中去除固体水果材料以生产果汁。 在一些实施例中,该方法还包括至少一个额外的发酵过程。 在一些实施例中,该方法还包括碳酸化发酵产品。 [0020] 本公开的另一个方面涉及一种基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞),其包含(i)编码具有糖苷酶活性的酶的第一异源基因,和(ii)编码具有O-甲基转移酶活性的酶的第二异源基因。 [0021] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是葡糖苷酶或鼠李糖苷酶。 在一些实施方案中,葡糖苷酶是β-D-葡糖苷酶或鼠李糖苷酶是α-L-鼠李糖苷酶。 [0022] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶来源于棘孢曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、Thermomicrobia PRI-1686、假丝酵母、多粘芽孢杆菌、油橄榄, 酿酒酵母、橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌、Oenococcus oeni、Prunis dulcis Bacillus circulans 或中华根瘤菌。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶选自由以下组成的组:衍生自棘齿曲霉的RhaB、衍生自棘齿曲霉的RhaA、衍生自土曲霉的AtRha、衍生自构巢曲霉的AndRha、衍生自黑曲霉的AngRha、衍生自曲霉属的AorhaA oryzae,来自植物乳杆菌NCC245的RhaB1,来自植物乳杆菌NCC245的RhaB2,来自嗜酸乳杆菌的LpRaml,来自Thermomicrobia PRI-1686的RhmA,来自Thermomicrobia PRI-1686的RhmB,来自Candida molischiana的bgln,来自多粘芽孢杆菌的bglA, 来自油橄榄的OepGLU、来自酿酒酵母的EGH1、来自橙色嗜热子囊菌IFO9748的Tabgl1、来自米曲霉的AoBGL1、来自黑曲霉的AnBGL1、来自里氏木霉的TrBGL2、来自里氏木霉的TrBGL1、来自粗糙脉孢菌的BGL1、BGL2 源自 粗糙脉孢菌、源自米曲霉的 bglH、源自酒球菌的 OoBgl、源自桃李属的 Ph691、来自桃李属的 Ph692、来自环状芽孢杆菌的 BsBglA 或来自中华根瘤菌的 SmBgl。 [0023] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶包含与SEQ ID NO:1-28中任一个所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的序列。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶包含SEQ ID NO:1-28中任一个所示的氨基酸序列。 [0024] 在一些实施例中,具有糖苷酶活性的酶包含分泌信号。 在一些实施方案中,分泌信号是选自下组的肽:SED1、MATa、MATa前序列、TFP5-1、TFP1-4、TFP10、TFP23、SUC2、SRL1和KSH1。 在一些实施方案中,信号序列包含SEQ ID NOs:29-36和50-54中任一个所示的氨基酸序列。 [0025]在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的第二异源基因源自阔叶蠓、番茄、刺蔷薇、罗勒、枇杷、火炬松、草莓、粟酒裂殖酵母或秀丽百日草。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶选自由以下组成的组:源自Silene latifolia的SIGOMT4、源自Solanuma lycopersicum的SIOMT1、源自Solanuma lycopersicum的SIOMT4、源自Solanuma lycopersicum的SICTOMT1、源自Rosa hybrida的RhOOMT1、源自RhOOMT2 来自Rosa hybrida,EOMT1来自罗勒,EjOMT1来自枇杷,AEOMT来自火炬松,FaOMT来自草莓,SpCOMT来自粟酒裂殖酵母,COMT1来自罗勒,ZeCAOMT来自百日草。 [0026] 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含与SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的序列。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列。 [0027] 在一些实施方案中,酵母细胞属于酵母属。 在一些实施方案中,酵母细胞属于酿酒酵母(S.cerevisiae)种。 在一些实施方案中,酵母细胞是酿酒酵母加州艾尔酵母菌株 WLP001、EC-1118、Elegance、Red Star Cote des Blancs、Epemay II、London Ale III、Augustiner、W-34/70、Andechs、D254、RC212、 或 BO213。 在一些实施方案中,酵母细胞属于巴斯德酵母(5. pastorianus)种。 本公开的方面涉及生产发酵产品的方法,包括使本文所述的任何修饰细胞与包含至少一种可发酵糖的培养基接触,其中接触在至少第一发酵过程期间进行,以生产发酵的 产品。 [0028] 在一些实施例中,培养基包含一种或多种与烟味相关的非挥发性酚糖苷。 在一些实施例中,与烟味相关的非挥发性酚糖苷包括糖苷、龙胆双糖苷和/或芸香糖苷。 在一些实施方案中,发酵产物包含一种或多种甲基化挥发性酚。 在一些实施方案中,一种或多种甲基化挥发性酚类包括藜芦醇(1,2-二甲氧基苯)、4-甲基藜芦醇、2-甲基苯甲醚、3-甲基苯甲醚和/或4-甲基苯甲醚。 [0029] 在一些实施例中,在至少一种糖源中提供至少一种可发酵糖。 在一些实施例中,可发酵糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。 [0030] 在一些实施方案中,与由不表达第一异源基因和/或第二异源基因的对应细胞产生的发酵产物相比,发酵产物包含降低水平的一种或多种非挥发性酚糖苷。 在一些实施例中,发酵产品是发酵饮料。 在一些实施例中,发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、酒柜、汽酒、硬苏打水、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。 [0031] 在一些实施例中,糖源包括麦芽汁、葡萄汁、果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。 在一些实施方案中,果汁是从至少一种选自葡萄、苹果、蓝莓、黑莓、覆盆子、醋栗、草莓、樱桃、梨、桃子、油桃、橙子、菠萝、芒果、 和百香果。 [0032] 在一些实施例中,糖源是麦芽汁并且该方法还包括产生培养基,其中产生培养基包括(a)使多个谷粒与水接触; (b) 将水和谷物煮沸或浸泡以产生麦芽汁。 [0033] 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到麦芽汁中以产生带啤酒花的麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到培养基中。 [0034]在一些实施例中,糖源是葡萄汁,并且该方法还包括生产培养基,其中生产培养基包括压碎多个水果 生产必需品。 在一些实施例中,该方法还包括从葡萄汁中去除固体水果材料以生产果汁。 [0035] 在一些实施例中,该方法还包括至少一个额外的发酵过程。 在一些实施例中,该方法还包括碳酸化发酵产品。 [0036] 本公开的方面涉及产生包含乙醇的组合物的方法,包括使修饰的细胞与包含至少一种可发酵糖的培养基接触,其中接触在至少第一发酵过程期间进行,以产生包含乙醇的组合物。 [0037] 在一些实施例中,培养基包含一种或多种与烟味相关的非挥发性酚糖苷。 在一些实施例中,与烟味相关的非挥发性酚糖苷包括糖苷、龙胆双糖苷和/或芸香糖苷。 在一些实施例中,其中组合物进一步包含一种或多种甲基化挥发性酚。 在一些实施方案中,一种或多种甲基化挥发性酚类包括藜芦醇(1,2-二甲氧基苯)、4-甲基藜芦醇、2-甲基苯甲醚、3-甲基苯甲醚和/或4-甲基苯甲醚。 [0038] 在一些实施例中,在至少一种糖源中提供至少一种可发酵糖。 在一些实施例中,可发酵糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。 [0039] 在一些实施方案中,与由不表达第一异源基因和/或第二异源基因的对应细胞产生的组合物相比,该组合物包含降低水平的一种或多种非挥发性酚糖苷。 在一些实施例中,组合物是发酵饮料。 在一些实施例中,发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、酒柜、汽酒、硬苏打水、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。 [0040] 在一些实施例中,糖源包括麦芽汁、葡萄汁、果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。 在一些实施方案中,果汁是从至少一种选自葡萄、苹果、蓝莓、黑莓、覆盆子、醋栗、草莓、樱桃、梨、桃子、油桃、橙子、菠萝、芒果、 和百香果。 [0041] 在一些实施例中,糖源是麦芽汁并且该方法还包括产生培养基,其中产生培养基包括(a)使多个谷粒与水接触; (b) 将水和谷物煮沸或浸泡以产生麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到麦芽汁中以 生产啤酒花麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到培养基中。 [0042] 在一些实施例中,糖源是葡萄汁,并且该方法还包括生产培养基,其中生产培养基包括压碎多个水果以生产葡萄汁。 在一些实施例中,该方法还包括从葡萄汁中去除固体水果材料以生产果汁。 在一些实施例中,该方法还包括至少一个额外的发酵过程。 在一些实施例中,该方法还包括碳酸化该组合物。 [0043] 本公开的方面涉及一种方法,包括使基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)与包含至少一种可发酵糖和一种或多种挥发性酚的培养基接触,从而将一种或多种挥发性酚转化为一种或多种甲基化挥发性物质 酚类; 其中所述经遗传修饰的细胞包含编码具有O-甲基转移酶活性的酶的异源基因。 [0044] 在一些实施例中,其中所述培养基进一步包含一种或多种与烟味相关的非挥发性酚糖苷。 在一些实施方案中,该方法还包括使培养基与具有糖苷酶活性的酶接触,从而产生一种或多种挥发性酚。 [0045]在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是重组和/或纯化的糖苷酶。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是葡糖苷酶或鼠李糖苷酶。 在一些实施方案中,葡糖苷酶是β-D-葡糖苷酶或鼠李糖苷酶是α-L-鼠李糖苷酶。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是从杏仁获得的重组和/或纯化的糖苷酶。 [0046] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶来源于棘孢曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、Thermomicrobia PRI-1686、假丝酵母、多粘芽孢杆菌、油橄榄, 酿酒酵母、橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌、Oenococcus oeni、Prunis dulcis Bacillus circulans 或中华根瘤菌。 在一些实施例中,具有糖苷酶活性的酶源自杏仁。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶选自由以下组成的组:衍生自棘齿曲霉的RhaB、衍生自棘齿曲霉的RhaA、衍生自土曲霉的AtRha、衍生自构巢曲霉的AndRha、衍生自黑曲霉的AngRha、衍生自曲霉属的AorhaA 米, 源自植物乳杆菌NCC245的RhaB1、源自植物乳杆菌NCC245的RhaB2、源自嗜酸乳杆菌的LpRaml、源自Thermomicrobia PRI-1686的RhmA、源自Thermomicrobia PRI-1686的RhmB、源自Candida molischiana的bgln、源自多粘芽孢杆菌的bglA、源自OepGLU 来自油橄榄、来自酿酒酵母的EGH1、来自橙色嗜热子囊菌IFO9748的Tabgl1、来自米曲霉的AoBGL1、来自黑曲霉的AnBGL1、来自里氏木霉的TrBGL2、来自里氏木霉的TrBGL1、来自粗糙脉孢菌的BGL1、来自粗糙脉孢菌的BGL2 粗糙脉孢菌、源自米曲霉的 bglH、源自酒球菌的 OoBgl、源自桃李属的 Ph691、来自桃李属的 Ph692、来自环状芽孢杆菌的 BsBglA 或来自中华根瘤菌的 SmBgl。 [0047] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶包含与SEQ ID NO:1-28中任一个所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的序列。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶包含SEQ ID NO:1-28中任一个所示的氨基酸序列。 [0048] 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶来源于大叶茭白、番茄、刺蔷薇、罗勒、枇杷、火炬松、草莓、粟酒裂殖酵母或秀丽百日草。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的异源基因源自大叶茭白、番茄、刺蔷薇、罗勒、枇杷、火炬松、草莓、粟酒裂殖酵母或秀丽百日草。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶选自由以下组成的组:源自Silene latifolia的SIGOMT4、源自Solanuma lycopersicum的SIOMT1、源自Solanuma lycopersicum的SIOMT4、源自Solanuma lycopersicum的SICTOMT1、源自Rosa hybrida的RhOOMT1、源自RhOOMT2 来自Rosa hybrida,EOMT1来自罗勒,EjOMT1来自枇杷,AEOMT来自火炬松,FaOMT来自草莓,SpCOMT来自粟酒裂殖酵母,COMT1来自罗勒,ZeCAOMT来自百日草。 [0049] 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含与SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的序列。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含分泌信号。 在一些实施方案中,分泌信号是选自下组的肽:SED1、MATa、MATa前序列、TFP5-1、TFP1-4、TFP10、TFP23、SUC2、SRF1和KSH1。 在一些实施方案中,信号序列包含SEQ ID NOs:29-36和50-54中任一个所示的氨基酸序列。 [0050] 在一些实施例中,从第一发酵产品中去除一种或多种挥发性酚包括过滤第一发酵产品。 在一些实施例中,过滤包括使第一发酵产品经受反渗透。 在一些实施例中,从第一发酵产品中去除一种或多种挥发性酚包括使第一发酵产品与澄清剂接触。 在一些实施例中,澄清剂是活性炭或环糊精聚合物。 [0051] 在一些实施例中,与烟味相关的一种或多种非挥发性酚糖苷包括糖苷、龙胆双糖苷和/或芸香糖苷。 在一些实施方案中,一种或多种挥发性酚包括愈创木酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、苯酚、4-甲基愈创木酚、丁香酚和/或4-甲基丁香酚。 在一些实施方案中,一种或多种甲基化挥发性酚类包括藜芦醇(1,2-二甲氧基苯)、4-甲基藜芦醇、2-甲基苯甲醚、3-甲基苯甲醚和/或4-甲基苯甲醚。 [0052] 在一些实施方案中,酵母细胞属于酵母属。 在一些实施方案中,酵母细胞属于酿酒酵母(S.cerevisiae)种。 在一些实施方案中,酵母细胞是酿酒酵母加州艾尔酵母菌株 WEP001、EC-1118、Elegance、Red Star Cote des Blancs、Epemay II、London Ale III、Augustiner、W-34/70、Andechs、D254、RC212、 或 BO213。 在一些实施方案中,酵母细胞属于巴斯德酵母(S. pastorianus)种。 [0053] 在一些实施例中,在至少一种糖源中提供至少一种可发酵糖。 在一些实施例中,可发酵糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。 在一些实施方案中,与由不表达异源基因的对应细胞产生的发酵产物相比,发酵产物包含降低水平的一种或多种非挥发性酚糖苷。 [0054] 在一些实施例中,发酵产品是发酵饮料。 在一些实施例中,发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、酒柜、汽酒、硬苏打水、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。 在一些实施例中,糖源包括麦芽汁、葡萄汁、果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。 在一些实施例中,果汁是从选自以下的至少一种水果获得的汁液 包括葡萄、苹果、蓝莓、黑莓、覆盆子、醋栗、草莓、樱桃、梨、桃子、油桃、橙子、菠萝、芒果和西番莲。 在一些实施例中,糖源是麦芽汁并且该方法还包括产生培养基,其中产生培养基包括:使多个谷粒与水接触; 将水和谷物煮沸或浸泡以产生麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到麦芽汁中以产生带啤酒花的麦芽汁。 在一些实施例中,该方法还包括将至少一种啤酒花品种添加到培养基中。 在一些实施例中,糖源是葡萄汁,并且该方法还包括生产培养基,其中生产培养基包括压碎多个水果以生产葡萄汁。 在一些实施例中,该方法还包括从葡萄汁中去除固体水果材料以生产果汁。 在一些实施例中,该方法还包括至少一个额外的发酵过程。 在一些实施例中,该方法还包括碳酸化发酵产品。 [0055] 本发明的一个或多个实施例的细节在下面的描述中阐述。 本发明的其他特征或优点将从以下附图和几个实施例的详细描述以及所附权利要求中显而易见。 [0056] 附图的简要说明 [0057]附图并非旨在按比例绘制。 在附图中,各个图中所示的每个相同或几乎相同的部件由相似的数字表示。 为清楚起见,并非每幅图中的每个组件都可能被标记。 在图纸中: [0058] 图1显示示例性烟雾污染修复途径和本文所述的烟雾污染相关分子的化学结构。 [0059] 图2显示了五种□-甲基转移酶(OMTs)对五种烟味酚的体外转化率。 转化率定义为甲醚产物(甲基化挥发性苯酚)的气相色谱-质谱 (GC-MS) 峰面积除以酚类底物的峰面积。 测试了每种酶的两个克隆复制,每个复制产生两个单独的条(克隆复制 1 和克隆复制 2)。 对每个克隆-底物对进行两次技术复制反应,产生代表±1标准偏差的误差条。 包括“无裂解物”和“空”载体对照,其中未检测到转化。 无底物对照 对每种酶进行分析,在这些条件下,GC-MS 检测不到底物和产物。 苯酚作为底物包含在该实验中以告知结构-活性关系,尽管它通常不被认为是烟雾污染物质。 OMT 酶对应于 Sigomtl,white campion; Siomtl,西红柿; [0060] Rhoomt2,玫瑰; Eomtl,罗勒; Ejomtl,枇杷。 [0061] 图3显示了通过葡糖苷酶将非挥发性葡糖苷转化为挥发性酚类产物。 来自表达异源葡糖苷酶的酵母的酸化裂解物与非挥发性酚类葡糖苷一起孵育 9 天。 该图显示了通过葡糖苷酶从非挥发性酚类葡糖苷转化的挥发性酚类产物的峰面积。 峰面积被归一化为所有实验组中给定底物的最高峰面积,该最大值对应于 100% 的转化率。 [0062] 图 图4A-4B显示来自表达与分泌信号肽融合的AoBgll的所示酵母细胞培养物的细胞外上清液的代表性聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。 [0063] 图5显示在体外发酵产物相关浓度下AoBgll将非挥发性酚类糖苷转化为所示挥发性酚类。 来自表达 AoBgl1 的酵母细胞的裂解物与糖苷在酸性缓冲液中孵育 9 天。 省略裂解物的对照(缓冲液,灰色条)表示 9 天期间非酶促转化的程度。 [0064] 图6显示通过添加到混合物中的纯化的β-葡糖苷酶将非挥发性酚类葡糖苷转化为指定的挥发性酚类。 P-葡糖苷酶与葡糖苷在酸性缓冲液中孵育 9 天。 不含酶的对照(缓冲液,灰色条)表示 9 天期间非酶促转化的程度。 [0065] 图7显示了表达OMT酶的基因工程酿酒酵母菌株对所示挥发性酚底物的消耗。 数据显示在添加酚底物的黑比诺葡萄汁中发酵 5 天后,所示挥发性酚类的浓度。 亲本菌株对照 (D254) 表明由于细胞隔离或单独的内源性生物转化导致酚类浓度降低。 表达来自罗勒的 OMT 的菌株 yl375 和表达来自枇杷的 OMT 的菌株 yl376 表明由于 OMT 过表达引起的苯酚浓度变化。 由于这种苯酚的完全转化,对应于带有 4-甲基愈创木酚的菌株 yl375 和 yl376 的柱是不可见的。 [0066] 图8显示了通过表达OMT酶的基因工程酿酒酵母从酚类产生所示的挥发性酚类甲基醚。 数据显示了 Pinot 葡萄酒发酵 5 天后指定甲基化酚的浓度 加入苯酚底物的黑葡萄汁。 酚类甲基醚藜芦醇、4-甲基藜芦醇、2-甲基苯甲醚、3-甲基苯甲醚和 4-甲基苯甲醚分别对应于愈创木酚、4-甲基愈创木酚、邻甲酚、对甲酚和间甲酚的 O-甲基化产物。 对亲本菌株 (D254) 的控制表明缺乏从酚类产生的苯酚甲基醚的内源性生产。 表达来自罗勒的 OMT 的菌株 yl375 和表达来自枇杷的 OMT 的 yl376 表明由于 OMT 过表达而产生酚甲醚。 对应于 yl375 和 yl376 以及 2-甲基苯甲醚和 4-甲基苯甲醚的柱是不可见的,因为没有检测到预测的苯酚​​甲基醚产物。 然而,相应的酚被菌株 yl376 消耗(见图 7); 甲醚产物可能被菌株进一步代谢。 [0067] 图 9 显示了在葡萄汁培养基中通过表达 O-甲基转移酶的基因工程葡萄酒酵母菌株从 4-甲基愈创木酚葡糖苷生产 4-甲基藜芦醇,该葡萄汁培养基中添加了来自杏仁的 P-葡糖苷酶。 数据显示在黑皮诺葡萄汁中添加酚类糖苷底物进行 5 天葡萄酒发酵后甲基化苯酚的浓度。 汁液对照(“汁液”)不含 P- 葡糖苷酶和酵母,但含有葡糖苷底物。 4-甲基愈创木酚葡萄糖苷通过 P-葡萄糖苷酶转化为 4-甲基愈创木酚,然后通过 OMT 酶转化为 4-甲基藜芦醇。 对亲本菌株 (D254) 和汁液(条形不可见)的控制表明在发酵过程中没有从苯酚葡糖苷内源性产生苯酚甲基醚。 表达来自罗勒的 OMT 的菌株 yl375 和表达来自枇杷的 OMT 的菌株 yl376 由于添加的 P-葡糖苷酶和 OMT 酶的过表达而表现出酚甲醚生产。 [0068] 图10显示了通过表达O-甲基转移酶和分泌型β-葡糖苷酶的基因工程葡萄酒酵母从4-甲基愈创木酚葡糖苷生产4-甲基藜芦醇。 数据显示在添加了 4-甲基愈创木酚葡糖苷的黑皮诺葡萄汁中发酵 5 天后 4-甲基藜芦醇的浓度。 汁液对照(“汁液”)不含酵母但含有糖苷底物。 4-甲基愈创木酚葡萄糖苷被 P-葡萄糖苷酶转化为 4-甲基愈创木酚,然后被 OMT 酶转化为 4-甲基藜芦醇。 对亲本菌株 (D254) 和汁液(条形不可见)的控制表明在发酵过程中没有从酚葡糖苷内源性产生酚甲醚。 yl386、yl387、y 1388 和 yl389 菌株表明由于 P-葡糖苷酶和 OMT 过表达而产生苯酚甲基醚。 菌株 yl386 对应于罗勒和米曲霉 P-葡萄糖苷酶的 OMT 表达,具有 N 末端 TFP5-1 分泌信号; 菌株yl387对应于 来自罗勒和米曲霉 P-葡萄糖苷酶的 OMT 的表达,具有 N 末端 SED1 分泌信号; 菌株 y 1388 对应于来自枇杷的 OMT 和具有 N 末端 TFP5-1 分泌信号的米曲霉 P-葡萄糖苷酶的表达; 菌株 yl389 对应于来自枇杷的 OMT 和具有 N 末端 SED1 分泌信号的米曲霉 P-葡萄糖苷酶的表达。 [0069] 详细说明 [0070]葡萄酒界已经做出重大努力来了解烟雾暴露对葡萄的影响以及对暴露的葡萄生产的葡萄酒的影响。 此外,还开发了方法来评估最终葡萄酒中烟味的风险,并减轻烟味对最终产品的感官影响。 当木材燃烧时,例如在野火中,它会释放出木质素衍生的挥发性酚类物质,从而产生烟熏味和香气。 暴露在烟雾中的葡萄吸收这些挥发性酚并将它们代谢成非挥发性酚苷,其中含有与糖分子结合的酚。 参见,例如,Hayasaka 等人,J. Agric。 食品化学。 (2010) 58: 10989-10998; Hayasaka 等人,J. Agric。 食品化学。 (2013) 61: 25-33; Hayasaka 等人,J. Agric Food Chem。 (2010) 58: 2076-2081; Szeto 等,分子。 (2020) 25. 对受烟熏影响的葡萄汁和葡萄酒的化学分析已确定非挥发性酚苷为单糖苷和双糖苷,苯酚和 β-D-葡萄糖部分之间存在直接联系。 最常见的非挥发性酚苷包括葡萄糖苷(含葡萄糖)、龙胆双糖苷(含两个葡萄糖)和芸香糖苷(含葡萄糖和一个末端鼠李糖)。 烟雾污染的风险取决于烟雾暴露的持续时间和葡萄的发育阶段,这些阶段在成熟和收获之间最容易受到影响。 一旦进入葡萄内部,烟熏化合物主要集中在葡萄皮上; 因此,在带皮的情况下酿造的红酒往往受烟味影响最显着。 [0071] 在酿酒过程开始时,酚苷从葡萄皮和/或葡萄汁中提取到发酵酒中。 糖苷在发酵、陈化、储存和/或饮用过程中水解会释放挥发性酚类,并有助于感官感知烟味。 参见,例如,Kennison 等人,J. Agric。 食品化学。 (2008) 56: 7379-7383; Singh 等人,澳大利亚葡萄与葡萄酒研究杂志 (2011) 17:S13-S21。 最有效的挥发性酚被认为是愈创木酚和间甲酚,它们在葡萄酒中的感官检测阈值分别为 23 pg/L 和 20 pg/L。 参见,例如,Parker 等人,J. Agric。 食品化学。 (2012) 60: 2629-2637。 当存在于葡萄酒中时 浓度高于这些阈值时,可察觉到与烟味相关的异味。 其他挥发性酚类,如对甲酚、邻甲酚、苯酚、4-甲基愈创木酚,也有助于感知烟雾污染,部分是通过提供叠加效应,即使浓度低于其感官检测阈值(约 62-65 皮克/升)。 具有较高感官检测阈值的挥发性酚,如丁香醇和 4-甲基丁香醇,被认为对烟雾污染的感知贡献较小,但仍可用作烟雾暴露的标记物。 [0072] 葡萄和葡萄酒中挥发性酚类和酚苷类物质的浓度会因烟雾暴露条件而异,但丁香酚龙胆双糖苷被认为是最丰富的烟雾污染化合物,浓度高达 1.5 mg/L。 然而,由于其高气味阈值,游离丁香醇影响烟雾感官知觉的可能性很小,即使所有丁香醇都从其结合形式中释放出来。 愈创木酚、4-甲基愈创木酚和甲酚糖苷虽然目前的浓度为每升数十至数百微克,但随着时间的推移会释放出游离酚,因此会强烈影响烟雾的感官感知。 例如,暴露在烟雾中的葡萄每升可从愈创木酚糖苷的水解中释放出数百微克的游离愈创木酚。 由于这些浓度远高于检测阈值,愈创木酚糖苷被认为是烟熏葡萄酒整体特征的主要贡献者。 [0073]最近,烟雾污染已成为啤酒酿造界的一个问题。 大多数美国啤酒花都生长在美国太平洋西北部,那里发生火灾,导致啤酒花暴露在烟雾中,与葡萄一样,啤酒花吸收的挥发性酚会形成酚苷。 研究工作表明,在啤酒酿造过程中添加暴露于烟雾中的啤酒花,无论制备(整锥、颗粒、提取物)或添加时间(水壶、漩涡、发酵期间),都可能导致啤酒被烟雾污染。然而 干投过程中加入烟熏酒花时,烟熏味最浓——这种在发酵罐中直接向啤酒中加入调味酒花的做法,近年来越来越流行。 [0074] 由于烟雾暴露对葡萄酒和啤酒风味的不利影响,因此有必要采取减轻烟雾污染影响的策略。 首先,酿酒师和酿酒师必须决定是否收获受烟雾影响的葡萄或啤酒花。 澳大利亚葡萄酒研究所建议通过发送葡萄样品进行分析和进行小规模发酵来评估烟雾污染的风险,这些发酵可以通过感官分析来分析与烟雾相关的特征(“我能闻到烟味 - 现在怎么办?”葡萄种植者和酿酒师 (2020)672:28-33)。 然而,收获葡萄或啤酒花作物的决定可能不会 直截了当。 低浓度或高浓度的游离酚和结合酚可能给出明确的答案,中间水平可能难以解释,因为发酵饮料(例如葡萄酒、啤酒)被烟熏污染的不同阈值存在不确定性。 此外,小规模发酵需要时间和资源,可能无法代表陈化和储存后最终产品中挥发性酚类的存在。 [0075] 在葡萄酒加工和发酵过程中,用于减轻烟熏污染的策略包括排除叶子材料、保持水果凉爽以及尽量减少发酵时间包含葡萄皮。 这些策略效果有限,不太可能将多酚浓度降低到风味检测阈值以下。 修复成品、烟熏葡萄酒的方法包括用活性炭精制葡萄酒、反渗透处理、用未污染的葡萄酒稀释葡萄酒,以及添加单宁或橡木片来掩盖烟熏味。 这些策略中的每一个都有重大的挑战和局限性。 例如,澄清从发酵饮料中去除颜色、风味和所需的芳香化合物。 反渗透也去除了理想的香气,但也没有完全去除糖苷,导致随着糖苷水解,烟味会随着时间的推移再次出现。 用未受污染的葡萄酒稀释葡萄酒需要大量未受污染的葡萄酒,并且在发酵饮料中添加单宁或橡木可能会产生与预期葡萄酒截然不同的葡萄酒。 [0076] 本公开描述了酵母菌株的开发,这些酵母菌株已经被基因工程改造以水解与烟味相关的非挥发性酚糖苷以产生一种或多种挥发性酚。 本文提供经改造以表达具有糖苷酶活性的酶的修饰酵母细胞或经改造以表达具有糖苷酶活性的酶和具有O-甲基转移酶(OMT)活性的酶的经修饰酵母细胞。 本文还提供经改造以表达具有O-甲基转移酶(OMT)活性的酶的修饰酵母细胞。 本文还提供了生产发酵饮料的方法,包括在发酵过程中将修饰的酵母细胞与包含糖源的培养基接触,所述糖源包含至少一种可发酵糖。 本文还提供了生产乙醇的方法,包括在发酵过程中将修饰的酵母细胞与包含糖源的培养基接触,所述糖源包含至少一种可发酵的糖。 在一些实施例中,经修饰的细胞和使用此类细胞的方法导致从受烟熏影响的成分(例如,葡萄、啤酒花)生产组合物和发酵产品,而不存在不希望的烟熏味感官特征。 糖苷酶 [0077]本公开的方面涉及包含编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因的修饰细胞。 本公开的方面涉及修饰的细胞,其包含编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因和编码具有O-甲基转移酶活性的酶的异源基因。 如本文所用,术语“异源基因”是指包含遗传指令的核酸序列(例如,DNA),其被引入宿主生物体(例如,遗传修饰的细胞)中并由其表达,而宿主生物体(例如,遗传修饰的细胞)不 自然编码引入的基因。 异源基因可以编码细胞通常不表达的酶、细胞通常不表达的酶的变体(例如,突变的酶)、编码通常在细胞中表达的酶的基因的额外拷贝。 细胞,或编码通常由细胞表达但处于不同调节下的酶的基因。 [0078] 本公开的方面还涉及使培养基或发酵产品与具有糖苷酶活性的酶接触。 在一些实施方案中,酶是重组酶,例如,其由生物体产生、分离和/或纯化并添加到培养基或发酵产物中。 在一些实施方案中,酶提取自来源,例如微生物、酵母、哺乳动物或植物来源。 因此,本文所述的任何糖苷酶(例如,AoBgl1)可在遗传修饰的细胞中表达为异源酶或以重组和/或纯化酶的形式提供。 在一些实施方案中,糖苷酶来自甜杏仁、大肠杆菌、那不勒斯嗜热袍菌、脆弱拟杆菌、热纤梭菌、根瘤菌、化脓性链球菌。 在一个实例中,糖苷酶从杏仁中纯化,并以冻干形式提供,例*自 Millipore Sigma。 在一个实例中,糖苷酶是重组人糖苷酶,并且以冻干形式提供,例*自Bio-Techne Corporation。 [0079] 糖苷酶是催化两个或多个糖之间或糖与另一种化学残基(例如,酚和糖)之间糖苷键水解的酶。 在一些实施方案中,糖苷酶从糖或糖苷中去除末端糖残基。 糖苷酶往往具有不同的底物特异性和催化活性,通常根据水解的糖残基类型进行分类。 在一些实施方案中,糖是葡萄糖或鼠李糖。 在一些实施例中,糖苷酶是葡糖苷酶。 在一些实施例中,糖苷酶是β-葡糖苷酶, 例如 P-d-吡喃葡萄糖苷葡糖水解酶。 在一些实施例中,糖苷酶是鼠李糖苷酶。 在一些实施方案中,糖苷酶是α-L-鼠李糖苷酶。 [0080] 非挥发性酚糖苷的水解导致游离的挥发性酚类物质的释放,这些酚类物质可能会在发酵前、发酵过程中或发酵后给发酵产品带来烟熏异味。 非挥发性酚糖苷形式的酚类可以被吸收到发酵底物(例如,葡萄、啤酒花)中,例如,当发酵底物暴露于环境烟雾时。 随着时间的推移,酚类从糖苷中释放出来,变成游离的挥发性酚类,从而产生不受欢迎的烟熏异味。 [0081] 本文所述的修饰细胞经过遗传修饰以表达编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因,该酶可以水解与烟味相关的非挥发性酚糖苷,从而产生游离的挥发性酚类。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是重组和/或纯化的酶,其可以水解与烟味相关的非挥发性酚糖苷,从而产生游离的挥发性酚类。 然后可以通过诸如过滤(例如,反渗透)、与澄清剂接触或通过进一步化学修饰(例如,通过转化为修饰形式(例如,甲基化))的方法去除挥发性酚类。 [0082]在一些实施方案中,糖苷酶催化糖部分从一种或多种与烟味相关的非挥发性糖苷中去除(释放)。 在一些实施方案中,糖苷酶催化葡萄糖部分从一种或多种与烟味相关的非挥发性糖苷中去除(释放)。 在一些实施方案中,糖苷酶催化鼠李糖从一种或多种与烟味相关的非挥发性酚糖苷中去除(释放)。 [0083] 如本文所用,术语“与烟味相关的非挥发性酚糖苷”是指与苯酚结合的糖部分,其形式在特定条件下不会蒸发成气体形式。 与烟味相关的非挥发性酚糖苷的例子包括但不限于糖苷、龙胆双糖苷和芸香糖苷。 在一些实施方案中,糖苷酶催化葡萄糖部分从与烟味相关的糖苷中去除(释放)。 在一些实施方案中,糖苷酶催化从与烟味相关的龙胆双糖苷中去除(释放)至少一个葡萄糖部分。 在一些实施方案中,糖苷酶催化葡萄糖部分和/或鼠李糖从与烟味相关的芸香苷中去除(释放)。 [0084] 如本文所述,非挥发性酚糖苷的水解导致产生一种或多种挥发性酚。 挥发性酚类的例子包括,没有 限制、愈创木酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、苯酚、4-甲基愈创木酚、丁香酚和/或 4-甲基丁香酚。 在一些实施方案中,非挥发性酚糖苷的水解导致愈创木酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、苯酚、4-甲基愈创木酚、丁香酚和/或4- 甲基丁香醇。 [0085] 在一些实施方案中,编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因是野生型(天然存在的)糖苷酶基因(例如,从生物体分离的基因)。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶获自细菌。 在一些实施例中,具有糖苷酶活性的酶获自植物。 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶获自酵母或真菌。 [0086] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶来源于棘孢曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、Thermomicrobia PRI-1686、假丝酵母、多粘芽孢杆菌、油橄榄, 酿酒酵母、橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌、酒球菌、甜李、环状芽孢杆菌或中华根瘤菌。 [0087] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是源自棘尖曲霉的RhaB、源自棘尖曲霉的RhaA、源自土曲霉的AtRha、源自构巢曲霉的AndRha、源自黑曲霉的AngRha、源自米曲霉的AorhaA、源自乳杆菌的RhaB1 植物乳杆菌 NCC245,RhaB2 来源于植物乳杆菌 NCC245,LpRaml 来源于嗜酸乳杆菌,RhmA 来源于 Thermomicrobia PRI-1686,RhmB 来源于 Thermomicrobia PRI-1686,bgln 来源于 Candida molischiana,bglA 来源于多粘芽孢杆菌,OepGLU 来源于油橄榄, 来自酿酒酵母的EGH1、来自橙色嗜热子囊菌IFO9748的Tabgl1、来自米曲霉的AoBGL1、来自黑曲霉的AnBGL1、来自里氏木霉的TrBGL2、来自里氏木霉的TrBGL1、来自粗糙脉孢菌的BGL1、来自粗糙脉孢菌的BGL2、bgol 源自米曲霉的OoBgl、源自Oenococcus oeni的OoBgl、来自Prunus dulcis的Ph691、来自Prunus dulcis的Ph692、来自Bacillus circulans的BsBglA或来自中华根瘤菌的SmBgl。 [0088] 在一些实施例中,糖苷酶是鼠李糖苷酶。 在一些实施例中,糖苷酶是α-L-鼠李糖苷酶(也称为α-L-鼠李糖苷 鼠李糖水解酶)。 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自棘孢曲霉的 RhaB。 棘孢曲霉 RhaB 由 SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AF284762。 [0089] MHI ITPLLIPAVLVAAARVPYREYILAPSSRVIVPASVRQVNGSVTNAAGLTGSSLGTAV FHGVSSVTYDFGKNVAGIVSLTVGSSSSPSAFLGVTFSESSLWASSEACDATGNSGLDAP LWFPVGQKAGTYTPDSKYVRGGFRYLTWSNTSATIPLNSLHITFTAAPDQDLQAYQGWF HSNDELLNEIWYAGAYTNQLCTIDPTYGSASSETISTSGLNYWYNNLTIANGTSTVTDGA KRDRAVWPGDMSISLESIAVSTNDLYSVRMGLEALLALQSSEGQLPWGGKPFNIDVSYTY HLHSLIGMSFLYRFSGDKVWLSNYWGQYSKGVEWAVRSVADGVKSAANQLLWDDQAGLYR DNQTTELHPQDGNAWAVKSNLTLSGSQNRAISQALKARWGRYGAPAPEAGATISPFIGGF EIQSHFLANQPDVALDMIRLQWGFMLRDPRMTQSTLIEGYSTDGSIHYAPYAND ARISHA HGWSTGPTYALTAYAAGLQLLGPAGNSWLIAPQPGGLTSIDCGFATALGVFSWFERDSV GRYNSFSFGAPTGTTGRIELPGVRGTLVSTTGQRVQLVNGTASGLRGGKWKLIESAD (SEQ ID NO: 1) [0090] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自棘孢曲霉的 RhaA。 棘孢曲霉 RhaA 由 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AF284761。 [0091] MLWSSWILTPALLAIGSHAVPFEDYILAPQSRTLNPSLVYQVNGTVDNPEALVGLTTHQT TLHGKSSVTYDFGRNIAGIVSLDVTSVSSKAAQLGVTFTESSLWISSEACDATSDAGLDS PLWFSVGHGPGTYGADKKHLRGAFRYLTLVNNSTATISLDGLSINYTAAPTQDLRGYKGY FHSSDELINRIWYAGAYTLQLCTIDPTTGDSLIWLGVISSSDNITLPQTDSWWNNYTITN GSTTLVDGAKRDRLVWPGDMS IAIESAAVSTADLESVRTALESLFVLQKANGQLPYAGRP FLDIVSFTYHLHSLIGASSYYQYTGDRSWITRYWGQYKKGLQWALSSLDNSGLANITASA DWLRFGMGGHNIEANAILYYVLNDAISLASSLDDRANVGNWSTAASKIKAAANARLWDAQ NSLYRDNETTTLHPQDGNAWAIKANLTLSSNQSEAISSALAARWGPYGAPAPEAGSTVSP FIGGFELQAHYLANEPDRALDLLRLQWGFMLDDPRMTNSTFIEGYSTDGSLAYAPYRNTP RVSHAHGWSTGPTSALTHYTAGLRLTGPAGSTWLFKPQPGNLTEVQAGFETQLGLFATQY QKSATGTFQQLTFTAPNGTSGSVEIEGATGQLISKRGQAVKLVNGKARGLQGGTWTLKGL (SEQ ID NO: 2) [0092] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自土曲霉的 AtRha。 土曲霉 AtRha 由 SEQ ID NO:3 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AFH54529。 [0093] MALS I SQVAFEHHRTALGIGETQPRVSWRFDGNVSDWEQRAYEIEVKRAGHDAD VERSES SDSVLVPWPSSPLQSGEEATVRVRSFGSDGQHDTPWSDAVTVEPGLLTPDDWHDAWIAS DRPTEVDATHRPIQFRKEFSVDDSYVSARLYITALGLYEARINDQRVGDHVMAPGWQSYQ YRHEYNTYDVTDLLKQGPNAIGVTVGEGWYSGRIGYDGGKRNIYGDTLGLLSLLWTKSD GSKLYIPSDSSWKSSTGP I I SSEI YDGEEYDSRLEQKGWSQVGFNSTGWLGTHELSFPKE RLASPDGPPVRRVAEHKLANVFSSASGKTVLDFGQNLVGWLRIRVKGPKGQTIRFVHTEV MENGEVATRPLRQAKATDHFTLSGEGVQEWEPSFTYHGFRYVQVDGWPADTPLDENSVTA IWHSDMERTGYFECSNPLISKLHENILWSMRGNFFSIPTDCPQRDERLGWTGDIHAFSR TANFIYDTAGFLRAWLKDARSEQLNHSYSLPYVIPNIHGNGETPTSIWGDAIVGVPWQLY ESFGDKVMLEEQYGGAKDWVDKGIVRNDVGLWDRSTFQWADWLDPKAPADDPGDATTNKY LVSDAYLLHSTDMLANISTSLSKGEEASNYTEWHAKLTKEFQKAWITSNGTMANETQTGL ALPLYFDLFPSAEQAQSAAKRLVNI IKQNDYKVGTGFAGTHLLGHTLSKYGESDAFYSML RQTEVPSWLYQWMNGTTTWERWDSMLPNGSINPGQMTSFNHYAVGSVGSWLHEVIGGLS PAEPGWRRINIEWPGGDLQQASTKFLTPYGMASTKWWLDGQDQSCGGFDFHLVAEVPPN TRATWLPGKGGEKVDVGSGVHEYHVRCVKL (SEQ ID NO: 3) 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自构巢曲霉的 AndRha。 构巢曲霉 AndRha 由 SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 CBF86381.1。 [0094] MISLPLLALATGAVASASCWRNTSCTGPSKPSFPGPWDSNNFAPGSRLIQPKSILSLPDG TYISDYTSDSHPSITTEDAGLVFDFGLEVGGIVTIDYSSSVPNTTLGLAFTEAKDYIGRT SDNSNGGTGADGALATLLTEGEGSYTMPDSQLRGGFRYLALFIPSSSSSNASLTIQSITL ELAFQPTWSNLRAYQGYFHSSDPVLNKAWYAGAYTLQTNSVPRTTCRVSVSSATGWNNNA VCGPGETLLLDGAKRDRWVWIGDMGVAVPSASVSTGDTESTKNALLAIWDNQTPSGLLPK AGPPYLRADSDTYHLWTI IGTYNYFLFTEDYDFLAGIWQKYVKALDYSLAKITPLGIMNA TQTADWGRWNYGTLASSANMLLYRSLTTAAFLAPYAGDNPENYTDLASTLRSAIVTHLYD SAVGAFRDSPNSTLYPQDANSMALAFSFFSQSPLNCSSSFNLAEAARVSSYLESNWTPIG PEVPELPNNISPFISSIELEGHFASGHADRAIELIRMLWGWYLAHPNGTQSTVPEGYLVD GSWGYRGDRGYRNDPRYVSHAHGWSSGPTSTLTEYAVGLKITKPKGSEWSLRPASFGIQG FEEAQAGFTTGLGKFKAAFRVQGKRATVTWDTPAGTKGWVQLPGEEGSWVEGGMGSLTVK L (SEQ ID NO: 4) [0095] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自构巢曲霉的 AndRha。 构巢曲霉 AndRha 由 SEQ ID NO:5 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 FR873475。 [0096]MSLSISGVTFEHHRSALGIGEPSPRISWRFDGTVSNWTQSAYEIEINRAGQANTFRVNSS DSVLVPWPSDPLQSGEEATVRVRSFGRANQPDAPWSDPVTVEPGLLDEDDWQSAVAIVSD RETEVNATHRPIYFRKDFDVDEEILSARLYITALGVYEAEINGQPVGDHVLAPGWQAYSH RHEYNTYDVTDLLQTGDNTIGVTVGEGWYAGALTWSMTRNIYGDTLGLLSLLSIATADGK TI YVPSDETWQSSTGP I IASEI YNGETYDSTQAIEGWSQPGFDASGWLGTHEVTFDKSVL AAPDAPAVRRVEERRLESVFKSASGKTVLDFGQNLVGWLRVRVKGPRGSTISFVHTEVME NGEVATRPLRNAKATDNLTLSGEEQEWEPSFTFHGFRYVQVTGWPEETELNADSVTAIVI NSDMEQTGFFSCSNPLLNKLHENI IWSMRGNFLS IPTDCPQRDERLGWTGDIHAF ARYAN FIYDTSGFLRGWLRDAYSEQLENNYAPPYVIPNVLGPGSPTSIWGDAIVSVPWDLFQTYG DKAMLSEQYAGATAWLDKGILRNEAGLWNRSTFQYADWLDPLAPPDDPGAATTNKYLVSD AYLIHSTELVANI SAYLDRPDDAERYAADRADLTRAFQKAWI SANGTVANETQTGLTLPL YFKLFERPEHYTDAVSRLVDI IKENEYKVGTGFAGTHLLGHTLSAYNASSTFYNTLLQED VPGWLFQVLMNGTTTWERWDSMLANGSVNPGEMTSFNHYAVGSVGAWMHENIGGLRPIEP GWRRFAVDVKVGGGLSSAQERFLSPYGSAESSWEVRDGKFMLGVKVPPNSEAWSLPGAP TRGKKEVIVGSGMHRFESTLG (SEQ ID NO: 5) [0097] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自黑曲霉的 AngRha。 黑曲霉 AngRha 由 SEQ ID NO:6 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 XP_001389086.1。 [0098] MWSSWLLSALLATEALAVPYEEYILAPSSRDLAPASVRQVNGSVTNAAALTGAGGQATFN GVSSVTYDFGINVAGIVSVDVASASSDSAFIGVTFTESSMWISSEACDATQDAGLDTPLW FAVGQGAGLYTVEKKYNRGAFRYMTWSNTTATVSLNSVKINYTASPTQDLRAYTGYFHS NDELLNRIWYAGAYTLQLCSIDPTTGDALVGLGVITSSETISLPQTDKWWTNYTITNGSS TLTDGAKRDRLVWPGDMSIALESVAVSTEDLYSVRTALESLYALQKPDGRLPYAGKPFFD TVSFTYHLHSLVGAASYYQYTGDRAWLTRYWGQYKKGVQWALSSVDSTGLANITASADWL RFGMGAHNIEANAILYYVLNDAI SLAQTLNDNAP IRNWTTTAARIKTVANELLWDDKNGL YTDNETTTLHPQDGNSWAVKANLTLSANQSAIVSESLAARWGPYGAPAPEAGATTVSPF IG [0099] GFELQAHYQAGQPDRALDLLRLQWGFMLDDPRMTNSTF IEGYSTDGSLAYAPYTNTPRVS [0100] HAHGWATGPTSALT IYTAGLRVTGPAGATWLYKPQPGNLTQVEAGFSTRLGSFAS SFSRS [0101] GGRYQELSFSTPNGTTGSVELGDVSGQLVSDRGVKVQLVGGKASGLQGGKWKLSNN(序列号:6) [0102] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自米曲霉的 AorhaA。 米曲霉AorhaA由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列提供,其对应于UniProtKB登录号BAE58354.1。 [0103] MRLPWSAWLLSPALLAVACYGVPYNEYILAPASRHLVPFEVLEVNGSVTDP S SLTQSTGG NATFNGPASVTFDFGRNIAGIVSLD IGS S STRDAF IGVTFTES SLWI S SQACDATADSGL DSPLWFPVGRGAGTYTADKKHNRGAFRYMTLVTNTTAWSVRNVQINYTAAP SQDLRAYT GYFHSNDELLNRVWYAGAYTNQICT IDP STGDALPFLGVI S SDSNI TLPETNPWYSNYT I SNGS STLTDGAKRDRLIWPGDMS IALESVSVSTADLYSVRTALETLLSQQRSDGRLPYAS EPFLDLVSYTYHLHSLIGVSYYYRHSGDRAWLSKYWGQYQKGLQWALS SVDNTGLANI TA S SDWLRFGMGGHNIEANAILYFVLNEAQELSQAINNHTNANWTKIASGIKSATNKNLWDA NNGLYKDNETTTLYPQDGNAWAIKANLTLSTNQS ST I S SALS SRWGNYGAPAPEAADAVS PF IGGFE IQAHFLANQPQKALDLIRLQWGFMLDDPRMTNSTF IEGYSTDGTLHYAPYTND ARVSHAHGWSTGPTAALSFFVAGLHLTGSAGATWRFAPQPGDLTSVDAGYTTALGLFSTT FKRSENGDYQELTFTTPQGTTGDVDLAGAEGTLVSADGERVFLVKGTATGI TGGSWNLEV ASQ (SEQ ID NO: 7) [0104] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自植物乳杆菌 NCC245 的 RhaB 1。 植物乳杆菌 NCC245 RhaB1 由 SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 FJ943501。 [0105] MSKEAVWLWYPGDFE IHQGMLQNFKREERGMGWPAYWYIDDCNRNVNFKRHYDLKESTQF TVLAKGTGYVDVNGTKYRLNHAINCDAGATD I QVFVGNVQGLP T I Y I VGE 11 KSD SGWLA SNFVTTLPAGHD ILYTDRNQDPNVIEYRTEKWAKAQQAVDGGVLYDFGRAVNGTVTVKT NGPVTLCYGESETEARDVEMCYYKQSDVTATTKVRKRAFRYVFVPHCQLGD IELTAMHEY IPKNNP S SFTSDNKLINQIWNVATETLNLCSDLFF IDGIKRDRWIWAGDAYQANF INQYS FFNED IDKRTLLALRGQDD IKQHMNT IVDYSMLWVIGVLNHYQMTGDREFLKI IYPKLES MVQYF IQQTNEHGF IYGRKNDWIFVDWSEMDKQGTVAAEQILLLEDYKT IMTCGEVLGKD VAGYQAKYDQLFKNLMKYFWDDEQGAF IDSYESGKRHVTRHANIFAILFDWDENKQQLI LKNVLLNNAI TQI TTPYFKFFEQDALCKLGEQHRVYQVLLDYWGGMLDRGAVTFWEEFDP SQHGKDMYAMYGDPYGKSLCHAWGASP IYLLGRHFVGLRPTAPGYQTFE IKPELSEFHHL HTVLP IKGGTVTWKDQHQLSVTASRAGGTLIVDGQRQSLEPNRTAWPV (SEQ ID NO: 8) [0106] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自植物乳杆菌 NCC245 的 RhaB2。 植物乳杆菌 NCC245 RhaB2 由 SEQ ID NO: 9 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 FJ943501。 [0107]MAFTFQINNDVQFRHNQALLDKSASYRP ILKETQVKAAS IVALELDTQYLEGWGVKQIAP IERLS SYELKRDDQI I IDFGDHQVGQFS ININAVGSPMDAPLCFKIKFAEMPAELARKSE DYDGWLSKSWIQEETVHLDVLPTTLTLPRRYSFRYAE I TWDTSPKWRAVFSNPWTATS AVDTATVHQPELADAQLQRI YEVGLKTLADCMQDVFEDGPKRDRRLWIGDLRLQALANYA TFKDTDLVKRCLYLFGAMPTTAGRIPANVFTKPTAVPDDTFLFDYSLFF I S ILADYEAFS SDKTVLNDLYRVAKNQMDLALAQVTSEGKLKLTEENPVF IDWSNDFDKETAGQAI I IYTL KQF I TLAELVNDTSLETYTAILRKLNQYAKTQLFDSQSGLFVSGDQREVNVASQVWMTLA HVLDPEQTTALMQTTVTKLFP I TGIATPYMYHHI TEALFEAGLKQEAVQLMKDYWGKMI T LGADTYWEAFDPNQPDYSPYGSP ILNSYCHAWSCTPVYLINKYLV (SEQ ID NO:9) [0108] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Thermomicrobia PRI-1686 的 RhmA。 Thermomicrobia PRI-1686 RhmA 由 SEQ ID NO: 10 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AAR96046。 [0109] MLRIDRVKVERSRDGLGLGTGRPRLCWRVETD IRDWRQAAYEVELYDGSGQLVGSTGRVE SGESVWVAWPFEALGSRQRAGVRVRVWGEDGSESDWSDLQWLEVGLLARDDWQGAF I TPD WEEDTSVANPCPYLRKTFSLPGGVRRARLYVTGLGVYEVELNGQRVGDHVLSPGWTSYRH RLLYETFDVTGLLREGDNCLGAILGDGWYRGRLGFGGGRRNLYGERLALLAQLEVELEDG SRQVWTDGSWRAHRGP ILESGI YDGEVYDARLEMPGWSTPEYDDSEWAGTRELGWPTES LEPLEVPARRTQEVAPRE ILRSFSGKT IVDFGQNLVGRVRLRVSGPRGQRVRLRHAEVLE GGELCTRTLRTARATDEYVLRGDGEEEWEPRFTFHGFRYVEVEGWPGELRAEDLVAWCH SDMERIGWFGCSDPLVERLHENWWSMRGNFLHIPTDCPQRDERLGWTGD IQVFSPAACF IYDASGFLTSWLRDVALDQDESGAVPFWPNALGGQVIPAAAWGDAAVIVPWVLYQRYGD AGVLEAQWP SMRAWVDC IKT IAGPARLWNKGFQFGDWLDPAAPPDNPAAARTDPYIVASA YFARSAE IVGLSAQVLGMQDMAEEYLGLASEVREAFNREYVTPNGRWSDAQTAYSLAIG FALLPTQEQRQHAGERLAELVRAEGYKIGTGFVGTPLICDALCATGHHDVAYRLLMSREC P SWLYPVTMGATT IWERWDSLRPDGSVNPGEMTSFNHYALGAVADWLHRWGGLAPAEPG YRKLRIQPVPGGGLSYARARHVTPYGTAECSWRTEGGE IEVRVWPPNTSAQWLPGSGR EVEVGSGEHVWRYAFEAHRYPPVTLDTPLKE ILEDAEAWEVLTRHFPEVASMPPRRLERI GT IRDLAASWAFNERVGRLERELQALSRERS (SEQ ID NO: 10) [0110] 具有糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Thermomicrobia PRI-1686 的 RhmB。 Thermomicrobia PRI-1686 RhmB 由 SEQ ID NO: 11 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AAR96047。 [0111] MQWQASWIWLEGEP SPRNDWVCFRKSFELDRSASPLEEAKLS I TADSRYVLYVNGQLVGR GPVRSWPFEQSYDTYDLRHLLHPGRNCLAVLVTHFGVSTFSYVRGRGGLLAQLELS SGDD RTT IGTDGSWKVHRHLGYSRRTTRI SPQQGFVEQLDARAWS SEWKDLMYDDSGWEDAMIV GPVGTPPWEQLVPRD IPFLTEEVLHPTRWSLHSTVPPKIAVAVDMRAIMMPDSADHAEQ VQYAGFLAT ILRTDGEGTARLLLSKPWVGDGIAAS INGQVYGAELMSRTPTGRELEVELS AGDNLLLVYVCGSDHADPLRLALDSDLGLELVSPTGGESAFVAIGPLASRWRNFDFSQP LEYDETAVRRI S SCASVADLRAWSHLPRSVPPELVSPADVFTLCTWPRQRTELTTGKELE AMVFP SKDPGLVP ILRAGDTELVLDFGQEVSGYLFLDVEASEGTLIDLYGFEFMEDDYRQ DTVGLDNTLRYTCREGRQHYVS​​PQRRGLRYLMLTVREARAPLRVHGVGWQSTYPVSQVG TFRCSDPLLND IWE I SRLTTKLCMEDTFVDCPAYEQTFWVGDSRNEALTAYYLFGAEELV RRCLRLVPGSRRYTPLYMDQVP SGWVSVIPNWTFLWVMACREYYERTGDLAFVQD IWPD I QYTLDHYLQHINDDGLLE I SAWNLLDWAP IDQPNSGWTHQNCFFVRALKDADELGQSAG DETAGRYAERARELAAAINTHLWSDEHKAYIDS IHADSTRS SVI SMQTQWALLTGVAEG DRAEWRSHIASPPAGWVQIGSPFMSFFLYEAMVRQGMYAQMLED IRQKYGLMLEHGATT CWETFPGALGARYTRSHCHAWSAAPGYFLGAYVLGVRPGGPGWHRVIVAPQPCDLAWARG SVPLPRGDRVDVSWRREGQKLLLRVERPQEVELEWPPEEYELELDERVRQTTQ (SEQ ID NO: 11) [0112] 具有糖苷酶(β-D-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Candida molischiana 的 Bgln。 Candida molischiana Bgln 由 SEQ ID NO: 12 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 U16259.1。 MKS T 111 L S VLAAAT AKN I S KAEMENLEHWWS YGRS DP VYP S P E I S GLGD WQF AYQRARE IVALMTNEEKTNLTFGSSGDTGCSGMISDVPDVDFPGLCLQDAGNGVRGTDMVNAYASGL HVGASWNRQLAYDRAVYMGAEFRHKGVNVLLGPWGP IGRVATGGRNWEGFTNDPYLAGA LVYETTKGIQENVIACTKHFIGNEQETNRNPSGTYNQSVSANIDDKTMHELYLWPFQDSV RAGLGS IMGSYNRVNNSYACKNSKVLNGLLKSELGFQGFWSDWGGQHTGIASANAGLDM AMPSSTYWEEGLIEAVKNGTVDQSRLDDMATRI IAAWYKYARLDDPGFGMPVSLAEDHEL VDARDP AAAS T I FQGAVEGHVLVKNENALPLKKPKY I SLFGYDGVS TDVNTVGGGF SFF S FDVKAIENKTLISGGGSGTNTPSYVDAPFNAFVAKAREDNTFLSWDFTSAEPVANPASDA CIDFINAAASEGYDRPNLADKYSDKLVEAVASQCSNTIWIHNAGIRLVDNWIEHENVTG VILAHLPGQDTGTSLIEVLYGNQSPSGRLPYTVAKKASDYGGLLWPTEPEGDLDLYFPQS NFTEGVYIDYKYFIQKNITPRYEFGYGLTYTTFDYSELEVDAITNQSYLPPDCTIEEGGA KSLWDIVATVKFTVTNTGDVAAAEVPQLYVGIPNGPPKVLRGFDKKLIHPGQSEEFVFEL TRRDLSTWDWAQNWGLQAGTYQFYVGRSVFDVPLTSALVFTN (SEQ ID NO: 12) [0113]具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自油橄榄(橄榄)的 OepGLU。 Olea europaea OepGLU 由 SEQ ID NO: 13 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 KX278417。 [0114] MDIQSNVLTITSGSSPTDTSSNGQAAKSTKERIKRSDFPSDFVFGAATASYQVEGAWNEG GKGMSNWDYFTQSQPGGISDFSNGTIAIDHFNMFKDDVWMKKLGLKAYRFSLSWPRILP GGRLCHGVSKEGVQFYNDLIDALLAADIEPYITIFHWDIPQCLQLEYGGFLHERWQDFI EYSEICFWEFGDRVKYWITLNEPWSFTVQGYVAGAFPPNRGVTPKDTEETKKHARLHRGG GKLLTAFKYGNPGTEPYKVAHNLILCHAHAVDIYRTKYQESQGGKIGITNCISWNEPLTD SQEDKDAATRGNDFMLGWFVEPWTGEYPESMIKNVGDRLPKFSEKEEKLVKGSYDFLGI NYYTSTYTSDDPTKPTTDSYLTDSRTKTSHERNKVPIGAQAGSDWLYIVPWGIYRVMVDM KKRYNDPVIYITENGVDEVNDKSKTSTEALKDDIRIHYHQEHLYYLKLAMDQGVNLKGYF IWSLFDNFEWAAGFSVRFGVMYVDYANGRYTRLPKRSAVWWRNFLTKPTAVPLKNEPEKS EDRRKRLRGST (SEQ ID NO: 13) [0115] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 [0116] 酿酒酵母。 酿酒酵母 EGH1 由 SEQ ID NO: 14 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号。 [0117] NP_012272.3。 [0118] MPAKIHISADGQFCDKDGNEIQLRGVNLDPSVKIPAKPFLSTHAPIENDTFFEDADKVSF INHPLVLDDIEQHI IRLKSLGYNTIRLPFTWESLEHAGPGQYDFDYMDYIVEVLTRINSV QQGMYI YLDPHQDVWSRFSGGSGAPLWTLYCAGFQPANFLATDAAILHNYYIDPKTGREV GKDEESYPKMVWPTNYFKLACQTMFTLFFGGKQYAPKCTINGENIQDYLQGRFNDAIMTL CARIKEKAPELFESNCI IGLESMNEPNCGYIGETNLDVIPKERNLKLGKTPTAFQSFMLG EGIECTIDQYKRTFFGFSKGKPCTINPKGKKAWLSAEERDAIDAKYNWERNPEWKPDTCI WKLHGVWEIQNGKRPVLLKPNYFSQPDATVFINNHFVDYYTGIYNKFREFDQELFI I IQP PVMKPPPNLQNSKILDNRTICACHFYDGMTLMYKTWNKRIGIDTYGLVNKKYSNPAFAW LGENNIRKCIRKQLSEMQKDAKSMLGKKVPVFFTEIGIPFDMDDKKAYITNDYSSQTAAL DALGFALEGSNLSYTLWCYCSINSHIWGDNWNNEDFSIWSPDDKPLYHDTRAKTPTPEPS PASTVASVSTSTSKSGSSQPPSFIKPDNHLDLDSPSCTLKSDLSGFRALDAIMRPFPIQI HGRFEFAEFNLCNKSYLLKLVGKTTPEQITVPTYIFIPRHHFTPSRLSIRSSSGHYTYNT [0119] DYQVLEWFHEPGHQFIEICAKSKSRPNTPGSDTSNDLPAECVIS (SEQ ID NO: 14) [0120] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Thermoascus aurantiacus IFO9748 的 Tabgl1。 Thermoascus aurantiacus IFO9748 Tabgll 是 由 SEQ ID NO: 15 所示的氨基酸序列提供,其对应于 [0121] UniProtKB 登录号 DQ114397。 [0122] MRLGWLELAVAAAATVASAKDDLAYSPPFYPSPWMDGNGEWAEAYRRAVDFVSQLTLAEK [0123] VNLTTGVGWMQEKCVGETGS IPRLGFRGLCLQDSPLGVRFADYVSAFPAGVNVAATWDKN [0124] LAYLRGKAMGEEHRGKGVDVQLGPVAGPLGRHPDGGRNWEGFSPDPVLTGVLMAETIKGI [0125] QDAGVIACAKHFIGNEMEHFRQASEAVGYGFDITESVSSNIDDKTLHELYLWPFADAVRA [0126] GVGSFMCSYNQVNNSYSCNSYLLNKLLKSELDFQGFVMSDWGAHHSGVGAALAGLDMSM [0127] PGD​​TAFGTGKSFWGTNLTIAVLNGTVPEWRVDDMAVRIMAAFYKVGRDRYQVPVNFDSWT [0128] KDEYGYEHALVGQNYVKVNDKVDVRADHADI IRQIGSASWLLKNDGGLPLTGYEKFTGV [0129] FGEDAGSNRWGADGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTADFPYLVTPEQAIQNEILSKGKGLVSA [0130] VTDNGALDQMEQVASQASVS IVFVNADSGEGYINVDGNEGDRKNLTLWKGGEEVIKTVAA [0131] NCNNTIWMHTVGPVLIDEWYDNPNVTAIVWAGLPGQESGNSLVDVLYGRVSPGGKTPFT [0132] WGKTRESYGAPLLTKPNNGKGAPQDDFTEGVFIDYRRFDKYNETP IYEFGFGLSYTTFEY [0133] SDIYVQPLNARPYTPASGSTKAAPTFGNI STDYADYLYPEDIHKVPLYIYPWLNTTDPKK [0134] SSGDPDYGMKAEDYIPSGATDGSPQP ILPAGGAPGGNPGLYDEMYRVSAI ITNTGNWGD [0135] EVPQLYVSLGGPDDPKWLRNFDRITLHPGQQTMWTTTLTRRDI SNWDPASQNWWTKYP [0136] KTVYIGSSSRKLHLQAPLPPY(序列号:15) [0137] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自米曲霉的AoBGL1。 米曲霉 AoBGL1 由 SEQ ID NO: 16 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号. [0138] Q2UIR4(基因 0090003001511)。 [0139]MLTSPTARTSVRI SRPATTERPNTVLTSGSLDIAMVQWSRTLTPPTSNMKLSAALSTLA ALQPAVGAAVQNRASDVADLEHYWSYGHSEPVYPTPETKGLGDWEEAFTKARSLVAQMTD KEKNNITYGYSSTANGCGGTSGGVPRLGFPGICLQDAGNGVRGTDMVNSYASGVHVGASW NRD L T Y S RAQ YMGAE F KRKGVNVALGP VAGP I GR I ARGGRNWE GFSNDPYLS GAL T GD T V RGLQESVIACVKHLIGNEQETHRSTPSMLANSRNQSSSSNLDDKTMHELYLWPFQDAVKA GAGSVMCSYNRINNSYGCQNSKAMNGLLKGELGFQGFWSDWGAQHTGIASAAAGLDMAM PSSSYWENGTLALAVKNESLPSTRLDDMATRIVATWYKYAEIENPGHGLPYSLLAPHNLT DARDPKSKSTILQGAVEGHVLVKNTNNALPLKKPQFLSLFGYDAVAAARNTMDDLDWNMW SMGYDNSLTYPNGSAVDAMMLKYIFLSSANPSAFGPGVALNATTITGGGSGASTASYIDA PFNAFQRQAYDDDTFLAWDFASQNPLVNPASDACIVFINEQSSEGWDRPYLADPYSDTLV QNVAS QC SNTMWI HNAGVRLVDRW I ENDN I T AVI YAHLP GQD S GRALVE VMYGKQ S P S G RLPYTVAKNESDYGSLLNPVIQSGTDDIYYPQDNFTEGVYIDYKAFVAANITPRYEFGYG LTYSTFDYSDLKVSTSSNVSTSYLAPGTTVAEGGLPSVWDI lATVTCTVSNTGSVAAAEV AQLYIGIPGGPAKVLRGFEKQLIEPGQQVQVTFDLTRRDLSTWDTEKQNWGLQAGSYALY VGKSVLDIQLTGSLSL (SEQ ID NO: 16) [0140] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自黑曲霉的 AnBGL1(也称为 BglA)。 黑曲霉AnBGL1由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列提供,其对应于AspGD系统名称An18g03570。 [0141] MRFTS IEAVALTAVSLASADELAYSPPYYPSPWANGQGDWAEAYQRAVDIVSQMTLAEKV NLTTGTGWELELCVGQTGGVPRLGIPGMCAQDSPLGVRDSDYNSAFPAGVNVAATWDKNL AYLRGQAMGQEFSDKGADIQLGPAAGPLGRSPDGGRNWEGFSPDPALSGVLFAETIKGIQ DAGWATAKHYIAYEQEHFRQAPEAQGYGFNITESGSANLDDKTMHELYLWPFADAIRAG AGAVMCSYNQINNSYGCQNSYTLNKLLKAELGFQGFVMSDWAAHHAGVSGALAGLDMSMP GDVDYDSGTSYWGTNLTI SVLNGTVPQWRVDDMAVRIMAAYYKVGRDRLWTPPNFSSWTR DEYGFKYYYVSEGPYEKVNQFVNVQRNHSELIRRIGADSTVLLKNDGALPLTGKERLVAL IGEDAGSNPYGANGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLVTPEQAI SNEVLKNKNGVFTA TDNWAIDQIEALAKTASVSLVFVNADSGEGYINVDGNLGDRRNLTLWRNGDNVIKAAASN CNNTIVI IHSVGPVLVNEWYDNPNVTAILWGGLPGQESGNSLADVLYGRVNPGAKSPFTW GKTREAYQDYLYTEPNNGNGAPQEDFVEGVF IDYRGFDKRNETP IYEFGYGLSYTTFNYS NLQVEVLSAPAYEPASGETEAAPTFGEVGNASDYLYPDGLQRI TKF IYPWLNSTDLEAS S GDASYGQDASDYLPEGATDGSAQP ILPAGGGAGGNPRLYDELIRVSVT IKNTGKVAGDEV PQLYVSLGGPNEPKIVLRQFERI TLQP SKETQWSTTLTRRDLANWNVETQDWE I TSYPKM VF AGS S S RKLP LRAS LP T VH * (SEQ ID NO: 17) [0142] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自里氏木霉的 TrBGL2。 里氏木霉 TrBGL2 由 SEQ ID NO:18 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AB003110。 [0143] MLPKDFQWGFATAAYQIEGAVDQDGRGP S IWDTFCAQPGKIADGS SGVTACDSYNRTAED IALLKSLGAKSYRFS I SWSRI IPEGGRGDAVNQAGIDHYVKFVDDLLDAGI TPF I TLFHW DLPEGLHQRYGGLLNRTEFPLDFENYARVMFRALPKVRNWI TFNEPLCSAIPGYGSGTFA PGRQSTSEPWTVGHNILVAHGRAVKAYRDDFKPASGDGQIGIVLNGDFTYPWDAADPADK EAAERRLEFFTAWFADP IYLGDYPASMRKQLGDRLPTFTPEERALVHGSNDFYGMNHYTS NYIRHRS SPASADDTVGNVDVLFTNKQGNC IGPETQSPWLRPCAAGFRDFLVWI SKRYGY PP IYVTENGTS IKGESDLPKEKILEDDFRVKYYNEYIRAMVTAVELDGVNVKGYFAWSLM DNFEWADGYVTRFGVTYVDYENGQKRFPKKSAKSLKPLFDELIAAA (SEQ ID NO: 18) [0144] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自里氏木霉的TrGL1。 里氏木霉 TrGL1 由 SEQ ID NO:19 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 U09580。 [0145] MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAWPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKV GIVSGVGWNGGPCVGNTSPASKI SYP SLCLQDGPLGVRYSTGSTAFTPGVQAASTWDVNL IRERGQF IGEEVKASGIHVILGPVAGPLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMGQT INGIQ SVGVQATAKHYILNEQELNRET I S SNPDDRTLHELYTWPFADAVQANVASVMCSYNKVNT TWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGP ALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYP SFNI SRNVQGNHKTNVRAIARD GIVLLKNDANILPLKKPAS IAWGSAAI IGNHARNSP SCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNY PYFVAPYDAINTRAS SQGTQVTLSNTDNTS SGASAARGKDVAIVF I TADSGEGYI TVEGN AGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVWHSVGAI ILEQILALPQVKAWWAGLP SQE SGNALVDVLWGDVSP SGKLVYT IAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLF IDYKHFDDANI TP RYEFGYGLSYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAWPGGP SDLFQNVATVTVD IANSGQVTG AEVAQLYI TYP S SAPRTPPKQLRGFAKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWWP SGSFGI SVGAS SRD IRLTSTLSVA (SEQ ID NO: 19) [0146] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自粗糙脉孢菌的BGL1。 粗糙脉孢菌BGL1由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列提供,其对应于UniProtKB登录号EAA26868.1。 [0147]MKFAIPLALLASGNLALAAPEP IHP SHQQLNKRSLAYSEPHYP SPWMDPKAIGWEEAYEK AKAFVSQLTLLEKVNLTTGIGWGAEQCVGQTGAIPRLGLKSMCMQDAPLAIRGTDYNSVF PAGVTTAATFDRGLMYKRGYALGQEAKGKGVTVLLGPVAGPLGRAPEGGRNWEGFSTDPV LTGIAMAET IKGTQDAGWACAKHF IGNEQEHFRQVGESQDYGYNI SETLS SNIDDKTMH EMYLWPFVDAIRAGVGSFMCAYTQANNSYSCQNSKLLNNLLKQENGFQGFVMSDWQAHHS GVASAAAGLDMSMPGDTMFNSGRSYWGTNLTLAVLNGTVPQWRIDDMAMRIMAAFFKVGQ TVEDQEP INFSFWTLDTYGPLHWAARKDYQQINWHVNVQGDHGSLIRE IAARGTVLLKNT GSLPLKKPKFLAVIGEDAGPNPLGPNGCADNRCNNGTLGIGWGSGTGNFPYLVTPDQALQ ARAVQDGSRYESVLRNHAPTE IKALVSQQDATAIVFVNANSGEGF IE IDGNKGDRLNLTL WNEGDALVKNVS SWCNNT IWLHTPGPVLLTEWYDNPNI TAILWAGMPGQESGNS I TDVL YGRVNP SGRTPFTWGATRESYGTDVLYEPNNGNEAPQLDYTEGVF IDYRHFDKANASVLY EFGFGLSYTTFEYSNLKIEKHQVGEYTPTTGQTEAAPTFGNFSESVEDYVFPAAEFPYVY QF IYPYLNSTDMSAS SGDAQYGQTAEEFLPPKANDGSAQPLLRS SGLHHPGGNPALYD IM YTVTAD I TNTGKVAGDEVPQLYVSLGGPEDPKWLRGFDRLRVEPGEKVQFKAVLTRRDV S S WDTVKQDWVI TE YAKKVYVGP S SRKLDLEEVLP (序列号:20) [0148] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自粗糙脉孢菌的BGL2。 粗糙脉孢菌BGL2由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列提供,其对应于UniProtKB登录号EAA30164.1。 [0149] MHLRIFAVLAATSLAWAETSEKQARQAGSGFAAWDAAYSQASTALSKLSQQDKVNIVTGV GWNKGPCVGNTPAIAS IGYPQLCLQDGPLGIRFGGSVTAFTPGIQAASTWDVELIRQRGV YLGAEARGVGVHVLLGPVAGALGKIPNGGRNWEGFGPDPYLTGIAMSET IEGIQSNGVQA CAKHF ILNEQETNRDT I S SWDDRTMHELYLFPFADAVHSNVASVMCSYNKVNGTWACEN DKIQNGLLKKELGFKGYVMSDWNAQHTTNGAANSGMDMTMPGSDFNGKT ILWGPQLNTAV NNGQVSKARLDDMAKRILASWYLLEQNSGYPATNLKANVQGNHKENVRAVARDGIVLLKN DDNILPLKKP SKLAI IGS S SWNPAGRNACTDRGCNTGALGMGWGSGTADYPYFVAPYDA LKTRAQSDGTTVNLLS SDSTSGVANAASGADAALVF I TADSGEGYI TVEGVTGDRPNLDP WHNGNQLVQAVAQANKNT I VWH STGP I ILET I LAQP GVKAWWAGLP S QENGNALVD VL YGLVSP SGKLPYT IAKSESDYGTAVQRGGTDLFTEGLF IDYRHFDKNGIAPRYEFGFGLS YTNFTYS SLS I TSTAS SGPASGDT IPGGRADLWETVATVTAWKNTGGVQGAEAPQLYI T LP S SAP S SPPKQLRGFAKLKLAPGESKTATF ILRRRDLSYWDTGSQNWWP SGSFGVWG AS SRDLRLNGKFDVY (SEQ ID NO: 21) [0150] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自米曲霉的bglH。 米曲霉 bglH 由 SEQ ID NO:22 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 BAE64214.1。 MLSPQALFGALVLLSAP SAWADTCKAP INHPGEPFSFVQPLNTT ILTPYGHSPPAYP SP NTTGNGGWETALVKAKQWVNKLTLEEKTWMATGQPGPCVGNVLP IPRLNFSGICLQNGPQ CVQQGDYS SVFVS SVSAAASWDRKLLYERAYALAEEHKAKGSHVILGP IGGPLGRSPYDG RTWEGFAADPYLTGVCMEET INGMQDAGVQANAKHF IANEQETQRNPTYAPDANATTYIQ DSVSANIDDRTLHE IYMWPFANAVRARVASAMCSYNRLNGSHSCQNSYLLNHLLKGELGF QGYVMSDWGATHSGVAS IESGMDMTMPGGFTLYGELWTEGSFFGKNLTEAVQNGTVPMSR LDDMIVRIMTPYFWLGQEKNYP SVDASVGPLNVDSAPDTWLYDWKFTGATNRDVRANHSA MIREHGGQSTVLLKNERNALPLRKPRNIWAGNDAGPLTQGPDLQADFEYGVLAGS SGSG SCRFSYLSTPLDAINARARKDGSLVQSYLNNTLLTTSALTSPLWIPQQPDVCLVFLKSFS AEGEDRTSLELDWNGNAWEAVATHCNNT IVI TNSGGANVMPFADHPNVTAILAQHYAGE ETGNAIADVLYGDVNP SAKLPYVIAYNESDYNAPLTTAVQTNGTYDWQSWFDEELEVGYR YFDAHNI SVRYEFGFGLSYTTFDLKDLKAKGSAAANLTALPAKRPTEPGGNPALWETVYT LEAEVSNTGDVDGYAVPQLYLQFPTSTPAGTPP SQLRGFDKIWLEAGEKKTVTFDLMRRD VSYWDWAQDWRIPAGAFTFKAGFS SRDFRANSVATLVKA (SEQ ID NO: 22) [0151] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Oenococcus oeni 的 OoBgl。 黄酒球菌 OoBgl 由 SEQ ID NO:23 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 EAV39986.1。 [0152] MSKI TS I I SGLSLKEKADLVSGKDFWFTAQVSGLDRMMVSDGP SGLRKQADASDALGLNK SWAVNFP S S SLTAASFDRALLQELGRNLGQAAKAERVGILLGPGINLKRSPLAGRNFEY FSEDPYLTGELAS SYVQGVQESGVGVSLKHFAANNREDQRFTAS SNIDQRSLHELYLSAF EKWKMARPAT IMCSYNAINGTLNSQNQRLLTQILREEWGFKGLVMSDWGAVSDHVAALK AGLDLEMPGKGNESTSE I IEAVNKGQLDEKVLERAASRVIQMVEKWQPENKTVI SYDLEK QHRFARQLAGES IVLLKNEQQLLPLKSNQSLAVIGQLAEKPRYQGSGSAHVNAFNTTTPL KWQD ILPKTAYQAGYQIDSDQIDQQAEQAAVDLAKQADQVWFAGFP S SYESEGFDKKT I SLPDNQNHLIERLAAVNKKI IWLENGSALEMPWVGQVEAIVETYLAGEAVGEATWD IL FGRVNP SGKLAESFP IKLADNPTYLTFNADRKNENYHEGLFVGYRYYDKKKQEVLFPFGH GLSYTTFEYRKLELLKSDHEVTVSFE IKNTGSVAGKETAQIYLSNQTSE IEKPLKELKGF AKVSLNPGQTKQVE IVLDKRSFSWYNPETDKWQVDNGSYQIQLAAS SRD IRLTKNLLIDW [0153] SENKRQALSPDSYLSD ILKEQAFKAPLKESGLDKLLEQLAGDENNQAILTNMPLRALMMM [0154] GVSNHQIQQF IKLANQS(序列号:23) [0155]具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Oenococcus oeni 的 OoBgl。 黄酒球菌 OoBgl 由 SEQ ID NO:24 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 WP_011677766.1。 [0156] MSKI TS I I SGLSLKEKADLVSGKDFWFTAQVSGLDRMMVSDGP SGLRKQADASNALGLNK SWAVNFP S S SLTAASFDRALLQELGRNLGQAAKAERVRILLGPGINLKRSPLAGRNFEY FSEDPYLTGELAS SYVQGVQESGVGVSLKRFAANNREDQRFTAS SNIDQRSLHELYLSAF EKAVKMARPAT IMCSYNAINGTLNSQNQRLLTQILREEWGFKGLVMSDWGAVSDHVAALK AGLDLEMPGKGNESTSE I IEAVNKGQLDEKVLERAASRVIQMVEKWQPENKTVI SYDLEK QHRFARQLVGES IVLLKNEQQLLPLKSNQSLAVIGQLAEKPRYQGSGSAHVNAFNTTTPL KWQD ILPKTAYQAGYQIDSDQIDQQAEQAAVDLAKQADQVWFSGFP S SYESEGFDKKT I SLPDNQNHLIERLAAVNKKI IWLENGSALEMPWVGQVEAIVETYLAGEAVGEATWD IL FGRVNP SGKLAESFP IKLADNPTYLTFNADRKNENYHEGLFVGYRYYDKKKQEVLFPFGH GLSYTTFEYRKLELLKSDHEVTVSFE IKNTGSVAGKETAQIYLSNQTSE IEKPLKELKGF AKVSLNPGQTKQVE IVLDKRSFSWYNPETDKWQVDNGSYQIQLAAS SRD IRLTKNLLIDW SENKVQALSPDSYLSD ILKEQAFKAPLKESGLDKLLEQLAGDENNQAILTNMPLRALMMM GVSNHQ I QQF I KLANQ S (SEQ ID NO: 24) [0157] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Primus dulcis 的 Ph691。 Prunus dulcis Ph69 由 SEQ ID NO: 25 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 H9ZGE0。 MALQFRSLLLCMVLLLLGFALANTNAARTDPP IVCATLNRTHFDTLFPGFTFGAATAAYQ LEGAANIDGRGP SVWDNFTHEHPEKI TDGSNGDVAIDQYHRYKEDVAIMKDMGLDAYRFS I SWSRLLPNGKLSGGINKKGIEYYNNLTNELLRNGIEPLVTLFHWDVPQALVDEYGGLLS PRIVDDFKAYADLCYKEFGDRVKHWTTLNEPYT I SNHGYT IGIHAPGRCSDWYNPKCLGG DSGIEPYLVTHYLLLAHAAAVKLYREKYQAYQNGVIGI TWSHWFEPASESQQDKDAAFQ ALDFMYGWFMDPLTRGDYPQIMRS ILGARLPNFTEEQSKSLSGSYDYIGVNYYSARYASA YPKDYSVTTPP SYLTDVHVNVTTDLNGVP IGPRAASDWLYVYPKGLYDLVLYTKEKYNDP IMYI TENGMDEFNNPKLSLEQALNDANRIDYYYRHLCYLQAAMKEGANVQGYFAWSLLDN FEWSEGYTVRFGINYIDYDNGLERHSKLSTHWFKSFLKRS S I SKKKIRRCGNNNGRATKF VYQI (SEQ ID NO: 25) [0158] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自 Prunus dulcis 的 Ph692。 Prunus dulcis Ph692 由 SEQ ID NO: 26 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 H9ZGE2。 MAMQLRSLLLCVLLLLLGFALADTNAAARIHPPWCANLSRANFDTLVPGFVFGAATASY QVEGAANLDGRGP S IWDTFTHKHPEKIADGSNGDVAIDQYHRYKEDVAIMKDMGLESYRF S I SWSRVLPNGTLSGGINKKGIEYYNNLINELLHNGIEPLVTLFHWDVPQTLEDEYGGFL SNRIVNDFEEYAELCFKKFGDRVKHWTTLNEPYTFS SHGYAKGTHAPGRCSAWYNQTCFG GDSATEPYLVTHNLLLAHAAAVKLYKTKYQAYQKGVIGI TWTPWFEPASEAKED IDAVF RALDF IYGWFMDPLTRGDYPQSMRSLVGERLPNFTKKESKSLSGSFDYIGINYYSARYAS ASKNYSGHP SYLNDVNVDVKTELNGVP IGPQAAS SWLYFYPKGLYDLLRYTKEKYNDP I I YI TENGVDEFNQPNPKLSLCQLLDDSNRIYYYYHHLCYLQAAIKEGVKVKGYFAWSLLDN FEWDNGYTVRFGINYVDYDNGLKRHSKHSTHWFKSFLKKS SRNTKKIRRCGNNNTSATKF VF (SEQ ID NO: 26) 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是来自环状芽孢杆菌的 BsBglA。 环状芽孢杆菌 BsBglA 由 SEQ ID NO:27 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 Q03506。 [0159] MS IHMFP SDFKWGVATAAYQIEGAYNEDGRGMS IWDTFAHTPGKVKNGDNGNVACDSYHR VEEDVQLLKDLGVKVYRFS I SWPRVLPQGTGEVNRAGLDYYHRLVDELLANGIEPFCTLY HWDLPQALQDQGGWGSRI T IDAFAEYAELMFKELGGKIKQWI TFNEPWCMAFLSNYLGVH APGNKDLQLAIDVSHHLLVAHGRAVTLFRELGI SGE IGIAPNTSWAVPYRRTKEDMEACL RVNGWSGDWYLDP IYFGEYPKFMLDWYENLGYKPP IVDGDMELIHQP IDF IGINYYTS SM NRYNPGEAGGMLS SEAI SMGAPKTD IGWE IYAEGLYDLLRYTADKYGNPTLYI TENGACY NDGLSLDGRIHDQRRIDYLAMHLIQASRAIEDGINLKGYMEWSLMDNFEWAEGYGMRFGL VHVDYDTLVRTPKDSFYWYKGVI SRGWLDL (SEQ ID NO: 27) [0160] 具有糖苷酶(β-葡糖苷酶)活性的示例性酶是 SmBgl,来自 [0161] 中华根瘤菌。 中华根瘤菌 SmBgl 由 SEQ ID NO: 28 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号。 [0162] F7X9K8。 [0163] MM I E AKKL AARF P GD F VF GVAT AS F Q I E GAS KAD GRKAS I WD AF S NMP GRVYGRHNGD VA CDHYNRLEQDLDLIKSLGVEAYRFS IAWPRIVPEGTGP INEKGLDFYDRLVDGLKARGIK AFATLYHWDLPLALMGDGGWTARTTAYAYQRYAKTVIARLGDRLDAVATFNEPWCSVWLG HLYGVHAPGERNMDAALAALHFTNLAHGLGVAAIRSERPELPVGIVINAHSVYPGSNSAE DKAAAERAFDFHNGVFFDP IFKGEYPEDFLSALGERMPAIEDGDMAT IAQPLDWWGLNYY TPMRVSADPAKGAEYPATVNAKPVSNVKTD IGWEVYAPALGSLVETLNARYRLPDCYI TE NGACYNMGVENGTVDDQPRLDYI SDHLAVTADLIAKGYPMRGYFAWSLMDNFEWAEGYRM RF G I VH VD YE T Q VRT IKKSGRWYKD LAE RF P S GNHKP G (SEQ ID 否:28) [0164]在一些实施方案中,异源基因编码具有糖苷酶活性的酶,使得表达该酶的细胞与不表达异源基因的细胞相比能够增加挥发性酚的产生。 在一些实施方案中,异源基因编码具有糖苷酶活性的酶,使得与表达具有野生型糖苷酶活性的酶的细胞相比,表达该酶的细胞能够产生增加水平的挥发性酚。 [0165] 在一些实施方案中,与未与酶接触的发酵产品相比,具有糖苷酶活性的酶(例如,重组和/或纯化的酶)能够增加发酵产品中挥发性酚的产生。 [0166] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% , 或与 SEQ ID NO: 1 所列序列具有 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2 %、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 2 所示序列的序列同一性。在一些 在实施例中,具有糖苷酶活性的酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%的氨基酸序列 , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 或 与 SEQ ID NO: 3 所示序列具有 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 与 SEQ ID NO: 4 所示序列具有 99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有氨基酸序列 至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% , 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 或 99.9% 序列同一性 编号:5。 [0167] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% , 或与 SEQ ID NO: 6 中所示序列具有 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2 %、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 7 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有氨基 具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 与所列序列有 95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 在 SEQ ID NO:8 中。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%的氨基酸序列 , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6 %、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 9 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有至少 80%、81%、82% 的氨基酸序列 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 与 SEQ ID NO: 10 中所列序列有 99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 的序列同一性。 [0168] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9 与 SEQ ID NO: 11 所列序列的%序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%的氨基酸序列 , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3 %、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 12 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有以下氨基酸序列: 至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 与 SEQ ID 中所示序列的 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 NO: 13. 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7 %、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 14 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有至少 80%、81%、82%、83% 的氨基酸序列 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 与 SEQ ID NO: 15 中所列序列有 99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性。 [0169] 在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% , 或与 SEQ ID NO: 16 所示序列具有 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2 %、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 17 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有氨基 具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 与所列序列有 95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 在 SEQ ID NO: 18 中。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%的氨基酸序列 , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6 %、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 19 中所列序列的序列同一性。在一些 在实施例中,具有糖苷酶活性的酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%的氨基酸序列 , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 或 与 SEQ ID NO: 20 中所示序列的 99.9% 序列同一性。 [0170]在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% , 或与 SEQ ID NO: 21 所示序列具有 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2 %、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 22 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有氨基 具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 与所列序列有 95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 在 SEQ ID NO:23 中。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%的氨基酸序列 , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6 %、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 24 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有与 SEQ ID NO: 24 中所示序列具有至少 80%、81%、82% 的氨基酸序列 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 与 SEQ ID NO: 25 中所列序列具有 99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性。在一些实施方案中, 具有糖苷酶活性的酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%的氨基酸序列 , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, or 99.9%序列 与 SEQ ID NO: 26 所示序列的同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%的氨基酸序列 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 与 SEQ ID NO: 27 所示序列具有 99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶具有至少具有 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 与 SEQ ID 中所示序列的 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 否:28。 [0171] 术语“同一性百分比”、“序列同一性”、“%同一性”、“%序列同一性”和%同一性,因为它们在本文中可互换使用,是指两个序列之间相似性的定量测量(例如, 核酸或氨基酸)。 同一性百分比可以使用 Karlin 和 Altschul, Proc 的算法来确定。 国家队。 学院。 科学。 USA 87:2264-68, 1990,修改为 Karlin 和 Altschul,Proc。 国家队。 学院。 科学。 USA 90:5873-77, 1993。此类算法已纳入 Altschul 等人的 NBLAST 和 XBLAST 程序(2.0 版),J. Mol。 生物学。 215:403-10, 1990. 可以使用 XBLAST 程序进行 BLAST 蛋白质搜索,得分 = 50,字长 = 3,以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。 在两个序列之间存在间隙的情况下,可以使用 Gapped BLAST,如 Altschul 等人,Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997。当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时,可以使用相应程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的默认参数。 [0172] 当陈述同一性百分比或其范围(例如,至少、多于等)时,除非另有说明,端点应包括在内并且范围(例如,至少 70% 同一性)应包括所有范围 引用范围(例如,至少 71%、至少 72%、至少 73%、至少 74%、至少 75%、至少 76%、至少 77%、至少 78%、至少 79% , 至少 80%, 至少 81%, 至少 82%, 至少 83%, 至少 84%, 至少 85%, 至少 86%, 至少 87%, 至少 88%, 至少 89% , 至少 90%, 至少 91%, 至少 92%, 至少 93%, 至少 94%, 至少 95%, 至少 95.5%, 至少 96%, 至少 96.5%, 至少 97% , 至少 [0173]97.5%、至少 98%、至少 98.5%、至少 99%、至少 99.5%、至少 99.6%、至少 99.7%、至少 99.8%、或至少 99.9%同一性)及其所有增量( 例如,百分之一(即 0.1%)、百分之一(即 0.01%)等)。 [0174] 在一些实施例中,具有糖苷酶活性的酶包含如SEQ ID NOs:1-28中任一项所列的氨基酸序列。 在一些实施例中,具有糖苷酶活性的酶由如SEQ ID NOs:1-28中任一项所列的氨基酸序列组成。 [0175] 在一些实施方案中,编码具有糖苷酶活性的酶的基因包含编码酶的核酸序列,该酶包含具有至少80%(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少 至少 83%、至少 84%、至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 至少 93%,至少 94%,至少 95%,至少 95.5%,至少 96%, 至少 96.5%、至少 97%、至少 97.5%、至少 98%、至少 98.5%、至少 99%、至少 99.5%、至少 99.6%、至少 99.7%、至少 99.8%、 或至少 99.9%)与 SEQ ID NOs:1-28 中任一项所列序列的序列同一性。 在一些实施方案中,编码具有糖苷酶活性的酶的基因包含编码由如SEQ ID NOs:1-28中任一个所示的氨基酸序列组成的酶的核酸序列。 [0176] 可以进行具有糖苷酶活性或预测具有糖苷酶活性的其他酶的鉴定,例如基于与糖苷酶的一个或多个结构域的相似性或同源性,例如由SEQ ID NO:1-28中的任一个提供的糖苷酶。 在一些实施方案中,可基于与活性结构域例如催化结构域例如与糖苷酶活性相关的催化结构域的相似性或同源性来鉴定用于本文所述的修饰细胞和方法的酶。 在一些实施例中,用于本文所述经修饰的细胞和方法的酶可与参考糖苷酶具有相对高水平的序列同一性,例如野生型糖苷酶,例如 SEQ ID NO: 1-28 中的任一个 ,在催化结构域的区域中,但基于对酶的较大部分或酶的全长的分析,与参考糖苷酶的序列同一性水平相对较低。 在一些实施例中,用于本文所述经修饰的细胞和方法的酶具有至少 80%、至少 81%、至少 82%、至少 83%、至少 84%、至少 85%、至少 86 %,至少 87%,至少 88%,至少 89%,至少 90%,至少 91%,至少 92%,至少 93%,至少 94%,至少 95%,至少 95.5 %,至少 96%,至少 96.5%,至少 97%,至少 97.5%,至少 98%,至少 98.5%,至少 99%,至少 99.5%,至少 99.6%,至少 99.7 相对于参考糖苷酶(例如,SEQ ID NOs:1-28),酶的催化结构域区域中的序列同一性至少为 99.8%,或至少为 99.9%。 [0177] 在一些实施方案中,用于本文所述的经修饰的细胞和方法的酶在酶的催化结构域区域中相对于参考糖苷酶(例如,SEQ ID NO:1-28)具有相对高水平的序列同一性。 基于对酶的较大部分或酶的全长的分析,与参考糖苷酶的序列同一性水平相对较低。 在一些实施方案中,用于本文所述的修饰细胞和方法的酶具有至少 10%、至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、 至少 45%,至少 50%,至少 55%,至少 60%,至少 65%,至少 88%,至少 89%,至少 90%,至少 91%,至少 92%, 至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 95.5%、至少 96%、至少 96.5%、至少 97%、至少 97.5%、至少 98%、至少 98.5%、 至少 99%,至少 99.5%, 至少 99.6%、至少 99.7%、至少 99.8% 或至少 99.9% 的序列同一性,基于酶的一部分或酶的全长,相对于参考糖苷酶(例如,SEQ ID NOs:1 -28). [0178]在一些实施方案中,具有糖苷酶活性的酶是重组和/或纯化的酶。 生产重组酶、分离酶和纯化酶(例如,从天然来源或从工程改造以重组表达酶的细胞)的方法对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。 [0179] 在一些实施例中,编码具有糖苷酶活性的酶的基因还包含分泌信号。 本文所用的术语“分泌信号”是指存在于新合成蛋白质末端(N-末端或 C-末端)的短肽序列(通常少于 70 个氨基酸),可促进新合成蛋白质的输出 细胞外合成蛋白质。 在一些实施例中,分泌信号促进糖苷酶输出细胞。 在一些实施方案中,分泌信号是 SED1、MATa、MAT 前序列 (MATaPRE)、TFP5-1、TFP1-4、TFP10、TFP23、SUC2、SRL1 或 KSH1。 在一些实施方案中,分泌信号在一个或多个氨基酸残基位置发生突变。 在一些实施方案中,分泌信号包括在一个或多个氨基酸残基位置处的置换突变。 在一些实施方案中,分泌信号相对于野生型分泌信号序列发生突变。 在一些实施方案中,MATa分泌信号包含相对于野生型分泌信号序列在氨基酸残基位置A9、A20和/或L42处的置换突变。 在一些实施例中,MATa分泌信号包含相对于野生型分泌信号序列的A9D取代突变。 在一些实施例中,MATa分泌信号包含相对于野生型分泌信号序列的A20T取代突变。 在一些实施例中,MATa分泌信号包含相对于野生型分泌信号序列的L42S取代突变。 在一些实施例中,相对于野生型分泌信号序列,MATa分泌信号包含A9D取代突变和A20T取代突变。 在一些实施例中,相对于野生型分泌信号序列,MATa分泌信号包含A9D取代突变、A20T和L42S取代突变。 在一些实施方案中,MATaPRE分泌信号包含相对于野生型分泌信号序列在氨基酸残基位置A9和/或A20处的取代突变。 在一些实施例中,MATaPRE分泌信号包含相对于野生型分泌信号序列的A9D取代突变。 在一些实施方案中,相对于野生型分泌信号序列,MATaPRE 分泌信号包含 A20T 取代突变。 在一些 在实施方案中,相对于野生型分泌信号序列,MATaPRE分泌信号包含A9D置换突变和A20T置换突变。 [0180] 示例性分泌信号是 SED1,其由如 SEQ ID NO: 29 所示的氨基酸序列提供。 [0181] MKLSTVLLSAGLASTTLAQS(序列号:29) [0182] 示例性分泌信号是 MATa,其由如 SEQ ID NO: 30 所示的氨基酸序列提供。 [0183] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFNSTNNGLLFINTTIASIAA KEEGVSLDKREEAAS (SEQ ID NO:30) [0184] 示例性分泌信号是 MATa 前序列,其由如 SEQ ID NO: 31 所示的氨基酸序列提供。 [0185] MRFP S I F T AVLF AAS SALAS (SEQ ID NO:31) [0186] 示例性分泌信号是 TFP5-1,其由如 SEQ ID NO: 32 所示的氨基酸序列提供。 [0187] MLQSWFFALLTFASSVSAIYSNNTVSTTTTLAPSYSLVPQETTISYADDTTTFFVTSTLDKRS (SEQ ID NO: 32) [0188] 示例性分泌信号是 TFP1-4,其由如 SEQ ID NO: 33 所示的氨基酸序列提供。 [0189] MFNRFNKFQAAVALALLSRGALGDSYTNSTSSADLSSITVSSASSASATASSDSLSSSSDGTVYLPSTTISGDLTVT GKVIATEAVEVAAGGKLTLLDGEKYVFSSDLDKRS(序列号:33) [0190] 示例性分泌信号是 TFP10,其由如 SEQ ID NO: 34 所示的氨基酸序列提供。 [0191]MQYKKTLVASALAATTLAAYAPSEPWSTLTPTATYSGGVTDYASTFGIAVQPISTTSSASSAATTASSKAKRAAS QIGDGQVQAATTTASVSTKSTAAAVSQIGDGQIQATTKTTAAAVSQIGDGQIQATTKTTSAKTTAAAVSQISDGQ IQATTTTLAPKLDKRS (序列号:34) [0192] 示例性分泌信号是 TFP23,其由如 SEQ ID NO: 35 所示的氨基酸序列提供。 [0193] MFNRFNKLQAALALVLYSQSALGQYYTNSSSIASNSSTAVSSTSSGSVSISSSIELTSSTSDVSSSLLTELTSSST [0194] EVSSSIAPSTSSSEVSSSITSSGSSVSGSSSITSSLDKRS(序列号:35) 示例性分泌信号是 SUC2,其由如 SEQ ID NO: 36 所示的氨基酸序列提供。 [0195] MLLQAFLFLLAGFAAKI SA(序列号:36) [0196] 示例性分泌信号是 SRL1,其由如 SEQ ID NO: 50 所示的氨基酸序列提供。 [0197] MLQSWFFALLTFAS SVSA(序列号:50) [0198] 示例性分泌信号是 KSH1,其由如 SEQ ID NO: 51 所示的氨基酸序列提供。 [0199] MSALFNFRSLLQVILLLICSCSYVHG(序列号:51) [0200] 示例性分泌信号是 MATa (A9D;A20T),其由如 SEQ ID NO: 52 所示的氨基酸序列提供。 [0201] MRFP S IFTDVLFAAS SALATPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFNSTNNGLLF INTT IAS IAA KEEGVSLDKREEAAS (SEQ ID NO:52) [0202] 示例性分泌信号是 MATa (A9D;A20T;L42S),其由如 SEQ ID NO: 53 所示的氨基酸序列提供。 [0203] MRFP S IFTDVLFAAS SALATPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFNSTNNGLLF INTT IAS IAA KEEGVSLDKREEAAS (SEQ ID NO:53) [0204] 示例性分泌信号是 MATa 前序列(A9D;A20T),其由如 SEQ ID NO: 54 所示的氨基酸序列提供。 [0205] MRFP S I FTDVLFAAS SALAT (SEQ ID NO:54) [0206] O-甲基转移酶 (OMT) [0207] 本发明的方面涉及包含编码具有O-甲基转移酶(OMT)活性的酶的基因的修饰细胞。 在一些实施方案中,该基因是异源基因。 在一些实施方案中,修饰的酵母细胞表达编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因和编码具有O-甲基转移酶(OMT)活性的酶的异源基因。 [0208] 本公开的方面还涉及使培养基或发酵产品与具有O-甲基转移酶(OMT)活性的酶接触。 在一些实施方案中,酶是重组酶,例如,其由生物体产生、分离的和/或 纯化并添加到培养基或发酵产物中。 在一些实施方案中,酶提取自来源,例如微生物、酵母、哺乳动物或植物来源。 [0209] 因此,本文描述的任何OMT酶可以在遗传修饰的细胞中表达为异源酶或以重组酶的形式提供。 [0210] O-甲基转移酶是催化受体分子甲基化或将甲基转移到受体分子氧上的酶。 在一些实施方案中,O-甲基转移酶催化一种或多种挥发性酚转化为甲醚,从而减少或消除发酵产品中的烟味。 在糖苷酶水解非挥发性酚糖苷以产生挥发性酚之后,挥发性酚可被O-甲基转移酶甲基化以产生甲基化的挥发性酚(也称为甲基醚),其不会产生烟熏味 烟味的异味特征。 [0211]几种具有相对较低的感官检测阈值的挥发性酚是愈创木酚和间甲酚。 愈创木酚的甲基化会产生藜芦醇(1,2-二甲氧基苯),它在各种植物中充当传粉媒介的吸引剂,并具有甜美的奶油香草气味。 间甲酚甲基化生成3-甲基苯甲醚,具有花香。 在这两种情况下,甲基化都会极大地改善烟味发酵饮料的香气。 已经表征了几种能够催化这些反应的酶。 例如,古普塔等人。 从催化藜芦醇形成的白莼菜中鉴定并表征了 OMT(Gupta 等人,BMC Plant Biol. (2012) 12:1-13)。 此外,Hitschler 等人。 在实验室酵母菌株的高拷贝质粒上表达了来自玫瑰植物的 OMT。 当饲喂间甲酚时,该菌株产生 3-甲基苯甲醚,72 小时后,不再检测到间甲酚。 (Hitschler 等人,FEMS Yeast Res. (2020) 20)。 在这种情况下,甲基化旨在作为一种工具来克服间甲酚的毒性,以改善用于制药和化学工业的间甲酚的微生物生产。 [0212] 在一些实施例中,本文所述的任何经修饰细胞经遗传修饰以表达编码具有O-甲基转移酶活性的酶的异源基因。 在一些实施方案中,修饰的酵母细胞表达编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因和编码具有O-甲基转移酶(OMT)活性的酶的异源基因。 在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶是重组酶(例如,分离的、纯化的酶)。 [0213] 在一些实施方案中,编码具有 O-甲基转移酶活性的酶的异源基因是野生型 O-甲基转移酶基因(例如,从 一个有机体)。 在一些实施方案中,O-甲基转移酶获自细菌、真菌或植物。 在一些实施方案中,O-甲基转移酶获自真菌。 [0214] 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶来源于大叶茭白、番茄、刺蔷薇、罗勒、枇杷、火炬松、草莓、粟酒裂殖酵母或秀丽百日草。 [0215] 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶是源自大叶茭白的SIGOMT4、源自番茄的SIOMT1、源自番茄的SIOMT4、源自番茄的SICTOMT1、源自蔷薇的RhOOMT1、源自蔷薇的RhOOMT2、源自番茄的EOMT1 来自罗勒(Ocimum basilicum)的 EjOMTl、来自枇杷的 EjOMT、来自火炬松的 AEOMT、来自草莓的 FaOMT、来自粟酒裂殖酵母的 SpCOMT、来自罗勒的 COMT1 或来自百日草的 ZeCAOMT。 [0216] 具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自 Silene latifolia (white campion) 的 SIGOMT1。 The Silene latifolia SIGOMT1 is provided by the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO: 37. MENPKELLNAQAHIWNHIFAYHS SAALKCAIELGIPDT IEKHGNPMTLQDLANSLAI TPTKTLSLYRLLRLLVHS NFFSMTKLVDGEEAYANNINSQLLLKDHPCTLAPFTLGMLDPAMTEPPHYLSKWFQNQDESVFHVIHGRSFWEHA GLTPGFNQLFNRAMGSDASFVS IALVANKDFAKMVEGIGSLVDVAGGDGTVAKI IARAYPWLKCTVFDLPQWDG LQGNGSNLEYVAGDMFKE IP SADWMLKWILHDWSDEHCVRILERCKEAIP SNGKI 11 IDMWDPQAQNNNHFHA QLLSDMEMMALNVGGIERTEDQWKKLFLQAGFNHYNIFP ILGIRSVIEVRCL (SEQ ID NO: 37) [0217] 具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自 Solanum lycopersicum(番茄)的 SIOMT1。 番茄 SIOMT1 由 SEQ ID NO:38 所示的氨基酸序列提供,其对应于 GenBank 登录号 MW380256。 [0218] MS S SESTS SELLHAQAQIWNYIFNF I S S SAVRCAFQLGIPDVLYKHDKPMCLSD I SAELSWNS SKVSFLP ILMQ FLVQSGFLNQHEDHYSLTPASCLLAKDDPFNVRSLLLLNHGQAFSKAWPELSDWFQNDSPTPFHTAHGKSLWDF I GEEQP SVLGD IFNDALASDSRLNTNVLIAECKHVFEGLTSLVDVGGGTGTVS IAIAKAFPNIKCTVLDLPQWGD LKGSGNLDFVGGDMFDMIPHTNAILLKCVLHDWNDEDCVKVLKKCKES IP SREKGGKVI I IDTVLEDPKQSNEFV RAQHNMGMLMMVLFAAKERTEKEWEKLFSEAGFTEYKIFPALGLRSLIE IYP (SEQ ID NO: 38) [0219]具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自 Solanum lycopersicum(番茄)的 SIOMT4。 番茄 SIOMT4 由 SEQ ID NO: 39 所示的氨基酸序列提供,其对应于 GenBank 登录号 MW380257。 METNNNVERANELFKAQAHI YKHAFAYANSMALNCAIQLGIPD I IHNHKKP I TLPDLLSGLKLP S SKSNAIHRLM RLLVHAQFFD I IKLEENSETEGYVLTTS SRLLLKSE IPNLLPCVRLMVDPVLVTPWQLLGEWFHKNEEATPFETA HGMPMWDFCAQNP IFDTAFNEAMASDSQMMKLWKDCREVFEGLNSLVDVGGGTGVIAKT ILEAIPHLKCTVLDL PHWANMPQTENLIYVGGNMFQC IPHADAILLKHVMHDWSDEDCVKILKRCREAIEDKDEGRKGKVLI IDMVLGR DEEEANMTEVKLIFDVLMMWTTGRQRTEKEWEKLFTEAGFMSYKI TPLLGLRSLIQVFP (SEQ ID NO: 39) [0220] 具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是 SICTOMT1,来自 [0221] Solarium lycopersicum(番茄)。 Solarium lycopersicum SICTOMT1 由 SEQ ID NO: 40 所示的氨基酸序列提供,对应于 Sol Genomics [0222] 网络登录号 SGN-U582403。 [0223] MGSTANIQLATQSEDEERNCTYAMQLLS S SVLPFVLHST IQLDVFD ILAKDKAATKLSALE IVSHMPNCKNPDAA TMLDRMLYVLASYSLLDCSWEEGNGVTERRYGLSRVGKFFVRDEDGASMGPLLALLQDKVF INSWFELKDAVLE GGVPFDRVHGVHAFEYPKLDPKFNDVFNQAMINHTTWMKRILENYKGFENLKTLVDVGGGLGVNLKMI TSKYPT IKGTNFDLPHWQHAP SYPGVDHVGGDMFESVPQGDAIFMKWILHDWSDGHCLKLLKNCHKALPDNGKVIWEAN LPVKPDTDTTWGVSQCDLIMMAQNPGGKERSEQEFRALASEAGFKGVNLICCVCNFWVMEFYK (SEQ ID NO: 40) [0224] 具有O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自Rosa hybrida(蔷薇)的RhOOMT1。 杂交蔷薇 RhOOMT1 由 SEQ ID NO:41 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AF502433.1。 [0225] MERLNSFRHLNQKWSNGEHSNELLHAQAHIWNHIFSF INSMSLKSAIQLGIPD I INKHGY PMTLSELTSALP IHPTKSHSVYRLMRILVHSGFFAKKKLSKTDEEGYTLTDASQLLLKDH PLSLTPYLTAMLDPVLTNPWNYLSTWFQNDDPTPFDTAHGMTFWDYGNHQP S IAHLFNDA MASDARLVTSVI INDCKGVFEGLESLVDVGGGTGTLAKAIADAFPHIECTVLDLPHWAD LQGSKNLKYTGGDMFEAVPPADTVLLKWILHDWSDEEC IKILERSRVAI TGKEKKGKVI I IDMMMENQKGDEES IETQLFFDMLMMALVGGKERNEKEWAKLFTDAGFSDYKI TP I SGLR SLIEVYP (SEQ ID NO: 41) [0226] 具有O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自Rosa hybrida(蔷薇)的RhOOMT2。 杂交蔷薇 RhOOMT2 由 SEQ ID NO:42 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AF502434。 [0227] MERLNSFKHLNQKWSNGEHSNELLHAQAHIWNHIFSF INSMSLKSAIQLGIPD I INKHGP MTLSELTSALP IHPTKSHSVYRLMRILVHSGFFAKKKLSKTDEEGYTLTDASQLLLKDHP LSLTPFLTAMLDPVLTTPWNYLSTWFQNEDPTPFDTAHGMTFWDYGNHQP S IAHLFNDAM ASDARLVTSVI IDDCKGVFEGLESLVDVGGGTGTVAKAIADAFPHIECTVLDLPHWADL QGSKNLKYTGGDMFEAVPPADTVLLKWILHDWNDEEC IKILKRSRVAI TSKDKKGKVI I I DMMMENQKGDEES IETQLFFDMLMMALVRGQERNEKEWAKLFTDAGFSDYKI TP ILGLRS LIEVYP (SEQ ID NO: 42) [0228] 具有O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自罗勒(罗勒)的EOMT1。 罗勒EOMT1由SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列提供,其对应于UniProtKB登录号AF435008。 [0229] MALQKVD I SLSTEQLLQAQVHVWNHMYAFANSMSLKCAIQLGIPD ILHKHGRPMTLSQLL QS IP INKEKTQCFQRLMRALVNSNFF IEENNSNNQEVCYWLTPASCLLLKEAPLTVTPLV QWLDPTFTNPWHHMSEWFTHEKHATQFEAANGCTFWEKLANEP SKGRFFDEAMSCDSRL IAHVFTKDYKHVIEGIRTLVDVGGGNGTMAKAIVEAMPT IKCTVIDLPHWAGLESTDNL NY I GGDMFQS I P S ADAI LLKS 11 HDWDDVEGLKI LKKCKDAWMGGKVI 11 DVWGVNHD IDEVLEDQLHFDMAMMCYFNAKERTMSEWEKLI YDAGFKSYKLTPAFGVRSLIEAYP(序列号:43) [0230] 具有O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自枇杷(枇杷)的EjOMT1。 粳稻 EjOMTlis 由 SEQ ID NO: 44 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 LC 127201。 [0231] MGLSNGDEVGATSHELLGAQAQIWNHMFQF INSMALKCAVQLGIPDVIHNHGQP I SLSEL IAALNVHP SKAHFVSRLMRILVHSDFFAQHHHVHHDCDDVEEEEAWLYSLTPTSRLLLK DGP SNTTPLVLMILDPVLTTPFHLMGAWLQMNGGDDPAT ICTPFEMENGMPFWDLAAQEP RFGNLFDEAMEADSKLLGREWEECGGVFEGLKSLVDVGGGTGTMAKAIANAFP S INC IV FDQPHWADLQGTTHNLGFVGGDMFVE IPPANAILLKWILHDWSDEESVKILKNCREAIL LSKNNEGNKKI I I ID I WGHVDNKEKMVDKKS IETQLMFDMLMMSTVTGKERSESEWKKI FLAAGFTHYNI THAFGFRSLIELYP SK (SEQ ID NO: 44) [0232]具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自火炬松(火炬松)的 AEOMT。 火炬松 AEOMT 由 SEQ ID NO:45 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 U39301。 MDSNMNGLAKSNGCE I SRDGFFESEEEELQGQAEAWKCTFAFAESLAVKCWLLGIPDMI AREGPRATLSLCE IVANLPTESPDAACLFRIMRFLVAKGIFPASKSARRRAFETRYGLTP ASKWLVKGRELSMAPMLLMQNDETTLAPWHHFNECVLEGGVAFQKANGAE IWSYASDHPD FNNLFNNAMACNARIVMKAILSKYQGFHSLNSLVDVGGGTGTAVAE IVRAYPF IRGINYD LPHWATAS SLSGVQHVGGDMFETVPTADAIFMKWIMHDWNDEDC IKILKNCRKAIPDTG KVI IVDWLDADQGDNTDKKRKKAVDP IVGTVFDLVMVAHS SGGKERTEKEWKRILLEGG FSRYNI IE IPALQSVIEAFPR (SEQ ID NO: 45) [0233] 具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自 Fragaria ananassa(草莓)的 FaOMT。 Fragaria ananas sa FaOMT 由 SEQ ID NO:46 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AF220491.2。 [0234] MGSTGETQMTPTHVSDEEANLFAMQLASASVLPMVLKAAIELDLLE IMAKAGPGSFLSP S DLASQLPTKNPEAPVMLDRMLRLLASYS ILTCSLRTLPDGKVERLYCLGPVCKFLTKNED GVS IAALCLMNQDKVLVESWYHLKDAVLDGGIPFNKAYGMTAFDYHGTDPRFNKVFNKGM ADHST I TMKKILETYKGFEGLKS IVDVGGGTGAWNMIVSKYP S IKGINFDLPHVIEDAP QYPGVQHVGGDMFVSVPKGNAIFMKWICHDWSDEHC IKFLKNCYAALPDDGKVILAEC IL PVAPDTSLATKGWHMDVIMLAHNPGGKERTEQEFEALAKGSGFQGIRVCCDAFNTYVIE FLKKI (SEQ ID NO: 46) [0235] 具有O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自粟酒裂殖酵母的SpCOMT。 粟酒裂殖酵母 SpCOMT 由 SEQ ID NO:47 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 NP_595284.1。 [0236] MPHMEDNGSEKEQLFLQHIQNLPQERLDAIRGHPELVLKE IDEFTYPDGSGVRMC IGDVK GGF IVGKIRERKPKIMVELGGYLGYSAILFGNE I SKIPGGRYYSLEVNEDYAKIAYELVK LAGLDE IVT IMIGKACDSLVELQQKLLHKDLGFQALDMVF IDHWKDLYVPDLRVIESLNM IAPGTLLVADNI I TPGAPEYHKYVNMSPEERRGYQAKVRNVNGFDF IGRWDLIYKTETKE FEGVIRNKHRKDAVDVTECVGYAKKD(序列号:47) [0237] 具有O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自罗勒(Ocimum basilicum)(罗勒)的COMT1。 罗勒 COMT1 由 SEQ ID NO:48 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 AAD38189。 [0238] MGSATNTPQINSDEEENFLFAMQLASASVLPMVLKSAIELDLLELIKKSGAGAFVSPVDL AAQLPTTNPDAHVMLDRILRLLTSYAILECRLKTLPDGGVERLYGLAPVCKFLTKNEDGV SMAPLTLMNQDKVLMESWYHLSDAWDGGIPFNKAYGMTAFEYHGTDPRFNKVFNQGMSN HST I TMKKILETYTGFDGLKTWDVGGGTGATLNMIVSKYP S IKGINFDLPHVIEDAP SY PGVEHVGGDMFVSVPKGDAIFMKWICHDWSDEHCVKFLKNCYDALPQNGKVILAECVLPE APDTGLATKNWHIDVIMLAHNPGGKERTEKEFQGLAKAAGFKQFNKACCAYNTWIMELL K (SEQ ID NO: 48) [0239] 具有 O-甲基转移酶活性的示例性酶是来自 Zinnia elegans (zinnia) 的 ZeCAOMT。 百日草 ZeCAOMT 由 SEQ ID NO: 49 所示的氨基酸序列提供,其对应于 UniProtKB 登录号 U19911。 [0240] MGSNQDDQAFLFAMQLASASVLPMVLKTAIELDLLET IAKAGPHGSVS S SELVAQLPKVN NPEAPVMIDRICSLLASYSVLTCTLKETADGCAERFYGLAPVCKFLIKNDAGVSLAPLLL MNQDKVLMESWYYLKDPVLDGGIPFNKAYGMSAFEYHGKDQRFNKVFNSGMFNHSTMTMK KIVELYNGFSGLKTLVDVGGGTGASLNMI TSKHKSLKGINFDLPHVIADATTYQGIEHVG GDMFESVPKGDAIFMKWILHDWSDAHCLQVLKNCYKSLPENGKVIVAEC ILPEAPDTTPA TQNVIHIDVIMLAHNPGGKERTEKEFEALAKGAGFKGFNKAACALNTWVME (SEQ ID NO: 49) [0241] 在一些实施方案中,异源基因编码具有O-甲基转移酶活性的酶,使得表达该酶的细胞能够增加挥发性酚向甲醚的转化。 在一些实施方案中,异源基因编码具有O-甲基转移酶活性的酶,使得与表达具有野生型O-甲基转移酶的酶的细胞相比,表达该酶的细胞能够增加挥发性酚向甲醚的转化 活动。 在一些实施方案中,异源基因编码具有O-甲基转移酶活性的酶,使得表达该酶的细胞与不表达异源基因的细胞相比能够增加挥发性酚向甲醚的转化。 [0242]在一些实施方案中,具有OMT活性的酶是重组酶,其可以将挥发性酚转化为酚甲醚。 在一些实施方案中,与未与OMT酶接触的发酵产品相比,与具有O-甲基转移酶活性的酶接触的发酵产品具有增加的挥发性酚向甲醚的转化。 在一些实施方案中,本文所述的任何方法还可包括向发酵过程和/或培养基中添加一种或多种辅因子以促进酶的活性。 在一些实施例中,该方法进一步 包括向发酵过程和/或培养基中添加外源S-腺苷甲硫氨酸。 在一些实施方案中,培养基包含S-腺苷甲硫氨酸。 [0243] 甲基醚(甲基化挥发性酚类)的实例包括但不限于藜芦醇(1,2-二甲氧基苯)、3-甲基茴香醚、2,4,6-三甲基苯酚、2-甲基苯酚、2,6-二甲苯酚、2,3,6 -三甲基苯酚、2-甲基苯甲醚和 4-甲基苯甲醚。 [0244] 在一些实施方案中,甲醚是藜芦醚(1,2-二甲氧基苯)、3-甲基苯甲醚和/或4-甲基苯甲醚。 [0245] 在一些实施例中,具有O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90的氨基酸序列 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 与 SEQ ID NO: 37 所示序列具有 99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 与 SEQ ID NO: 38 所示序列具有 99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O -甲基转移酶活性具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 与如 SEQ ID NO: 39 所示的序列。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3% 、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 40 所示序列的序列同一性。 [0246] 在一些实施例中,具有O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90的氨基酸序列 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 与 SEQ ID NO: 41 所示序列具有 99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 与 SEQ ID NO: 42 所示序列具有 99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性。在一些实施方案中,具有 O -甲基转移酶活性具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% , 或与 SEQ ID NO: 43 中所示序列具有 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1% 、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO:44 所示序列的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶的酶 活性具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%的氨基酸序列 、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 的序列同一性 序列如 SEQ ID NO: 45 所示。 [0247]在一些实施例中,具有O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90的氨基酸序列 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 与 SEQ ID NO: 46 所示序列具有 99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 与 SEQ ID NO: 47 所示序列具有 99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 的序列同一性。在一些实施方案中,具有 O -甲基转移酶活性具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 序列同一性 与如 SEQ ID NO: 48 所示的序列。在一些实施方案中,具有 O-甲基转移酶活性的酶具有具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3% 、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% 或 99.9% 与 SEQ ID NO: 49 所示序列的序列同一性。 [0248] 在一些实施例中,具有O-甲基转移酶活性的酶包含如SEQ ID NOs:37-49中任一项所列的氨基酸序列。 在一些实施例中,具有O-甲基转移酶活性的酶由如SEQ ID NOs:37-49中任一项所示的氨基酸序列组成。 [0249] 在一些实施例中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因包含编码包含氨基的酶的核酸序列 具有至少 80% (例如,至少 80%、至少 81%、至少 82%、至少 83%、至少 84%、至少 85%、至少 86%、至少 87%、 至少 88%,至少 89%,至少 90%,至少 91%,至少 92%,至少 93%,至少 94%,至少 95%,至少 95.5%,至少 96%, 至少 96.5%、至少 97%、至少 97.5%、至少 98%、至少 98.5%、至少 99%、至少 99.5%、至少 99.6%、至少 99.7%、至少 99.8%、 或至少 99.9%) 与 SEQ ID NOs: 37-49 中任一个所列序列的序列同一性。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因包含编码由如SEQ ID NO:37-49中任一个所示的氨基酸序列组成的酶的核酸序列。 [0250] 可以进行具有O-甲基转移酶活性或预测具有O-甲基转移酶活性的另外的酶的鉴定,例如基于与O-甲基转移酶的一个或多个结构域的相似性或同源性,例如由以下任何一种提供的O-甲基转移酶 SEQ ID NO:37-49。 在一些实施方案中,可基于与活性结构域例如催化结构域例如与O-甲基转移酶活性相关的催化结构域的相似性或同源性来鉴定用于本文所述的修饰细胞和方法的酶。 在一些实施例中,用于本文所述经修饰的细胞和方法的酶可与参考O-甲基转移酶具有相对高水平的序列同一性,例如野生型O-甲基转移酶,例如SEQ ID NO中的任何一个 :37-49,在催化结构域区域,但基于对酶的较大部分或酶的全长的分析,与参考 O-甲基转移酶的序列同一性水平相对较低。 在一些实施例中,用于本文所述经修饰的细胞和方法的酶具有至少 80%、至少 81%、至少 82%、至少 83%、至少 84%、至少 85%、至少 86 %,至少 87%,至少 88%,至少 89%,至少 90%,至少 91%,至少 92%,至少 93%,至少 94%,至少 95%,至少 95.5 %,至少 96%,至少 96.5%,至少 97%,至少 97.5%,至少 98%,至少 98.5%,至少 99%,至少 99.5%,至少 99.6%,至少 99.7 相对于参考O-甲基转移酶(例如,SEQ ID NO:37-49),酶的催化结构域区域中的序列同一性至少为 99.8%,或至少为 99.9%。 [0251]在一些实施方案中,用于本文所述的经修饰的细胞和方法的酶在酶的催化结构域区域中相对于参考O-甲基转移酶(例如,SEQ ID NOs:37- 49) 以及基于对酶的较大部分或酶的全长的分析,与参考 O-甲基转移酶的序列同一性水平相对较低。 在一些实施方案中,用于本文所述的修饰细胞和方法的酶具有 至少 10%、至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、至少 45%、至少 50%、至少 55%、至少 60 %,至少 65%,至少 88%,至少 89%,至少 90%,至少 91%,至少 92%,至少 93%,至少 94%,至少 95%,至少 95.5 %,至少 96%,至少 96.5%,至少 97%,至少 97.5%,至少 98%,至少 98.5%,至少 99%,至少 99.5%,至少 99.6%,至少 99.7 %、至少 99.8%、或至少 99.9% 的序列同一性,基于酶的一部分或酶的全长相对于参考 O-甲基转移酶(例如,SEQ ID NO:37-49)。 [0252] 基因工程的一般方法 [0253] 对于本领域的普通技术人员来说也显而易见的是,与另一种糖苷酶和/或O - 甲基转移酶(例如,参考酶)。 通常,可以使用本领域已知的方法鉴定其他糖苷酶和/或O-甲基转移酶中的相应位置,例如通过比对两种或更多种酶的氨基酸序列。 用于比对氨基酸(或核苷酸)序列的软件程序和算法是本领域已知的并且容易获得,例如,Clustal Omega(Sievers 等人,2011)。 [0254] 本文所述的糖苷酶和/或O-甲基转移酶可进一步包含一种或多种修饰,例如以特异性改变与其所需生理活性无关的多肽特征。 或者或此外,本文所述的糖苷酶和/或O-甲基转移酶可含有一个或多个突变以调节酶在细胞中的表达和/或活性。 [0255] 编码糖苷酶和/或O-甲基转移酶的核酸的突变优选保留编码序列的氨基酸阅读框,并且优选不在核酸中产生可能杂交形成二级结构的区域,例如发夹 或环,这可能对酶的表达有害。 [0256] 可以通过选择氨基酸取代,或通过编码多肽的核酸中选定位点的随机诱变来进行突变。 如本文所述,可以表达变体多肽并测试一种或多种活性以确定哪种突变提供具有所需特性的变体多肽。 可以对变体(或非变体多肽)进行进一步的突变,这些变体对于多肽的氨基酸序列是沉默的,但是提供了在特定宿主中用于翻译的优选密码子(称为密码子优化)。 翻译的首选密码子 例如,酿酒酵母中的核酸是本领域普通技术人员所熟知的。 还可以对基因或 cDNA 克隆的非编码序列进行其他突变以增强多肽的表达。 糖苷酶和/或 O-甲基转移酶(酶)变体的活性可以通过以下方式进行测试:将编码酶变体的基因克隆到表达载体中,将载体引入合适的宿主细胞,表达酶变体,然后测试功能性 酶的能力,如本文所公开。 [0257]本文所述的糖苷酶和/或O-甲基转移酶可含有对应于参考糖苷酶和/或O-甲基转移酶例如野生型酶的一个或多个位置的氨基酸取代。 在一些实施方案中,糖苷酶在对应于参考糖苷酶的1、2、3、4、5或更多个位置处含有氨基酸取代。 在一些实施方案中,糖苷酶不是天然存在的糖苷酶,例如,是基因修饰的。 在一些实施方案中,O-甲基转移酶在对应于参考O-甲基转移酶的1、2、3、4、5或更多位置处含有氨基酸取代。 在一些实施方案中,O-甲基转移酶不是天然存在的O-甲基转移酶,例如,是基因修饰的。 [0258] 在一些实施方案中,糖苷酶和/或O-甲基转移酶变体还可含有一个或多个基本上不影响糖苷酶和/或O-甲基转移酶的活性和/或结构的氨基酸取代。 技术人员还将认识到可以在酶中进行保守氨基酸取代以提供前述多肽的功能等价变体,即变体保留多肽的功能能力。 如本文所用,“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。 可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体,例如在汇编此类方法的参考文献中发现的,例如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds. ,第四版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,2012 年,或 Current Protocols in Molecular Biology,F.M. Ausubel 等人编辑,John Wiley & Sons, Inc.,纽约。 多肽的示例性功能等同变体包括本文公开的蛋白质的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。 氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代:(a) M、I、L、V; (b) F、Y、W; (c) K、R、H; (d) A、G; (美东时间; (f) 问、问; (g) E、D。 如本领域的普通技术人员所知,编码具有糖苷酶和/或O-甲基转移酶活性的酶的同源基因可以从其他物种获得并且可以通过同源性搜索来鉴定,例如通过蛋白质BLAST搜索,可在 国家生物技术信息中心 (NCBI) 网站 (ncbi.nlm.nih.gov)。 通过将酶的氨基酸序列与一种或多种参考酶进行比对和/或通过将相似或同源酶的二级或三级结构与一种或多种参考酶进行比较,可以确定相似或同源酶中相应的氨基酸残基 酶,并且可以确定相似或同源酶中突变的氨基酸残基。 [0259] 与本公开相关的基因可以从含有给定基因的任何 DNA 来源的 DNA 中获得(例如,通过 PCR 扩增)。 在一些实施方案中,与本发明相关的基因是合成的,例如,通过体外化学合成产生的。 获得编码本文所述酶的基因的任何方式都与本文所述的修饰细胞和方法相容。 [0260] 本文提供的公开涉及编码具有糖苷酶和/或O-甲基转移酶活性的酶的基因的重组表达、前述的功能修饰和变体,以及与其相关的用途。 可以通过常规技术鉴定与本发明相关的核酸的同源物和等位基因。 [0261]本发明还包括在严格条件下与本文所述核酸杂交的核酸。 本文所用的术语“严格条件”是指本领域熟悉的参数。 核酸杂交参数可以在编译此类方法的参考文献中找到,例如,分子克隆:实验室手册,J. Sambrook 等人,编辑,第四版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约, 2012 年,或当前分子生物学协议,F.M. Ausubel 等人编辑,John Wiley & Sons, Inc.,纽约。 [0262] 可以使用其他条件、试剂等,这会导致类似的严格程度。 熟练的技术人员将熟悉这些条件,因此这里不给出它们。 然而,应当理解,技术人员将能够以允许清楚地鉴定本发明核酸的同系物和等位基因的方式操纵条件(例如,通过使用较低的严格条件)。 本领域技术人员还熟悉用于筛选细胞和文库以表达此类分子的方法,然后将其常规分离,随后分离相关核酸分子并测序。 本发明还包括简并核酸,其包含与天然材料中存在的密码子不同的密码子。 例如,丝氨酸残基由密码子 TCA、AGT、TCC、TCG、TCT 和 AGC 编码。 六个密码子中的每一个对于编码丝氨酸残基的目的是等同的。 因此,对于本领域普通技术人员显而易见的是,任何编码丝氨酸的核苷酸三联体都可以用于在体外或体内指导蛋白质合成装置,以将丝氨酸残基掺入延长的多肽中。 类似地,编码其他氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括但不限于:CCA、CCC、CCG和CCT(脯氨酸密码子); CGA、CGC、CGG、CGT、AGA 和 AGG(精氨酸密码子); ACA、ACC、ACG 和 ACT(苏氨酸密码子); AAC 和 AAT(天冬酰胺密码子); ATA、ATC 和 ATT(异亮氨酸密码子)。 其他氨基酸残基可由多个核苷酸序列类似地编码。 因此,本发明包括简并核酸,其由于遗传密码的简并性而在密码子序列上不同于生物学分离的核酸。 本发明还包括密码子优化以适合宿主细胞的最佳密码子使用。 [0263] 本发明还提供修饰的核酸分子,其包括一个或多个核苷酸的添加、取代和缺失。 在优选的实施方案中,这些修饰的核酸分子和/或它们编码的多肽保留了未修饰的核酸分子和/或多肽的至少一种活性或功能,例如酶活性。 在某些实施方案中,经修饰的核酸分子编码经修饰的多肽,优选具有如本文别处所述的保守氨基酸取代的多肽。 修饰的核酸分子在结构上与未修饰的核酸分子相关,并且在优选的实施方案中与未修饰的核酸分子在结构上足够相关,使得修饰的和未修饰的核酸分子在本领域技术人员已知的严格条件下杂交。 [0264] 例如,可以制备编码具有单个氨基酸变化的多肽的修饰的核酸分子。 这些核酸分子中的每一个都可以具有一个、两个或三个核苷酸取代,不包括与本文所述的遗传密码的简并性相对应的核苷酸变化。 同样,可以制备编码具有两个氨基酸变化的多肽的修饰的核酸分子,其具有例如2-6个核苷酸变化。 本领域技术人员将很容易想到许多像这样的修饰核酸分子,包括例如编码氨基酸2和3、2和4、2和5、2和6等的密码子中的核苷酸取代 . 在前面的示例中,两个氨基酸的每个组合都包含在 修饰的核酸分子,以及编码氨基酸取代的所有核苷酸取代。 还可以制备编码具有额外取代(即 3 个或更多)、添加或缺失(例如,通过引入终止密码子或剪接位点)的多肽的额外核酸分子,并且容易地包含在本发明中 由本领域的普通技术人员设想。 可以通过常规实验测试任何前述核酸或多肽与本文公开的核酸和/或多肽的结构关系或活性的保留。 [0265] 可以通过选择氨基酸取代,或通过编码多肽的核酸中选定位点的随机诱变来进行突变。 如本文所述,可以表达变体多肽并测试一种或多种活性以确定哪种突变提供具有所需特性的变体多肽。 可以对变体(或非变体多肽)进行进一步的突变,这些变体对于多肽的氨基酸序列是沉默的,但是提供了在特定宿主中用于翻译的优选密码子(称为密码子优化)。 用于在例如酿酒酵母中翻译核酸的优选密码子是本领域普通技术人员众所周知的。 还可以对基因或 cDNA 克隆的非编码序列进行其他突变以增强多肽的表达。 [0266] 在本公开的一方面,与本发明相关的一种或多种基因在重组表达载体中表达。 如本文所用,“载体”可以是多种核酸中的任何一种,可以通过限制和连接将所需序列插入其中以用于不同遗传环境之间的运输或用于在宿主细胞中表达。 载体通常由 DNA 组成,但也可以使用 RNA 载体。 载体包括但不限于:质粒、fosmids、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。 [0267] 克隆载体是能够自主复制或整合到宿主细胞基因组中的载体。 在质粒的情况下,随着质粒在宿主细胞如宿主细菌内拷贝数的增加,所需序列的复制可能发生多次,或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅发生一次。 在噬菌体的情况下,复制可能在裂解期主动发生或在溶原期被动发生。 [0268] 表达载体是一种可以通过限制和连接将所需的 DNA 序列插入其中,从而使其可操作地连接到调节序列并可以表达为 RNA 转录物的载体。 载体可进一步包含一种或多种标记序列,适用于鉴定已经或未被转化或 用载体转染。 标记包括,例如,编码增加或减少对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因,编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶的基因(例如β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶) ),以及明显影响转化或转染细胞、宿主、菌落或斑块表型的基因(例如,绿色荧光蛋白)。 优选的载体是那些能够自主复制和表达存在于与其有效连接的DNA片段中的结构基因产物的载体。 [0269]如本文所用,当编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时,它们被称为“可操作地”连接或可操作地连接 . 如果希望将编码序列翻译成功能性蛋白质,如果在 5' 调节序列中启动子的诱导导致编码序列的转录,并且如果性质 两个 DNA 序列之间的连接不会 (1) 导致移码突变的引入,(2) 干扰启动子区域指导编码序列转录的能力,或 (3) 干扰 相应的 RNA 转录本被翻译成蛋白质的能力。 因此,如果启动子区域能够影响该DNA序列的转录,则启动子区域将可操作地连接至编码序列,使得所得转录物可以翻译成所需的蛋白质或多肽。 [0270] 当编码本公开的任何酶的核酸分子在细胞中表达时,多种转录控制序列(例如,启动子/增强子序列)可用于指导其表达。 在一些实施方案中,每个基因可操作地连接至启动子(例如,每个基因连接至单独的启动子)。 启动子可以是天然启动子,即基因在其内源环境中的启动子,其提供基因表达的正常调节。 在一些实施方案中,启动子可以是组成型的,即启动子是不受调节的,以允许其相关基因(例如,具有糖苷酶和/或O-甲基转移酶活性的酶)的连续转录。 也可以使用多种条件启动子,例如受分子存在或不存在控制的启动子。 [0271] 基因表达所需的调控序列的确切性质可能因物种或细胞类型而异,但通常应根据需要包括参与转录和翻译起始的 5' 非转录和 5' 非翻译序列 分别是 TATA 盒、加帽序列、CAAT 序列等。 具体而言,此类 5' 非转录调节序列将包括启动子区域,该启动子区域包括用于可操作连接的基因的转录控制的启动子序列。 [0272] 调节序列还可以根据需要包括增强子序列或上游激活子序列。 本发明的载体可以任选地包括5'前导序列或信号序列。 合适载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断力之内。 [0273] 包含表达所需的所有元件的表达载体是可商购的并且是本领域技术人员已知的。 参见,例如,Sambrook 等人,分子克隆:实验室手册,第四版,冷泉港实验室出版社,2012 年。通过将异源 DNA (RNA) 引入细胞,对细胞进行基因工程改造。 异源 DNA (RNA) 可置于转录元件的可操作控制之下,以允许异源 DNA 在宿主细胞中表达。 如本领域普通技术人员所理解的,本文描述的任何酶也可以在其他酵母细胞中表达,包括用于生产葡萄酒、蜂蜜酒、清酒、苹果酒等的酵母菌株。 [0274] 可以使用本领域标准的方法和技术将编码本公开的具有糖苷酶活性的酶和/或具有O-甲基转移酶活性的酶的核酸分子引入一个或多个细胞中。 例如,可以通过标准方案引入核酸分子,例如转化包括化学转化和电穿孔、转导、粒子轰击等。 [0275] 表达编码要求保护的发明的酶的核酸分子也可以通过将核酸分子整合到基因组中来实现。 [0276]基因的掺入可以通过将编码酶的核酸掺入酵母细胞的基因组,或通过瞬时或稳定维持编码酶的新核酸作为附加型元件来实现。 在真核细胞中,永久性、可遗传的遗传变化通常是通过将 DNA 引入细胞基因组来实现的。 [0277] 异源基因还可以包括编码基因产物表达所需的各种转录元件(例如,具有糖苷酶的酶和/或具有O-甲基转移酶活性的酶)。 例如,在一些实施方案中,编码具有糖苷酶的酶和/或具有O-甲基转移酶的酶的基因可以可操作地连接至启动子。 在一些实施例中,启动子是诱导型启动子。 在一些实施例中,启动子在发酵过程的特定阶段是有活性的。 为了 例如,在一些实施方案中,来自启动子的峰值表达是在发酵过程的早期阶段,例如,在>50%的可发酵糖被消耗之前。 在一些实施方案中,来自启动子的峰值表达是在发酵过程的后期阶段,例如,在 50% 的可发酵糖已被消耗之后。 [0278] 培养基中的条件在发酵过程中会发生变化,例如随着糖源和氧气的耗尽,营养物和氧气的可用性往往会在发酵过程中随着时间的推移而降低。 此外,其他因素的存在,例如细胞代谢产生的产物,可能会增加。 在一些实施方案中,启动子受发酵过程中的一种或多种条件调节,例如一种或多种因子的存在或不存在。 在一些实施方案中,启动子受缺氧条件的调节。 缺氧激活基因的启动子的例子是本领域已知的。 参见,例如,Zitomer 等人。 肾脏诠释 (1997) 51(2): 507-13; 冈萨雷斯西索等人。 生物技术。 快报 (2012) 34:2161-2173。 [0279] 在一些实施例中,启动子是组成型启动子。 用于酵母细胞的组成型启动子的实例是本领域已知的并且对本领域普通技术人员来说是显而易见的。 在一些实施方案中,启动子是酵母启动子,例*自表达异源基因或外源基因的酵母细胞的天然启动子。 [0280] 用于本文所述的遗传修饰细胞和方法的启动子的非限制性实例包括,HEM13 启动子(pHEM13)、SPG1 启动子(pSPG1)、PRB1 启动子(pPRB1)、QCR10(pQCRIO)、PGK1 启动子(pPGK1), OLE1启动子(pOLE1)、ERG25启动子(pERG25)、HHF2启动子(pHHF2)、TDH1启动子(pTDH1)、TDH2启动子(pTDH2)、TDH3启动子(pTDH3)、ENO2启动子(pENO2)或HSP26 启动子 (pHSP26)。 [0281] 转基因酵母细胞 [0282] 本公开的方面涉及基因修饰的酵母细胞(修饰细胞)和此类修饰细胞在生产发酵产品(例如,发酵饮料)的方法和生产乙醇的方法中的用途。 本文所述的遗传修饰的酵母细胞是用编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因和/或编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因进行遗传修饰的。 [0283] 术语“基因修饰的细胞”、“基因修饰的酵母细胞”和“修饰的细胞”在本文中可互换使用,指真核细胞(例如,酵母细胞),其已经是或目前可能是 , 通过引入一个修改 异源基因。 术语(例如,修饰的细胞)包括通过引入异源基因而被遗传修饰的原始细胞的后代。 技术人员应当理解,单个细胞的后代可能由于突变(例如,自然、意外或故意改变 修饰细胞的核酸)。 [0284]用于本文所述方法的酵母细胞优选能够发酵糖源(例如,可发酵糖)并产生乙醇(乙醇)和二氧化碳。 在一些实施方案中,酵母细胞属于酵母属。 酵母属包括近 500 种不同的物种,其中许多用于食品生产。 一个例子是酿酒酵母 (S. cerevisiae),它通常被称为“啤酒酵母”或“面包酵母”,用于生产葡萄酒、面包、啤酒等产品。 酵母属的其他成员包括但不限于与酿酒酵母近缘的野生酵母奇异酵母、巴彦酵母、巴斯德酵母、卡尔斯伯格酵母、uvarum 酵母、酿酒酵母变种 boulardii、真巴彦酵母。 在一些实施例中,酵母是酿酒酵母(S.cerevisiae)。 [0285] 酵母属物种可以是单倍体(即,具有单组染色体)、二倍体(即,具有成对的一组染色体)或多倍体(即,携带或包含多于两个同源染色体组)。 例如,用于啤酒酿造的酵母菌种通常分为两组:艾尔啤酒菌株(例如酿酒酵母)和拉格啤酒菌株(例如 S. pastorianus、S. carlsbergensis、S. uvarum) ,这是底部发酵。 这些特征反映了它们在开放式方形发酵罐中的分离特性,以及其他特性,例如首选发酵温度和达到的酒精浓度。 [0286] 尽管啤酒酿造和葡萄酒生产传统上侧重于使用酿酒酵母菌株,但其他酵母种类和属在发酵饮料的生产中也受到重视。 在一些实施例中,酵母细胞属于非酵母属。 参见,例如,Crauwels 等人。 酿造科学(2015)68:110-121; 埃斯特维斯等人。 微生物 (2019) 7(11): 478。在一些实施方案中,酵母细胞属于 Kloeckera 属、念珠菌属、Starmerella 属、Hanseniaspora 属、Kluyveromyces/Lachance 属、Metschnikowia 属、Saccharomy codes 属、接合酵母属、Dekkera 属(也称为酒香酵母属), Wickerhamomyces 或 Torulaspora。 非酵母菌的例子 include, without limitation, Hanseniaspora uvarum, Hanseniaspora guillermondii, Hanseniaspora vinae, Metschnikowia pulcherrima, Kluyveromyces/Lachancea thermotolerans , Starmerella bacillaris (previously referred to as Candida stellatal Candida zemplinina), Saccharomycodes ludwigii, Zygosaccharomyces rouxii, Dekkera bruxellensis , Dekker a anomala, Bretanomyces custersianus 、Bretanomyces naardenensis、Bretanomyces nanus、Wickerhamomyces anomalus 和 Torulaspora delbrueckii。 [0287] 在一些实施例中,本文所述的方法涉及使用多于一种基因修饰的酵母。 例如,在一些实施例中,该方法可涉及使用多于一种属于酵母属的基因修饰酵母。 在一些实施例中,该方法可涉及使用多于一种属于非酵母属的基因修饰酵母。 在一些实施例中,该方法可涉及使用多于一种属于酵母属的基因修饰酵母和一种属于非酵母属的基因修饰酵母。 或者,或此外,本文所述的任何方法可涉及使用一种或多种基因修饰的酵母和一种或多种非基因修饰的(野生型)酵母。 [0288] 在一些实施例中,酵母是杂交菌株。 如本领域普通技术人员将显而易见的,术语酵母的“杂交菌株”是指由两种不同的酵母菌株杂交产生的酵母菌株,例如以获得一种或多种期望的特征。 例如,杂交菌株可以由属于相同属或相同种的两种不同酵母菌株杂交产生。 在一些实施方案中,杂交菌株由酿酒酵母菌株和真巴氏酵母菌株杂交产生。 参见,例如,Krogerus 等人。 微生物细胞工厂 (2017) 16: 66。 [0289]在一些实施方案中,酵母菌株是野生酵母菌株,例如从天然来源分离并随后繁殖的酵母菌株。 或者,在一些实施例中,酵母菌株是驯化酵母菌株。 已驯化的酵母菌株经过人类选择和育种以具有所需的特性。 [0290] 在一些实施例中,经遗传修饰的酵母细胞可用于与其他酵母或细菌菌株的共生基质中。 酵母细胞和细菌菌株的共生基质可用于生产发酵饮料,如康普茶、开菲尔和姜汁啤酒。 例如,脆弱酵母菌是开菲尔培养物的一部分,它是在乳清中含有的乳糖上生长的。 其他可用于与转基因酵母细胞共生基质的细菌菌株包括双歧杆菌 动物亚种 乳杆菌、短双歧杆菌、乳杆菌属细菌和片球菌属细菌。 [0291] 尽管许多发酵饮料是使用酿酒酵母菌株生产的,但其他酵母属在发酵饮料的生产中也很受欢迎,并且可以与修饰的酵母细胞一起用于共生基质。 在一些实施例中,其他酵母细胞属于非酵母属。 参见,例如,Crauwels 等人。 酿造科学(2015)68:110-121; 埃斯特维斯等人。 微生物 (2019) 7(11): 478。在一些实施方案中,其他酵母细胞属于 Kloeckera 属、念珠菌属、Starmerella 属、Hanseniaspora 属、克鲁维酵母属/Lachance 属、梅奇酵母属、酵母菌属、接合酵母属、德克酵母属(也称为酒香酵母属), Wickerhamomyces 或 Torulaspora。 非酵母菌属酵母的实例包括但不限于,Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora guillermondii、Hanseniaspora vinae、Metschnikowia pulcherrima、Kluyveromyces/Lachancea thermotolerans、Starmerella bacillaris(以前称为 Candida stellatal Candida zemplinina)、Saccharomycodes ludwigii、Zygosellexaccharom、 Dekkera anomala、Brettanomyces custersianus、Brettanomyces naardenensis、Brettanomyces nanus、Wickerhamomyces anomalus 和 Torulaspora delbrueckii。 [0292] 遗传修饰酵母细胞的方法是本领域已知的。 在一些实施方案中,酵母细胞是二倍体并且编码具有如本文所述的糖苷酶活性的酶的异源基因的一个拷贝被引入酵母基因组中。 [0293] 在一些实施方案中,酵母细胞是二倍体并且编码具有如本文所述的糖苷酶活性的酶的异源基因的一个拷贝被引入到酵母基因组的两个拷贝中。 在一些实施方案中,异源基因的拷贝是相同的。 在一些实施方案中,异源基因的拷贝不相同,但基因编码具有糖苷酶活性的相同酶。 在一些实施方案中,异源基因的拷贝不相同,并且基因编码具有不同糖苷酶活性的酶(例如,其突变体、变体、片段)。 在一些实施方案中,细胞含有编码具有糖苷酶活性的酶的基因,称为内源基因,并且还含有编码具有糖苷酶活性的酶的第二基因,其可以是与编码的具有糖苷酶活性的酶相同或不同的酶。 由内源基因。 [0294] 在一些实施方案中,酵母细胞是二倍体并且编码具有本文所述的O-甲基转移酶活性的酶的基因的一个拷贝被引入到酵母基因组的两个拷贝中。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因的拷贝是相同的。 在一些实施例中,基因的拷贝 编码具有 O-甲基转移酶活性的酶的基因不相同,但这些基因编码具有 O-甲基转移酶活性的相同酶。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因的拷贝不相同,并且基因编码具有不同的O-甲基转移酶活性的酶(例如,其突变体、变体、片段)。 在一些实施方案中,细胞含有编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因,称为内源基因,并且还含有编码具有O-甲基转移酶活性的酶的第二基因,其可以是与O-甲基转移酶相同或不同的酶。 -由内源基因编码的甲基转移酶活性。 [0295] 在一些实施方案中,酵母细胞是四倍体。 Tetrapioid 酵母细胞是维持四套完整染色体(即一套完整的染色体有四个拷贝)的细胞。 在一些实施方案中,酵母细胞是类四倍体并且编码具有如本文所述的糖苷酶活性的酶的异源基因的拷贝被引入基因组的至少一个拷贝中。 在一些实施方案中,酵母细胞是类四倍体并且编码具有如本文所述的糖苷酶活性的酶的异源基因的拷贝被引入多于一个拷贝的基因组中。 在一些实施方案中,酵母细胞是类四倍体并且编码具有如本文所述的糖苷酶活性的酶的异源基因的拷贝被引入基因组的所有四个拷贝中。 在一些实施方案中,异源基因的拷贝是相同的。 在一些实施方案中,异源基因的拷贝不相同,但基因编码具有糖苷酶活性的相同酶。 在一些实施方案中,异源基因的拷贝不相同,并且基因编码具有不同糖苷酶活性的酶(例如,其突变体、变体、片段)。 [0296] 在一些实施方案中,酵母细胞是类四倍体并且编码具有如本文所述的O-甲基转移酶活性的酶的基因的拷贝被引入基因组的至少一个拷贝中。 在一些实施方案中,酵母细胞是类四倍体并且编码具有如本文所述的O-甲基转移酶活性的酶的基因的拷贝被引入多于一个拷贝的基因组中。 在一些实施方案中,酵母细胞是类四倍体并且编码具有本文所述的O-甲基转移酶活性的酶的基因拷贝被引入基因组的所有四个拷贝中。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因的拷贝是相同的。 在一些实施方案中,编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因的拷贝不相同,但基因编码具有O-甲基转移酶活性的相同酶。 在一些实施例中,编码具有O-甲基转移酶的酶的基因的拷贝数 活性不相同,并且基因编码具有不同的O-甲基转移酶活性的酶(例如,其突变体、变体、片段)。 在一些实施方案中,细胞含有编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因,称为内源基因,并且还含有编码具有O-甲基转移酶活性的酶的基因的一个或多个额外拷贝,其可以是相同的 或与内源基因编码的具有O-甲基转移酶活性的不同酶。 [0297] 在一些实施方案中,相对于不包含第一异源基因和第二外源基因的野生型酵母细胞,修饰细胞的生长速率基本上没有受损。 测量和比较两种细胞生长速率的方法是本领域普通技术人员已知的。 可以在两种类型的细胞之间测量和比较的生长速率的非限制性示例是复制速率、出芽速率、每单位时间产生的菌落形成单位 (CFU) 和每单位时间培养基中减少的可发酵糖的量 时间。 如果经测量的生长速率至少为 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%,则修饰细胞的生长速率相对于野生型细胞“未显着受损” 野生型细胞生长速率的至少 90%、至少 95%、至少 99% 或至少 100%。 [0298]可用于本文所述方法的酵母细胞菌株将是本领域普通技术人员已知的,并且包括用于酿造所需发酵饮料的酵母菌株以及可商购的酵母菌株。 常见啤酒菌株的例子包括但不限于美国艾尔啤酒菌株、比利时艾尔啤酒菌株、英国艾尔啤酒菌株、比利时兰比克/酸艾尔啤酒菌株、大麦酒/帝国烈性黑啤酒菌株、印度淡啤酒菌株、布朗艾尔啤酒菌株、Kolsch 和 Altbier 菌株, Stout 和 Porter 菌株,以及小麦啤酒菌株。 [0299] 与本文所述的遗传修饰细胞和方法一起使用的菌株的非限制性实例包括 Wyeast American Ale 1056、Wyeast American Ale II 1272、Wyeast Denny’s Favorite 50 1450、Wyeast Northwest Ale 1332、Wyeast Ringwood Ale 1187、Siebel Inst. 美国艾尔 BRY 96、怀特实验室美国艾尔酵母混合啤酒 WLP060、怀特实验室加州艾尔 V WLP051、怀特实验室加州艾尔 WLP001、怀特实验室老索诺玛艾尔 WLP076、怀特实验室太平洋艾尔 WLP041、怀特实验室东海岸艾尔 WLP008、怀特实验室东米德兰兹 Ale WLP039、White Labs San Diego 超级酵母 WLP090、White Labs San Francisco Lager WLP810、White Labs Neutral Grain WLP078、Lallemand American West Coast Ale BRY-97、Lallemand CBC-1(木桶和瓶子调理)、Brewferm Top、Coopers Pure Brewers ' 酵母,Fermentis US-05,Real Brewers Yeast Lucky #7,Muntons Premium Gold,Muntons Standard 酵母,东海岸 Yeast Northeast Ale ECY29, East Coast Yeast Old Newark Ale ECY10, East Coast Yeast Old Newark Beer ECY12, Fermentis Safale US-05, Fermentis Safbrew T-58, Real Brewers Yeast The One, Mangrove Jack 美国西海岸酵母, Mangrove Jack Workhorse 啤酒酵母、Lallemand Abbaye 比利时艾尔啤酒、White Labs Abbey IV WLP540、White Labs 美国农家混合啤酒 WLP670、White Labs 安特卫普艾尔啤酒 WLP515、东海岸酵母比利时 Abbaye ECY09、White Labs 比利时艾尔啤酒 WLP550、Mangrove Jack 比利时艾尔啤酒酵母、Wyeast 比利时深色艾尔啤酒 3822-PC,Wyeast 比利时 Saison 3724,White Labs 比利时 Saison I WLP565,White Labs 比利时 Saison II WLP566,White Labs 比利时 Saison III WLP585,Wyeast 比利时 Schelde 啤酒 3655-PC,Wyeast 比利时世涛 1581-PC,White Labs 比利时风格啤酒 酵母混合 WLP575、White Labs 比利时风格赛森啤酒混合 WLP568、东海岸酵母比利时白 ECY 11、Lallemand Belle Saison、Wyeast Biere de Garde 3725-PC、White Labs Brettanomyces Bruxellensis Trois Vrai WLP648、Brewferm Top、Wyeast Canadian/Belgian Ale 3864 -PC、Lallemand CBC-1(木桶和瓶子调理)、Wyeast Farmhouse Ale 3726-PC、East Coast Yeast Farmhouse Brett ECY03、Wyeast Flanders Golden Ale 3739-PC、White Labs Flemish Ale Blend WLP665、White Labs French Ale WLP072、Wyeast 法国 Saison 3711、Wyeast Leuven Pale Ale 3538-PC、Fermentis Safbrew T-58、东海岸酵母 Saison Brasserie Blend ECY08、东海岸酵母 Saison 单株 ECY14、Real Brewers Yeast The Monk、Siebel Inst。 Trappist Ale BRY 204、East Coast Yeast Trappist Ale ECY 13、White Labs Trappist Ale WLP500、Wyeast Trappist Blend 3789-PC、Wyeast British Ale 1098、Wyeast British Ale II 1335、Wyeast British Cask Ale 1026-PC、Wyeast English Special Bitter 1768 -PC、Wyeast Irish Ale 1084、Wyeast London Ale 1028、Wyeast London Ale III 1318、Wyeast London ESB Ale 1968、Wyeast Ringwood Ale 1187、Wyeast Thames Valley Ale 1275、Wyeast Thames Valley Ale II 1882-PC、Wyeast West Yorkshire Ale 1469 , Wyeast Whitbread Ale 1099, Mangrove Jack British Ale 酵母, Mangrove Jack Burton Union Yeast, Mangrove Jack Workhorse 啤酒酵母, East Coast Yeast British Mild Ale ECY18, East Coast Yeast Northeast Ale ECY29, East Coast Yeast Burton Union ECY 17, East Coast Yeast 老纽瓦克艾尔 ECY 10、White Labs Bedford 英国艾尔 WLP006、White Labs 英国艾尔 WLP005、White Labs 伯顿艾尔 WLP023、White Labs 东米德兰兹艾尔 WLP039、White Labs 英式混合艾尔 WLP085、White Labs 英式艾尔 WLP002、White Labs 埃塞克斯酵母 WLP022、白色实验室爱尔兰啤酒 WLP004、白色实验室伦敦啤酒 WLP013、白色实验室曼彻斯特啤酒 WLPO38、白色实验室老索诺玛啤酒 WLP076、白色实验室圣地亚哥超级酵母 WLP090、白色实验室惠特布莱德啤酒 WLP017、白色实验室北约克郡啤酒 WLP037、库珀纯啤酒 啤酒酵母,Siebel Inst。 英国艾尔 BRY 264,Muntons Premium Gold,Muntons 标准酵母、Lallemand Nottingham、Fermentis Safale S-04、Fermentis Safbrew T-58、Lallemand Windsor(英国艾尔啤酒)、Real Brewers Yeast Ye Olde English、Brewferm Top、White Labs 美国威士忌 WLP065、White Labs 干英式艾尔啤酒 WLP007、White Labs 爱丁堡强麦酒 WLP028、Fermentis Safbrew S-33、Wyeast 苏格兰强麦酒 1728、东海岸酵母苏格兰重型 ECY07、White Labs 超高重力 WLP099、White Labs Whitbread 强麦酒 WLP017、Wyeast Belgian Lambic Blend 3278、Wyeast 比利时 Schelde 强麦酒 3655-PC、Wyeast Berliner-Weisse Blend 3191-PC、Wyeast Brettanomyces Bruxellensis 5112、Wyeast Brettanomyces Lambicus 5526、Wyeast Lactobacillus 5335、Wyeast Pediococcus Cerevisiae 5733、Wyeast Roeselare Ale Blend 3763、Wyeast Trappist Blend 3789-Pc、White Labs Wlpian Belgian Sour Mix55 Weisse Blend Wlp630、White Labs Saccharomyces “Bruxellensis”Trois Wlp644、White Labs Brettanomyces Bruxellensis Wlp650、White Labs Brettanomyces Claussenii Wlp645、White Labs Brettanomyces Lambicus Wlp653、White Labs Flemish Ale Blend Wlp665、东海岸酵母 Berliner Blend Ecy06、东海岸酵母 Ecy04,东海岸酵母 Brett Bruxelensis Ecy05,东海岸酵母 Brett Custersianus Ecyl9,东海岸酵母 Brett Nanus Ecyl6,菌株 #2,东海岸酵母 BugCounty ECY20,东海岸酵母 BugFarm ECY01,东海岸酵母农舍 Brett ECY03,东海岸酵母佛兰芒 爱尔啤酒 ECY02、东海岸酵母乌德布伦 ECY23、酵母美国爱尔啤酒 1056、Siebel Inst. 美国艾尔 BRY 96、White Labs 美国艾尔酵母混合 WLP060、White Labs 波旁酵母 WLP070、White Labs 加州艾尔 V WLP051、White Labs 加州艾尔 WLP001、White Labs 干英国艾尔 WLP007、White Labs 东海岸艾尔 WLP008、White Labs 中性谷物 WLP078、White Labs 超高重力 WLP099、White Labs Tennessee WLP050、Fermentis US -05、Real Brewers Yeast Lucky #7、Fermentis Safbrew S-33、East Coast Yeast Scottish Heavy ECY07、Lallemand Windsor(英国艾尔啤酒)、Wyeast American Ale 1056 , Wyeast American Ale II 1272, Wyeast British Ale 1098, Wyeast British Ale II 1335, Wyeast Denny's Favorite 50 1450, Wyeast London Ale 1028, Wyeast London Ale III 1318, Wyeast London ESB Ale 1968, Wyeast Northwest Ale 1332, Wyeast Ringwood Ale 1187 , 西贝尔研究所 美国艾尔 BRY 96、White Labs 美国艾尔酵母混合 WLP060、White Labs 贝德福德英国艾尔 WLP006、White Labs 英国艾尔 WLP005、White Labs 伯顿艾尔 WLP023、White Labs 加州艾尔 V WLP051、White Labs 加州艾尔 WLP001、White Labs 东海岸艾尔 WLP008、White Labs English Ale WLP002、White Labs London Ale WLP013、White Labs Essex Ale Yeast WLP022、White Labs Pacific Ale WLP041、White Labs San Diego 超级酵母 WLP090、White Labs Whitbread Ale WLP017、Brewferm Top、Mangrove Jack Burton Union 酵母、 Mangrove Jack 美国西海岸酵母,Mangrove Jack Workhorse 啤酒酵母、Coopers 纯啤酒酵母、Fermentis US-05、Fermentis Safale S-04、Fermentis Safbrew T-58、Real Brewers Yeast Lucky #7、Real Brewers Yeast The One、Muntons Premium Gold、Muntons Standard 酵母、东海岸 酵母东北艾尔 ECY29、Lallemand Nottingham、Lallemand Windsor(英国艾尔)、Wyeast 美国艾尔 1056、Wyeast 美国艾尔 II 1272、Wyeast 英国艾尔 1098、Wyeast 英国艾尔 II 1335、Wyeast Thames Valley Ale 1275、Wyeast Thames Valley II 1882- PC、Wyeast West Yorkshire Ale 1469、Wyeast Whitbread Ale 1099、Wyeast British Cask Ale 1026-PC、Wyeast English Special Bitter 1768-PC、Wyeast London Ale 1028、Wyeast London Ale III 1318、Wyeast London ESB Ale 1968、Wyeast Northwest Ale 1332 , Wyeast Ringwood Ale 1187, White Labs American Ale Yeast Blend WLP060, White Labs British Ale WLP005, White Labs Bedford British Ale WLP006, White Labs British Ale WLP005, White Labs Burton Ale WLP023, White Labs California Ale V WLP051, White Labs California Ale WLP001,白色实验室东海岸啤酒 WLP008,白色实验室英国啤酒 WLP002,白色实验室埃塞克斯啤酒酵母 WLP022,白色实验室法国啤酒 WLP072,白色实验室伦敦啤酒 WLP013,白色实验室太平洋啤酒 WLP041,白色实验室惠特布莱德啤酒 WLP017,Brewferm Top,东 Coast Yeast British Mild Ale ECY18、Coopers Pure Brewers' Yeast、Muntons Premium Gold、Muntons Standard 酵母、Mangrove Jack Newcastle Dark Ale 酵母、Lallemand CBC-1(木桶和瓶子调理)、Lallemand Nottingham、Lallemand Windsor(英国艾尔)、Fermentis Safale S-04、Fermentis US-05、Siebel Inst。 美国艾尔 BRY 96、Wyeast 美国小麦 1010、Wyeast 德国艾尔 1007、Wyeast Kolsch 2565、Wyeast Kolsch II 2575-PC、White Labs 比利时拉格 WLP815、White Labs 杜塞尔多夫 Alt WLP036、White Labs 欧洲艾尔 WLP011、White Labs 德国艾尔/Kblsch WLP029,东海岸酵母 Kolschbier ECY21,Mangrove Jack Workhorse 啤酒酵母,Siebel Inst。 Alt Ale BRY 144、Wyeast 美国啤酒 1056、Wyeast 美国啤酒 II 1272、Wyeast 英国啤酒 1098、Wyeast 英国啤酒 II 1335、Wyeast Denny's Favorite 50 1450、Wyeast English Special Bitter 1768- PC、Wyeast 爱尔兰啤酒 1084、Wyeast 伦敦啤酒 1028 , Wyeast London Ale III 1318, Wyeast London ESB Ale 1968, Wyeast Northwest Ale 1332, Wyeast Ringwood Ale 1187, Wyeast Thames Valley Ale 1275, Wyeast Thames Valley Ale II 1882-PC, Wyeast West Yorkshire Ale 1469, Wyeast Whitbread Ale 1099, 白色 Labs 美国啤酒酵母混合 WLP060、White Labs 贝德福德英国啤酒 WLP006、White Labs 英国啤酒 WLP005、White Labs 伯顿啤酒 WLP023、White Labs 加州啤酒 V WLP051、White Labs 加州啤酒 WLP001、White Labs 东海岸啤酒 WLP008、White Labs 东米德兰兹啤酒 艾尔啤酒 WLP039、White Labs English Ale WLP002、White Labs Essex Ale Yeast WLP022、White Labs Irish Ale WLP004、White Labs London Ale WLP013、White Labs Old Sonoma Ale WLP076、 White Labs Pacific Ale WLP041、White Labs Whitbread Ale WLP017、Coopers Pure Brewers’ Yeast、Fermentis US-05、Muntons Premium Gold、Muntons Standard Yeast、Fermentis Safale S-04、Lallemand Nottingham、Lallemand Windsor(英国艾尔啤酒)、Siebel Inst. 美国啤酒 BRY 96、White Labs 美国小麦小麦啤酒 320、White Labs 巴伐利亚小麦啤酒 351、White Labs 比利时威特啤酒 400、White Labs 比利时威特啤酒 II 410、White Labs Hefeweizen 啤酒 300、White Labs Hefeweizen IV 啤酒 380、酵母美国小麦 1010、Wyeast 巴伐利亚小麦 3638、Wyeast 巴伐利亚混合小麦 3056、Wyeast Belgian Ardennes 3522、Wyeast 比利时小麦 3942、Wyeast Belgian Witbier 3944、Wyeast 加拿大/比利时啤酒 3864-PC、Wyeast 禁果酵母 3463、Wyeast 德国小麦 Weiasthenstephan 3333 Weizen 3068、Siebel Institute Bavarian Weizen BRY 235、Fermentis Safbrew WB-06、Mangrove Jack 巴伐利亚小麦、Lallemand Munich(德国小麦啤酒)、Brewferm Blanche、Brewferm Lager、东海岸酵母比利时白 ECY 11、Augustiner、W-34/70 , 安德克斯, D254, RC212, BO213。 在一些实施例中,酵母是酿酒酵母菌株 WLPOOL [0300]在一些实施例中,与本文所述的经遗传修饰的细胞和方法一起使用的酵母菌株是葡萄酒酵母菌株。 在一些实施方案中,与本文所述的基因修饰细胞和方法一起使用的酵母菌株是红酒酵母菌株(用于生产红酒(例如,赤霞珠、西拉、黑皮诺等)的葡萄酒菌株)。使用的酵母菌株的实例 使用本文所述的基因修饰细胞和方法包括但不限于 Red Star Montrachet、EC-1118、Elegance、Red Star Cote des Blancs、Epernay II、Red Star Premier Cuvee、Red Star Pasteur Red、Red Star Pasteur Champagne、Fermentis BCS -103、D254、RC212、BO213 和 Fermentis VR44。 [0301] 方法 [0302] 本公开的方面涉及使用本文所述的任何基因修饰的酵母细胞生产发酵产品的方法。 还提供了使用本文所述的任何基因修饰的酵母细胞生产乙醇的方法。 在一些实施方案中,该方法还包括向发酵中添加重组和/或纯化的酶,例如糖苷酶或OMT酶,如本文所述。 [0303] 发酵过程利用了使用微生物将碳水化合物转化为酒精和二氧化碳的自然过程。 它是一种代谢过程,通过酶促作用在有机底物中产生化学变化。 在食品生产的背景下,发酵泛指任何过程,其中 微生物给食品或饮料带来理想的变化。 发酵条件和发酵的进行在本文中称为“发酵过程”。 [0304] 在一些方面,本公开涉及一种生产发酵产品(例如发酵饮料)的方法,包括在第一发酵过程中将本文所述的任何修饰细胞与包含至少一种可发酵糖的培养基接触,以产生发酵的 产品。 本文所用的“培养基”是指有利于发酵的液体,是指不抑制或阻止发酵过程的液体。 在一些实施例中,介质是水。 [0305] 同样如本文所用,术语“可发酵糖”是指可被微生物(例如本文所述的任何细胞)转化为醇和二氧化碳的碳水化合物。 在一些实施方案中,可发酵糖通过酶例如重组酶或表达酶的细胞转化为醇和二氧化碳。 可发酵糖的实例包括但不限于葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖。 [0306] 在一些实施例中,可发酵糖在糖源中提供。 所要求保护的方法中使用的糖源可能取决于,例如,发酵产品的类型和可发酵的糖。 糖源的例子包括但不限于麦芽汁、谷物/谷物、果汁(例如,葡萄汁和苹果汁/苹果酒)、蜂蜜、蔗糖、大米和曲。 可从中获得果汁的水果的实例包括但不限于葡萄、苹果、蓝莓、黑莓、覆盆子、醋栗、草莓、樱桃、梨、桃子、油桃、橙子、菠萝、芒果和百香果。 [0307] 在一些实施方案中,本文所述的修饰细胞在厌氧或半厌氧环境中培养。 厌氧细胞培养是指在没有可用氧气的环境中培养微生物(例如改良酵母细胞)的技术。 半厌氧细胞培养是指在氧气可用性有限的环境(例如已预充氧的培养基)中培养微生物(例如改良酵母细胞)的技术。 [0308]对本领域的普通技术人员而言显而易见的是,在一些情况下,可能需要加工糖源以使可发酵糖可用于发酵。 以啤酒生产为例,发酵饮料将谷物(谷物、大麦)煮沸或浸泡在水中,水合谷物并激活麦芽酶,将淀粉转化为可发酵糖,称为“糖化”。 如本文所用,术语“麦芽汁”是指糖化过程中产生的液体,其中含有 可发酵糖。 然后将麦芽汁暴露于发酵生物体(例如,本文所述的任何细胞),这允许发酵生物体的酶将麦芽汁中的糖转化为酒精和二氧化碳。 [0309] 在一些实施例中,谷物是发芽的、未发芽的或包含发芽和未发芽谷物的组合。 用于本文所述方法的谷物的实例包括但不限于大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦、高粱、小麦、乌麦和鸠麦。 [0310] 在生产清酒的例子中,糖源是大米,用曲霉菌(米曲霉)孵育,将大米淀粉转化为可发酵糖,从而产生曲。 然后将酒曲暴露于发酵生物体(例如本文所述的任何细胞),这允许发酵生物体的酶将酒曲中的糖转化为酒精和二氧化碳。 [0311] 在生产葡萄酒的例子中,葡萄被收获、捣碎(例如压碎)成包含皮、固体、果汁和种子的组合物。 由此产生的成分被称为“必须”。 葡萄汁可以与葡萄汁分离并发酵,或者可以发酵整个葡萄汁(即,带有皮、种子、固体)。 然后将葡萄汁或葡萄汁暴露于发酵生物体(例如本文所述的任何细胞),这允许发酵生物体的酶将葡萄汁或葡萄汁中的糖转化为酒精和二氧化碳。 [0312] 在一些实施例中,本文所述的方法涉及产生培养基,其可涉及加热或浸泡糖源,例如在水中。 在一些实施例中,水具有至少50摄氏度(50°C)的温度并且与糖源孵育一段时间。 在一些实施例中,水具有至少75℃的温度并且与糖源孵育一段时间。 在一些实施例中,水具有至少100℃的温度并且与糖源孵育一段时间。 优选地,在添加本文所述的任何细胞之前冷却培养基。 [0313] 在一些实施例中,本文所述的方法还包括在发酵过程中将至少一种(例如,1、2、3、4、5 种或更多种)啤酒花品种添加到例如培养基、麦芽汁中。 啤酒花是啤酒花植物 (Humulus lupulus) 的花朵,常用于发酵,为发酵产品赋予各种风味和香气。 啤酒花被认为除了花香、水果味和/或柑橘味和香气之外还赋予苦味,并且可以基于预期目的来表征。 例如,苦味啤酒花赋予发酵产品一定程度的苦味,因为啤酒花中存在 α 酸。 啤酒花花,而香气啤酒花具有较低的α酸含量,并为发酵产品提供理想的香气和风味。 [0314]是否将一种或多种啤酒花添加至培养基和/或添加啤酒花的麦芽汁和阶段可基于多种因素,例如啤酒花的预期目的。 例如,旨在赋予发酵产品苦味的啤酒花通常在麦芽汁的制备过程中添加,例如在麦芽汁的煮沸过程中。 在一些实施例中,将意图赋予发酵产品苦味的啤酒花添加到麦芽汁中并与麦芽汁一起煮沸一段时间,例如约15-60分钟。 相比之下,旨在赋予发酵产品所需香气的啤酒花通常比用于苦味的啤酒花晚加入。 在一些实施例中,旨在赋予发酵产品所需香气的啤酒花在煮沸结束时或在麦芽汁煮沸后加入(即,“干酒花”)。 在一些实施例中,可以在该方法期间多次(例如,至少两次、至少三次或更多次)添加一种或多种啤酒花。 [0315] 在一些实施例中,啤酒花以湿或干啤酒花的形式添加并且可以任选地与麦芽汁一起煮沸。 在一些实施例中,啤酒花是干啤酒花颗粒的形式。 在一些实施例中,将至少一种啤酒花添加到培养基中。 在一些实施例中,啤酒花是湿的(即未干燥的)。 在一些实施例中,啤酒花被干燥,并且可选地可以在使用前进一步加工。 在一些实施例中,啤酒花在发酵过程之前被添加到麦芽汁中。 在一些实施例中,啤酒花在麦芽汁中煮沸。 在一些实施例中,将啤酒花与麦芽汁一起煮沸,然后与麦芽汁一起冷却。 [0316] 许多啤酒花品种是本领域已知的并且可用于本文所述的方法中。 啤酒花品种的例子包括但不限于 Ahtanum、Amarillo、Apollo、Cascade、Centennial、Chinook、Citra、Cluster、Columbus、Crystal/Chrystal、Eroica、Galena、Glacier、Greenburg、Horizo​​n、Liberty、Millennium、Mosaic、Mount Hood、 雷尼尔山、纽波特、掘金、栅栏、桑蒂亚姆、锡姆科、斯特林、峰会、战斧、终极、先锋、战士、威拉米特、宙斯、海军上将、酿酒师的黄金、金条、挑战者、第一金、法格斯、戈尔丁、先驱、北下、北方 Brewer, Phoenix, Pilot, Pioneer, Progress, Target, Whitbread Golding 品种 (WGV), Hallertau, Hersbrucker, Saaz, Tettnang, Spalt, Feux-Coeur Francais, Galaxy, Green Bullet, Motueka, Nelson Sauvin, Pacific Gem, Pacific Jade, Pacifica、Pride of Ringwood、Riwaka、Southern Cross、Lublin、Magnum、Perle、Polnischer Lublin、Saphir、Satus、Select、Strisselspalt、Styrian Goldings、Tardif de Bourgogne、Tradition、Bravo、Calypso、Chelan、Comet、El Dorado、San Juan 红宝石 红色,十四行诗戈尔丁,超级方铅矿,Tillicum,Bramling Cross,Pilgrim,Hallertauer Herkules,Hallertauer Magnum,Hallertauer Taurus,Merkur,Opal,Smaragd,Halleratau Aroma,Kohatu,Rakau,Stella,Sticklebract,Summer Saaz,Super Alpha,Super Pride, Topaz、Wai-iti、Bor、Junga、Marynka、Premiant、Sladek、Styrian Atlas、Styrian Aurora、Styrian Bobek、Styrian Celeia、Sybilla Sorachi Ace、Hallertauer Mittelfrueh、Hallertauer Tradition、Tettnanger、Tahoma、Triple Pearl、Yakima Gold 和 Michigan 铜。 [0317] 在一些实施例中,包含至少一种可发酵糖的至少一种糖源的发酵过程可进行约1天至约31天。 在一些实施方案中,发酵过程进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、 14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天 , 31 天或更长时间。 在一些实施例中,一种或多种可发酵糖的发酵过程可在约4℃至约30℃的温度下进行。 在一些实施例中,一种或多种可发酵糖的发酵过程可在约8℃至约14℃或约18℃至约24℃的温度下进行。 在一些实施例中,一种或多种可发酵糖的发酵过程可在约 4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11 摄氏度、12摄氏度、13摄氏度、14摄氏度、15摄氏度、16摄氏度、17摄氏度、 [0318] 18°C、19°C、20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C 或 30 摄氏度。 [0319]在一些实施例中,发酵导致培养基中存在的可发酵糖的量减少。 在一些实施例中,可发酵糖量的减少发生在 1 天、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天、7 天、8 天、9 天、10 天、11 天、12 天、 13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天 , 30 天, 31 天, 或更长, 从发酵开始。 在一些实施例中,可发酵糖的量减少至少 5%、至少 10%、至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40 %,至少 45%,至少 50%,至少 55%,至少 60%,至少 65%,至少 70%,至少 75%,至少 80%,至少 85%,至少 90 %,至少 95%,至少 96%,至少 97%,至少 98%,至少 99%,至少 99.5%,至少 99.6%,至少 99.7%,至少 99.8%,至少 99.9 %,或 100%。 在一些实施方案中,相对于野生型酵母细胞在相同时间内发酵的可发酵糖的量,经修饰的细胞或多个细胞发酵相当或更多量的可发酵糖。 本文所述的方法可涉及至少一种额外的发酵过程。 这种额外的发酵方法可称为二次发酵过程(也称为“陈化”或“熟化”)。 如本领域普通技术人员所理解的,二次发酵通常涉及将发酵饮料转移到第二容器(例如,玻璃瓶、桶)中,发酵饮料在其中孵育一段时间。 在一些实施方案中,二次发酵进行10分钟至12个月的时间段。 在一些实施方案中,二次发酵进行 10 分钟、20 分钟、40 分钟、40 分钟、50 分钟、60 分钟(1 小时)、2 小时、3 小时、4 小时、5 小时、6 小时、7 小时、 8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时 , 1天, 2天, 3天, 4天, 5天, 6天, 7天, 8天, 9天, 10天, 11天, 12天, 13天, 14天, 2周, 3周, 4 周,5周,6周,7周,8周,9周,10周,11周,12周,13周,14周,3个月,4个月,5个月,6个月,7个月,8个月, 9 个月、10 个月、11 个月、12 个月或更长时间。 在一些实施例中,一种或多种可发酵糖的额外或二次发酵过程可在约4℃至约30℃的温度下进行。 在一些实施例中,一种或多种可发酵糖的额外或二次发酵过程可在约8℃至约14℃或约18℃至约24℃的温度下进行。 在一些实施例中,一种或多种可发酵糖的额外或二次发酵过程可在约4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C的温度下进行 摄氏度,11°C,12°C,13°C, [0320] 14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C 摄氏度,27°C, [0321] 28°C、29°C 或 30°C。 [0322] 对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是,额外或二次发酵过程的时间段和温度的选择将取决于诸如啤酒类型、所需啤酒的特性和所用酵母菌株等因素 在方法中。 [0323] 在一些实施例中,可在发酵过程之前或之后将一种或多种额外的风味成分添加到培养基中。 例子包括啤酒花油、啤酒花芳香剂、啤酒花提取物、啤酒花苦精和异构化啤酒花提取物。 [0324] 来自发酵过程的产物可在发酵过程中或从发酵产物中挥发和消散。 例如,使用本文所述的细胞在发酵过程中产生的挥发性酚可能会消散或蒸发,导致发酵产品中挥发性酚的水平降低。 本文所述的任何方法都可能涉及从发酵产品中去除一种或多种挥发性酚类。 在一些实施例中,去除或降低发酵产品中挥发性酚类的水平包括使发酵产品经受一个或多个额外的过程,例如过滤(例如,反渗透)、使发酵产品与澄清剂接触,或改变 挥发性酚类(例如,甲基化等化学修饰)。 [0325] 在一些实施例中,该方法包括使发酵产品经受过滤过程。 适用于从发酵产品中去除挥发性酚类的过滤方法是本领域已知的。 在一些实施方案中,过滤过程是反渗透,其涉及使发酵产物通过具有足以从发酵产物中除去挥发性酚的截留分子量的膜(过滤器)。 [0326] 在一些实施例中,该方法包括使发酵产品与澄清剂接触。 用于去除烟味的澄清剂的例子包括活性炭和环糊精聚合物。 用于除去挥发性酚类的另外的示例性方法和澄清剂是本领域已知的。 参见,例如,Mirabelli-Montan 等人。 分子 (2021) 26:1672。 [0327] 在一些实施例中,去除或降低发酵产品中挥发性酚类的水平包括使发酵产品经受酶促过程以修饰挥发性酚,例如使发酵产品与能够去除不想要的酚或将不想要的转化为不想要的酚的酶接触。 挥发酚转化为中性或更理想的形式。 在一些实施方案中,去除或降低发酵产品中挥发性酚类的水平包括使发酵产品与具有O-甲基转移酶活性的酶接触,例如本文所述的任何具有O-甲基转移酶活性的酶。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶是纯化的或分离的重组酶。 在一些实施方案中,具有O-甲基转移酶活性的酶由基因修饰的酵母细胞表达,该酵母细胞可以是与表达编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因相同的基因修饰细胞或第二基因修饰细胞。 在一些实施方案中,去除或降低发酵产品中挥发性酚类的水平涉及将发酵产品与表达具有O-甲基转移酶活性的酶的基因修饰细胞接触。 在一些实施方案中,首先将发酵产物与表达具有 O-甲基转移酶活性的酶的基因修饰细胞接触,然后将发酵产物与 具有 O-甲基转移酶活性的纯化或分离的重组酶。 在一些实施方案中,首先将发酵产物与表达具有糖苷酶活性的酶的基因修饰细胞接触,然后将发酵产物与纯化或分离的具有OMT活性的重组酶接触。 在一些实施方案中,首先将发酵产物与纯化或分离的具有糖苷酶活性的重组酶接触,然后将发酵产物与表达具有OMT活性的酶的遗传修饰细胞接触。 [0328] 各种精炼、过滤和陈化过程可能会在发酵后发生,之后将液体装瓶(例如,捕获并密封在容器中以供分配、储存或消费)。 本文所述的任何方法还可以包括对发酵产品进行蒸馏、巴氏灭菌和/或碳酸化。 在一些实施例中,该方法涉及对发酵产品进行碳酸化。 使发酵饮料碳酸化的方法是本领域已知的并且包括例如用气体(例如,二氧化碳、氮气)强制碳酸化、通过向发酵饮料添加另外的糖源以促进进一步发酵和产生碳来自然碳酸化 二氧化硫(例如,瓶子调节)。 [0329] 发酵产品 [0330]本公开的方面涉及通过本文公开的任何方法生产的发酵产品。 在一些实施例中,发酵产品是发酵饮料。 发酵饮料的例子包括但不限于啤酒、葡萄酒、清酒、蜂蜜酒、苹果酒、卡瓦酒、起泡酒(香槟)、康普茶、姜汁啤酒、开菲尔水。 在一些实施例中,饮料是啤酒。 在一些实施例中,饮料是酒。 在一些实施例中,饮料是起泡酒。 在一些实施例中,饮料是香槟。 在一些实施例中,饮料是清酒。 在一些实施例中,饮料是蜂蜜酒。 在一些实施例中,饮料是苹果酒。 在一些实施例中,饮料是硬苏打水。 在一些实施例中,饮料是酒柜。 [0331] 在一些实施例中,发酵产品是发酵食品。 发酵食品的例子包括但不限于发酵酸奶、豆豉、味噌、泡菜、酸菜、发酵香肠、面包和酱油。 [0332] 本公开的方面涉及在产品发酵过程中减少不希望的产品例如挥发性酚类的产生。 在一些实施方案中,糖苷酶和/或O-甲基转移酶在本文所述的基因修饰细胞中的表达导致不需要的产物的产生减少约5%, 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% , 95% 或更多相对于使用野生型酵母细胞或不表达酶的酵母细胞产生的不需要的产品 (例如, 挥发性酚类)。 [0333] 本公开的方面涉及减少发酵产品中不希望的产物如挥发性酚类的存在。 在一些实施例中,本文所述的基因修饰细胞中糖苷酶和/或O-甲基转移酶的表达导致发酵产物中不需要的产物减少约5%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更多 使用野生型酵母细胞或不表达酶的酵母细胞生产的发酵产品中的产物(例如,挥发性酚类)。 [0334] 在一些实施例中,本文所述的方法导致发酵产品中一种或多种挥发性酚的水平降低。 挥发性酚的非限制性实例包括但不限于愈创木酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、苯酚、4-甲基愈创木酚、丁香酚和/或4-甲基丁香酚。 [0335] 如本文所述,挥发性酚类的产生可以赋予发酵产品类似烟熏的香气。 在一些实施例中,挥发性酚类的效价小于100pg/L ¹ , 例如小于 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9.5, 9.0, 8.5, 8.0 , 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 皮克·升 ¹ 或更少。 在一些实施方案中,发酵产品中挥发性酚类的效价降低约 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更多,相对于使用野生型酵母生产的发酵产品中不需要的产品(例如,挥发性酚)的水平 不表达酶(例如,糖苷酶和/或 O-甲基转移酶)的细胞或酵母细胞。 在一些实施例中,挥发性酚的效价低于人类检测的限度。 [0336] 测量挥发性酚类的效价/水平的方法对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。 在一些实施方案中,使用气相色谱质谱法(GC/MS)测量非挥发性酚苷和/或挥发性酚的效价/水平。 在一些实施方案中,非挥发性酚苷和/或挥发性酚的效价/水平使用液相色谱质谱法(LC/MS)测量。 在一些实施例中,非挥发性酚苷和/或挥发性酚类的效价/水平使用感官小组评估,包括例如人类味觉测试员。 在一些实施例中,发酵饮料含有0.1%至30%的体积酒精(也称为“ABV”、“abv”或“alc/vol”)。 在一些实施例中,发酵饮料含有按体积计约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.07%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、 1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11% , 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28 %、29%、30% 或更高。 在一些实施例中,发酵饮料是不含酒精的(例如,具有小于0.5%体积的酒精)。 [0337] 套件 [0338] 本公开的方面还提供了使用基因修饰的酵母细胞的试剂盒,例如用于生产发酵饮料、发酵产品或乙醇。 在一些实施方案中,试剂盒含有修饰的细胞,其含有编码具有糖苷酶活性的酶的异源基因和/或编码具有O-甲基转移酶活性的酶的异源基因。 [0339] 在一些实施例中,套件用于生产发酵饮料。 在一些实施例中,该套件用于生产啤酒。 在一些实施例中,该套件用于生产葡萄酒。 在一些实施例中,试剂盒用于清酒的生产。 在一些实施例中,该套件用于生产蜂蜜酒。 在一些实施例中,该套件用于生产苹果酒。 [0340] 试剂盒还可以包含用于本文所述的任何方法或用于本文所述的任何细胞的其他组分。 例如,在一些实施例中,试剂盒可含有谷物、水、麦芽汁、葡萄汁、酵母、啤酒花、果汁或其他糖源。 在一些实施例中,试剂盒可包含一种或多种可发酵糖。 在一些实施例中,试剂盒可包含一种或多种额外的试剂、成分或组分。 [0341] 执行本文所述方法的说明也可包括在本文所述的试剂盒中。 [0342] 可以组织试剂盒以指示包含本文所述的任何修饰细胞的单次使用组合物。 例如,单次使用的组合物(例如,待使用的量)可以是包装的组合物(例如,修饰的细胞),例如包装的(例如,包含在小包中)粉末、小瓶、安瓿、培养管、片剂、囊片、胶囊 ,或装有液体的小袋。 [0343] 组合物(例如修饰的细胞)可以以干燥、冻干、冷冻或液体形式提供。 在一些实施例中,修饰细胞作为琼脂上的菌落提供 中等的。 在一些实施例中,修饰的细胞以可以直接接种到培养基中的起子培养物的形式提供。 当试剂或组分以干燥形式提供时,重构通常是通过添加溶剂,例如介质。 溶剂可以以另一种包装方式提供并且可以由本领域技术人员选择。 [0344] 许多包装或试剂盒是本领域技术人员已知的,用于分配组合物(例如,修饰的细胞)。 在某些实施例中,包装是贴有标签的泡罩包装、刻度盘分配器包装、管、包、鼓或瓶。 [0345] 本文所述的任何试剂盒还可包含一个或多个用于执行本文所述方法的器皿,例如玻璃瓶或桶。 [0346] 一般技术 [0347]除非另有说明,本公开主题的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术,这些在本领域的技术范围内。 此类技术在文献中得到了充分解释,例如但不限于,分子克隆:实验室手册,J. Sambrook 等人,编辑,第四版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约, 2012; 寡核苷酸合成 (M. J. Gait, ed., 1984); 分子生物学方法,Humana 出版社; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis 编辑,1998)学术出版社; 动物细胞培养(R. I. Freshney, ed., 1987); 细胞和组织培养简介(J. P. Mather 和 P. E. Roberts,1998)Plenum Press; 细胞和组织培养:实验室程序(A. Doyle、J. B. Griffiths 和 D. G. Newell 编辑,1993-8)J. Wiley and Sons; 酶学方法(Academic Press, Inc.); 实验免疫学手册(D. M. Weir 和 C. C. Blackwell,编辑); 哺乳动物细胞的基因转移载体(J. M. Miller 和 M. P. Calos,编,1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR:聚合酶链式反应,(Mullis 等人,编辑,1994 年); Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 等人,编辑,1991); 分子生物学中的简短协议(Wiley 和 Sons,1999)。 [0348] 等价物和范围 [0349] 应当理解,本公开不限于本文明确描述的任何或所有特定实施例,并且因此当然可以变化。 这也是 应当理解,本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,并不旨在进行限制。 [0350] 除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。 尽管与本文所述那些相似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或测试,但现在描述优选的方法和材料。 [0351] 引用本公开中引用的所有出版物和专利以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。 所有此类出版物和专利都通过引用并入本文,就好像每个单独的出版物或专利都具体且单独地指示通过引用并入一样。 这种通过引用的方式并入明确限于引用的出版物和专利中描述的方法和/或材料,并且不扩展到引用的出版物和专利中的任何词典定义(即,引用的出版物和专利中的任何词典定义不是 同样在公开中明确重复的不应被视为如此并且不应被理解为定义随附权利要求中出现的任何术语)。 如果任何并入的参考文献与本公开内容之间存在冲突,则以本公开内容为准。 此外,落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施例可被明确排除在任何一项或多项权利要求之外。 因为这样的实施例被认为是本领域的普通技术人员已知的,所以即使排除没有在本文中明确阐述,它们也可以被排除。 本公开的任何特定实施例可以出于任何原因从任何权利要求中排除,无论是否与现有技术的存在相关。 [0352] 任何出版物的引用都是为了它在申请日之前的披露,不应被解释为承认本披露无权凭借在先披露而先于此类出版物。 此外,提供的发布日期可能与实际发布日期不同,可能需要独立确认。 [0353]如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的,本文描述和图示的每个单独实施例具有分立的组件和特征,这些组件和特征可以容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合而不背离 从本公开的范围或精神。 任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。 在权利要求中,诸如“a”、“an”和“the”的冠词可能表示一个或多个,除非另有说明或从上下文中明显看出。 无论此处使用何种性别代词(例如,男性、女性、中性、其他等),代词均应解释为性别中性(即,解释为平等地指代所有性别),无论隐含的性别如何,除非上下文 明确表示或另有要求。 除非上下文明确指出或另有要求,否则本文中无论何处使用,以单数形式使用的词语包括复数形式,以复数形式使用的词语包括单数形式。 如果一个、多个或所有组成员出现、受雇于给定产品或过程或以其他方式与给定产品或过程相关,则组的一个或多个成员之间包含“或”的声明或描述被视为满足,除非另有说明 相反或从上下文中可以明显看出。 本公开包括这样的实施例,其中该组中恰好有一个成员存在于给定的产品或过程中、被用于或以其他方式与给定的产品或过程相关。 本公开包括其中多于一个或所有组成员存在于、受雇于给定产品或过程或以其他方式与给定产品或过程相关的实施例。 [0354] 此外,本公开包括所有变化、组合和排列,其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语引入到另一权利要求中。 例如,可以修改从属于另一权利要求的任何权利要求,以包括在从属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。 在元素以列表形式呈现的情况下(例如,以马库什组格式),元素的每个子组也被公开,并且任何元素都可以从组中删除。 应当理解,一般而言,在本公开或本公开的方面被称为包括特定元素和/或特征的情况下,本公开的某些实施例或本公开的方面由或基本上由以下组成: 这些元素和/或特征。 为了简单起见,那些实施例在本文中没有具体阐述。 还应注意的是,术语“包括”和“包含”旨在是开放的并且允许包括额外的元素或步骤。 在给出范围的情况下,端点包括在这样的范围内,除非另有说明。 此外,除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中可以明显看出,表示为范围的值可以采用本公开的不同实施例中所述范围内的任何特定值或子范围,以 范围下限单位的十分之一,除非上下文另有明确规定。 [0355] 仅使用常规实验,本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的特定实施例的许多等同物。 这 此处描述的本实施例的范围并不旨在限于以上描述,而是如所附权利要求中所阐述的那样。 本领域的普通技术人员将理解,在不脱离如所附权利要求所限定的本公开的精神或范围的情况下,可以对本描述进行各种改变和修改。 [0356] 例子 [0357] 示例 1 [0358] 糖苷酶的表达以从糖缀合物中释放挥发性酚 [0359]暴露在烟雾中的葡萄和啤酒花会吸收木材燃烧产生的挥发性酚类物质,并将其代谢成不挥发性的酚苷。 随着时间的推移,挥发性酚从非挥发性酚糖苷中释放出来,在所得发酵产品中产生烟熏异味(图 1)。 本公开涉及用于在发酵之前、期间或之后去除挥发性酚类的方法和组合物,以减少或消除含有已经暴露于烟雾的葡萄和/或啤酒花的发酵产品中的烟雾污染。 [0360] 为了从其非挥发性酚糖苷前体中释放游离的挥发性酚,构建了基因工程酿酒酵母菌株以表达水解糖苷键的糖苷酶。 可以分泌糖苷酶以使糖苷能够在细胞外水解,因为转运到细胞中可能是有限的。 糖苷酶在自然界中广泛存在,并且各自具有不同的底物特异性和催化活性。 S. cerevisiae 编码多种糖苷酶,但已知分泌的糖苷酶很少,并且没有一种糖苷酶具有对烟雾污染底物的活性。 [0361] 先前已做出努力以工程化酵母中的糖苷酶表达((Kaya 等人,Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79:51-60),(Adam 等人,Yeast. (1995) 11:395) -406), (Sanchez-Torres, et al., J. Agric. Food Chem. (1998) 46: 354-360), (Larue, et al., Biotechnol. Biofuels. (2016) 9: 52))。 曼萨纳雷斯等。 改造了葡萄酒酵母以分泌棘孢曲霉 rhaA 基因,编码 α-L-鼠李糖苷酶(Manzanares 等人,Appl. Environ. Microbiol. (2003) 69: 7558-7562)。 他们设计了第二个菌株来表达 Candida molischiana 基因 bgln,该基因编码一种 β-D-葡萄糖苷酶。 用这些菌株进行的微酿造试验表明,葡萄酒中单萜糖苷水解和游离单萜含量增加。 石川等。 在毕赤酵母中表达米曲霉 RhaA 基因,编码 α-L-鼠李糖苷酶(Ishikawa, et al., J. Biosci. Bioeng. (2017) 124: 630-634)。 当与酿酒酵母 a 因子分泌信号肽融合时, 酶被分泌到上清液中。 然后纯化和表征分泌的酶。 其他小组已经在酵母中设计了 β-葡糖苷酶表达以用于其他应用(异黄酮生产(Kaya 等人,Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79:51-60)、纤维二糖利用((Eriksen 等人,Microb . Cell Fact. (2013) 12: 61), (Hu, et al., Front. Microbiol. (2016) 7: 241), (Galazka, et al., Science. (2010 330: 84-86)), 纤维素降解(Oh, et al., FEMS Yeast Res. (2020) 20)。但是,这些工作都没有在减轻烟雾污染的背景下完成。 [0362] 为了鉴定对酚糖苷底物具有高活性的糖苷酶,在酵母细胞中表达和筛选糖苷酶候选物,例如葡萄糖苷酶(去除葡萄糖)和鼠李糖苷酶(去除鼠李糖)。 结合几种分泌信号肽(例如 SED1、MATa、MATa 前序、TFP5-1、TFP1-4、TFP10、TFP23、SUC2、SRE1 和 KSH1)对糖苷酶进行测试,以确定显示的糖苷酶分泌信号对 在酿酒酵母和酿造菌株中表达的最大糖苷水解活性。 表 1 显示了编码糖苷酶的示例性基因,这些酶将针对糖苷水解活性进行筛选。 [0363] 表 1. 编码糖苷酶的基因 [0364] 一旦游离,可以使用过滤过程(例如,反渗透)、与澄清剂接触或进一步修饰(例如,通过酶促修饰)来去除挥发性酚类。 [0365] O-甲基转移酶的表达将酚羟基官能团转化为甲氧基官能团 [0366] 在通过非挥发性酚糖苷的水解释放出游离挥发性酚之后,游离挥发性酚可以被化学修饰以不再为发酵产品提供与烟熏相关的感官特征。 酚类化合物的羟基的修饰可以改变它们的感官贡献 O-甲基转移酶 (OMT) 酶被评估在糖苷酶过表达菌株中催化苯酚甲基化的能力。 [0367]挥发性酚的甲基化可以极大地改善烟熏发酵产品的香气特征。 将筛选来自多种植物物种的 OMT,以确定对愈创木酚和间甲酚的甲基化具有高活性的 OMT。 表 2 显示了编码 OMT 酶的基因,用于评估愈创木酚和间甲酚甲基化活性。 表 2. 编码 OMT 酶的基因 [0368] 示例 2 [0369] 5 种主要烟雾污染酚的 O-甲基转移酶活性筛选 [0370] 酵母菌株(S. cerevisiae,菌株 CEN.PK2-1D)用编码 O-甲基转移酶 (OMT) 的筛选质粒转化,该质粒来自五种生物(白野菜、番茄、玫瑰、罗勒和枇杷)中的一种,由 酵母 GALI 启动子。 用半乳糖诱导后 24 小时,通过离心沉淀 10 mL 酵母培养物,然后悬浮在 pH 7.4 的 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。 通过玻璃珠辅助的机械破碎裂解酵母细胞,并通过离心澄清所得裂解物。 通过在 280 nm 处测量吸光度来估计浓度,从而对总蛋白质含量进行归一化。 [0371] 为了测量 OMT 酶对烟雾污染酚的活性,在 96 孔深孔板中的每个 500 pL 体外反应中加入 pH 7.4 的 PBS、50 pL 酵母裂解物、2 mM S-腺苷甲硫氨酸和 1 mM 烟雾 污染苯酚(4-甲基愈创木酚、愈创木酚、邻甲酚、间甲酚或对甲酚)。 反应在室温下进行2小时,然后用乙酸乙酯萃取。 [0372] 乙酸乙酯提取物通过气相色谱-质谱法 (GC-MS) 使用线性升温在 10 分钟内从 60 °C 升至 150 °C 进行分析。 每种苯酚底物和甲醚产物的保留时间和裂解均通过权威标准进行验证。 本实验通过计算每个反应的转化率来定性比较酶活性,转化率定义为甲醚产物的峰面积除以酚类底物的峰面积。 所有五个的可测量转换 观察到五种酶中的三种(玫瑰、罗勒和枇杷)产生的烟雾污染酚(图 2)。 这些数据表明,玫瑰、罗​​勒和枇杷 OMT 酶中的每一种都能够将烟味酚转化为甲基化挥发性酚,从而去除烟味感官音符。 5 种主要烟味单糖苷的 fl-葡萄糖苷酶活性筛选 [0373] 用含有由酵母 GALI 启动子驱动的 P-葡萄糖苷酶的筛选质粒转化酵母菌株(酿酒酵母菌株 CEN.PK2-1D)。 总共筛选了五种 P-葡糖苷酶的抗烟味单葡糖苷底物活性。 在含半乳糖的培养基中诱导需氧蛋白表达 48 小时后,制备含有活性 P-葡萄糖苷酶的酵母菌株的裂解物。 将裂解物与 0.1 mg/mL 单葡糖苷底物在 pH 3.8 的水性缓冲液中结合,以模拟葡萄酒/葡萄汁的酸性环境。 将单葡糖苷酶促转化为酚类允许在室温下不搅拌进行 9 天,以模拟葡萄酒发酵的条件。 然后将含有单葡糖苷反应物和酚类产物的裂解物混合物稀释到 5% 乙腈中,并通过 LC/MS 进行分析。 这些数据表明,AoBgll 和 AnBgll 两种葡糖苷酶都能够将非挥发性酚类葡糖苷(苯酚与葡萄糖结合)转化为挥发性酚类(图 3)。 [0374] 用 AoBgll [t-葡萄糖苷酶筛选分泌信号肽 [0375]酵母菌株(酿酒酵母,菌株 CEN.PK2-1D)用含有来自米曲霉 (AoBgll) 的 P-葡萄糖苷酶的筛选质粒转化,并具有由酵母 GALI 启动子驱动的 5' 分泌信号肽。 总共筛选了 12 种分泌信号肽促进 AoBgl1 转运到细胞外空间的能力(图 4A-4B)。 在含半乳糖的培养基中诱导需氧蛋白表达 48 小时后,从培养物上清液中浓缩分泌的蛋白。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离浓缩的分泌蛋白,并通过银染显现。 分泌型 P-葡萄糖苷酶的预期分子量在 90-100 kDa 之间,具体取决于分泌信号肽的特性。 这些数据表明,当酶与分泌肽 TFP5-1、SED1、MATaPRE、MATa(A9D;A20T)、SRL1、KSH1 或 MATa(A9D;A20T;L42S) 融合时,转基因酵母细胞能够分泌 AoBgll。 在产品相关浓度下,AoBgll 对 5 种主要烟味单葡糖苷的活性 [0376] 酵母菌株(酿酒酵母,菌株 CEN.PK2-1D)用筛选质粒转化,该质粒含有来自米曲霉 (AoBgl1) 的 P-葡萄糖苷酶,由酵母 GALI 启动子驱动。 然后在含半乳糖的培养基中诱导需氧蛋白表达 48 小时后,制备含有活性 AoBgl1 酶的酵母菌株的裂解物。 将裂解物与 500 pg/L 单葡糖苷底物在 pH 3.8 的水性缓冲液中结合,以模拟葡萄酒/葡萄汁的酸性环境。 500 pg/L 接近已报告的受污染葡萄或果汁中烟污染糖苷的浓度。 将单葡糖苷酶促转化为酚类允许在室温下不搅拌进行 9 天,以模拟葡萄酒发酵的条件。 包括仅缓冲液对照以解释糖苷键的自发水解。 然后通过有机萃取将酚类产物从含水裂解物基质中分离出来,通过 GC/MS 进行分析,并使用可信标准进行定量(图 5)。 这些数据表明,AoBgll 在发酵产物相关浓度 (500 pg/L) 下将五种非挥发性酚类糖苷中的每一种转化为相应的挥发性酚类。 [0377] 在发酵产物相关浓度下纯化的 [i-葡萄糖苷酶对 5 种主要烟味单葡糖苷的活性 [0378] 来自杏仁的重组 P-葡萄糖苷酶以纯净的冻干粉形式购买,并在水溶液中重构。 酶溶液在 pH 3.8 的水性缓冲液中用 500 pg/L 单葡糖苷底物稀释,以模拟葡萄酒/葡萄汁的酸性环境。 500 pg/L 接近已报告的受污染葡萄或果汁中烟污染糖苷的浓度。 将单葡糖苷酶促转化为酚类允许在室温下不搅拌进行 9 天,以模拟葡萄酒发酵的条件。 包括仅缓冲液对照以解释糖苷键的自发水解。 然后通过有机萃取将酚类产物从含水裂解物基质中分离出来,通过 GC/MS 进行分析,并使用可信标准进行定量(图 6)。 这些数据表明添加的纯化 P-葡糖苷酶能够将非挥发性酚类葡糖苷转化为挥发性酚类。 [0379] 示例 3 [0380] 使用表达选定 O-甲基转移酶的菌株进行小规模葡萄酒发酵 [0381] 一种称为 D254 的葡萄酒酵母菌株,通常用于酿造西拉和黑皮诺等红酒,被设计为组成型表达 O-甲基转移酶 来自罗勒(来自罗勒的 EOMT1)或枇杷(Eriobotrya japonica,EjOMTl)的酶,分别对应于工程菌株 yl375 和 yl376。 将工程菌株 yl375 和 yl376 以及亲本菌株 D254 接种到含有 500 pg/L 挥发性酚底物的黑皮诺葡萄汁中。 允许厌氧葡萄酒发酵在 32°C 下进行五天。 然后从细胞外葡萄酒基质中提取挥发性酚底物和酚甲醚产物,通过 GC/MS 进行分析,并使用可靠的标准品进行定量。 [0382]根据这些数据,在葡萄酒发酵过程中,表达 O-甲基转移酶(表 3)的转基因酵母细胞能够消耗挥发性烟雾污染酚。 具体而言,工程酵母菌株 yl375(表达来自罗勒的 EjOMT1)和 yl376(表达来自枇杷的 EOMT1)分别将挥发性酚类愈创木酚和 4-甲基愈创木酚转化为酚类甲基醚藜芦醇和 4-甲基藜芦醇(图 7 和图 8)。 此外,工程酵母菌株 yl376 将挥发性酚类邻甲酚、对甲酚和间甲酚部分转化为酚类甲基醚 2-甲基苯甲醚、3-甲基苯甲醚和 4-甲基苯甲醚,部分转化为未知的副产物 (图7和图8)。 [0383] 表 3. 实施例 3 中使用的菌株 使用掺入 fi-葡萄糖苷酶和表达 OMT 的菌株进行小规模葡萄酒发酵 [0384] 一种被称为 D254 的葡萄酒酵母菌株,通常用于酿造西拉和黑比诺等红酒,被设计为组成型表达一种 O-甲基转移酶,该酶来源于罗勒(来自罗勒的 EOMT1)或枇杷(Eriobotrya japonica,EjOMTl), 分别对应于工程菌株yl375和yl376。 将工程菌株 yl375 和 yl376 与亲本菌株 D254 一起接种到含有 500 pg/L 非挥发性酚类葡萄糖苷底物(4-甲基愈创木酚葡萄糖苷)和 1.5 pg/mL 纯化的来自杏仁的 P-葡萄糖苷酶的黑皮诺葡萄汁中。 允许厌氧葡萄酒发酵在 32°C 下进行五天。 然后从细胞外葡萄酒基质中提取酚类甲基醚产物(4-甲基藜芦醇),通过 GC/MS 进行分析,并使用真实标准进行定量(图 9)。 [0385] 这些数据表明,两种酶促转化(非挥发性糖苷到挥发性酚类和挥发性酚类到酚类甲基醚)成功地进行了第一种酶(葡萄糖苷酶)外源提供和第二种酶(OMT)在葡萄酒酵母中表达。 具体来说,在葡萄酒发酵过程中,添加的纯化 P-葡萄糖苷酶将酚类葡萄糖苷转化为酚类物质。 这些酚随后通过表达 OMT 酶的转基因酵母细胞转化为无烟酚甲醚。 两个表达的 OMT(表达来自罗勒的 EjOMT1 的菌株 yl375 和表达来自枇杷的 EOMT1 的菌株 yl376)表现出烟雾污染 4-甲基愈创木酚向 4-甲基藜芦醇的可检测转化。 [0386] 使用同时表达 OMT 和分泌性 f>- 葡糖苷酶的菌株进行小规模葡萄酒发酵 [0387] 一种称为 D254 的葡萄酒酵母菌株,通常用于酿造西拉和黑皮诺等红酒,被设计为组成型表达罗勒或枇杷 OMT 以及与分泌信号肽(SED1 或 TFP5-1)融合的 AoBgll,对应 工程菌株 yl386(表达 EOMT1 和 AoBgll(N:TFP5-l))、yl387(表达 EOMT1 和 AoBgll(N:SEDl))、y 1388(表达 EjOMTl 和 AoBgll(N:TFP5-l))和 yl389( 表达 EjOMTl 和 AoBgll(N:SEDl))(见表 3)。 将工程菌株 yl386、yl387、y 1388 和 yl389 与亲本菌株 D254 一起接种到含有 500 pg/L 非挥发性酚类葡萄糖苷底物(4-甲基愈创木酚葡萄糖苷)的黑皮诺葡萄汁中。 允许厌氧葡萄酒发酵在 32°C 下进行五天。 两个酶促步骤的苯酚甲醚产物(4- 然后从细胞外葡萄酒基质中提取甲基藜芦醇),通过 GC/MS 进行分析,并使用可靠的标准品进行定量(图 10)。 [0388] 这些数据表明,用葡萄酒酵母中表达的两种酶(葡糖苷酶和 OMT)成功地进行了两种所需的酶促转化(非挥发性糖苷到挥发性酚和挥发性酚到酚甲醚)。 具体来说,在葡萄酒发酵过程中,工程酵母菌株 yl386、yl387、y 1388 和 yl389 从 4-甲基愈创木酚葡糖苷中产生挥发性酚类甲基醚 4-甲基藜芦醇。