(摘自产权组织) 描述 发明名称:基因工程活菌及其构建方法 [0001] 参考序列表 [0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表,其全部内容通过引用并入本文。 发明领域 [0003] 本发明涉及基因工程活细菌及其构建方法。 特别地,本发明涉及提供可有效治疗和/或预防疾病或病症的基因工程活细菌。 背景 [0004] 天然存在或人工改造的细菌已被用作疫苗或药物来对抗各种疾病,例如传染病和最近的癌症。 除了功效,将细菌用于医疗目的最重要的问题是安全性。 出于这个原因,已经做出许多努力来杀死感兴趣的细菌或对细菌进行基因改造,使它们获得在病灶中优先或选择性生长的能力。 [0005] 非常需要一种新型细菌,用于有效治疗疾病或改善状况,同时确保生物安全。 [0006] 鉴于前述背景,在某些示例性实施例中,目的是提供替代细菌以克服现有技术的至少一个缺点。 [0007] 一方面,提供了一种基因工程活细菌,其包含至少一个编码医学效应子的效应子基因; 以及至少一种缩短细菌寿命的基因修饰,使得细菌在施用于受试者后,在足以允许医疗效应器发挥至少一种医疗作用的时间内存活,并在足以使发病机制最小化的时间内死亡 到主题。 在一些实施例中,细菌源自强毒株。 [0008] 在一些示例性实施方案中,医学效应物是可以引发至少一种足以治疗目标疾病或病症的对受试者的免疫反应的抗原。 [0009] 在一些示例性实施方案中,医学效应物是可以在受试者中引发至少一种免疫反应和/或减小足以治疗目标疾病或病症的目标损伤的大小的治疗因子。 [0010] 在一些示例性实施方案中,免疫反应由CD4+和/或CD8+T细胞引发。 [0011] 在一些示例实施例中,医学效应物是抗原或从细菌的同源基因表达的治疗因子。 [0012] 在一些示例性实施方案中,医学效应物是抗原或从异源基因表达的治疗因子。 [0013] 在一些示例性实施方式中,异源基因还包括前导序列和/或终止区,其提高细菌中的异源表达。 [0014] 在一些示例性实施例中,治疗因子是导致靶病变中的细胞裂解的细胞毒素。 [0015] 在一些示例性实施方案中,目标疾病或病症是癌症或肿瘤,并且其中医学效应物引起受试者的肿瘤抑制或溶解。 [0016] 在一些示例性实施例中,足以使发病机制最小化的时间少于48小时。 [0017] 在一些示例性实施例中,细菌不能在受试者体内复制或定殖。 [0018] 在一些示例性实施方案中,基因修饰是来自细菌染色体的至少一种必需基因或营养缺陷型基因的缺失或突变。 [0019] 在一些示例实施例中,细菌是二氨基庚二酸的营养缺陷型。 [0020] 在一些示例性实施方案中,基因修饰是天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)从细菌染色体中的缺失。 [0021] 在一些示例性实施方案中,细菌具有可通过将细菌暴露于一种或多种调节效应物来控制的存活时间,所述调节效应物在体内施用时调节细菌的存活时间。 [0022] 在一些示例性实施方案中,调节效应物是二氨基庚二酸。 [0023] 在一些示例性实施方案中,医学效应物是由选自下组的基因表达的同源肽:chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD、yfcV 和 pks 岛。 [0024] 在一些示例性实施方案中,医学效应物是选自下组的细胞毒素:铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)、蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和幽门螺杆菌的空泡毒素及其组合。 [0025] 在一些示例性实施方案中,医学效应物是选自由CpG、环状二核苷酸和肿瘤抗原组成的组的抗癌因子。 [0026] 在一些示例性实施例中,细菌源自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳杆菌属或乳球菌属。 [0027] 在一些示例性实施例中,细菌源自大肠杆菌。 [0028] 在一些示例性实施方式中,细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH3,保藏号为 19836. [0029] 在一些示例性实施方案中,细菌表达与SEQ ID No:35的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的序列。 [0030] 在一些示例性实施方式中,细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp107,保藏号为 19835. [0031] 在一些示例性实施例中,细菌是静脉内施用的。 在一些示例性实施例中,细菌被配制成静脉内施用。 [0032] 在一些示例性实施方案中,当静脉内施用时,足以使发病机制最小化的时间少于48小时。 [0033] 在一些示例性实施例中,细菌是局部施用的。 在一些示例性实施例中,细菌被配制成局部施用。 [0034] 在一些示例性实施方案中,当在注射部位局部施用时,细菌在注射部位存活长达5天,但在注射部位外48小时内死亡。 在一些实施方案中,细菌从正常组织和器官中清除。 [0035] 在一些示例性实施方式中,细菌以7.5×10 9 cfu/kg小鼠的等效剂量施用。 在一些示例性实施例中,细菌以7.5×10 9 cfu/kg小鼠的等效剂量静脉内施用。 [0036] 在一些示例性实施方式中,疾病是癌症或肿瘤并且肿瘤内施用细菌。 [0037] 在一些示例性实施方式中,以每克约100-200mm 3 的肿瘤5×10 8 cfu的等效剂量肿瘤内施用细菌。在一些示例性实施方式中,以4×10 9 的等效剂量肿瘤内施用细菌。 cfu/克约100-200mm 3 的肿瘤。在一些示例性实施方案中,以至少5×10 8 cfu/克约100-200mm 3 的肿瘤的等效剂量肿瘤内施用细菌。 [0038] 另一方面,提供了一种大肠杆菌的活细菌,其包含从该细菌的染色体中缺失天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的基因; 其中细菌来源于强毒株。 [0039] 在一些示例性实施方式中,细菌表达至少一种编码医学效应子的效应子基因。 [0040] 在一些示例性实施方式中,细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH3,保藏号为 19836. [0041] 在一些示例性实施方案中,细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌(ExlA)的外溶素A的基因。 [0042] 在一些示例性实施方案中,该基因与 SEQ ID NO: 35 的全部或片段具有至少约 80%、85%、90%、95% 或 100% 的序列同一性。 [0043] 在一些示例性实施方式中,细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp107,保藏号为 19835. [0044] 另一方面,提供了一种免疫原性组合物,其包含前述权利要求中任一项的细菌。 [0045] 在进一步的方面,提供了一种活细菌疫苗,其包含任何一个示例性实施方案的细菌和任选的佐剂。 [0046] 在进一步的方面,提供了一种治疗疾病或病症的方法,包括向受试者施用包含有效量的任何示例性实施方案的细菌的组合物。 [0047] 在一些示例性实施例中,疾病是肿瘤或癌症。 [0048] 在进一步的方面,提供了一种构建基因工程活细菌的方法,包括以下步骤:对细菌进行基因工程,使得该细菌具有较短的寿命,使得该细菌在施用于受试者后在一段时间内存活 足以使医学效应器发挥至少一种医学作用,并在足以使受试者的发病机制最小化的时间内死亡,其中细菌来源于强毒株。 [0049] 在一些示例性实施方式中,该方法还包括以下步骤:对细菌进行基因工程改造以表达至少一种医学效应子。 [0050] 本文讨论了其他示例实施例。 [0051] 本公开有许多优点。 在某些实施例中,由于所提供的细菌是体内受试者体内的活细菌,因此通过保持其效应分子的完整性和功能性来确保医疗功效。 [0052] 在某些示例性实施例中,短寿命细菌优于杀死或灭活的细菌,因为短寿命细菌在给药后可以在体内存活一段时间以发挥更好的医疗作用。 [0053] 在某些实施例中,由于所提供的细菌来源于强毒力或致病性菌株,并且保留所有或至少部分致病性因子作为医学效应物,因此治疗效果远优于非致病性菌株。 这些毒株的许多抗原和毒力因子带来了各种治疗潜力,例如引发对疾病的免疫或直接杀死癌细胞。 在某些实施方案中,仅肿瘤内或静脉内注射的少量短寿命细菌就足以有效地抑制肿瘤进展或治愈肿瘤。 [0054] 在某些实施方案中,由于所提供的细菌是短寿命的,因此基因突变的潜在风险被最小化并且确保了医疗用途的生物安全性。 [0055] 在某些实施例中,由于所提供的细菌寿命短且具有高免疫原性和治疗功效,因此该细菌即使在静脉内施用时也能达到令人满意的治疗效果。 在某些实施方案中,少量短寿命细菌的静脉内或系统给药足以实现令人满意的肿瘤抑制。 细菌不需要被设计成专门针对或定植于肿瘤等目标,也不需要局限于局部或肿瘤内给药,但仍然可以在治疗疾病方面取得很好的疗效。 [0056] 在某些实施方案中,短寿命细菌优于基因修饰的病变特异性细菌,因为短寿命细菌不会轻易突变以失去其短期存活特征,而病变特异性细菌易于突变以失去其病变- 瞄准能力。 [0057] 在某些实施方案中,短寿命细菌可用作疫苗或治疗剂的载体或媒介物以治疗或预防各种疾病或改善某些病症。 在某些实施例中,短寿命细菌可用于诊断目的。 [0058] 附图简要说明 [0059] 图1A显示了根据示例性实施方式在LB培养基中体外生长0、24和48小时的短寿命细菌的活细胞数。 [0060] 图1B显示了根据示例性实施方案在补充有二氨基庚二酸(DAP)的LB培养基中体外生长0、24和48小时的短寿命细菌的活细胞数。 [0061] 图1C显示了根据一个示例性实施方案,在均化的混合器官悬浮液中离体生长0、24和48小时的短寿命细菌的活细胞数。 [0062] 图1D显示了根据一个示例实施例,在1天、2天、5天和11天后皮下注射到小鼠体内的短寿命细菌的活细胞数。 [0063] 图2A显示根据示例性实施方案,短寿命细菌mp107和对照菌株MG1655对小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的杀伤百分比。 [0064] 图2B显示根据示例性实施方案,分别由短寿命细菌mp107和对照菌株MG1655杀死人肺癌细胞系(A549)的百分比。 [0065] 图 2C 显示了根据一个示例性实施方案,通过瘤内 (i.t.) 注射对照菌株 MG1655、短寿命细菌 SH3 和表达 ExlA mp107 的短寿命细菌(具有两种不同剂量)对鼠类肿瘤体积的抑制。 (*P<0.05,***P<0.001)。 误差棒,SEM。 [0066] 图 3A 显示了根据一个示例性实施例,通过静脉内 (i.v.) 注射 PBS 和表达 ExlA mp107 的短寿命细菌以 7.5X10 9 cfu/kg 小鼠的剂量抑制鼠类肺癌。 (***P<0.001)。 误差棒,SEM。 [0067] 图3B显示了根据示例性实施方式的用mp107或对照菌株MG1655处理的小鼠肿瘤内CD4+T细胞百分比的流式细胞术结果。 (***P<0.001)。 误差棒,SEM。 [0068] 图3C显示了根据示例性实施方式的用mp107或对照菌株MG1655处理的小鼠肿瘤内CD8+T细胞百分比的流式细胞术结果。 (***P<0.001)。 误差棒,SEM。 [0069] 图4显示了根据示例性实施方式的质粒pExlA的图谱示意图。 [0070] 图5显示了根据示例性实施方式的质粒pExlA2的图谱示意图。 [0071] 图6A显示了根据示例实施例的大肠杆菌菌株SH3和SH4的溶血分析。 [0072] 图6B显示根据示例性实施方案的大肠杆菌对照菌株MG1655和MG1655/pExlA2的溶血分析。 [0073] 图7显示了根据示例性实施方式,在以2×10 8 cfu/小鼠的剂量静脉内注射mp105、mp106或mp107后小鼠体重减轻的百分比。 PBS 作为阴性对照。 误差棒,SEM。 [0074] 图8显示了根据一个示例性实施方案静脉注射mp105、mp106或mp107的携带皮下LLC肿瘤的小鼠的肿瘤体积(mm 3 )的增加。 PBS 作为阴性对照。 误差棒,SEM。 [0075] 图9显示了根据示例性实施方案,通过静脉注射mp105(iv)或静脉注射和瘤内注射mp105的组合(iv+it)施用的携带皮下LLC肿瘤的小鼠的肿瘤体积(mm 3 )的增加。 PBS 作为阴性对照。 误差棒,SEM。 [0076] 图10A和10B分别显示了根据一个示例性实施方案,在以1×10 8 cfu/小鼠或PBS的剂量皮下注射两次剂量的mp105后14天,肝和肺中鼠伤寒沙门氏菌的定量。 通过计数菌落形成单位来量化器官中的细菌,并通过菌落 PCR 验证。 [0077] 微生物沉积物 [0078] 菌株 SH2 保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号的中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC),保藏号为 100101。 22685 于 2021 年 6 月 10 日。菌株 SH3 保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号的中国微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号为 100101。 19836 于 2020 年 5 月 18 日。菌株 mp107 保藏于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号中国微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号:100101。 19835 于 2020 年 5 月 18 日。菌株 SH4 保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号的中国微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号:100101。 22557 于 2021 年 5 月 18 日。细菌菌株 mp105 保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号的中国微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号为 100101。 22555 于 2021 年 5 月 18 日。细菌菌株 mp106 保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号的中国微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号为 100101。 2021 年 5 月 18 日为 22556。 详细说明 [0079] 如本文和权利要求中所用,“包含”是指包括以下要素但不排除其他要素。 [0080] 如本文和权利要求中所用,单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物,除非上下文另有明确规定。 例如,如上所用的“一个”基因是指一个或多个基因,它们可以相同或不同。 [0081] 如本文所用,术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内并且不超过规定值的±10%。 仅作为示例,大约 50 表示从 45 到 55,包括其间的所有值。 [0082] 如本文所用,短语“约”特定值也包括特定值,例如,约50包括50。 [0083] 如本文和权利要求中所用,“免疫原性组合物”是有效(例如,以合适的形式和量)引发针对疾病或病症的免疫(免疫学)反应的组合物。 在一些实施方案中,免疫原性组合物是有效预防癌症或肿瘤的疫苗。 [0084] 如本文和权利要求中所用,“有效量”是有效实现至少可测量量的所需效果的量。 例如,该量可以有效引发免疫反应,和/或它可以有效引发保护性反应,以抵抗带有目标多肽的病原体。 在一些实施例中,该量可有效引发针对癌症或肿瘤的免疫反应。 [0085] 如本文和权利要求中所用,“受试者”是指动物,例如哺乳动物,包括但不限于灵长类动物(例如人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠 之类的。 [0086] 如本文和权利要求书中所用,细菌的“发病机制”是导致宿主或受试者患病的生物学机制。 [0087] 如本文和权利要求书中所用,“无毒”菌株(例如,非侵入性、共生性或共生性)是一种不会对受试者造成疾病或有害致病作用的菌株。 这种细菌可以是天然存在的、GRAS(“通常被认为是安全的”)或益生菌。 另一方面,“强毒”菌株具有至少一个毒力因子,可能对受试者造成疾病或有害的致病作用,并且通常不被认为是安全的。 [0088] 在某些示例性实施方案中,“毒力”菌株可以进行遗传修饰,使得即使它保留或具有某些额外的毒力因子,它也不会导致疾病或对受试者或宿主没有有害的致病作用。 [0089] “毒力因子”是由细菌产生的分子,其提高细菌伤害宿主或宿主内细胞(例如,宿主内的肿瘤)的能力。 毒力因子的例子包括细胞毒素、毒素、溶血素、蛋白酶、破坏性酶,以及有助于细菌定植、进出细胞和获取营养的能力的因子。 [0090] 如本文所用,术语“治疗”是指减轻、减轻或改善疾病或病症症状、预防额外症状、改善或预防症状的潜在代谢原因、抑制疾病或病症的方法。 病症、阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、导致疾病或病症消退、缓解由疾病或病症引起的病症、或预防和/或治疗地停止疾病或病症的症状 . [0091] 如本文和权利要求书中所用,“短寿命”细菌或具有“短寿命”的细菌是指在体内施用至受试者后仅能存活短时间的细菌,例如,在几 小时(比如 1-3 小时)到几天(比如 1-3 天),这取决于施用的细菌数量和施用它们的方式。 在某些实施方案中,“短寿命”细菌在给药后不能在受试者体内复制或定植。 [0092] 如本文和权利要求书中所用,细菌“死亡”是指细菌的生命永久终止。 [0093] 如本文和权利要求中所用,“减毒”细菌是指毒力或感染性低于亲本形式或菌株的细菌。 [0094] 如本文和权利要求中所用,“医疗效应物”是指对疾病或病症发挥至少一种医疗作用的试剂。 医学效应物的例子包括但不限于治疗因子、抗原、肽和细胞毒素。 [0095] 如本文和权利要求中所用,对受试者的疾病或病症“施加医学作用”是引起治疗受试者的疾病或病症的生物学变化。 医学作用的例子包括但不限于引发免疫反应、引起疾病病变内的细胞裂解、抑制生物途径、结合受体、抑制受体、抑制靶细胞或生物体中的细胞过程,以及抑制 减少一种或多种导致或维持疾病或病症的因素的产生。 细胞过程包括但不限于 DNA 复制、RNA 翻译、细胞分裂和维持细胞稳态。 [0096] 在某些示例性实施方案中,非常希望开发一种新型细菌,其具有死细菌和活细菌的优点,同时避免它们各自的缺点。 [0097] 在某些示例性实施例中,提供的是短寿命细菌。 当在体内施用短寿命细菌时,细菌会在数小时的时间尺度上存活。 通过用特定化合物或分子补充细菌悬浮液,可以人为地改变短寿命细菌的寿命。 因为短命细菌在给药时是活的,所以它们产生的效应分子保持完整和功能。 因为短寿命细菌在给药后数小时或数天在体内死亡,所以发病机制被最小化。 [0098] 在某些示例性实施方案中,提供了包含基因工程细菌的药物组合物。 [0099] 在某些示例性实施例中,可以通过删除一个或某些必需基因来产生短寿命细菌。 或者,可以通过突变或删除相关的营养缺陷型基因来遗传构建细菌的营养缺陷型。 由此产生的突变细菌可能具有不同的、相对较短的寿命。 其中一些可能会在体内迅速死亡,这取决于它们所施用的生长环境中的营养成分。 如果生长环境中残留有细菌暂时赖以生存的营养物质或化合物,则细菌可以存活更长时间。 [0100] 编号的实施例 - 第 1 组 [0101] 1. 一种基因工程活细菌,包括 [0102] 至少一种编码至少一种医学效应子的效应子基因; 以及至少一种缩短细菌寿命的基因修饰,使得细菌在施用于受试者后,在足以允许医疗效应器发挥至少一种医疗作用的时间内存活,并在足以使发病机制最小化的时间内死亡 主题; 其中细菌来源于强毒株。 [0103] 2.如实施方式1所述的细菌,其中所述医学效应物是可在受试者中引发至少一种足以治疗目标疾病或病症的免疫反应的抗原。 [0104] 3.如实施方式1所述的细菌,其中所述医学效应物是可以在受试者中引发至少一种免疫反应和/或减小足以治疗目标疾病或病症的目标损伤的大小的治疗因子。 [0105] 4.实施例2或3的细菌,其中免疫应答由CD4+和/或CD8+T细胞引发。 [0106] 5.如实施方式1所述的细菌,其特征在于,所述医学效应物是所述细菌的同源基因表达的抗原或治疗因子。 [0107] 6.实施方案1的细菌,其中所述医学效应物是抗原或从异源基因表达的治疗因子。 [0108] 7.如实施例6所述的细菌,其中所述异源基因还包括提高细菌中异源表达的前导序列和/或终止区。 [0109] 8.如实施例3或6所述的细菌,其中治疗因子是在靶病变中引起细胞裂解的细胞毒素。 [0110] 9.实施例2或3的细菌,其中目标疾病或病症是癌症或肿瘤,并且其中医学效应物在受试者中引起肿瘤抑制。 [0111] 10.实施例1的细菌,其中该细菌不能在受试者体内复制或定殖。 [0112] 11.实施例1的细菌,其中基因修饰是细菌染色体中至少一种必需基因或营养缺陷型基因的缺失或突变。 [0113] 12.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌是二氨基庚二酸营养缺陷型。 [0114] 13.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述基因修饰是天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从细菌染色体中的缺失。 [0115] 14.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌具有可通过将细菌暴露于一种或多种调节效应物来控制的存活时间,所述调节效应物在体内施用时调节细菌的存活时间。 [0116] 15.实施例14的细菌,其中调节效应物是二氨基庚二酸。 [0117] 16. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述医学效应子是由选自下组的基因表达的同源肽,该组由以下各项组成:chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD、yfcV 和pk岛。 [0118] 17. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述医学效应物是选自由铜绿假单胞菌的外溶素A (ExlA)、蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和空泡毒素组成的组的细胞毒素 幽门螺杆菌及其组合。 [0119] 18.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述医学效应物是选自由CpG、环状二核苷酸和肿瘤抗原组成的组的抗癌因子。 [0120] 19. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌源自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特氏菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳杆菌属或乳球菌属。 [0121] 20. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌源自大肠杆菌。 [0122] 21. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH3,保藏号为。 19836. [0123] 22. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌表达与SEQ ID No: 35的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的序列。 [0124] 23. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp107,保藏号为: 19835. [0125] 24. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌被配制成静脉内施用。 [0126] 25.前述实施方案中任一项的细菌,其中当静脉内施用时,足以使发病机制最小化的时间小于48小时。 [0127] 26. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌被配制成局部施用。 [0128] 27. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌在注射部位局部施用时在注射部位存活长达5天但在注射部位外48小时内死亡。 [0129] 28.根据实施例24所述的细菌,其中所述细菌以7.5×10 9 cfu/kg小鼠的等效剂量施用。 [0130] 29. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述疾病是癌症或肿瘤并且肿瘤内施用所述细菌。 [0131] 30.如实施例29所述的细菌,其中所述细菌以每克约100-200mm 3 的肿瘤至少5×10 8 cfu的等效剂量施用。 [0132] 31. 一种大肠杆菌活菌,包括 [0133] 细菌染色体天冬氨酸半醛脱氢酶 (asd) 的基因缺失; [0134] 其中细菌来源于强毒株。 [0135] 32.如实施例31所述的细菌,其中所述细菌表达至少一种编码医学效应子的效应子基因。 [0136] 33.实施例31的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH3,保藏号为: 19836. [0137] 34.如实施例31所述的细菌,其中所述细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌(ExlA)的外溶素A的基因。 [0138] 35.实施例34的细菌,其中基因与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性。 [0139] 36.根据实施例31所述的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp107,保藏号为:1000。 19835. [0140] 37.一种免疫原性组合物,其包含前述实施方案中任一项的细菌。 [0141] 38.一种活细菌疫苗,包含前述实施方案中任一项的细菌和任选的佐剂。 [0142] 39.一种治疗疾病或病症的方法,包括向受试者施用包含有效量的任何前述实施方案的细菌的组合物。 [0143] 40.如实施方式39所述的方法,其中所述疾病是肿瘤或癌症。 [0144] 41. 一种构建基因工程活菌的方法,包括以下步骤: [0145] 对细菌进行基因工程改造,使该细菌的寿命较短,从而使该细菌在施用于受试者后,在足以让医疗效应器发挥至少一种医疗作用的时间内存活,并在足以使发病机制最小化的时间内死亡 给受试者,其中细菌来源于强毒株。 [0146] 42. 实施例 41 的方法,还包括以下步骤: [0147] 基因工程细菌表达至少一种医学效应。 [0148] 编号的实施例-第 2 组 [0149] 1. 一种基因工程活细菌,包括 [0150] 至少一种编码至少一种医学效应子的效应子基因; 以及至少一种缩短细菌寿命的基因修饰,使得活细菌在被施用于受试者后,在足够长的时间内存活以允许医疗效应器发挥至少一种医疗作用,并在时间过后死亡 尽量减少受试者的发病机制; [0151] 其中细菌来源于强毒株。 [0152] 2.如实施方式1所述的细菌,其中所述医学效应物是可在受试者中引发至少一种足以治疗目标疾病或病症的免疫反应的抗原。 [0153] 3.如实施方式1所述的细菌,其中所述医学效应物是可以在受试者中引发至少一种免疫反应和/或减小足以治疗目标疾病或病症的目标损伤的大小的治疗因子。 [0154] 4.实施例2或3的细菌,其中免疫应答由CD4+和/或CD8+T细胞引发。 [0155] 5.如实施方式1所述的细菌,其特征在于,所述医学效应物是所述细菌的同源基因表达的抗原或治疗因子。 [0156] 6.实施方案1的细菌,其中所述医学效应物是抗原或从异源基因表达的治疗因子。 [0157] 7.如实施例6所述的细菌,其中所述异源基因还包括提高细菌中异源表达的前导序列和/或终止区。 [0158] 8.如实施例3或6所述的细菌,其中治疗因子是在靶病变中引起细胞裂解的细胞毒素。 [0159] 9.实施例2或3的细菌,其中目标疾病或病症是癌症或肿瘤,并且其中医学效应物在受试者中引起肿瘤抑制。 [0160] 10.实施例1的细菌,其中该细菌不能在受试者体内复制或定殖。 [0161] 11.实施例1的细菌,其中基因修饰是细菌染色体中至少一种必需基因或营养缺陷型基因的缺失或突变。 [0162] 12.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌是二氨基庚二酸营养缺陷型。 [0163] 13.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述基因修饰是天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从细菌染色体中的缺失。 【0164】 14.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌具有可通过将细菌暴露于一种或多种调节效应物来控制的存活时间,所述调节效应物在体内施用时调节细菌的存活时间。 [0165] 15.实施例14的细菌,其中调节效应物是二氨基庚二酸。 【0166】 16. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述医学效应子是由选自下组的基因表达的同源肽,该组由以下各项组成:chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD、yfcV 和pk岛。 [0167] 17. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述医学效应物是选自由铜绿假单胞菌的外溶素A (ExlA)、蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和空泡毒素组成的组的细胞毒素 幽门螺杆菌及其组合。 [0168] 18.前述实施方案中任一项的细菌,其中所述医学效应物是选自由CpG、环状二核苷酸和肿瘤抗原组成的组的抗癌因子。 [0169] 19. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌源自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特氏菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳杆菌属或乳球菌属。 [0170] 20. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌源自大肠杆菌。 [0171] 21. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH3,保藏号为。 19836. [0172] 22. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌表达与SEQ ID No: 35的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的序列。 [0173] 23. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp107,保藏号为: 19835. [0174] 24. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌被配制成静脉内施用。 [0175] 25.前述实施方案中任一项的细菌,其中当静脉内施用时,足以使发病机制最小化的时间少于2天、5天或11天。 [0176] 26. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌被配制成局部施用。 [0177] 27. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述细菌在注射部位局部施用时在注射部位存活长达5天但在注射部位外48小时内死亡。 [0178] 28.根据实施例24所述的细菌,其中所述细菌以7.5×10 9 cfu/kg小鼠的等效剂量施用。 [0179] 29. 前述实施方案中任一项的细菌,其中所述疾病是癌症或肿瘤并且肿瘤内施用所述细菌。 [0180] 30.如实施例29所述的细菌,其中所述细菌以每克约100-200mm 3 的肿瘤至少5×10 8 cfu的等效剂量施用。 [0181] 31.根据实施例1-20中任一项所述的细菌,其中所述至少一种效应基因包含细胞毒素基因和溶血素III编码基因的部分DNA片段。 [0182] 32.实施例31的细菌,其中细胞毒素是铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)。 [0183] 33.根据实施例31或32中任一项所述的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp106,保藏号为。 22556。 [0184] 34. 前述实施方案中任一项的细菌,还包含至少一种减弱细菌毒力的毒力基因修饰。 [0185] 35.实施例34的细菌,其中至少一种毒力基因修饰是至少一种毒力基因从细菌染色体上的缺失或突变。 [0186] 36.实施例34或35中任一项的细菌,其中毒力基因修饰是从细菌的染​​色体中缺失hlyCABD操纵子。 [0187] 37.如实施例36中任一项所述的细菌,其中该细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH4,保藏号为: 22557。 [0188] 38.实施例34-37中任一项的细菌,其中所述细菌表达与SEQ ID No:40的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的序列。 [0189] 39. 实施例 34-37 中任一项的细菌,其中所述细菌表达与 SEQ ID No: 41 和/的全部或片段具有至少约 80%、85%、90%、95% 或 100% 序列同一性的第一序列和/ 或与SEQ ID No:42的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的第二序列。 [0190] 40.根据实施例38或39中任一项所述的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp105,保藏号为。 22555。 [0191] 41.如实施例31-40中任一项所述的细菌,其中所述细菌以2×10 8 cfu/小鼠的等效剂量施用。 [0192] 42.根据实施例34-40中任一项所述的细菌,其中所述细菌被配制成结合静脉内注射和瘤内注射施用。 [0193] 43.实施例42的细菌,其中瘤内注射具有7.5×10 7 cfu/小鼠的等效剂量并且静脉内注射具有3×10 7 cfu/小鼠的等效剂量。 [0194] 44.一种大肠杆菌的活细菌,其包含从该细菌的染色体中缺失天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的基因; [0195] 其中细菌来源于强毒株。 [0196] 45.如实施例44所述的细菌,其中所述细菌表达至少一种编码医学效应子的效应子基因。 [0197] 46.根据实施例44所述的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH3,保藏号为: 19836. [0198] 47.如实施例44所述的细菌,其中所述细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌(ExlA)的外溶素A的基因。 [0199] 48.实施例47的细菌,其中基因与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性。 [0200] 49.实施例44的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp107,保藏号为: 19835. [0201] 50.实施例44的细菌,其中至少一种效应基因包含细胞毒素基因和溶血素III编码基因的部分DNA片段。 [0202] 51.实施例50的细菌,其中细胞毒素是铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)。 [0203] 52.根据实施例50或51中任一项所述的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp106,保藏号为。 22556。 [0204] 53.实施例44-52中任一项的细菌,还包含至少一种减弱细菌毒力的毒力基因修饰。 [0205] 54.实施例53的细菌,其中至少一种毒力基因修饰是至少一种毒力基因从细菌染色体上的缺失或突变。 [0206] 55.实施例53或54中任一项的细菌,其中毒力基因修饰是hlyCABD操纵子从细菌染色体上的缺失。 [0207] 56.根据实施例55所述的细菌,其中所述细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株SH4,保藏号为: 22557。 [0208] 57.实施例53-56中任一项的细菌,其中所述细菌表达与SEQ ID No:40的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的序列。 [0209] 58. 实施例 53-56 中任一项的细菌,其中所述细菌表达与 SEQ ID No: 41 和/的全部或片段具有至少约 80%、85%、90%、95% 或 100% 序列同一性的第一序列和/ 或与SEQ ID No:42的全部或片段具有至少约80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的第二序列。 [0210] 59.如实施例57或58中任一项所述的细菌,其中该细菌来源于保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC)的菌株mp105,保藏号为。 22555。 [0211] 60.实施例50-59中任一项的细菌,其中所述细菌以2×10 8 cfu/小鼠的等效剂量施用。 [0212] 61.实施例53-59中任一项的细菌,其中所述细菌被配制成结合静脉内注射和瘤内注射施用。 [0213] 62.实施例61的细菌,其中瘤内注射具有7.5×10 7 cfu/小鼠的等效剂量并且静脉内注射具有3×10 7 cfu/小鼠的等效剂量。 [0214] 63.一种免疫原性组合物,其包含前述实施方案中任一项的细菌。 [0215] 64.一种活细菌疫苗,包含前述实施方案中任一项的细菌和任选的佐剂。 [0216] 65.一种治疗疾病或病症的方法,包括向受试者施用包含有效量的任何前述实施方案的细菌的组合物。 [0217] 66.如实施方式65所述的方法,其中所述疾病是肿瘤或癌症。 [0218] 67. 一种构建基因工程活细菌的方法,包括以下步骤: [0219] 对细菌进行基因工程改造,使该细菌的寿命较短,从而使该细菌在施用于受试者后,在足以让医疗效应器发挥至少一种医疗作用的时间内存活,并在足以使发病机制最小化的时间内死亡 给受试者,其中细菌来源于强毒株。 [0220] 68. 实施例 67 的方法,还包括以下步骤: [0221] 基因工程细菌表达至少一种医学效应。 [0222] 69.包含有效量的任何前述实施方案的细菌的组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。 [0223] 70.实施例69的用途,其中所述疾病是肿瘤或癌症。 [0224] 在一些实施方案中,提供了一种基因工程活细菌,其包含至少一个编码医学效应子的效应子基因; 以及至少一种缩短细菌寿命的基因修饰,使得细菌在被施用于受试者后,在足以允许医疗效应器发挥至少一种医疗作用的时间内存活,并在该时间后死亡以最小化发病机制以至 主题。 该细菌来源于强毒株。 [0225] 在某些实施方案中,有毒菌株可提供比非致病性或无毒细菌更高的基础水平的免疫原性和治疗潜力。 [0226] 在某些实施方案中,该时间足以允许医学效应器针对至少一种疾病或病症发挥至少一种医学作用。 该作用可能会在一段时间后持续存在,在细菌死亡并从受试者体内清除很久之后。 [0227] 在一些示例实施例中,医疗行为是预防和/或治疗行为。 [0228] 在一些示例性实施例中,足以使细菌的医学效应器启动预防和/或治疗作用的时间少于 48 小时。 [0229] 示例 1 [0230] 材料和方法 [0231] (1) 构建短寿命细菌的方法 [0232] 必需基因或营养缺陷型基因的缺失或突变 [0233] 要创建短命细菌,至少需要删除或突变一种必需基因或营养缺陷型基因。 在某些示例性实施例中,使用强毒菌株进行突变。 [0234] 在这个示例性实施例中,从健康志愿者提供的粪便样本中分离并纯化了大肠杆菌SH2菌株。 将粪便样品重新悬浮在 PBS 缓冲液中,并铺展在补充有 1 mM 异丙基 β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 和 X-gal (0.06 mg/ml) 的 LB 琼脂上。 大肠杆菌形成蓝色菌落并与其他细菌物种区分开来。 SH2 是一种粪便大肠杆菌分离株。 菌株 SH2 保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC),保藏号: 22685,2021 年 6 月 10 日。 [0235] 在这个示例性实施例中,作为编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的必需基因的asd基因从大肠杆菌菌株SH2的染色体中被删除。 使用 lambda (λ) -Red 重组系统从大肠杆菌的细菌染色体中删除了 asd 基因。 使用两个引物来创建删除: [0236] asd-F(正向引物): [0237] [0238] asd-R(反向引物): [0239] [0240] 使用氯霉素抗性基因 (cat) 作为模板,通过聚合酶链反应 (PCR) 扩增包含与 asd 基因紧邻区域具有同源性 (45 nt) 的 loxP-cat-loxP 氯霉素抗性盒的 DNA 片段。 引物 asd-F 和 asd-R 用于该 PCR。 用质粒pSim6转化电感受态大肠杆菌,在42℃诱导λ重组蛋白的表达。 通过电穿孔将上述PCR片段导入携带pSim6的大肠杆菌中。 诱导 λ-red 后,在 37℃ 过夜孵育后选择重组菌落的氯霉素抗性。 分离抗性菌落并通过菌落 PCR 使用引物 asd-F2(正向)TAGGTTTCCGAGCGGATCCA(SEQ ID NO:3)和 Cm-R3(反向)CCTCTTACGTGCCGATCAACG(SEQ ID NO:4)进行验证,这些引物被设计在 asd 基因的侧翼 . 验证 PCR 的大小为 505 bp。 通过表型测试进一步证实了 asd 缺失,其中正确的菌落没有在 LB 培养基上生长,但很容易在补充有 DAP(50 μ g/ml)的 LB 培养基上生长。 确认 asd 缺失后,选择单个菌落并用携带卡那霉素抗性基因的 705 Cre 质粒进行转化。 在 37℃诱导质粒中 Cre 重组酶的表达,并铺展在不含任何抗生素的 Luria-Bertani (LB) 琼脂上。 然后将单个菌落在 LB 琼脂和补充有氯霉素的 LB 琼脂上划线。 选择在 LB 琼脂上生长但不在含有氯霉素的 LB 琼脂上生长的单个菌落。 这种具有 asd 基因缺失但没有 loxp-cat-loxp 盒的突变株被命名为 SH3。 菌株 SH3 保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC),保藏号: 2020 年 5 月 18 日为 19836。 [0241] 突变株毒力基因鉴定 [0242] 通过菌落PCR检测SH3内的毒力基因。 为了设计引物,首先通过评估多重序列比对在不同的大肠杆菌菌株中鉴定保守序列区域。 然后,引物被设计成对保守区域具有特异性。 所有使用的引物都列在表 1 中。 [0243] [0244] [0245] 表 1. 用于检测 SH3 毒力基因的引物 [0246] 体外细菌生长试验 [0247] 将 10 μl 细菌 SH3 的过夜培养物在含有或不含 50 μg/ml DAP 的 1 ml LB 肉汤培养基中进行继代培养(时间 0)。 孵育 24 和 48 小时后,连续稀释细菌并通过计算 Luria-Bertani (LB) 琼脂和添加 50 μg/ml DAP 的 LB 琼脂上的菌落形成单位来定量活细菌。 [0248] 离体细菌存活试验 [0249] 六至八周大的雌性 C57BL/6J 小鼠被安乐死。 取出包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏在内的器官并分别匀浆。 将等体积的各单独器官悬浮液混合在一起以形成混合器官悬浮液。 悬浮混合物用于离体存活测定。 将5μl的细菌过夜培养物在500μl的器官悬浮液中进行传代培养(时间0)。 24 和 48 小时后,通过在添加了 50 μg/ml DAP 的 LB 琼脂上计数菌落形成单位来量化活细菌。 [0250] 体内细菌存活试验 [0251] 将含或不含 5 μg/ml DAP 的细菌悬浮液(约 1 x 10 9 cfu)皮下注射到六至八周大的雌性 C57BL/6J 小鼠(平均体重约为 20 g)的胁腹。 然后从细菌注射部位以及包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏在内的关键器官取出组织,用于测定不同时间点的菌落形成单位。 将约 1 克的每种组织在 1 毫升的 PBS 缓冲液中匀化。 将所得组织悬液连续稀释,铺于添加有50μg/ml DAP的LB琼脂上,分别于37℃孵育过夜。 分别计数稀释后的组织悬液的菌落形成单位(cfu),并根据稀释倍数计算组织中的细菌数。 [0252] 使用与上述类似的方法重复相同的体内细菌存活测定,将细菌悬浮液(约 5 x 10 8 cfu)注射到六至八周大的雌性 C57BL/6J 小鼠(平均 体重约为20克)。 然后从细菌注射部位以及包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏在内的关键器官取出组织,用于测定不同时间点的菌落形成单位。 将约 1 克的每种组织在 1 毫升的 PBS 缓冲液中匀化。 将所得组织悬液连续稀释,铺于添加有50μg/ml DAP的LB琼脂上,分别于37℃孵育过夜。 分别计数稀释后的组织悬液的菌落形成单位(cfu),并根据稀释倍数计算组织中的细菌数。 [0253] 例 2 [0254] (2) 短命细菌作为医疗效应器的载体 [0255] 通过基因克隆构建表达细胞毒素的短寿命细菌 [0256] 合成了编码铜绿假单胞菌 PA7 外溶素 A 的 exlA 基因(Genbank:CP000744.1)(ExlA)(图 4),以及启动子和终止子(SEQ ID No:35),并克隆到 pBAD-DEST49 质粒(Invitrogen , US, cat. No. 12283-016) 根据制造商的说明使用 CloneEZ 无缝克隆技术 (GenScript)。 通过测序分析验证重组质粒pExlA。 随后通过电穿孔将重组质粒 pExlA 引入到 asd 缺失的突变体 SH3 中,并使用引物 oxb-F(正向:CTGTTGTGACCGCTTGCTCT)(SEQ ID No:33)和 exlA-R(反向:GAGGTGGAAGACAGGATTGTC)(SEQ ID 否:34)。 确认质粒转化后,选择单个菌落。 产生的具有重组质粒的突变菌株被命名为mp107。 菌株 mp107 保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC),保藏号: 2020 年 5 月 18 日为 19835。 [0257] 体外细胞毒性试验 [0258] 小鼠 Lewis 肺癌 (LLC) 细胞系和人肺癌细胞系 (A549) 用于体外细胞毒性测定。 将每个细胞系以每孔 1 X 10 4 个细胞的生长培养基(DMEM + 10%FBS +1%Gln + 1%P/S)接种在 96 孔板中。 当细胞生长到 80% 融合时,将它们与细菌 mp107 以 100 的 moi(即每个细胞 100 个细菌)在无抗生素加 5 μg/ml DAP 的培养基中共培养。 大肠杆菌参考菌株 MG1655 用作对照细菌。 作为对照,对照细菌也与 1 X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液共培养。 孵育 3 小时后,用 PBS 洗涤细菌细胞三次,并用 1% 结晶紫染色 5 分钟。 用结晶紫染色的细胞将被视为活细胞,因为死细胞已被洗涤去除。 染色的细胞用 PBS 轻轻洗涤,然后用 95% 乙醇脱色。 用微量滴定板读数器在 595 nm 处测量脱色溶液中反映活癌细胞数量的结晶紫染色量(595 nm 处的光密度 (OD))。 使用以下公式计算共培养细菌杀死的细胞百分比(或杀死百分比 (%)):(对照的 OD 595–处理的 OD 595)/对照的 OD 595)× 100%。 [0259] 局部给药时短寿命细菌的体内抗肿瘤评估 [0260] 六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠用于小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的肿瘤植入。 具体而言,将癌细胞系的1×10 6 个细胞皮下注射到每只小鼠的胁腹。 细胞系植入后7-12天,当肿瘤的平均体积达到约100-200mm 3 时,将对照菌MG1655、短寿命菌SH3和mp107以5×10 8 的剂量注射到每只小鼠的每个肿瘤中 分别为每克肿瘤的 cfu。 注射PBS制备阴性对照,注射4×10 9 cfu/g肿瘤制备高剂量mp107组。 在细菌 i.t. 后每周大约两次(从第 0 天到第 20 天)使用数字卡尺测量肿瘤大小。 注射。 评估每个治疗组和对照组之间肿瘤生长抑制率(TGI)的差异。 [0261] 短寿命细菌 SH3 和 mp107 补充有 5 μg/ml DAP 用于评估体内医学效应器对短寿命细菌存活时间的调节。 [0262] 系统给药时短寿命细菌的体内抗肿瘤评估 【0263】 六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠用于小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的肿瘤植入。 具体而言,将癌细胞系的1×10 6 个细胞皮下注射到每只小鼠的胁腹。 细胞系植入后7-12天,当肿瘤的平均体积达到约100-200 mm 3 时,系统注射短寿命细菌mp107,分别以7.5 X 10 7.5 X 10 的剂量注射到每只小鼠的尾静脉中 9 cfu/kg 小鼠。 阴性对照是用注射 PBS 制备的。 在细菌 i 后每周大约两次(从第 0 天到第 20 天)使用数字卡尺测量肿瘤大小。 v. 注射。 评估每个治疗组和对照组之间肿瘤生长抑制率(TGI)的差异。 【0264】 小鼠体内短寿命细菌的生物分布 【0265】 体内抗肿瘤评估后的小鼠被安乐死。 取肿瘤组织及肝、肺、心、肾、脾等重要脏器组织,测定不同时间点的集落形成单位。 将约 1 克的每种组织在 1 毫升的 PBS 缓冲液中匀化。 将所得组织悬液连续稀释,铺于添加有50μg/ml DAP的LB琼脂上,分别于37℃孵育过夜。 分别计数稀释后的组织悬液的菌落形成单位(cfu),并根据稀释倍数计算组织中的细菌数。 【0266】 流式细胞仪 【0267】 肿瘤组织用 37.5 μg/mL Liberase TM (Roche) 和 8,000 U/mL DNase I,牛胰腺 (Merck Millipore) 消化。 细胞悬液用200μM细胞滤网过滤并用PBS漂洗。 然后使用以下抗体对细胞进行标记物染色:BB700 大鼠抗小鼠 CD4 克隆 RM4-5 (RUO) (BD)、CD3e 女士 FITC 145-2C11 (BD)、CD4 女士 BV510 RM4-5 (BD)、CD8a 女士 APC-Cy7 53-6.7 (BD) 和 BV510 大鼠抗小鼠 CD45RB (BD)。 根据制造商的说明,用流式细胞仪 Life Attune NxT (Life Technologies) 分析染色的细胞。 [0268] 结果 [0269] 例 3 [0270] 构建短寿命细菌 [0271] 按照实施例1所述方法制备染色体基因缺失突变株,命名为SH3。 大肠杆菌菌株有四个系统发育群(A、B1、B2和D),通过PCR检测chuA和yjaA基因及DNA片段TSPE4可以确定系统发育类型。 大肠杆菌染色体中的 C2。 使用的引物对是 chuA-F (GACGAACCAACGGTCAGGAT) (SEQ ID No: 23) 和 chuA-R (TGCCGCCAGTACCAAAGACA) (SEQ ID No: 24)、yjaA-F (TGAAGTGTCAGGAGACGCTG) (SEQ ID No: 25) 和 yjaA-R (ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC)(SEQ ID No:26),以及 TspE4C2-F(GAGTAATGTCGGGGCATTCA)(SEQ ID No:27)和 TspE4C2-R(CGCGCCAACAAAGTATTACG)(SEQ ID No:28)。 所得 PCR 产物的大小分别为 279、211 和 152 bp。 如果大肠杆菌菌株对 chuA 和 yjaA 均为阳性,则该菌株被确定为系统发育 B2 组。 系统发育分型表明SH3属于B2型大肠杆菌。 进一步对大肠杆菌毒力基因进行PCR检测,发现SH3与聚酮合酶基因组岛(pks岛)呈阳性,该岛是编码巨型模块化非核糖体肽和聚酮合酶的致病岛,以及其他毒力基因或操纵子,如chuA、yjaA 、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD 和 yfcV。 结果表明,SH3 是一种具有多种毒力因子的大肠杆菌菌株,因此与从非致病性或无毒力菌株改造而来的菌株相比,具有更高的基础免疫原性和治疗效果。 [0272] 短寿命细菌的体外细菌生长试验结果 [0273] 现在参考图 1A 和 1B,体外生长测定显示 asd 缺失的突变体 SH3 在不补充 DAP 的情况下无法在生长培养基 (LB) 中存活(图 1A),但很容易生长(约 8 x 10 7 cfu 24 小时和 48 小时后约 5 x 10 7 cfu),当在生长培养基中补充 DAP 时(图 1B)。 这些结果表明,在缺乏必需补充剂的情况下,具有必需基因缺失的转基因短寿命细菌无法在体外存活。 [0274] 短寿命细菌的离体细菌存活试验结果 [0275] 现在参考图 1C,在体外研究中也观察到 asd 突变体 SH3 的存活率低(24 或 48 小时后没有生长) 通过在添加了 DAP (50μg/ml) 的 LB 琼脂上计数菌落形成单位进行量化(图 1C)。 结果表明,在缺乏必需补充剂的情况下,具有必需基因缺失的转基因短寿命细菌无法在体外存活。 【0276】 短寿命细菌的体内细菌存活试验结果 [0277] 为了确定asd突变体SH3是否可以在体内短时间存活,将asd突变体SH3(约1X10 9 cfu)皮下注射到小鼠中。 [0278] 现在参考图 1D,在没有 DAP 补充的情况下,注射后 2 天后,SH3 的活细胞计数从约 1 x 10 9 cfu 下降到约 2.7 x 10 8,注射部位约有 27% 的 SH3 存活。 5 天后,活菌数继续急剧下降。 11 天后无法检测到活细胞计数,表明具有必需基因缺失的转基因细菌寿命很短,无法在体内复制或定植。 [0279] 短寿命细菌的体内细菌存活试验结果 [0280] 体内细菌存活试验结果还表明,SH3 仅存在于皮下注射部位,最多可存活 5 天,但在所有其他受试器官(包括肝、肺、脾、心和肾)中均不存在,无论 注射后 2 天、5 天和 11 天后,细菌悬液中是否添加 DAP。 结果表明,短寿命细菌位于皮下注射部位,因此在局部给药时可以安全使用。 [0281] 将短寿命细菌 SH3(约 5 x 10 8 cfu)进一步注射到六至八周大的雌性 C57BL/6J 小鼠的尾静脉中,以进一步评估系统给药时的安全性。 静脉注射后,没有用短寿命细菌治疗的小鼠死亡。 相比之下,100% 用野生型细​​菌处理的小鼠在 48 小时内死亡。 此外,在静脉内 (i. v.) 注射后 6 天检查时,在用短寿命细菌处理的任何小鼠的任何器官中均未检测到 SH3。 [0282] 值得注意的是,在所有这些体内评估中,asd 缺失突变体 SH3 的突变率为 0%。 即从注射部位分离的SH3细胞100%保持对DAP的依赖性生存和生长,表明即使是转基因细菌也保留了它们的毒力因子,无论是局部给药还是安全使用。 或系统地。 【0283】 总之,这些数据表明,当局部或系统给药时,具有毒力因子的短寿命细菌在体内使用时出人意料地安全。 不受任何理论的束缚,短寿命细菌在受试者或宿主内暂时存活,因此即使细菌具有多种毒力因子也不会发展为全身性感染或疾病。 因此,该细菌可作为安全高效的载体或载体,用于制备疫苗或治疗剂,以治疗或预防各种疾病或改善某些状况。 SH3 等短命突变细菌可用作开发活疗法的平台。 【0284】 短寿命细菌存活时间的调节 [0285] 仍参考图 1D,向细菌悬液中补充终浓度为 5μg/ml 的 DAP,并进行体内细菌存活测定。 在补充 DAP 的情况下,注射 2 天后,SH3 的活细胞计数仅从约 1 x 10 9 cfu 下降至约 6.27 x 10 8 cfu。 换言之,注射后约 62.7% 的 asd 突变体 SH3 在注射部位存活了 2 天(图 1D)。 这个百分比明显高于没有 DAP 的 SH3。 因此,结果表明可以通过补充调节效应子来调节短寿命细菌的存活时间。 有利的是突变体短寿命细菌的存活时间可由调节效应子控制。 虽然注射部位 SH3 的存活时间因添加 5μg/ml DAP 而增加,但在注射后 2 天、5 天和 11 天后检查时,SH3 在任何小鼠的任何关键器官中均不存在。 【0286】 例 4 【0287】 表达异源毒力因子的短寿菌构建结果 [0288] 在该示例性实施方案中,在组成型启动子oxb18的控制下,从实施例2获得的短寿命细菌SH3进一步用表达细胞毒素、铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)的质粒转化。 包含oxb 18启动子、pelB前导序列、铜绿假单胞菌PA7的exlA基因、终止子(rrnB转录终止区)的序列如SEQ ID NO:35所示,克隆到质粒pBAD-DEST49中,形成a 重组质粒pExlA(图4)。 纯化并验证的重组菌株命名为mp107。 [0289] 表达细胞毒素的短寿命细菌的体外细胞毒性试验结果 [0290] 现在参考图2A,在体外评价了mp107的细胞毒性。 在细胞系与细菌在加有DAP(5μg/ml)的生长培养基中共培养3小时后测定杀灭百分比。 两者 P < 0.001(独立 t 检验)。 数据显示,短寿命细菌 mp107 对 LLC 细胞的杀灭率高得惊人,约为 92%,而对照细菌 MG1655 的杀灭率仅为约 13%(图 2A)。 数据还显示,mp107 对 A549 细胞的杀灭率惊人地高,约为 90%,而对照细菌 MG1655 的杀灭率仅为约 30%(图 2B)。 这些结果表明 mp107 对小鼠和人类肺癌细胞具有毒性或致死性,表明表达异源毒力因子(如细胞毒素)的短寿命细菌可能对治疗肺癌等癌症具有高效能。 【0291】 局部给药时短寿命细菌的体内抗肿瘤评估结果 [0292] 现在参考图2B,构建了小鼠携带由Lewis肺癌细胞(LLC)形成的皮下肿瘤的同系小鼠癌症模型。 为了提高短寿命细菌在体内肿瘤内的存活时间,在对小鼠的肿瘤给药之前,使用补充有 5μg/ml 剂量的 DAP 的细菌悬浮液进行体内抗肿瘤评估。 对于对照菌株MG1655、短寿命细菌SH3和表达exlA mp107胞外溶素的短寿命细菌组,以每克肿瘤5×10 8 cfu的剂量注射这些细菌; 对于mp107组(高剂量),注射剂量为每克肿瘤4×10 9 cfu。 图2B显示在整个治疗期间(从第3天到第20天)与对照MG 1655组和PBS组(无细菌注射)相比,SH3组的肿瘤生长被显着抑制。 短寿命细菌 SH3 显示出比参考菌株 MG1655 更高水平的肿瘤抑制 (p=0.0002),表明具有毒力因子的 SH3 细菌比对照细菌具有更高的抗癌功效。 数据还显示,在整个治疗期间(从第 3 天到第 20 天),与 SH3 组相比,mp107 组的肿瘤生长受到显着抑制。 数据进一步表明,表达另一种细胞毒素 mp107 的短命细菌比短命细菌 SH3 本身更有效地抑制肿瘤生长 (p=0.03),表明 exlA 编码的细胞毒素赋予了额外的抗癌能力 短命细菌。 当注射剂量增加到每克肿瘤4X10 9 cfu(更高剂量)时,mp107的抗癌功效也相应增加。 肿瘤内注射细菌 20 天后,高剂量 mp107 的竞争反应率达到 75%(8 只小鼠中的 6 只),表明短寿命细菌 SH3 进一步表达异源毒力因子如 细胞毒素ExlA(即mp107治疗组)的抗癌疗效。 肿瘤生长抑制率(TGI)的比较显示各治疗组与对照组之间存在显着差异。 【0293】 系统给药时短寿命细菌的体内抗肿瘤评估结果 【0294】 现在参考图3A,将短寿命细菌mp107静脉注射到小鼠的尾静脉中(7.5×10 9 cfu/kg小鼠)。 在整个治疗期间(从第 2 天到第 30 天),与 PBS 对照组相比,由于静脉内注射短寿命细菌,肿瘤生长受到显着抑制。 44.4%(9 只小鼠中有 4 只)经 mp107 处理的小鼠在第 30 天治愈了肿瘤,这表明以 7.5 x 10 9 cfu/kg 小鼠的单剂量系统施用短寿命细菌可有效 治疗癌症。 [0295] 短寿命细菌在小鼠体内的生物分布结果 【0296】 在实验结束时,对经过细菌处理的小鼠进行了细菌生物分布分析。 在肿瘤或任何关键器官(包括肺、肝、脾、心或肾)中均未检测到短寿命细菌 mp107,表明短寿命细菌不会在肿瘤组织或受试者体内定植。 由于肿瘤不含细菌,数据表明静脉注射短寿命细菌后观察到的肿瘤抑制是由间接机制引起的,例如免疫机制。 [0297] 流式细胞术结果 [0298] 现在参考图3B和3C,通过流式细胞术分析瘤内淋巴细胞。 数据显示,与用对照细菌 MG1655 处理的小鼠相比,用短寿命细菌 mp107 处理的小鼠肿瘤中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞分别增加了 19 倍和 12 倍,表明短期 活细菌在接受治疗的小鼠中引发 T 细胞反应。 这些数据表明,表达异源蛋白 ExlA 的短寿命细菌 mp107 可引发抗癌免疫,从而抑制肿瘤生长。 [0299] 这些数据表明,表达某些抗原的短命细菌也可以作为疫苗来预防癌症等疾病的发展。 [0300] 例 5 [0301] 材料和方法 [0302] (3) 构建短寿命细菌的方法 [0303] 毒力基因缺失或突变 [0304] 为了进一步提高使用短寿命细菌的安全性,可以通过额外的基因修饰进一步减弱短寿命细菌的毒力。 在这个示例性实施例中,编码细菌(大肠杆菌)菌株 SH3 的α溶血素的 hlyCABD 操纵子被删除或突变以产生新的细菌菌株 SH4。 [0305] 在这个示例性实施例中,使用 λ (λ) -Red 重组系统从大肠杆菌菌株 SH3 的细菌染色体中删除了 hlyCABD 操纵子。 使用两个引物来创建删除: 【0306】 M-hly-F(前向): [0307] [0308] M-hly-R(反向): [0309] [0310] M-hly-F 和 M-hly-R 引物用于通过 PCR 扩增氯霉素抗性盒。 使用氯霉素抗性基因 (cat) 作为模板,通过 PCR 扩增包含与紧邻 hlyCABD 操纵子的区域具有同源性 (45 nt) 的 loxP-cat-loxP 氯霉素抗性盒的 DNA 片段。 引物 M-hly-F 和 M-hly-R 用于该 PCR。 用质粒pSim6转化菌株SH3,在42℃诱导λ重组蛋白的表达。 通过电穿孔将上述PCR片段导入携带pSim6的SH3中。 在诱导 λ-red 后,针对氯霉素抗性选择重组体并通过菌落 PCR 验证。 然后根据制造商的说明(Gene Bridges,德国)使用 705 Cre 方法移除氯霉素抗性盒。 简而言之,在 37℃ 下诱导转化体中来自质粒的 Cre 重组酶的表达,然后将细菌涂布在不含任何抗生素的 LB 琼脂上。 37℃过夜培养后,单菌落在LB琼脂和添加氯霉素的LB琼脂上划线。 选择在 LB 琼脂上生长但不在含有氯霉素的 LB 琼脂上生长的单个菌落。 这种具有 hlyCABD 操纵子缺失和 asd 基因缺失但没有 loxp-cat-loxp 盒的突变菌株被命名为 SH4。 菌株 SH4 保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC),保藏号: 2021 年 5 月 18 日 22557。 [0311] 例 6 [0312] (4) 短命细菌作为医疗效应器的载体 【0313】 基因克隆构建表达细胞毒素和溶血素III部分片段的短寿命细菌 [0314] 合成了编码铜绿假单胞菌外溶素 A 的 exlA 基因(SEQ ID NO:41)和编码溶血素 III(SEQ ID No:42)的 hly III 基因的部分 DNA 片段,并克隆到 pBAD-DEST49 质粒(Invitrogen,美国)中 , 目录号 12283-016),根据制造商的说明,使用 CloneEZ 无缝克隆技术 (GenScript) 形成重组质粒 pExlA2(图 5)。 通过测序分析验证重组质粒pExlA2。 随后通过电穿孔将重组质粒 pExlA2 分别引入细菌菌株 SH4 和 SH3,并通过菌落 PCR 验证。 确认转化后,为每个细菌菌株选择一个菌落。 重组质粒pExlA2转化得到的突变株SH4和SH3分别命名为mp105和mp106。 菌株 mp105 保藏于中国微生物菌种综合保藏中心(CGMCC),保藏号: 22555,2021 年 5 月 18 日。菌株 mp106 保藏于中国微生物菌种保藏中心(CGMCC),保藏号: 2021 年 5 月 18 日为 22556。 [0315] 例 7 [0316] 溶血试验 [0317] 通过电穿孔将重组质粒 pExlA2 引入对照菌株 MG1655,并通过菌落 PCR 验证。 确认转化后,选择单个菌落。 得到的用质粒pExlA2转化的MG1655被命名为MG1655/pExlA2。 [0318] 将菌株 SH3、SH4、对照菌株 MG1655 和 MG1655/pExlA2 的过夜培养物分别滴在补充有二氨基庚二酸 (DAP, 50 μg/ml) 和 10% (v/v) 兔血的 LB 琼脂上,和 然后37℃孵育8-10小时。 终点时观察相应菌株的溶血能力。 通过观察琼脂澄清的存在来揭示由于红细胞破裂导致的溶血。 [0319] 例 8 [0320] 短寿命细菌注射后安全性和抗癌疗效的体内评估 [0321] 六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠用于小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的肿瘤植入。 具体而言,将 1 x 10 6 个 LLC 细胞系细胞皮下注射到每只小鼠的胁腹。 细胞系植入后 7-12 天,当肿瘤的平均体积达到约 50-200 毫米 3 时,将细菌菌株(mp105、mp106 和/或 mp107)静脉内注射 (iv) 至尾静脉或联合静脉注射 和每只小鼠的瘤内注射 (iv+it),分别。 以相同的方式注射 PBS 缓冲液作为阴性对照。 在细菌注射后第4天、第6天、第8天和第11天测量体重。 在细菌注射后,每周使用数字卡尺测量肿瘤大小 2-3 次。 [0322] 例 9 [0323] 物种鉴定 [0324] 待鉴定的细菌从组织中分离并通过传代培养纯化。 然后根据制造商的说明使用天根基因组 DNA 试剂盒(北京天根生物科技)从每个细菌菌株中分离基因组 DNA,并通过 16S 核糖体 DNA (rDNA) 序列分析确定物种鉴定。 具体地,以基因组DNA为模板,使用引物27F和1492R进行PCR扩增。 然后对 PCR 产物进行测序并在 GenBank 中进行比对。 [0325] 27F(前): [0326] [0327] 1492R(反向): [0328] [0329] 例 10 [0330] 评估短寿命细菌作为治疗和预防疫苗 [0331] 在这个例子中,使用存在细菌感染的雌性 C57BL/6J 小鼠来证明和评估 mp105 在减轻细菌感染方面的能力。 按照实施例9中描述的方法对从小鼠的肝脏和肺等器官分离的细菌进行种属鉴定分析。16S rDNA测序显示小鼠自然感染了鼠伤寒沙门氏菌。 为了检查 mp105 是否可以治疗现有的鼠伤寒沙门氏菌感染和/或预防随后的细菌感染,给小鼠两次皮下注射 mp105(1 x 10 8 cfu/小鼠)或 PBS,间隔 14 天。 注射后 14 天,以 2 x 10 7 cfu/小鼠的剂量用致病性大肠杆菌菌株 CFT073 攻击小鼠以建立额外的感染。 攻击5天后,对小鼠实施安乐死,通过菌落形成单位(CFU)平板计数和菌落PCR验证对肝、肺、心、肾、脾等关键器官进行细菌感染分析。 由于 S. typhimurium 菌株对 hlyCABD 操纵子呈阴性,而 CFT073 携带操纵子,因此 PCR 可用于区分这两种细菌。 用于 PCR 的引物是 hly-F 和 hly-R。 [0332] hly-F(前锋): [0333] 【0334】 hly-R(反向): [0335] 【0336】 结果 【0337】 例 11 【0338】 减毒短命菌构建结果 [0339] 按照实施例5所述方法制备SH3染色体上hlyCABD操纵子基因缺失的突变株,命名为SH4。 删除编码 alpha 溶血素的 hlyCABD 操纵子可以提高使用 SH4 作为短寿命细菌示例的安全性,用于癌症治疗和抗微生物感染疫苗等各种应用。 [0340] 例 12 [0341] 表达细胞毒素的短寿命减毒菌的构建结果 [0342] 从实施例5获得的短寿命细菌SH4和从实施例2获得的SH3进一步用表达细胞毒素、铜绿假单胞菌的外溶素A(SEQ ID NO:41)和编码溶血素的hly III基因的部分DNA片段的质粒转化 III(SEQ ID NO:42)分别按照实施例6中描述的方法。 序列包括oxb 18启动子、pelB前导序列、铜绿假单胞菌PA7的exlA基因、溶血素III编码基因的部分DNA片段、终止子(rrnB转录终止区),如SEQ ID NO:40所示 ,克隆到质粒pBAD-DEST49中,形成重组质粒pExlA2。 重组质粒pExlA2转化得到的突变株SH4和SH3分别命名为mp105和mp106。 【0343】 例 13 【0344】 溶血试验结果 【0345】 现在参考图6A,结果显示SH3基因组中编码α溶血素的hlyCABD操纵子缺失后,SH4失去了引起溶血的能力,表明SH4缺乏α溶血素的产生。 相比之下,SH3 仍保持引起溶血的能力。 【0346】 现在参考图6B,溶血测定结果显示MG1655和MG1655/pExlA2均未引起溶血。 结果表明,尽管存在溶血素 III 编码基因的部分 DNA 片段,但质粒并未产生溶血素 III。 令人惊讶的是,肿瘤治疗的体内评估结果(如下文实施例15中详细所示)表明该片段的表达增强了抗癌功效。 【0347】 综上所述,由于 mp105 是从用 pExlA2 转化的 SH4 获得的,示例短寿命细菌 mp105 也缺乏溶血素生产,因此推测在受试者体内用于各种应用(例如癌症治疗)时更安全。 【0348】 例 14 [0349] 短寿命细菌注射后安全性和抗癌疗效的体内评价结果 [0350] 现参见图7,建立小鼠携带由Lewis肺癌细胞(LLC)形成的皮下肿瘤的同系小鼠癌症模型。 根据实施例8中描述的方法显示分别用细菌mp105、mp106和mp107处理的每只小鼠的体重损失百分比变化。每种细菌菌株以2x10 8 cfu/小鼠的剂量静脉内注射。 一般来说,虽然所有用细菌处理的小鼠在静脉注射后都减轻了一定的体重,但 mp105 处理的小鼠比用 mp106 或 mp107 处理的小鼠减轻的体重要少得多。 特别是,在 mp105 和 mp106 处理的小鼠之间,第 4 天和第 8 天的体重减轻差异达到统计学显着性(独立 t 检验,P < 0.05)。 这些结果进一步表明,由于至少删除了 hlyCABD 操纵子,示例性短寿命细菌 mp105 具有更好的抗癌功效,并且在受试者体内比 mp106 或 mp107 更安全地用于体内使用。 [0351] 例 15 [0352] 短寿命细菌介导的肿瘤治疗的体内评估结果 【0353】 现参考图8,根据实施例8中描述的方法比较了mp105、mp106和mp107的抗癌功效。体内数据显示,mp106的肿瘤体积的增长明显慢于mp107,特别是在 治疗后第 21 天,表明与 mp107 相比,mp106 显示出适度的抗癌功效改善。 这些结果表明 pExlA2 赋予细菌比 pExlA 更好的抗癌能力。 令人惊讶的是,mp105 在抑制肿瘤生长方面明显优于 mp106 (p = 0.04) 和 mp107 (p = 0.031)。 到实验结束时,37.5% 的 mp105 治疗小鼠的肿瘤被治愈。 mp106 和 mp107 治疗组的治愈率分别为 12.5% 和 11.1%,低于 mp-105 治疗组。 这些结果共同表明,与 mp106 和 mp107 相比,示例短寿命细菌 mp105 不仅更安全,而且抗癌效果更佳。 【0354】 例 16 [0355] 不同给药途径对短寿命细菌介导的抗癌疗效的体内评价结果 【0356】 现在参考图9,根据实施例8中描述的方法比较了mp105的不同给药途径。比较了在癌症治疗中肿瘤内和静脉内注射mp105的组合与单独的静脉内注射。 瘤内注射和静脉内注射的剂量分别为7.5×10 7 cfu/小鼠和3×10 7 cfu/小鼠。 图 9 显示,与仅静脉注射 mp105 的小鼠相比,携带皮下 LLC 肿瘤并联合静脉注射和瘤内注射 mp105 (iv + it) 的小鼠在治疗后第 12 天后肿瘤体积惊人地下降 (iv) 。 结果表明,与单独静脉注射相比,两种给药途径(即静脉注射和瘤内注射)的组合显着提高了示例短寿命细菌 mp105 的抗癌功效。 这表明,对于临床应用,例如短寿命细菌mp105可以直接注射到原发癌病灶,同时静脉注射以控制转移病灶。 [0357] 例 17 【0358】 短寿命细菌作为治疗和预防疫苗的评估结果 [0359] 现在参考图10A和10B,评估了示例短寿命细菌mp105用作抗微生物感染疫苗的能力。 mp105 是一种短命细菌,由具有多种毒力因子和抗原的 B2 型大肠杆菌基因工程改造而来,在前面的示例中显示出高度免疫原性。 这连同其 exlA 的异源表达,并由于 hlyCABD 缺失而进一步减弱,使 mp105 可用作受试者体内的安全活疫苗。 图 10A 和 10B 中的结果表明,两种剂量的 mp105 皮下注射显着减少了测试的关键器官(包括肝脏和肺)中的鼠伤寒沙门氏菌。 与 PBS 相比,mp105 使肝脏中的鼠伤寒沙门氏菌数量减少了 73.6%(图 10A),肺中的鼠伤寒沙门氏菌数量减少了 64.6%(图 10B)。 这表明示例短寿命细菌 mp105 可作为针对现有细菌感染的有效治疗性疫苗。 此外,在一只 PBS 处理小鼠的肝脏(100 CFU/10mg 肝组织)、一只 PBS 处理小鼠的心脏(3 CFU/10mg 心脏组织)和一只肺中检测到 CFT073 PBS 处理的小鼠(15 CFU/10mg 肝组织)。 换句话说,50% 的 PBS 处理小鼠被 CFT073 感染。 相比之下,在 mp105 治疗组的任何小鼠中均未检测到 CFT073(卡方检验,P=0.046)。 这表明示例短寿命细菌 mp105 也可作为针对潜在细菌感染的预防性疫苗。 [0360] 因此充分描述了本公开的示例性实施例。 尽管描述涉及特定实施例,但本领域技术人员将清楚本发明可通过这些特定细节的变化来实施。 因此,本公开不应被解释为限于在此阐述的实施例。 【0361】 例如,很明显,可用于治疗受试者的疾病或病症的医学效应物可能是所选细菌菌株的内在效应物。 这些医学效应器可能会根据基因改造的特定设计而被过度表达或抑制。 也可以使用源自其他菌株或来源的医学效应子的异源表达。 【0362】 例如,如上文描述了从染色体中缺失必需基因天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的基因,但可以缺失或突变其他必需基因或营养缺陷型基因以产生短寿命细菌。 这些必需基因可以是但不限于 asd、csrA、thyA、dapA、dapB、ribF、ispH、folA、ftsL、murE、mraY、lpxC、secA、can、heml、map、rpsB 和 tsf。 可根据涉及的相关基因设计合适的引物序列。 【0363】 例如,如上所述从染色体中删除基因是通过λ(λ)-Red重组系统完成的,但也可以使用本领域已知的其他遗传修饰技术,例如限制性内切酶克隆。 【0364】 例如,上述使用的菌株是大肠杆菌菌株,但也可以使用其他菌株,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。 例子包括但不限于芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌。 也可以使用其他细菌,例如拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳杆菌属和乳球菌属。 【0365】 例如,上述的基因修饰是基因缺失,但也可以是基因突变等其他基因修饰。 可以引入两种或多种基因修饰来产生短寿命细菌。 【0366】 例如,上述调节效应器是DAP。 然而,根据所采用的相关基因修饰,可以使用其他调节效应子。 在某些实施方案中,调节效应物无毒且可安全用于受试者。 【0367】 例如,表达细胞毒素ExlA的示例性实施方案如上所述,但也可以使用异源表达具有治疗效果的其他蛋白质或细胞毒素的短寿命细菌的其他构建。 其他蛋白质可以是抗癌效应物或其可用于癌症治疗的组合。 示例性抗癌效应物可以是但不限于选自铜绿假单胞菌外溶素A(ExlA)、蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和空泡毒素的一种或多种基因的表达。 幽门螺杆菌。 【0368】 例如,来自铜绿假单胞菌的ExlA在大肠杆菌中异源表达的示例性实施方案如上所述,但也可以使用其他医学效应物的一种或多种同源或异源基因的表达。 【0369】 例如,组成型启动子oxb18如上所述,但医学效应子的表达可以由其他组成型启动子或诱导型启动子驱动。 示例诱导型启动子可以根据肿瘤特异性微环境如缺氧或低葡萄糖条件被诱导。 [0370] 例如,可以将其他合适的前导序列和终止区或其他序列或基序引入医学效应基因序列以提高蛋白质在细菌中的表达。 【0371】 例如,如上所述的基因exlA在质粒pBAD中表达,但也可以使用其他合适的质粒,并且可以将基因整合到染色体中而不是在质粒中表达。 医学效应基因可以在质粒中表达,但如果将该基因插入细菌染色体,也可以在染色体上表达。 [0372] 例如,上述示例性实施方案中的短寿命细菌如 SH3、SH4、mp107、mp105 和 mp106 可用于治疗受试者的疾病或病症。 然而,这种短命细菌也可用作预防癌症或传染病的疫苗,或用于诊断。 【0373】 例如,治疗癌症的短命细菌的基因表达可能是其他医学效应物或抗癌因子,如CpG、环状二核苷酸、抗原,或其他细胞毒素,如蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素 和幽门螺杆菌空泡毒素,或这些抗癌因子的组合。