技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测技术领域，更具体地说，涉及一种高灵敏非洲猪瘟病毒核酸检测方法的建立。 背景技术 [0002]非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一种猪的急性、出血性传染病，因其严重危害养猪业，且无有效的疫苗防治，世界动物卫生组织将其列为法定上报传染病，我国列为一类传染病，非洲猪瘟也是作为13种重点防范的外来动物疫病之一。 [0003]目前，国外对非洲猪瘟诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链反应等；其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高和特异性不强，动物接种试验不安全；实验室诊断ASFV的常规方法是在猪骨髓(PBM)细胞培养中进行病毒分离(VI)，尽管该方法可靠且敏感，但该检测所需时间过长(6天)；聚合酶链反应(PCR)是一种替代VI的快速检测ASFV的方法，特别适用于筛选质量较差或降解的带有不可恢复病毒的样本；PCR技术使ASFV的诊断能够在收样后数小时内完成，缩短了诊断时间；PCR检测非洲猪瘟病毒的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等特点。 [0004]因此亟需建立一种新的、高效的、特异性强、灵敏度高、重复性好的检验方法。 发明内容 [0005]1.要解决的技术问题 [0006]针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高灵敏非洲猪瘟病毒核酸检测方法的建立，可以实现通过巢式荧光定量PCR技术，准确诊断、早期筛查和高效检测出非洲猪瘟病毒，根据非洲猪瘟病毒vp72基因设计的引物和探针、建立荧光定量探针法PCR反应体系、将配制好的反应体系放入荧光定量PCR扩增仪中进行荧光定量PCR扩增，设计探针和内外2对引物，经过一次PCR扩增，利用外引物、外引物、内引物和内引物得到四种导向的qPCR扩增产物,从而使巢式PCR内外部引物和特异性探针的设计能够提高检测结果的准确性和特异性，又因其扩增效率显著提高增加了检测的灵敏性，从而有效的减少了检测的时间，提高了检测效率。 [0007]2.技术方案 [0008]为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。 [0009]一种高灵敏非洲猪瘟病毒核酸检测方法的建立，包括如下步骤： [0010]S1.根据非洲猪瘟病毒vp72基因设计引物和探针； [0011]S2.建立荧光定量探针法PCR反应体系； [0012]S3.将配制好的反应体系放入荧光定量PCR扩增仪中进行荧光定量PCR扩增； [0013]S4.观察CT值并分析结果； [0014]S5.根据CT值绘制标准曲线； [0015]通过巢式荧光定量PCR技术，准确诊断、早期筛查和高效检测出非洲猪瘟病毒，根据非洲猪瘟病毒vp72基因设计的引物和探针、建立荧光定量探针法PCR反应体系、将配制好的反应体系放入荧光定量PCR扩增仪中进行荧光定量PCR扩增，设计探针和内外2对引物，经过一次PCR扩增，利用外引物、外引物、内引物和内引物得到四种导向的qPCR扩增产物,从而使巢式PCR内外部引物和特异性探针的设计能够提高检测结果的准确性和特异性，又因其扩增效率显著提高增加了检测的灵敏性，从而有效的减少了检测的时间，提高了检测效率。 [0016]进一步的，所述荧光定量探针法PCR反应体系及条件具体如下:设置内外引物分别为IF 0.3μl、IR 0.3μl、OF 0.3μl、OR 0.3μl和探针P 0.3μl，再利用荧光定量PCR仪进行扩增。 [0017]进一步的，所述步骤1中探针5'端标记荧光基团，探针3'端标记淬灭基团。 [0018]进一步的，所述步骤S2中扩增用的模板为：非洲猪瘟阳性质粒10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝/ul，阴性对照，所述扩增模板设置为4μl。 [0019]进一步的，所述步骤S3中荧光定量PCR扩增仪采用巢式荧光定量PCR技术原理，通过巢式荧光定量PCR技术在荧光定量探针法PCR技术的基础上与巢式PCR相结合，从而使检测方法更有保障。 [0020]进一步的，所述荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，47℃收集FAM荧光20sec，72℃延伸20sec，40个循环。 [0021]3.有益效果 [0022]相比于现有技术，本发明的优点在于： [0023](1)本方案可以实现通过巢式荧光定量PCR技术，准确诊断、早期筛查和高效检测出非洲猪瘟病毒，根据非洲猪瘟病毒vp72基因设计的引物和探针、建立荧光定量探针法PCR反应体系、将配制好的反应体系放入荧光定量PCR扩增仪中进行荧光定量PCR扩增，设计探针和内外2对引物，经过一次PCR扩增，利用外引物、外引物、内引物和内引物得到四种导向的qPCR扩增产物,从而使巢式PCR内外部引物和特异性探针的设计能够提高检测结果的准确性和特异性，又因其扩增效率显著提高增加了检测的灵敏性，从而有效的减少了检测的时间，提高了检测效率。 附图说明 [0024]图1为本发明的PCR反应体系表示意图； [0025]图2为本发明的荧光定量PCR扩增程序表示意图； [0026]图3为本发明的CT值阴性对照表示意图； [0027]图4为本发明的CT值标准曲线示意图。 具体实施方式 [0028]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0029]实施例1： [0030]请参阅图1-4，一种高灵敏非洲猪瘟病毒核酸检测方法的建立，包括如下步骤： [0031]S1.根据非洲猪瘟病毒vp72基因设计引物和探针； [0032]S2.建立荧光定量探针法PCR反应体系； [0033]S3.将配制好的反应体系放入荧光定量PCR扩增仪中进行荧光定量PCR扩增； [0034]S4.观察CT值并分析结果； [0035]S5.根据CT值绘制标准曲线； [0036]通过设计探针和内外2对引物，只需经过一次PCR扩增，利用外引物、外引物、内引物和内引物得到四种导向的qPCR扩增产物。 [0037]请继续参阅图1，荧光定量探针法PCR反应体系及条件具体如下:设置内外引物分别为IF 0.3μl、IR 0.3μl、OF 0.3μl、OR 0.3μl和探针P 0.3μl，再利用PCR仪进行扩增。 [0038]步骤1中探针5'端标记荧光基团，探针3'端标记淬灭基团。 [0039]请继续参阅图1和图3，步骤S2中扩增用的模板为：非洲猪瘟阳性质粒10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝/ul，阴性对照，扩增模板设置为4μl。 [0040]步骤S3中荧光定量PCR扩增仪采用巢式荧光定量PCR技术原理，通过巢式荧光定量PCR技术在荧光定量探针法PCR技术的基础上与巢式PCR相结合，从而使检测方法更有保障。 [0041]请继续参阅图2，荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，47℃收集FAM荧光20sec，72℃延伸20sec，40个循环。 [0042]本发明通过根据非洲猪瘟病毒vp72基因设计的引物和探针、建立荧光定量探针法PCR反应体系、将配制好的反应体系放入荧光定量PCR扩增仪中进行荧光定量PCR扩增，通过设计探针和内外2对引物，经过一次PCR扩增，利用外引物、外引物、内引物和内引物得到四种导向的qPCR扩增产物,从而使巢式PCR内外部引物和特异性探针的设计能够提高检测结果的准确性和特异性，又因其扩增效率显著提高增加了检测的灵敏性，能够高效检测非洲猪瘟病毒，适用于非洲猪瘟病毒的准确诊断和早期筛查。 [0043]以上，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。