技术领域 [0001] 交叉引用 [0002] 本申请要求以下临时申请,2020 年 7 月 2 日提交的美国专利申请第 63/047,793 号和 2020 年 7 月 2 日提交的美国专利申请第 63/047,877 号,2020 年 7 月 2 日提交。优先权是于 2020 年 7 月 2 日提交的美国专利申请序列号 63/047,865 和美国专利申请序列号 63/047,848 要求保护,每一个的内容均通过引用整体并入本文。 [0003] 发明领域 [0004] 本公开涉及用于治疗血管疾病的组合物和方法。 [0005] 序列表 [0006] 本申请包含以 ASCII 格式电子提交的序列表,其全部内容通过引用并入本文。 该 ASCII 副本创建于 2021 年 7 月 2 日,名为 4427-10502_sequence_ST25.txt,大小为 343.976 字节。 背景技术 [0007] 发明背景肌内膜增殖或肌内膜增生是血管系统中的复杂病理过程,其特征在于血管壁中平滑肌细胞的异常增殖。 增殖的平滑肌细胞迁移到内皮下区域并形成增生性病变,这可导致血管腔狭窄和闭塞。 [0008] 心脏同种异体移植物血管病 (CAV) 是一种加速的纤维增生性疾病,影响移植物的肌肉血管,是心脏移植后发病率和死亡率的主要原因。 CAV被认为是由免疫损伤和内皮浸润介导的,导致血管平滑肌细胞增殖和随后的管腔变窄。 CAV 的症状包括移植物的心外膜和心肌内动脉内膜逐渐增厚,通常由免疫介导的血管损伤引起。 到移植后 3 年,CAV 发生在所有心脏移植接受者的至少约三分之一(严重程度不同)中。 CAV通常以血管平滑肌细胞增殖、炎症免疫细胞聚集和脂质沉积为特征。 尽管 CAV 是一种缓慢进展的疾病,但由于移植物神经阻滞,在没有传统症状(例如心绞痛)的情况下,通常会发生急性移植物衰竭、心律失常、梗塞或心源性死亡等并发症。 [0009] 类似的血管病变发生在其他实体器官同种异体移植物中,并且会严重限制它们的长期存活。 由于这些血管病变难以治疗并且几乎可以影响同种异体移植物中的所有血管,因此它们与同种异体移植物接受者的显着发病率和死亡率相关,并且可能需要重复移植。 因此,迫切需要能够预防或减少实体器官同种异体移植物如心脏同种异体移植物中此类血管病程度的有效疗法。 [0010] 烟雾病是1957年在日本首次报道的一种阻塞性脑血管疾病,其特征是颈内动脉(ICA)的上窦部分狭窄,在脑底部形成异常的血管网络。 Moyamoya 是一个通用术语,用于描述影响颅内颈内动脉的两种不同情况; 烟雾病(MMD)是一种导致双侧动脉病变的先天性疾病,在东亚和日本的儿童和成人中更为突出,而烟雾病综合征(MMS)是特发性的,常见于 20 至 40 岁的白人成年人。做。 MMS 没有已知的遗传成分,但由于 MMD 有遗传成分,它通常与糖尿病、狼疮或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。 MMD 和 MMS 的治疗选择包括每天服用阿司匹林、改变生活方式以最大限度地提高脑灌注以及通过手术直接或间接搭桥以恢复血流。 烟雾病主要影响女性 (70-85%) 而不是男性 (15-30%),跨越种族,但最常见于东亚人和高加索人。 烟雾病 (MMD) 在东亚人群中具有家族史的儿童和成人中都很突出。 烟雾病综合征 (MMS) 在 20 多岁/30 多岁的白种人中占主导地位,是特发性的,通常伴有合并症(自身免疫性疾病),但临床文献通常不区分烟雾病和 MMS 患者。 [0011] 慢性血液透析是肾功能不全患者的常用治疗方法。 这些患者经常接受外科手术,其中通常在非惯用手臂中创建人工动静脉瘘 (AVF)。 AVF 为血液透析过程提供了一个持久的血管接入点。 AVF 的常见并发症是 AVF 或 AVF 处或附近的血管阻塞。 这种阻塞可包括,例如,血块和内膜增生,如果不治疗,可导致永久性神经损伤或受影响肢体瘫痪(参见,例如,Asif et al. (2006) Clin J Am Soc Nephol. [0012] 在一个方面,本公开涉及一种用于在具有同种异体移植物的受试者中减少和/或预防同种异体移植物血管病的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以治疗同种异体移植物主题 减少和/或预防血管病。 [0013] 在另一方面,本公开涉及一种用于预防或减轻受试者中与烟雾病相关的一种或多种症状的方法,该方法包括向受试者施用足以与烟雾病相关的量的ENPP1剂或ENPP3剂受试者的疾病预防或减轻一种或多种症状。 [0014] 另一方面,本公开涉及一种用于抑制或预防预期接受或已经接受外科手术治疗烟雾病的受试者的脑血管闭塞的方法,该方法包含足量的 ENPP1 试剂或 ENPP3 试剂.和向受试者施用药剂以抑制或预防受试者的脑血管闭塞。 [0015] 在另一个方面,本公开涉及一种用于在预期经历或经历手术干预作为烟雾病治疗的受试者中抑制或预防不需要的血管平滑肌细胞增殖的方法,该方法包含足量的 ENPP1,并且施用该药剂或 ENPP3 剂施用于受试者以抑制或防止受试者体内不需要的血管平滑肌细胞增殖。 [0016] 在另一方面,本公开还包括一种用于抑制或减缓受试者从 I 期铃木级 MMD 进展到 II 期铃木级 MMD 的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂治疗受试者抑制和/或减缓从 I 期 MMD 到 II 期 MMD 的进展 [0017] 在另一个方面,本公开还包括一种用于抑制或减缓受试者从 I 期铃木级 MMD 进展到 III 期铃木级 MMD 的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂治疗受试者抑制和/或减缓从 I 期 MMD 到 III 期 MMD 的进展 [0018] 在另一个方面,本公开涉及一种用于抑制或预防处于发展烟雾病风险中的受试者的脑血管闭塞的方法,该方法包括向受试者施用足量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以抑制或防止脑血管阻塞。 [0019] 在另一个方面,本公开涉及一种用于抑制或预防处于发展烟雾病风险的受试者中不需要的血管平滑肌细胞增殖的方法,该方法包括向受试者施用足够量的ENPP1试剂或ENPP3试剂。通过使用该方法抑制或防止受试者体内不需要的血管平滑肌细胞增殖。 [0020]在另一个方面,本公开还涉及一种用于治疗处于发展烟雾病风险中的受试者的方法,该方法包括向受试者施用足以治疗受试者的量的ENPP1剂或ENPP3剂。 [0021] 另一方面,本公开涉及抑制或预防患有烟雾病的受试者的脑血管闭塞的方法,该方法包括向受试者施用足以预防脑血管闭塞的量的ENPP1剂或ENPP3剂主题 抑制或防止遮挡。 本公开涉及一种在患有烟雾病的受试者中抑制或预防不需要的血管平滑肌细胞增殖的方法,该方法包括向受试者施用足量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以防止不需要的脑血管在抑制或防止平滑肌细胞增殖。 [0022] 另一方面,本公开涉及治疗患有烟雾病的受试者的方法,包括向受试者施用足以治疗受试者的量的ENPP1剂或ENPP3剂。 [0023] 在另一方面,本公开涉及治疗患有烟雾病的受试者的方法,包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗受试者的烟雾病。 [0024] 在另一方面,本公开涉及治疗患有烟雾病综合征的受试者的方法,包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗受试者的烟雾病综合征。 [0025] 本公开是一种用于减少和/或预防受试者脑动脉中血管平滑肌细胞增殖进展的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以减少血管平滑肌细胞增殖。受试者大脑动脉中的肌肉细胞,减少和/或防止细胞增殖的进展。 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,受试者患有 I、II 或 III 期、IV 级铃木级 MMD。 [0026] 在另一方面,本公开还包括一种用于抑制或减缓受试者从 I 期铃木级 MMD 进展到 II 期铃木级 MMD 的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 制剂或 ENPP3配制以抑制和/或减缓受试者从 I 期 MMD 到 II 期 MMD 的进展。 [0027] 另一方面,本公开的特征在于一种用于治疗患有烟雾病的受试者的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗受试者的外周动脉疾病的步骤。 [0028] 在另一方面,本公开涉及治疗患有烟雾病综合征的受试者的方法,包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗受试者的烟雾病综合征。 [0029] 另一方面,本公开的特征在于减少和/或预防患有烟雾病的受试者的大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂通过向受试者施用,减少和/或防止所述受试者的所述大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0030] 本公开还涉及一种用于减少和/或预防接受脑动脉手术的受试者的脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或一种 ENPP3 试剂,用于减少和/或预防受试者大脑动脉手术部位的大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0031] 本公开还涉及一种用于减少和/或预防接受脑动脉手术的受试者的脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或一种 ENPP3 试剂,用于减少和/或预防受试者大脑动脉手术部位的大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0032] 另一方面,本公开的特征在于一种用于治疗患有烟雾病的受试者的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗受试者的外周动脉疾病的步骤。 在另一方面,本公开涉及治疗患有烟雾病综合征的受试者的方法,包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗受试者的烟雾病综合征。 另一方面,本公开的特征在于减少和/或预防患有烟雾病的受试者的大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂通过向受试者施用,减少和/或防止所述受试者的所述大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0033] 在另一方面,本公开还包括一种用于在放置动静脉透析分流器的部位处或附近减少和/或预防受试者外周血管中血管平滑肌细胞增殖进展的方法,该方法包括将有效量的 ENPP1 制剂或 ENPP3 制剂施用于受试者以减少和/或预防在放置动静脉透析分流器的部位处或周围的外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0034] 另一方面,本公开提供了一种用于减少和/或预防接受外周血管手术的受试者的外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 向受试者施用药剂以减少和/或预防受试者外周血管手术部位的外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展,其中该手术涉及放置动静脉透析分流.包括 [0035] 在另一方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防需要外周血管手术的受试者的外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,其中该手术是动脉-静脉手术透析分流术,其中该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以减少和/或预防受试者外周血管手术部位外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展.做。 [0036] 在另一个方面,本公开还包括一种用于减少和/或防止在外周血管中进行分流术的受试者的外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括有效量的 ENPP1 剂或ENPP3 剂,并向受试者给药以减少和/或防止外周血管中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0037] 在另一方面,本公开的特征在于一种用于减少和/或预防在外周血管中进行分流术的受试者的外周血管狭窄或再狭窄的方法,该方法包括施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3向受试者给药并施用于外周血管以减少和/或预防狭窄或再狭窄。 [0038] 另一方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管的血管病变的方法,其包含有效量的(i)ENPP1试剂或ENPP3试剂和(ii)补体抑制剂。向受试者施用以减少和/或预防受试者中同种异体移植血管的血管病变。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0039]在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管的血管病变的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以减少和/或预防血管病变。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0040] 在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管的血管病变的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以减少和/或预防血管病变。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0041] 在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括有效量的(i) ENPP1 试剂或 ENPP3 试剂(ii))向受试者施用补体抑制剂以减少和/或预防所述受试者的所述同种异体移植血管中血管平滑肌细胞增殖的进展。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0042] 在另一个方面,本公开涉及一种用于在具有同种异体移植物的受试者中减少和/或预防同种异体移植物血管病变(例如,心脏同种异体移植物血管病变)的方法,该方法包括有效量的(i)和施用ENPP1剂或ENPP3 剂和 (ii) 补体抑制剂用于受试者以减少和/或预防受试者的同种异体移植物血管病变。 [0043] 在另一个方面,本公开涉及用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3减少和/或防止受试者的所述同种异体移植血管中血管平滑肌细胞增殖进展的药剂。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0044] 在另一个方面,本公开提供了一种用于在具有同种异体移植物并且已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗的受试者中减少和/或预防同种异体移植物血管病变(例如,心脏同种异体移植物血管病变)的方法。至于该方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以减少和/或预防受试者的同种异体移植物血管病。 在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用补体抑制剂。 [0045] 在另一方面,本公开内容涉及在具有同种异体移植物并且已经接受或正在接受包含 ENPP1 剂或 ENPP3 剂的治疗的受试者中减少和/或预防同种异体移植物血管病变(例如,心脏同种异体移植物血管病变)。通过向受试者施用有效量的补体抑制剂来减少和/或预防受试者的同种异体移植物血管病。 在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用 ENPP1 剂或 ENPP3 剂。 [0046] 在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防在具有同种异体移植物的受试者的同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括有效量的(i)ENPP1剂或 ENPP3 和 (ii) 补体抑制剂用于受试者以减少和/或预防所述受试者的所述同种异体移植物的所述脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0047] 在另一方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有同种异体移植物的受试者的同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,其中该受试者已接受包含补体抑制剂的治疗,或者和该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以减少和/或预防受试者的同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展。 在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用补体抑制剂。 [0048] 在另一个方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有同种异体移植物的受试者的同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,其中该受试者接受包含ENPP1剂或ENPP3剂的治疗.已经接受或正在接受,并且该方法包括向受试者施用有效量的补体抑制剂以减少和/或防止受试者同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展。 在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用 ENPP1 剂或 ENPP3 剂。 [0049] 在另一个方面,本公开还涉及一种用于在具有实体器官移植材料并且正在对该器官移植材料进行手术的受试者中减少和/或预防实体器官移植材料中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括有效量的(i)ENPP1试剂或ENPP3试剂和(ii)补体抑制剂,从而减少和/或预防受试者的实体器官移植材料中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0050] 另一方面,本公开还描述了一种用于延迟或预防具有所述同种异体移植血管的受试者的同种异体移植血管衰竭的方法,或作为其预防的方法,该方法包括有效量的 ENPP1 剂或施用将 ENPP3 剂施用于受试者以延迟或预防或预防受试者的同种异体移植血管失败。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0051] 另一方面,本公开还描述了一种用于延迟或预防具有所述同种异体移植血管的受试者的同种异体移植血管衰竭的方法,或作为其预防的方法,该方法包括有效量的 ENPP1 剂或施用将 ENPP3 剂施用于受试者以延迟或预防或预防受试者的同种异体移植血管失败。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0052] 在另一个方面,本公开的特征还在于一种用于在具有所述实体器官同种异体移植物的受试者中延迟实体器官同种异体移植物失败的方法,所述方法包括有效量的(i) ENPP1 试剂或 ENPP3 试剂和(ii) 和施用补体对受试者延迟实体器官同种异体移植失败的抑制剂。 在一些实施方案中,同种异体移植物失败至少 2 个月(例如,至少 6 个月、至少 1 年、至少 2 年、至少 3 年、至少 5 年、至少 7 年、至少 10 年、甚至超过10年))可能会延迟。 [0053] 在另一方面,本公开的特征还在于一种用于延迟具有所述同种异体移植血管的受试者的同种异体移植血管衰竭的方法,所述方法包括有效量的(i) ENPP1 试剂或 ENPP3 试剂和(ii) )施用对受试者施用补体抑制剂以延缓受试者中同种异体移植血管的衰竭。 在一些实施方案中,同种异体移植物失败至少 2 个月(例如,至少 6 个月、至少 1 年、至少 2 年、至少 3 年、至少 5 年、至少 7 年、至少 10 年、甚至超过10年))可能会延迟。 [0054]另一方面,本公开的特征还在于一种用于延迟具有实体器官同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植失败的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗延迟实体器官移植的受试者同种异体移植失败。 在一些实施方案中,同种异体移植物失败至少 2 个月(例如,至少 6 个月、至少 1 年、至少 2 年、至少 3 年、至少 5 年、至少 7 年、至少 10 年、甚至超过10年))可能会延迟。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0055] 在另一方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有实体同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄的方法,该方法包括有效量的(i)ENPP1剂或向受试者施用ENPP3剂和(ii)补体抑制剂以减少和/或预防实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄。 [0056] 在另一方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有实体同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄的方法,该方法包括有效量的ENPP1剂或ENPP3剂和向受试者施用补体抑制剂以减少和/或预防实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0057] 在另一方面,本公开的特征还在于延迟或预防实体器官同种异体移植排斥的方法,或作为其预防,所述方法包括有效量的(i)延迟或预防实体器官同种异体移植排斥通过向受试者施用ENPP1剂或ENPP3剂和(ii)补体抑制剂在受试者中。 [0058] 在另一个方面,本公开的特征还在于延迟或预防实体器官同种异体移植排斥反应的方法或作为其预防的方法,其中该受试者是 ENPP1 剂或 ENPP3 剂,正在接受或已经接受治疗包含药剂,该方法包括向受试者施用有效量的补体抑制剂以延迟或预防受试者的实体器官同种异体移植排斥反应。 在一些实施例中,该方法还可以包括向受试者施用ENPP1剂或ENPP3剂。 [0059] 在另一个方面,本公开的特征还在于延迟或预防具有所述同种异体移植血管的受试者中的同种异体移植血管排斥的方法,或作为其预防的方法,包括有效量的(i)施用ENPP1剂或ENPP3药剂和(ii)补体抑制剂,用于受试者延缓或防止受试者中所述血管的排斥。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0060] 在另一方面,本公开的特征还在于延迟或预防具有同种异体移植血管的受试者排斥同种异体移植血管的方法,或作为其预防的方法,其中受试者包含 ENPP1 剂或正在接受或已经接受治疗包含 ENPP3 剂,该方法包括向受试者施用有效量的补体抑制剂以延迟或预防受试者中的同种异体移植血管排斥。 在一些实施例中,该方法还可以包括向受试者施用ENPP1剂或ENPP3剂。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0061] 在另一方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防具有同种异体移植物的受试者的同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括将有效量的 ENPP1 剂施用至受试者.施用以减少和/或预防所述受试者的所述同种异体移植物的所述脉管系统中所述血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0062] 在另一方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有实体同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄的方法,该方法包括有效量的ENPP1剂或ENPP3剂和向受试者施用以减少和/或预防实体器官同种异体移植物中的狭窄或再狭窄。 [0063] 在另一个方面,本公开涉及一种在具有实体同种异体移植物的受试者中延长实体器官同种异体移植物存活的方法,该方法包括向受试者施用足量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以延长实体器官同种异体移植物的存活。 [0064] 在另一个方面,本公开涉及一种用于在具有实体同种异体移植物的受试者中抑制或预防实体器官同种异体移植物中的血管病变的方法,该方法包括向受试者施用足够量的ENPP1试剂或ENPP3试剂。抑制或预防受试者的实体器官同种异体移植物中的血管病变。 [0065] 在另一个方面,本公开涉及一种用于抑制或预防具有血管同种异体移植物的受试者的同种异体移植血管血管病变的方法,该方法包括向受试者施用足以预防或抑制同种异体移植物血管病。 [0066] 在另一方面,本公开涉及一种用于抑制或预防血管平滑肌细胞在具有血管同种异体移植物的受试者的同种异体移植血管中增殖的方法,该方法包括提供足够量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂至主题和给药以预防或抑制同种异体移植血管中的血管平滑肌细胞增殖。 [0067] 在另一个方面,本公开涉及在具有血管同种异体移植物的受试者中延长同种异体移植血管存活的方法,该方法包括向受试者施用足以延长存活的量的ENPP1剂或ENPP3剂的血管。 [0068] 在另一个方面,本公开还涉及一种用于在具有实体器官移植材料并且正在对该器官移植材料进行手术的受试者中减少和/或预防实体器官移植材料中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括有效量和向受试者施用ENPP1制剂以减少和/或预防受试者的实体器官移植材料中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0069] 在另一个方面,本公开的特征还在于一种用于或作为用于预防具有所述实体器官同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植物失败的方法,该方法包括有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂。预防或预防受试者的实体器官同种异体移植失败。 [0070] 另一方面,本公开的特征还在于一种用于延迟具有实体器官同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植失败的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3剂以治疗延迟实体器官移植的受试者同种异体移植失败。 在一些实施方案中,同种异体移植物失败至少 2 个月(例如,至少 6 个月、至少 1 年、至少 2 年、至少 3 年、至少 5 年、至少 7 年、至少 10 年、甚至超过10年))可能会延迟。 [0071]另一方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管的血管病变的方法,其包含有效量的(i)ENPP1试剂或ENPP3试剂和(ii)补体抑制剂。向受试者施用以减少和/或预防受试者中同种异体移植血管的血管病。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0072] 在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管的血管病变的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以减少和/或预防血管病变。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 [0073] 在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管的血管病变的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以减少和/或预防血管病变。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0074] 在另一个方面,本公开涉及用于减少和/或预防受试者的同种异体移植血管中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP1剂或ENPP3减少和/或防止受试者的所述同种异体移植血管中血管平滑肌细胞增殖进展的药剂。 在一些实施例中,血管是动脉。 在一些实施例中,血管是静脉。 在一些实施方案中,受试者已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗。 在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用补体抑制剂。 [0075] 在另一个方面,本公开涉及一种用于在具有同种异体移植物的受试者中减少和/或预防同种异体移植物血管病变(例如,心脏同种异体移植物血管病变)的方法,该方法包括有效量的(i)和施用ENPP1剂或ENPP3 剂和 (ii) 补体抑制剂用于受试者以减少和/或预防受试者的同种异体移植物血管病变。 [0076] 在另一个方面,本公开提供了一种用于在具有同种异体移植物并且已经接受或正在接受包含补体抑制剂的治疗的受试者中减少和/或预防同种异体移植物血管病变(例如,心脏同种异体移植物血管病变)的方法。至于该方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP1 剂或 ENPP3 剂以减少和/或预防受试者的同种异体移植物血管病。 在一些实施方案中,该方法还包括向受试者施用补体抑制剂。 [0077] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,药剂在手术之前、期间和/或之后施用。 [0078] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,药剂在分流器放置之前、分流器放置期间和/或分流器放置之后施用。 [0079] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,手术和/或分流器放置还包括将透析导管引入受试者中。 [0080] 在一些实施方案中,本文所述的任何方法可包括向受试者施用一种或多种抗凝血剂、抗生素和抗高血压药。 [0081] 在一些实施例中,本文所述的任何方法可包括监测对象的分流管阻塞,例如血栓形成。 [0082] 在一些实施方案中,本文所述的任何一种方法还包括向患者施用一种或多种免疫抑制剂。 [0083] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1试剂包含保留酶活性的ENPP1变体。 [0084] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3试剂包含保留酶活性的ENPP3变体。 [0085] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,受试者正在或正在被施用一种或多种抗凝血剂、抗生素和抗高血压药。 [0086] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,受试者已经接受和/或正在接受与实体器官同种异体移植相结合的免疫抑制疗法,例如一种或多种免疫抑制剂。 [0087] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,受试者已经接受和/或正在接受一种或多种他汀类药物、血管扩张剂、抗凝剂(例如,阿司匹林)和免疫抑制剂连同实体器官同种异体移植物移植。 [0088] 在一些实施方案中,本文所述的任何一种方法还包括向患者施用一种或多种他汀类药物、血管扩张剂、抗凝剂(例如,阿司匹林)和免疫抑制剂。 [0089] 在一些实施例中,本文所述的任何方法还包括对实体器官同种异体移植物进行血运重建手术。 [0090] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,预期受试者将经历、已经经历或正在经历实体器官同种异体移植物的血运重建。 [0091] 在一些实施例中,血运重建包括血管成形术、搭桥术和/或支架放置。 [0092] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,药剂在手术之前、期间和/或之后施用。 [0093] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,手术包括球囊血管成形术和/或支架的放置。 [0094] 在一些实施例中,本文所述的方法还包括进行外科手术。 [0095] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1试剂包含ENPP1多肽。 [0096] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1试剂包含编码ENPP1多肽的核酸。 [0097] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1试剂包含病毒载体,所述病毒载体包含编码ENPP1多肽的核酸。 [0098] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1多肽包含ENPP1的细胞外结构域。 [0099] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1多肽包含ENPP1的催化结构域。 [0100] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸99-925。 [0101] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1多肽包含异源蛋白质。 [0102] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质增加ENPP1多肽在哺乳动物中的循环半衰期。 [0103] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质是免疫球蛋白分子的Fc区。 [0104] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,免疫球蛋白分子是IgG1分子。 [0105] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质是白蛋白分子。 [0106] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质位于ENPP1多肽的羧基末端。 [0107] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,ENPP1剂包含接头。 [0108] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,接头将ENPP1多肽和异源蛋白质分开。 [0109] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,接头包含以下氨基酸序列:(GGGGS) _n ,其中 n 是从 1 到 10 的整数。 [0110] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1剂被皮下施用至受试者。 [0111] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP1剂静脉内施用至受试者。 [0112] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,受试者是烟草使用者、患有高血压、具有升高的胆固醇或甘油三酯水平、患有糖尿病、患有肾病或肥胖。 [0113] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,受试者患有I期、II期或III期铃木级MMD。 在另一方面,本公开的特征在于通过向受试者施用有效量的 ENPP3 制剂抑制和/或减缓受试者从第一阶段铃木级 MMD 到第三阶段铃木级 MMD 的进展。 [0114] 在另一方面,本公开的特征在于一种用于减少和/或预防需要针对所述脑动脉进行手术的受试者的脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,其中该受试者患有烟雾病;该方法包括施用向受试者施用有效量的ENPP1试剂或ENPP3试剂以减少和/或预防受试者大脑动脉手术部位处的大脑动脉中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0115] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,大脑动脉是颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、大脑中动脉(MCA)和大脑前动脉(ACA)中的一个或多个。 [0116] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3剂在支架放置之前、支架放置期间和/或支架放置之后施用。 [0117] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,实体器官同种异体移植物是心脏同种异体移植物。 [0118] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,实体器官同种异体移植物是肺同种异体移植物、肝脏同种异体移植物或肾脏同种异体移植物。 [0119] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,补体抑制剂是补体组分C5抑制剂,例如抗C5抗体,例如依库珠单抗或rabulizumab-cwvz。 [0120] 在一些实施方案中,补体抑制剂是补体成分 C1 (包括 C1s 和 C1q)、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8 和/或 C9 的抑制剂,例如通过结合这些补体中的任何一种组件是一种抗体,它抑制的功能 [0121] 在一些实施方案中,补体抑制剂是坎普他汀或其类似物。 [0122] 在一些实施方案中,补体抑制剂是C5a抑制剂、C5aR抑制剂、C3抑制剂、因子D抑制剂、因子B抑制剂、C4抑制剂、C1q抑制剂、C1s抑制剂或其任何组合。 [0123] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,补体抑制剂是凝集素途径抑制剂,例如抗MASP2抗体(例如,OMS721)。 [0124] 在另一方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防具有实体同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄的方法,该方法包括将有效量的 ENPP1 剂施用至主题.施用以减少和/或预防所述实体器官同种异体移植物的所述脉管系统中的狭窄或再狭窄。 [0125] 在另一个方面,本公开涉及一种用于减少和/或预防患有同种异体移植物血管病的受试者的同种异体移植物血管病的方法,该方法包括向受试者施用有效量的 ENPP3 剂以引起受试者:治疗同种异体移植物血管病. [0126] 在另一个方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有同种异体移植物的受试者的同种异体移植物的脉管系统中血管平滑肌细胞增殖的进展的方法,该方法包括将有效量的ENPP3剂施用至受试者.施用以减少和/或预防所述受试者的所述同种异体移植物的所述脉管系统中所述血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0127] 在另一个方面,本公开还涉及一种用于减少和/或预防实体器官移植材料中的血管平滑肌细胞增殖在具有实体器官移植材料并且正在对该器官移植材料进行手术的受试者中的进展的方法,该方法包括向受试者施用有效量的ENPP3试剂以减少和/或预防受试者的实体器官移植材料中血管平滑肌细胞增殖的进展。 [0128] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,药剂在手术之前、期间和/或之后施用。 [0129] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,手术包括球囊血管成形术和/或支架的放置。 [0130] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,受试者不具有 ENPP1 缺陷。 [0131] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3试剂包含ENPP3多肽。 [0132] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3试剂包含编码ENPP3多肽的核酸。 [0133] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3试剂包含病毒载体,所述病毒载体包含编码ENPP3多肽的核酸。 [0134] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3多肽包含ENPP3的细胞外结构域。 [0135] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3多肽包含ENPP3的催化结构域。 [0136] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸49至875。 [0137] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3多肽包含异源蛋白质。 [0138] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质增加ENPP3多肽在哺乳动物中的循环半衰期。 [0139] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质是免疫球蛋白分子的Fc区。 [0140] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,免疫球蛋白分子是IgG1分子。 [0141] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质是白蛋白分子。 [0142] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,异源蛋白质位于ENPP3多肽的羧基末端。 [0143]在本文所述的任何方法的一些实施例中,ENPP3剂包含接头。 [0144] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,接头将ENPP3多肽和异源蛋白质分开。 [0145] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,接头包含以下氨基酸序列:(GGGGS)n,其中n是1至10的整数。 [0146] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3剂被皮下施用至受试者。 [0147] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中,ENPP3剂静脉内施用至受试者。 [0148] 在本文所述的任何方法的一些实施例中,受试者是烟草使用者、患有高血压、具有升高的胆固醇或甘油三酯水平、患有糖尿病、患有肾病或肥胖。 在本文所述的任何方法的一些实施例中,受试者患有脑动脉闭塞。 [0149] 在另一方面,本公开涉及用于减少和/或预防具有实体同种异体移植物的受试者的实体器官同种异体移植物的脉管系统中的狭窄或再狭窄的方法,该方法包括将有效量的ENPP3剂施用至主题.施用以减少和/或预防所述实体器官同种异体移植物的所述脉管系统中的狭窄或再狭窄。 [0150] 根据以下详细描述和权利要求,本公开的其他特征和优点将变得显而易见。 附图简要说明 [0151] 图1 显示移植前后对照和实验小鼠的预防性治疗方案的示意图。 在主动脉移植前 7 天,每天以 10 mg/kg 体重的示例性剂量皮下注射 ENPP1-Fc 来治疗实验小鼠。 对照组注射含有 Tris 缓冲盐水 (pH 7.4) 的载体。 然后,在植入后第 28 天解剖所有小鼠,小鼠大约 10 周大。 图 2 图为小鼠心脏移植示意图。 它还显示了移植主动脉 5 μm 切片的形态学测量值。 计算中值面积、内膜面积和内膜/介质比(I/M 比)。 图 3 显示异位心脏移植猪模型的示意图。 图 3(A) 显示了在心脏骤停后使用冷心脏停搏液 (Plegisol) 采集的供体心脏。 图 3(B) 显示移植物保持在冰盐水浆液中,并通过产生房间隔缺损和功能障碍的二尖瓣、最大限度地减少左心室萎缩和腔内血栓形成来为植入做准备。 图 3(C) 显示了接受者的下腔静脉 (IVC),并分离出肾下主动脉。 图 3(D) 显示了通过将供体肺动脉与受体的下腔静脉吻合以及将供体升主动脉与受体的腹主动脉吻合来移植心脏的移植。 使用 (E) 心电图 (ECG) 和 (F) 超声心动图 (UCG) 监测移植物功能。 箭头表示异位心脏同种异体移植引起的电尖峰。 ( Hsu 等,移植。 2018 年 12 月; 102(12): 2002-2011 .) 图 4 是在支架植入后第 14 天和第 42 天通过血管造影术捕获的代表性深动脉图像的一系列照片。 与第 14 天的血管形态相比,两个对照图像显示第 42 天由于内膜增生引起的深度狭窄。 相反,在用 ENPP1-Fc 处理的动物中,在第 14 天和第 42 天之间几乎没有观察到深层形态的可见变化。 血管内支架的上边界和下边界在每张图片中由矩形标识。 图 5 是在支架植入后第 14 天和第 42 天通过光学相干断层扫描 (OCT) 捕获的代表性深动脉图像的一系列照片。 与第 14 天的血管形态相比,两张对照图像显示第 42 天深核内明显的内膜增厚。 相反,在用 ENPP1-Fc 处理的动物中,在第 14 天和第 42 天之间几乎没有观察到可见的内膜增厚。 狭窄程度在第 42 天的照片中突出显示。 图 6 是描述在第 14 天和第 42 天用 ENPP1-Fc(治疗)或给定载体对照(对照)治疗的猪的心脏狭窄面积百分比的条形图,如通过 OCT 测量的。 图 7 显示了在脑部手术诱导 MMD 之前和之后控制和实验小鼠的预防性治疗方案的示意图。 实验小鼠在手术前 7 天每天皮下注射 ENPP1-Fc,典型剂量为 10 mg/kg 体重。 对照组注射含有 Tris 缓冲盐水 (pH 7.4) 的载体。 然后,在植入后第 28 天解剖所有小鼠,小鼠大约 10 周大。 图 8 展示了颈内动脉狭窄生成MMD模型的过程。 图 8A) 显示了鼠标在手术过程中的方向。 头部(牙齿)、前爪和尾巴被固定,颈部中线(红色虚线)被切开。 白色方框代表正在跟踪的图像区域。 图 8B) 显示了暴露气管、胸锁乳突肌 (SCM) 和二腹肌后腹 (PBD) 的颈部区域的开口。 图 8C) 显示缝合线 (S1-2) 放置以缩回 SCM 和 PBD 以暴露常见的颈内动脉和颈外动脉(CCA、ICA、ECA)。 8D) 显示枕动脉 (OA)、迷走神经 (VN) 和 ICA 的识别。 8E) 是一条虚线,显示 OA 的缝合结扎和切割以更好地暴露 ICA。 8F) 显示了 ICA 暴露并使用 6±0 缝线分离的切断 OA。 8G) 显示了从 ICA 到 ECA 的微线圈排列(如 H 所示)。 (Roberts 等人,颈内动脉狭窄:烟雾病综合征的新型手术模型,PLoS One。2018;13(1):e0191312。) 图 9 是血液透析血液从包含血液透析分流器的受试者手臂流出,经过压力监测器、血液泵和肝素泵以防止凝块,然后进入管道的图表。 血液在进入透析器或过滤器之前流过另一个压力监测器。 过滤后的血液继续通过静脉压力监测器、气阱和空气检测器以及空气检测器夹,然后返回到受试者的手臂。 图 10 是物体的右上胸部区域 (100) 移植段位于 (2) 的出现 植入式透析部分 (2) 银植入式透析分流器 (2) 它也可以植入身体的其他部位,只要它被适当地植入近端,通常是 6 到 8 毫米,进入中等大小的动脉以与血管一起使用。 可植入透析分流器优选地由在单一结构中相互连接的动脉端口组成。 (4) 和静脉端口 (6) 包括 在其他实施例中,端口 (4) , (6) 可以是单独的结构,其可以包括能够相互附接的特征。 动脉移植物 (12) 通常是一个动脉端口 (4) 而它延伸穿过静脉移植物 (18) 银脉口 (6) 延伸自 在移植过程中,动脉移植物 (12) 最好在每一端都有一条动脉 (26) 当连接到静脉移植物的侧壁时 (18) 静脉的尽头 (34) 连接到 在另一个实施例中,动脉移植物 (12) 动脉由一对端端吻合 (26) 可以连接到 还有静脉移植 (18) 允许进入中央静脉系统的静脉 (34) 它可以采用插入静脉导管的静脉导管的形式。 透析动脉导管 (102) 炉干口 (4) 轻敲静脉导管 (104) 这可以通过用 动脉和静脉导管( 102 , 104 ), 每个都连接到一个弹射器。 实施发明的具体细节 [0152] 正义 [0153]除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。 尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试,但描述了优选的方法和材料。 [0154] 为了清楚起见,“ NPP1 “ 和 ” ENPP1 “指相同的蛋白质并且在本文中可互换使用。如本文所用,术语“ ENPP1蛋白 “ 或者 ” ENPP1多肽 "指的是ENPP1基因编码的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1蛋白,它可以裂解ATP产生PPi,也可以减少软组织异位钙化。 [0155] ENPP1 蛋白是一种 II 型跨膜糖蛋白,可切割多种底物,包括核苷酸和核苷酸糖磷酸二酯键以及核苷酸和核苷酸糖焦磷酸键。 ENPP1 蛋白具有跨膜结构域和可溶性胞外结构域。 细胞外结构域进一步细分为生长调节素B结构域、催化结构域和核酸酶结构域。 野生型 ENPP1 的序列和结构在 Braddock 等人的 PCT 申请公开号 WO 2014/126965 中有详细描述,该专利通过引用整体并入本文。 [0156] 本文使用的 ENPP1 多肽包括 ENPP1 的变体,包括表现出 ENPP1 酶活性的多肽、保留 ENPP1 酶活性的 ENPP1 突变体、ENPP1 片段或表现出 ENPP1 酶活性的缺失变体。 如下所示,ENPP1 酶活性是指 ENPP1 多肽将三磷酸腺苷 (ATP) 裂解成血浆焦磷酸盐 (PPi) 的能力。 [0157] 如本文所用,ENPP3多肽包括ENPP3的变体,包括表现出ATP裂解酶活性的多肽、保留ATP裂解酶活性的ENPP3突变体、ENPP3的片段或表现出ATP裂解酶活性的缺失变体。 如下所示,ATP 裂解酶活性是指 ENPP3 多肽将三磷酸腺苷 (ATP) 裂解成血浆焦磷酸盐 (PPi) 的能力。 [0158] ENPP1和ENPP3多肽、其突变体或突变体片段的一些实例包括国际PCT申请公开号WO/2014/126965-Braddock等人、WO/2016/187408-Braddock等人、WO/2017/087936-Braddock等人和 WO2018 /027024-Braddock 等人,所有这些都通过引用整体并入本文。 [0159] ENPP1多肽或ENPP3多肽 酶活性 "定义为对 AMP 和 PPi 具有 ATP 水解活性和/或对 ADP 和 AMP 具有 AP3a 水解活性。NPP1 和 NPP3 容易将 ATP 水解为 AMP 和 PPi。底物,NPP1 可以通过酶促反应的 HPLC 分析证明可裂解 ATP,并使用 ATP、AMP 和 ADP 标准品确认底物和反应产物的身份。在 NPP1 存在的情况下,ATP 底物会随着时间的推移而降解, 随着酶产物 AMP 的积累。使用不同浓度的 ATP 底物, 在存在 ATP 的情况下推导出 NPP1 的初始速率, 并将数据呈现为酶速率曲线拟合得出常数: 在生理pH、NPP1的动力学速率常数为Km=144 μM和kcat _t =7.8s ^-1 是。 [0160] 如本文所用,术语“ ENPP1前体蛋白 “是指在 ENPP1 N-末端具有其信号肽序列的 ENPP1 多肽。在蛋白水解后,信号序列从 ENPP1 裂解以提供 ENPP1 蛋白。在本公开中有用的信号肽序列包括白蛋白信号序列,非常 Azurocidin 信号序列、ENPP1信号肽序列、ENPP2信号肽序列、ENPP7信号肽序列和/或ENPP5信号肽序列。 [0161] 如本文所用,术语“ ENPP3前体蛋白 “是指在 ENPP3 N-末端具有其信号肽序列的 ENPP3 多肽。在蛋白水解后,信号序列从 ENPP3 裂解以提供 ENPP3 蛋白。在本公开中有用的信号肽序列包括白蛋白信号肽序列、天青苷信号肽序列、ENPP1信号肽序列、ENPP2信号肽序列、ENPP7信号肽序列和/或ENPP5信号肽序列。 [0162] 如本文所用,术语“ 天青苷信号肽序列 ”指来源于人天青苷的信号肽。天青苷又称为阳离子抗菌蛋白CAP37或肝素结合蛋白(HBP),是一种在人体中由AZU1基因编码的蛋白质。天青苷(Azurocin)编码的核苷酸序列信号肽 MTRLTVLALLAGLLASSRA (SEQ ID NO: 42) 与 NPP1 或 NPP3 基因的核苷酸序列融合,其在编码时产​​生 ENPP1 前体蛋白或 ENPP3 前体蛋白。高表达 CHO 细胞系,Kober 等人。 , Biotechnol Bioeng. 2013 年 4 月;110(4):1164-73) [0163] 如本文所用,术语“ ENPP1-Fc 构造 "封装 ENPP1 (例如,ENPP1 的细胞外结构域)重组融合和/或化学缀合(包括共价和非共价连接)到 IgG 分子(优选人 IgG)的 FcR 结合结构域。在某些实施方案中,C ENPP1 的 - 末端融合或缀合到 FcR 结合域的 N-末端。 [0164] 如本文所用,术语“ ENPP3-Fc 构造 "是指ENPP3重组融合和/或化学缀合(包括共价和非共价连接)到IgG分子(优选人IgG)的FcR结合结构域。在某些实施方案中,ENPP1的C端融合或缀合到FcR 结合域的 N 端。 [0165] 如本文所用,术语“ Fc “指人 IgG(免疫球蛋白)Fc 结构域。IgG 的亚型如 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 被考虑用作 Fc 结构域。” Fc区或Fc多肽 “是 IgG 分子的一部分,与通过木瓜蛋白酶消化 IgG 分子获得的可结晶片段相关。Fc 区包含 IgG 分子两条重链的 C 端半部分,通过二硫键连接。它具有抗原-结合活性,但包含补体和 Fc 受体的结合位点,包括碳水化合物部分和 FcRn 受体 Fc 片段是整个第二个恒定域 CH2(根据 Kabat 编号系统,人 IgG1 的残基 231-340)和第三个常数结构域 CH3(残基 341-447)术语“IgG 铰链-Fc 区”或“铰链-Fc 片段”从 Fc 区(残基 231-447)和 Fc 区的 N 端延伸。指的是区域由铰链区(残基 216-230)组成的 IgG 分子 术语“恒定域”是指含有抗原结合位点的可变域,它具有比免疫球蛋白其他部分更保守的氨基酸序列。指的是部分免疫球蛋白分子的组成。恒定结构域包含重链的 CH1、CH2 和 CH3 结构域以及轻链的 CHL 结构域。 [0166] 如本文所用,术语“ 功能等效的变体“,如本文所用,涉及与 ENPP1 或 ENPP3 的序列(如上定义)基本同源的多肽,并分别保留 ENPP1 或 ENPP3 的酶活性和生物学活性。确定是否保留生物学活性的方法ENPP1 或 ENPP3 的活性对本领域技术人员来说是众所周知的,并且包括在本申请的实验部分中使用的任何测定。特别是,由病毒载体递送的 ENPP1 或 ENPP3 的功能等同变体包括在本公开中。 [0167] ENPP1 或 ENPP3 的功能等同变体是分别与天然 ENPP1 或 ENPP3 基本上同源的多肽。 表述“基本上同源”是指蛋白质序列分别至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%,以上述 ENPP1 或 ENPP3 序列。至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 的同一性程度,并且仍然至少 50%、55%、60%、70% , 80% 的野生型 ENPP1 或 ENPP3 蛋白用于 ATP 裂解 或保留 90% 活性时的蛋白质序列。 [0168] 使用本领域技术人员熟知的计算机算法和方法确定两个多肽之间的同一性程度。 两个氨基酸序列之间的同一性优选通过 BLASTP 算法确定(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)),但也可以使用其他类似的算法。 BLAST 和 BLAST 2.0 用于确定具有本文所述参数的序列同一性百分比。 用于执行 BLAST 分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。 [0169] ENPP1 或 ENPP3 功能等效的变体 分别描述了将用于产生 ENPP1 或 ENPP3 的宿主细胞中的密码子偏好,并且可以通过替换多核苷酸中的核苷酸来获得。 这种“密码子优化”可以通过计算机算法来确定,包括密码子频率表,例如威斯康星大学麦迪逊,威斯康星州麦迪逊大学提供的密码子偏好包版本 9.0 提供的“Human high.cod”。 预期 ENPP1 或 ENPP3 多肽的变体保留至少 50%、55%、60%、70%、80% 或 90% 的野生型 ENPP1 或 ENPP3 蛋白的 ATP 裂解活性。 [0170] 如本文所用,术语“ ENPP1片段 “是指至少具有 ENPP1 催化结构域或全长 NPP1 的活性子序列的 ENPP1 蛋白的片段或部分,以蛋白质形式或以编码它的核酸形式施用。 [0171] 如本文所用,术语“ ENPP1配方 “一种 ENPP1 融合蛋白或 ENPP1 片段,包含至少一个能够通过裂解三磷酸腺苷 (ATP) 产生血浆焦磷酸盐 (Ppi) 的催化结构域,或至少一个能够通过酶促裂解 ATP 产生 PPi 的催化结构域。ENPP1 多肽或融合蛋白包含编码它的多核苷酸例如cDNA或RNA的蛋白质或ENPP1片段,或包含编码它的多核苷酸的载体例如病毒载体。 [0172] 如本文所用,术语“ 野生型 “是指从自然发生的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是种群中最常观察到的,因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式人 NPP1 或 NPP3 基因。对比 如本文所用,术语“功能等同”是指与野生型相比,NPP1 或 NPP3 基因或基因产物在序列和/或功能特性(即改变的特征)方面表现出改变基因或基因产物。通过与野生型基因或基因产物相比,它们具有改变的特征(包括改变的核酸序列)这一事实来识别它们。 [0173] 如本文所用,当提及诸如量、持续时间等的可测量值时,“约”是指从指定值起超过+20%或+10%,只要这种变化适合于执行所公开的优选+5%,甚至更优选+1%,甚至更优选+0.1%。 [0174] 如本文所定义,术语“ 部分 “是指能够与ENPP1或ENPP3多肽共价或非共价连接并赋予与其连接的蛋白质所需特性的化学成分或生物分子。例如,术语部分是聚天冬氨酸或聚谷氨酸。 (4-20 个连续的 asp 或 glu 残基)、骨靶向肽或延长 ENPP1 或 ENPP3 多肽半衰期的分子聚合物 (HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物 (PAS)、弹性蛋白样肽 (ELP) 和明胶样蛋白 (GLK)。 [0175] 如本文所定义,术语“ 目的 ", " 个人 “ 或者 ” 病人 "优选为,例如病理性钙化和病理性骨化疾病,例如婴儿全身性动脉钙化(GACI)、2型常染色体隐性低磷血症性佝偻病(ARHR2)、婴儿特发性动脉钙化(IIAC)、颈后韧带骨关节炎(OPLL) 、低血磷性佝偻病、骨关节炎、动脉粥样硬化斑块钙化、遗传性和非遗传性骨关节炎、强直性脊柱炎、随着年龄增长而发生的动脉硬化以及抗性钙形成(终末期肾病引起的钙化防御)和损失-NPP1 基因中的功能突变,例如导致过早衰老的功能丧失突变。此类患者没有维持健康受试者血浆焦磷酸盐 (PPi) 正常水平所需的 NPP1 量。将具有指定血清中 NPP1 的正常水平,PPi 的正常水平对应于 2-3 μM。 [0176] 如本文所用,术语“ 血浆焦磷酸 (PPi) 水平 “是指存在于动物血浆中的焦磷酸盐的量。在某些实施方案中,动物包括大鼠、小鼠、猫、狗、人、牛和马。有多种测量 PPi 的方法,其中之一是通过使用经过修饰的尿苷二磷酸葡萄糖 (UDPG) 焦磷酸化酶进行酶测定(Lust & Seegmiller, 1976, Clin. Chim. Acta 66:241-249;Cheung & Suhadolnik, 1977, Anal. Biochem. 83:61-63)。 [0177]通常,健康人类受试者的血浆 PPi 水平范围为约 1 μM 至约 3 μM,并且在一些情况下为 1-2 μM。 ENPP1 表达缺陷的受试者表现出低 ppi 水平,低于正常水平至少 10%,低于正常水平至少 20%,低于正常水平至少 30%,低于正常水平至少 40%,高于正常水平范围为 at低于正常值至少 50%、低于正常值至少 60%、低于正常值至少 70%、低于正常值至少 80%及其组合。 在患有婴儿期全身动脉钙化 (GACI) 的患者中,发现 ppi 水平低于 1 μm,在某些情况下低于可检测水平。 在患有弹性假黄瘤 (PXE) 的患者中,ppi 水平低于 0.5 μm。 (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014 Sep;34(9):1985-9;Braddock 等人,Nat Commun. 2015;6:10006。) [0178] 如本文所用,术语“PPi”是指无机焦磷酸盐。 [0179] “ 低水平 PPi “指的是受试者的血浆焦磷酸盐 (PPi) 水平至少低于 2% - 5% 的正常水平的 0.1% - 0.99%。健康人类受试者的正常血浆 PPi 水平为 1.8 至 2.6 μM。 + / - 在 0.1 μM 范围内(关节炎和风湿病,第 22 卷,第 8 期(1979 年 8 月)) [0180] 如本文所用,术语“ 非手术组织损伤 “涉及使用银器、钝器或尖锐物体(例如刀)的物理改变,机械损伤(例如从高处坠落),重型机械对工作场所造成的损坏,或车辆损坏(例如在创伤事件中发生的车祸对组织造成的损伤),包括但不限于仅限于或持续损害血管。 [0181] 如本文所用,术语“ 心肌梗塞 “是指因动脉内壁斑块的形成而导致的心肌永久性损伤,该斑块减少了流向心脏的血液,并因供氧不足而损害了心肌。心肌梗死的症状包括从心脏传来的疼痛左臂至颈部、胸痛、呼吸急促、出汗、恶心、呕吐、心律异常、焦虑、疲劳、虚弱、压力大、抑郁等因素。 [0182] 如本文所用,术语 “烟雾病” 或者 “烟雾病综合症” 脑动脉狭窄闭塞性疾病,表现为平滑肌细胞增生,内膜增生,导致动脉Willis环周围狭窄闭塞。 这伴随着皮质下区域类似“烟雾”(“moyamoya”)的新血管的发育。 MMD 发生在儿童和成人中,在 5 到 10 岁之间有两个高峰,在 30 到 50 岁之间有第二个高峰。 常见症状包括头痛或头晕、肢体或身体一侧无力或瘫痪、语言问题 - 无法说话或记住单词、感觉或认知障碍、不自主运动、癫痫发作或意识丧失、视力问题、中风和大脑出血。有。 80% 的烟雾病病例是 RNF213 和/或 R4810K 突变的携带者。 MMD 和 MMS 的治疗选择包括每天使用阿司匹林、改变生活方式以最大限度地提高脑灌注,以及通过手术直接或间接搭桥以恢复血流。 [0183] 我们修订了确定性 MMD 的诊断标准,以包括同时存在双侧和单侧颈动脉狭窄 (ICA) 表现且脑底部血管网络异常的患者。 用于对患者群体进行分级的 Suzuki 系统用于 MMD。 MMD 的明确诊断需要单侧病例的导管血管造影,而双侧病例可以通过导管血管造影或磁共振成像/血管造影 (MRI/MRA) 立即诊断。 [0184] 如本文所用, 《脑血管阻塞》 该短语指的是大脑中血管的暂时性或永久性闭塞。 由于血管变窄(狭窄)、血块形成(血栓形成)、阻塞(栓塞)或血管破裂(出血),可能会发生血流受限。 缺乏足够的血流(缺血)会影响脑组织并导致中风。 [0185] 如本文所用,术语 “铃木分类系统” 使用 Suzuki J, Takaku A. Cerebrovascular "moyamoya" disease. Disease showing abnormal net-like vessels in base of brain. Arch Neurol. 1969; 20(3):288±99.) 指 该分类系统将患者的临床表现分为四个阶段。 大多数患者会经历部分或全部 Suzuki 阶段,但尽管进展可能以不同的速度发生,但它似乎在儿童中比在青少年或成人中发生得更快。 该系统仅基于传统的血管造影术,如下表所示。 [0186] [0187] 如本文所用,术语 “颈内动脉 (ICA)” 位于颈部内侧并向大脑和眼睛供血的动脉。 [0188] 如本文所用,术语 “颈外动脉 (ECA)” 指头颈部的大动脉。 当它分为颈外动脉和颈内动脉时,它发生在颈总动脉中。 ECA 向面部、头皮、颅骨和脑膜供应血液。 如本文所用,术语“大脑前动脉(ACA)”是指大脑上向额叶和颞上叶的大部分中线部分供应含氧血液的动脉。 一对大脑前动脉起自颈内动脉,是威利斯环的一部分。 [0189] 如本文所用,术语 “大脑中动脉 (MCA)” 指为大脑供血的三大成对动脉之一。 MCA 起源于颈内动脉,继续进入外侧沟,然后分支并投射到大脑外侧皮层的大部分区域。 它还为前颞叶和半月板皮质供血。 [0190] 如本文所用,术语 《常规血管造影》 是指一种医学成像技术,用于显示身体血管和器官的内部或内腔,尤其是动脉、静脉和心脏腔室。 传统上,这是通过将不透射线的造影剂注入血管并使用基于 X 射线的技术(例如荧光透视法)成像来完成的。 [0191] 如本文所用,术语 《导管造影》 是指使用导管、X 射线引导和注射造影剂来检查身体主要区域(例如大脑或心脏)的血管是否存在动脉瘤等异常和动脉粥样硬化(斑块)等疾病的医疗程序做。 [0192] 如本文所用, “磁共振血管造影(MRA)” 该短语指的是一种医疗程序,在该程序中,磁共振成像扫描仪用于在静脉注射针头注射造影剂的帮助下,可视化大脑、肺和心脏等关键区域的血管阻塞。 这是一种诊断血管阻塞或闭塞的非侵入性方法。 [0193] 如本文所用,术语“ 需要手术的对象 ”指的是没有 ENPP1 缺陷但外周动脉如股动脉、腘动脉或胫-腓动脉发生动脉闭塞的患者。 [0194] 如本文所用,术语“ 手术部位 ”是指因血管外伤或意外外伤而发生组织损伤的动脉区域。 [0195] 如本文所用,术语“ 脑钙化“(BC)是指一种非特异性神经病理学,其中钙和其他矿物质在血管壁和组织实质中发生沉积,导致神经元死亡和神经胶质增生。脑钙化”通常被称为唐氏综合症,路易体病,阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆、脑肿瘤和各种​​内分泌失调。 心脏组织钙化是指钙(可能还有其他矿物质)沉积在心脏组织(例如主动脉组织和冠状动脉组织)中的积累。 [0196] 如本文关于使用透析分流器所使用的,狭窄减慢并减少了通过 AV 瘘管的血流,引起透析治疗质量问题,延长穿刺后出血,或引起 Lou 疼痛。 狭窄还可能导致通道阻塞或血栓。 [0197] 如本文所用,术语“ 手术切口(刀形切口) “是指在外科手术过程中使用锋利的物体(例如手术刀)在组织上做的切口。切口是切入身体组织以暴露下面的组织、骨骼或器官,以便可以进行外科手术执行。 [0198] 如本文所用,术语“ 手术部位 ”是指因血管外伤或意外外伤而发生组织损伤的动脉区域。 [0199] 术语“ 动静脉分流 “ 或者 ” AV短路 “或者干脆” 段落 “指的是一种植入式装置,其中包含一根连接动脉和静脉的管子。分流器连接动脉和静脉插管,并提供高于正常的血流量以进行有效的血液透析。分流器可以放置在身体的任何位置。它通常位于在右锁骨下方的手臂、腿部或胸部区域。 [0200] 如本文所用,术语“ 涂层款 ”是指一段可以缓慢洗脱治疗化合物或多肽如 ENPP1 或 ENPP3 以减少手术部位血管平滑肌细胞增殖量的段落,通常执行以消除动脉阻塞。 [0201] 如本文所用,术语“ 血液透析 “是指补偿肾功能异常所必需的治疗,其中废物和水从血液中过滤并过滤,更清洁的血液返回身体。血液透析控制血压并去除钾,钠和它有助于平衡重要的矿物质,如钙。 [0202] 如本文所用,术语 “瘘管” 是指中空或管状器官与体表之间,或两个中空或管状器官之间的异常或手术形成的通道。 [0203] 术语“ 支架 “是指放置在血管、管子或导管内以帮助愈合或缓解阻塞的管状支撑物。 [0204] 条款 “血管” 携带血液通过组织和器官的管状结构; 指静脉、动脉或毛细血管。 [0205] 如本文所用,术语 “补体抑制剂” 是分子(例如蛋白质(例如抗体)、小分子或肽)。 补体抑制剂在本领域中是众所周知的并且例如在 Zipfel 等人(2019)Front Immunol 10:2166 中有所描述。 也参见例如美国专利No.5,679,345,其公开内容通过引用整体并入本文。 [0206] 如本文所用,术语“ 改变 ", " 缺点 ", " 过渡 “ 或者 ” 突变 ”指细胞内基因突变,影响其编码的多肽的功能、活性、表达(转录或翻译)或构象,包括错义和无义突变、插入、缺失、移码和过早终止。 [0207] 如本文所定义,短语“ 隔膜区 " 是动脉的板状弹性体外侧和板状弹性体内侧之间的区域。 [0208] 如本文所定义,短语“ 内膜区 " 而内膜区域是动脉的板状弹性体内部和管腔之间的区域。 [0209] 如本文所定义,短语“ 板状弹性体外 “指的是位于动脉血管隔膜平滑肌外的弹性结缔组织层。 [0210] 如本文所定义,短语“ 板状弹性体内部 "指构成血管内膜最外层的弹性组织层。 [0211] 如本文所定义,短语“ 流明 "指血管的内部,例如动脉、静脉或毛细血管内发生血流的中心空间。 [0212] 如本文所定义,“ 血管病变 短语“指血管系统的疾病”。 脉管系统 “指血管在体内或器官内的排列,例如实体器官移植,或在身体部位内。” 血管 “指受试者身体的动脉、小动脉、毛细血管和静脉中的一条或多条或受试者的实体器官同种异体移植物。” 血管炎 “指静脉、动脉、毛细血管或淋巴管的炎症。” 血管化移植物 ”指的是受体脉管系统已连接到移植物内的血管后的移植物。 [0213] 如本文所定义,短语“ 心脏同种异体移植物血管病 (CAV) )”是指同种异体移植物或实体器官移植物如心脏的血管并发症,其中供应移植心脏的血管逐渐变窄并限制血流,导致随后的心肌损伤或猝死。CAV的诊断是一种疾病这通过对移植器官(如心脏)的定期随访和监测来实现侵入性诊断的早期迹象,包括冠状动脉造影和血管内超声检查,以及多巴酚丁胺负荷超声心动图、正电子发射断层扫描、成像、计算机断层扫描血管造影(CT 血管造影) ),以及非侵入性研究,包括各种生物标志物的水平,例如 C 反应蛋白、血清脑利钠肽、肌钙蛋白和血清 microRNA 628-5p。 [0214] 如本文所定义,“ 同种异体移植" 指将器官或组织从供体移植到同一物种的受体。 同种异体移植物占许多人体器官和组织移植材料,包括来自尸体、活体相关和活体非相关供体的同种异体移植物。 [0215] 如本文所定义,“ “实体器官同种异体移植” 指实体器官的同种异体移植物。 “实体器官”是具有实体组织稠度的内部器官,既不是空心的(例如胃肠道)也不是液体(例如血液)。 实体器官包括但不限于肾脏、肝脏、角膜、肠、心脏、肺和胰腺。 [0216] 如本文所定义,短语“ 移植物排斥 “ 或者 ” 移植材料排斥 “是指移植器官或组织被接受者的免疫系统排斥的情况,这会破坏同种异体移植物,并通过移植组织的血管纤维化导致移植器官长期丧失功能。 [0217] 如本文所定义,“ 延长同种异体移植物的存活期 短语“是指防止接受者免疫系统对移植供体器官或组织的排斥反应,提高移植器官的寿命,可延长2年、3年、4年、5年、8年、10年或者更多。 [0218] 如本文所定义,短语“ 同种异体心脏移植“是指实体器官移植材料,包括将供体心脏移植到受者体内,或将一个或多个供体动脉或静脉移植到受者心脏中。心脏同种异体移植物中的移植物排斥通常通过进行心内膜心肌活检来诊断。做。 [0219] 如本文所定义,短语“ 肾同种异体移植 ”是指实体器官移植物材料,包括将供体肾移植到受者体内,或将一个或多个供体动脉或静脉移植到受者肾脏中。肾同种异体移植物中的移植物排斥反应通常通过监测尿蛋白水平来诊断,例如肌酐与肌酐比值、血清肌酐水平和肾小球滤过率。 [0220] 如本文所定义,短语“ 肝脏移植 ”指实体器官移植物材料,包括将供体肝移植到受者体内,或将一条或多条供体动脉或静脉移植到受者肝脏内。同种异体肝移植排斥反应的特征是转氨酶、胆红素和碱性磷酸酶. 诊断是通过监测水平做出的。 [0221] 如本文所定义,短语“ 肺移植 “是指实体器官移植材料,包括将供体肺移植到受者体内,或将一个或多个供体动脉或静脉移植到受者肺部。肺同种异体移植物中的移植物排斥反应以支气管活检和肺功能测试为特征。经支气管镜检查确诊。 [0222] 如本文所定义,短语“ 同种异体移植血管 “ 或者 ” 同种异体移植血管系统 “是指将一个或多个供体血管(例如动脉、静脉、毛细血管和/或小动脉)移植到受体中。 [0223] 如本文所定义,短语“ 同种异体移植动脉 ”指将一根或多根供体动脉移植到受体体内。 [0224] 如本文所定义,短语“ 同种异体移植静脉 "指将一根或多根供体静脉移植到受体体内。 [0225] 如本文所定义,短语“ 心内膜心肌活检 “是指经皮获取少量心肌组织用于诊断、治疗和研究目的的程序。它主要用于 (1) 随访移植心脏的心肌排斥反应和 (2) 特定的炎症、侵袭性或 It用于诊断家族性心肌病和 (3) 对未知心肌肿块进行取样。 [0226] 如本文所定义,短语“ 支气管镜肺活检 “指的是通过内窥镜导向钳从肺部获得的活组织检查,这有助于评估中央肺区的病变和沿支气管束分布的移植物材料。 [0227] 如本文所定义,短语“ 外科手术 “外科手术也指侵入性医疗程序,包括血管介入,通过切口或射频消融或冷冻消融或激光消融导致组织损伤。 [0228] 如本文所定义,短语“ 软组织挫伤 ”是指经皮血管介入治疗(如支架置入术或血管成形术)后血管平滑肌的增殖或迁移,最终导致动脉壁增厚和动脉腔隙缩小,从而导致再狭窄。 [0229] 如本文所定义,“ NPP1缺乏症 “ 或者 ” ENPP1缺乏症 短语“是指相对于NPP1蛋白的正常血清水平或NPP1的正常活性,NPP1蛋白的量或NPP1活性的降低,其中该降低导致病理性钙化和/或病理性骨化的疾病或病症。此类病理性病症包括但不限于 GACI 和 ARHR2。如本文所用,ENPP1 缺乏是 NPP1 蛋白的量,其不会导致病理性钙化和/或病理性骨化的疾病或病症和/或 NPP1 轻微减少活动。 [0230] 如本文所定义,“ 再狭窄" 该短语指的是狭窄的复发。 狭窄是指血管变窄,血流受限。 再狭窄通常涉及动脉或其他大血管变窄,治疗去除阻塞,然后再次变窄。 通常使用超声、X 射线计算机断层扫描 (CT)、核成像、光学成像或对比增强图像或免疫组织化学检测中的一种或多种来检测再狭窄。 如本文所定义,“ 肌内膜增生 短语“是指发生在受试者动脉壁内膜中的血管平滑肌细胞的增殖。 [0231] 如本文所用,短语“ 减少或预防肌内膜增生 “是指可溶性 NPP1 在给药时降低组织损伤部位血管平滑肌细胞增殖水平的能力,从而减少动脉壁增厚并防止动脉再狭窄的发生或降低其水平。 [0232] 如本文所用,术语“ 治疗 “ 或者 ” 治疗 “将可溶性 NPP1(单独或与其他药剂组合)应用于或给予患者、疾病或病症、疾病或病症的症状,或从有可能发展为疾病或病症的患者身上分离的组织病症,或 治疗、治愈、消除、减轻、改变、补救、减轻、改善或影响细胞系(例如,用于诊断或体外应用)、疾病或病症、疾病或病症的症状,或发生疾病或病症的可能性。定义为基于从药物基因组学领域获得的知识,为了给予目的而应用或施用治疗剂,可以专门定制或修改这种治疗。 [0233] 如本文所用,术语“ 防止 “ 或者 ” 预防 “ 或者 ” 减少 “表示如果什么都没发生,则不会发生病症或疾病,或者如果已经发生,则不会发生进一步的病症或疾病。此外,还考虑预防与病症或疾病能力相关的部分或全部症状. [0234] 如本文所用,术语“ 有效量 “与未接受此类量的相应受试者相比,足以改善病症、病症、疾病或减少病症、病症或疾病的进展或进展,药剂(例如,NPP1 融合或 NPP3 融合多肽)量。有效量还可以治疗、治愈、预防或减轻病症、疾病或病症。该术语还包括有效改善正常生理功能的量。如本文所用,术语“ 多肽 ”指由通过肽键连接的氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物组成的聚合物。 [0235] 如本文所用,术语“ 孤立 “是指从其自然状态改变或去除。例如,天然存在于活体动物中的核酸或多肽不是“分离的”,而是与处于自然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸.或多肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在或可以存在于非天然环境中,例如宿主细胞。 [0236] 如本文所用,“ 大幅提炼 “是指基本上不含其他成分。例如,基本上纯化的多肽是已从其他成分中分离出来的多肽,在其天然存在的状态下通常与之相关。非限制性例子是 95% 纯,99 包括% 纯、99.5% 纯、99.9% 纯和 100% 纯。 [0237] 如本文所用,术语“ 寡核苷酸 “ 或者 ” 多核苷酸 “是至少两个核酸,在某些实施方案中长度至少为8、15或25个核苷酸,但长度最多为50、100、1000或5000个核苷酸,或者可以是与多核苷酸特异性杂交的化合物。 [0238] 如本文所用,术语“ 药物组合物 ”或“组合物”是指至少一种可用于本公开的化合物与药学上可接受的载体的混合物。药物组合物有助于将化合物施用给患者。本领域存在许多用于施用化合物的技术,所述技术包括皮下、静脉内、口服、气雾剂、吸入、直肠、阴道、透皮、鼻内、口腔、舌下、肠胃外、鞘内、胃内、眼部、肺部和局部给药。但不限于此。 [0239] 如本文所用,术语“ 药学上可接受的 “是指一种材料,例如载体或稀释剂,其不会消除化合物的生物活性或性质并且相对无毒,即该材料不会引起不希望的生物效应或组合物的组成,其中它可以在不与任何成分(例如磷酸盐缓冲盐水 (PBS))以有害方式相互作用的情况下施用于受试者。 [0240] 如本文所用,术语“ 病理性钙化 ”是指钙盐在人体的血管、软组织和分泌排泄通路中的异常沉积,使之硬化。有两种类型:营养不良性钙化,发生在垂死和死亡的组织中,以及细胞和组织钙化。存在转移性钙化,导致细胞外钙水平升高(高钙血症),超过稳态能力 钙化可能涉及细胞以及细胞外基质成分,例如基底膜中的胶原蛋白和动脉壁中的弹性纤维:胃粘膜 - 胃、肾和肺、角膜、心脏瓣膜、全身动脉和肺静脉的内皮衬里。 [0241] 如本文所用,术语“ 病理性骨化 “是指骨在骨系统以外的组织和通常不表现成骨特性的结缔组织中发育的病理状态。骨化根据受影响的组织或器官的性质分为三种类型,软骨骨化和骨内骨化是发生在软骨中并代替软骨的骨化。膜内骨化是发生在结缔组织中并代替结缔组织的骨的骨化。化生性骨化是指骨质在正常柔软的身体结构中的发育。也称为异养性骨化。 [0242] 如本文所用,“ 减少钙化 " 是通过使用非侵入性方法(例如 X 射线、显微 CT 和 MRI)观察到的。钙化的减少也可以使用放射成像和 99mTc-焦磷酸盐 (99mPYP) 摄取来推断。通过微计算在小鼠尸检中存在钙化根据 Braddock 等人制定的方案(Nature Communications 第 6 卷,文章编号:10006),使用苏木精和曙红 (H&E) 和茜素红等染料从心脏、主动脉和肾脏获取断层扫描 (CT) 扫描和组织切片( 2015)) [0243] 如本文所用,术语“ 异位钙化 ”是指以钙盐在组织中的病理性沉积或软组织中的骨生长为特征的病症。 [0244] 如本文所用,术语“ 软组织异位钙化 ”是指磷酸钙、羟基磷灰石、草酸钙和磷酸八钙的生物矿化不当,通常发生在软组织中,导致软组织失去硬化。“动脉钙化”发生在动脉和心脏瓣膜中指异位钙化导致动脉硬化和/或变窄。动脉内钙化与动脉粥样硬化斑块负荷和心肌梗死风险增加、外周血管疾病缺血发作增加以及血管成形术后夹层风险增加相关。有。 [0245] 如本文所用,术语“ 静脉钙化 “指的是静脉中发生的异位钙化,会降低其弹性并限制血液流动,进而导致血压升高和冠状动脉缺陷。 [0246] 如本文所用,术语“ 血管钙化 ”是指矿物质在血管系统中的病理性沉积。它有多种形式,包括内膜钙化和内侧钙化,但也可见于心脏瓣膜。血管钙化与动脉粥样硬化、糖尿病、某些遗传疾病有关,并且与肾脏疾病,特别是 CKD 血管钙化患者发生心血管不良事件的风险更高 [0247] 如本文可互换使用的,术语“ 腺相关病毒载体 ", " 腺相关病毒载体 ", " 腺相关病毒 ", " 腺相关病毒 ", " AAV 病毒体 ", " AAV病毒颗粒 “ 和 ” AAV 颗粒 “是指由至少一种AAV衣壳蛋白(优选由特定AAV血清型的所有衣壳蛋白)和衣壳化重组病毒基因组组成的病毒颗粒。该颗粒可以是人ENPP1或人ENPP3或其功能等同物。包含编码变体的序列的异源多核苷酸,和具有转录调节区的重组病毒基因组,所述转录调节区至少包含两侧为AAV反向末端重复序列的启动子。 AAV 载体颗粒 “ 或者 ” 腺相关病毒载体 称为是 ”。 [0248] 如本文所用,术语“ 向量 “是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中,载体是质粒,即可以连接额外的DNA区段的环状双链DNA环。在一些实施方案中,载体是病毒载体。并且额外的核苷酸序列可以连接到病毒基因组。在一些实施例中,载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。)在另一个实施方案中,载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在被引入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起复制。此外,某些载体(表达载体))可以指导与其可操作连接的基因的表达。 [0249] 如本文所用,术语“ 重组宿主细胞 “(或简称为“宿主细胞”)是指其中已引入外源核酸和/或重组载体的细胞。应当理解,“重组宿主细胞”和“宿主细胞”是指特定的主题细胞,如以及这种细胞的后代。由于突变或环境影响,后代可能会发生某些修饰,因此此类后代实际上可能与亲本细胞不相同,但仍包含在术语“宿主细胞”,如本文所用。 [0250] 此处使用的术语“ 重组病毒基因组 “是指其中至少一个外源表达盒多核苷酸已被插入到天然存在的AAV基因组中的AAV基因组。根据本公开的AAV基因组通常含有顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(ITRs) ) 和表达盒。 [0251] 如本文所用,术语“ 表达盒 “是指重组或合成产生的核酸构建体,其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一组特定核酸元件。根据本公开的AAV载体的重组病毒基因组的表达盒和与编码 ENPP1 或 ENPP3 或其功能等同变体的核苷酸序列可操作连接的转录调节区。 [0252] 此处使用的术语“ 转录调控区 “是指能够调节一个或多个基因表达的核酸片段。根据本公开内容的转录调节区包含启动子和任选地增强子。 [0253] 术语“ 发起人",如本文所用,功能是调节一个或多个多核苷酸的转录,位于多核苷酸序列的上游,具有 DNA 依赖性 RNA 聚合酶的结合位点、转录起始位点,并且属于但不限于到、转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点,以及本领域已知的直接或间接调节启动子转录量的任何其他核苷酸序列。任何种类启动子的存在,包括诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子,都可以用于本公开。 [0254] 如本文所用,术语“ 增强剂 “是指转录因子与其结合以增加基因转录的DNA序列元件。增强子的实例可以是但不限于RSV增强子、CMV增强子、HCR增强子等。在另一个实施例中,增强子可以是肝-特异性增强子,更优选肝调节区增强子(HCR)。 [0255] 如本文所用,术语“ 有效连接 “是指启动子序列相对于感兴趣的多核苷酸的功能关系和位置(例如,如果启动子或增强子影响序列的转录,则启动子或增强子可操作地连接至编码序列)。一般而言,可操作地与序列相邻感兴趣的是连接的启动子。 然而,增强子不需要与感兴趣的序列相邻以控制其表达。 在另一个实施方案中,编码启动子和 ENPP1 或 ENPP3 的核苷酸或其功能等价变体顺序。 [0256] 术语“ 有效量 “是指编码无毒但足够量的 ENPP1 或 ENPP3 以提供所需生物学结果的病毒载体。结果是减少和/或减轻疾病或任何生物学的体征、症状或原因系统可以是任何其他想要的改变 [0257] 此处使用的术语“ 帽蛋白 “是指具有天然 AAV Cap 蛋白(例如,VP1、VP2、VP3)的至少一种功能活性的多肽。Cap 蛋白的功能活性的实例诱导衣壳的形成并促进单链 DNA 的积累。原则上,任何帽蛋白都可以用于本公开内容的上下文中。 [0258] 此处使用的术语“ 衣壳 ”是指包装病毒基因组的结构。衣壳由几个由蛋白质组成的寡聚结构亚基组成。例如,AAV是由三种衣壳蛋白:VP1,VP2和VP3相互作用产生的。它具有二十面体结构衣壳形成。 [0259] 此处使用的术语“ 代表蛋白 “是指具有天然 AAV Rep 蛋白(例如,Rep 40、52、68、78)的至少一种功能活性的多肽。Rep 蛋白的“功能活性”是指识别、结合和切割 AAV 起源的多肽。 DNA 复制 与蛋白质生理功能相关的任何活动,包括 DNA 解旋酶活性以及促进 DNA 复制 [0260] 如本文所用,术语“ 腺相关病毒ITR “ 或者 ” AAV ITR “是指存在于腺相关病毒基因组 DNA 链两端的反向末端重复序列。ITR 序列是 AAV 基因组有效繁殖所必需的。这些序列的另一个特性是它们能够形成发夹。此功能有助于自启动,允许不依赖引物酶的第二条 DNA 链的合成。修改这些 ITR 序列的程序在本领域是已知的( Brown T,“基因克隆”,Chapman & Hall,英国伦敦,1995 年; Watson R 等人,“重组 DNA”,2 ^nd 埃德。 美国科学书籍,纽约,纽约州,美国,1992 年; Alberts B, et al., "Molecular Biology of the Cell", Garland Publishing Inc., New York, N.Y., US, 2008; Innis M, et al., Eds., "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press Inc., San Diego, Calif., US, 1990; 和 Schleef M, Ed.,“用于治疗和疫苗接种的质粒”,Wiley-VCH Verlag GmbH,特拉华州魏因海姆,2001 年 ). [0261] 术语“ 组织特异性 “启动子仅在特定类型的分化细胞或组织中具有活性。通常,组织特异性启动子中的下游基因是一种基因,其在组织中的活性程度比它特异的组织高得多。如果存在,启动子在除它特异的组织之外的任何组织中可能几乎没有或基本上没有活性。 [0262] 如本文所用,术语“ 诱导启动子 ”是指在生理上或发育上受到调节的启动子,例如,通过应用化学诱导剂。例如,它是四环素诱导型启动子、米非司酮(RU-486)-诱导型启动子等。 [0263] 如本文所用,术语“ 组成型启动子 “是指在生物体的所有细胞中,或在发育的大多数阶段,很少或没有细胞环境条件下,以相对恒定的水平保持活性的启动子。在另一个实施方案中,ENPP1的转录调控区的组成型启动子的实例包括,但不限于,逆转录病毒肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选配RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(可选配CMV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、α-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶 (PGK) 启动子和 EF1a 启动子 ( Boshart M, et al., Cell 1985; 41:521-530 ). [0264] 此处使用的术语“ 聚腺苷酸化信号 "涉及介导多聚腺嘌呤片段与 mRNA 3' 端连接的核酸序列。合适的多聚腺苷化信号包括 SVSV40 早期多聚腺苷化信号、SV40 晚期多聚腺苷化信号、HSV 胸苷激酶多聚腺苷化信号、鱼精蛋白基因多聚腺苷化信号信号、腺病毒 5 EIb 多聚腺苷化信号、牛生长激素多聚腺苷化信号、人变异生长激素多聚腺苷化信号等。 [0265] 如本文所用,术语“ 信号肽 "是指在蛋白质翻译过程中连接到感兴趣的新生蛋白质氨基末端的氨基酸残基序列(长度为10-30个残基)。信号肽被信号识别颗粒(SRP)识别,并且在运输到内质网, 它被信号肽酶 ( Lodish 等人,2000 年,分子细胞生物学,第 4 版 ). [0266] 如本文所用,术语“ 免疫反应”或“免疫反应” “是指宿主的免疫系统对入侵的(传染性)致病生物体中抗原或外来蛋白质的引入或表达作出反应。免疫反应通常是体液和局部的;B 细胞产生的抗体是抗原-与抗原结合在抗体复合物中灭活或中和抗原。当将人蛋白注射到小鼠模型系统中时,经常观察免疫反应。一般情况下,小鼠模型系统在引入外来抗原之前通过注射免疫抑制剂进行免疫,使其具有抗性以确保更好的生存能力。 [0267] 如本文所用,术语“ 免疫抑制 “是使用免疫抑制药物有意降低宿主免疫系统的激活或功效,以促进对外来抗原(如外来蛋白质、器官移植材料、骨髓和组织移植物)的免疫耐受。免疫抑制药物的非限制性例子包括抗- CD4 (GK1.5) 抗体、环磷酰胺、硫唑嘌呤 (Imuran)、霉酚酸酯 (Cellcept)、环孢菌素 (Neoral)、Sandimmune、Gengraf)、甲氨蝶呤 (Rheumatrex)、来氟米特 (Arava)、环磷酰胺 (Cytoxan) 和苯丁酸氮芥 (Leukeran) ). [0268]范围:在整个本公开中,本公开的各个方面可以以范围格式呈现。 应当理解,范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁,不应被解释为对本公开范围的僵化限制。 因此,范围的叙述应被视为已经具体公开了所有可能的子范围,以及该范围内的个别数值。 例如,1至6等范围的表述不仅包括具体公开的子范围,例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等个别值。在该范围内,例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6,也应视为具有。 无论范围的宽度如何,这都适用。 [0269] 治疗方法 [0270] 本公开涉及用于治疗 PAD 的 ENPP1 或 ENPP3 制剂的施用,包括向受试者施用 sNPP1 和 sNPP3 多肽及其融合蛋白,以及施用编码此类多肽的核酸。 此类多肽的序列包括但不限于以下内容。 [0271] 命令 [0272] 序列号:1 - ENPP1 氨基酸序列 - 野生型 [0273] Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly [0274] 1 5 10 15 [0275] Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly [0276] 20 25 30 [0277] Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser [0278] 35 40 45 [0279] Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala [0280] 50 55 60 [0281] Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu [0282] 65 70 75 80 [0283] Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly [0284] 85 90 95 [0285] Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys [0286] 100 105 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Ile Ile Ser Leu Phe [0400] 1 5 10 15 [0401] Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly Phe Thr Ala His Arg [0402] 20 25 30 [0403]Ile Lys Arg Ala Gly Gly Trp Glu Gly Pro Pro Thr Val Leu Ser [0404] 35 40 45 [0405] Asp Ser Pro Trp Thr Asn Ile Ser Gly Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe [0406] 50 55 60 [0407] Glu Leu Gln Glu Ala Gly Pro Asp Cys Arg Cys Asp Asn Leu Cys [0408] 65 70 75 80 [0409] Lys Ser Tyr Thr Ser Cys Cys His Asp Phe Asp Glu Leu Cys Leu Lys [0410] 85 90 95 [0411] Thr Ala Arg Gly Trp Glu Cys Thr Lys Asp Arg Cys Gly Glu Val Arg [0412] 100 105 110 [0413] Asn Glu Glu Asn Ala Cys His Cys Ser Glu Asp Cys Leu Ala Arg Gly [0414] 115 120 125 [0415] Asp Cys Cys Thr Asn Tyr Gln Val Val Cys Lys Gly Glu Ser His Trp [0416] 130 135 140 [0417] Val Asp Asp Asp Cys Glu Glu Ile Lys Ala Ala Glu Cys Pro Ala Gly [0418] 145 150 155 160 [0419] Phe Val Arg Pro Pro Leu Ile Ile Phe Ser Val Asp Gly Phe Arg Ala [0420] 165 170 175 [0421] Ser Tyr Met Lys Lys Gly Ser Lys Val Met Pro Asn Ile Glu Lys Leu [0422] 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Asp Val Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser [0535] 180 185 190 [0536] Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp [0537] 195 200 205 [0538] Leu Thr Ala Met Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro [0539] 210 215 220 [0540] Gly Ser Glu Val Ala Ile Asn Gly Ser Phe Pro Ser Ile Tyr Met Pro [0541] 225 230 235 240 [0542] Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Ser Thr Leu Leu Lys [0543] 245 250 255 [0544] Trp Leu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr [0545] 260 265 270 [0546]Phe Glu Gly Pro Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Val Ser Ala [0547] 275 280 285 [0548] Arg Val Ile Lys Ala Leu Gln Val Val Asp His Ala Phe Gly Met Leu [0549] 290 295 300 [0550] Met Glu Gly Leu Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Val Asn Ile Ile [0551] 305 310 315 320 [0552] Leu Leu Ala Asp His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu [0553] 325 330 335 [0554] Tyr Met Thr Asp Tyr Phe Pro Arg Ile Asn Phe Tyr Met Tyr Glu [0555] 340 345 350 [0556] Gly Pro Ala Pro Arg Ile Arg 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ctataaccta 1560 [4061] atgtgtgatc ttctacgcat tcaaccagca ccaaacaatg gaacccatgg tagtttaaac 1620 [4062] catcttctga aggtgccttt ttatgagcca tcccatgcag aggaggtgtc aaagttttct 1680 [4063] gtttgtggct ttgctaatcc attgcccaca gagtctcttg actgttctg ccctcaccta 1740 [4064] caaaatagta ctcagctgga acaagtgaat cagatgctaa atc​​tcaccca agaagaaata 1800 [4065] acagcaacag tgaaagtaaa tttgccattt gggaggccta gggtactgca gaagaacgtg 1860 [4066] gaccactgtc tcctttacca cagggaatat gtcagtggat ttggaaaagc tatgaggatg 1920 [4067] cccatgtgga gttcatacac agtcccccag ttgggaca catcgcctct gcctccccact 1980 [4068] gtccccagact gtctgcgggc tgatgtcagg gttcctcctt ctgagagcca aaaatgttcc 2040 [4069] ttctatttag cagacaaga tatcacccac ggcttcctct atcctcctgc cagcaataga 2100 [4070] acatcagata gccaatatga tgctttaatt actagcaatt tggtacctat gtatgaaga 2160 [4071] ttcagaaaaa tgtgggacta cttccacagt gttcttctta taaaacatgc cacagaaaga 2220 [4072] aatggagtaa atgtggttag tggaccaata tttgattata attatgatgg ccattttgat 2280 [4073] gctccagatg aaattaccaa acatttagcc aacactgatg ttcccatccc aacacactac 2340 [4074] tttgtggtgc tgaccagttg taaaaacaag agccacacac cggaaaactg ccctgggtgg 2400 [4075] ctggatgtcc taccctttat catccctcac cgacctacca acgtggagag ctgtcctgaa 2460 [4076] ggtaaaccag aagctctttg ggttgaaga agatttacag ctcacattgc ccgggtccgt 2520 [4077] gatgtagaac ttctcactgg gcttgacttc tatcaggata aagtgcagcc tgtctctgaa 2580 [4078] attttgcaac taaagacata tttaccaaca tttgaaacca ctatt 2625 [4079] 序列号:77 - ENPP1 核苷酸序列: [4080] atggaacggg acggctgtgc cggcggagga tcaagaggcg gagaaggcgg cagagcccct 60 [4081] agagaaggac ctgccggcaa cggcagagac agaggcagat ctcatgccgc cgaagcccct 120 [4082] ggcgatcctc aggctgctgc ttctctgctg gcccccatgg atgtgggcga ggaacctctg 180 [4083] gaaaaggccg ccagagccag aaccgccaag gaccccaaca cctacaaggt gctgagcctg 240 [4084]gtgctgtccg tgtgcgtgct gaccaccatc ctgggctgca tcttcggcct gaagcccagc 300 [4085] tgcgccaaag aagtgaagtc ctgcaagggc cggtgcttcg agcggacctt cggcaactgc 360 [4086] agatgcgacg ccgcctgtgt ggaactgggc aactgctgcc tggactacca ggaaacctgc 420 [4087] atcgagcccg 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atcctgaagc tgaaaaccca tctgcccacc 2760 [4126] ttcagccagg aagat 2775 [4127] 序列号:78 - 天青苷-ENPP1-FC 核苷酸序列 [4128] ggtaccgccacc 阿特格 acaagactgacagtgctggctctgctggccggactgttggcctcttctagagct gctccttcctgcgccaaagaagtgaagtcctgcaagggcagatgcttcgagcggaccttcggcaactgtagatgtgacgccgcttgcgtggaactgggcaactgctgcctggactaccaagagacatgcatcgagcccgagcacatctggacctgcaacaagttcagatgcggcgagaagcggctgaccagatctctgtgcgcctgctctgacgactgcaaggacaagggcgactgctgcatcaactactcctctgtgtgccagggcgagaagtcctgggttgaagaaccctgcgagtccatcaacgagcctcagtgtcctgccggcttcgagacacctcctactctgctgttctccctggatggcttcagagccgagtacctgcatacttggggaggcctgctgccagtgatctccaagctgaagaagtgcggcacctacaccaagaacatgaggcctgtgtaccctaccaagacattccccaaccactactccatcgtgaccggcctgtatcctgagagccacggcatcatcgacaacaagatgtacgaccccaagatgaacgcctccttcagcctgaagtccaaagagaagttcaaccccgagtggtataagggcgagcctatctgggtcaccgctaagtaccagggactgaagtctggcaccttcttttggcctggctccgacgtggaaatcaacggcatcttccccgacatctataagatgtacaacggctccgtgcctttcgaggaacgcattctggctgttctgcagtggctgcagctgcctaaggatgagaggcctcacttctacaccctgtacctggaagaacctgactcctccggccactcttatggccctgtgtcctctgaagtgatcaaggccctgcagcgagtggacggaatggtcggaatgctgatggacggcctgaaagagctgaacctgcacagatgcctgaacctgatcctgatctccgaccacggcatggaacaggggagctgcaagaagtacatctacctgaacaagtacctgggcgacgtgaagaacatcaaagtgatctacggcccagccgccagactgaggccttctgatgtgcctgacaagtactactccttcaactacgagggaatcgcccggaacctgtcctgcagagagcctaaccagcacttcaagccctacctgaagcactttctgcctaagcggctgcacttcgccaagtctgacagaatcgagcccctgaccttctatctggaccctcagtggcagctggccctgaatcctagcgagagaaagtactgtggctccggcttccacggctccgacaacgtgttctctaatatgcaggccctgttcgtcggctacggccctggctttaaacacggcatcgaggccgacaccttcgagaacatcgaggtgtacaatctgatgtgtgacctgctgaatctgacccctgctcctaacaacggcacccacggatctctgaaccatctgctgaagaatcccgtgtacacccctaagcaccccaaagaggttcaccctctggtccagtgtcctttcaccagaaatcctcgggacaacctgggctgctcttgcaacccttctatcctgcctatcgaggactttcagacccagttcaacctgaccgtggccgaggaaaagatcatcaagcacgagacactgccctacggcagacctagagtgctgcagaaagagaacaccatctgcctgctgtcccagcaccagttcatgtccggctactcccaggacatcctgatgcctctgtggacctcctacaccgtggaccggaacgatagcttctccaccgaggacttcagcaactgcctgtaccaggatttcagaatccctctgagccccgtgcacaagtgcagcttctacaagaacaacaccaaggtgtcctacggcttcctgtctcctccacagctgaacaagaactccagcggcatctactctgaggccctgctgaccaccaacatcgtgcccatgtaccagtccttccaagtgatctggcggtacttccacgacaccctgctgaggaagtacgccgaagaaagaaacggcgtgaacgtggtgtctggccccgtgttcgacttcgactacgacggcagatgcgactctctggaaaacctgcggcagaaaagacgagtgatccggaatcaagagatcctgattcctacacacttctttatcgtgctgaccagctgcaaggatacctctcagacccctctgcactgcgagaatctggacaccctggccttcattctgcctcacagaaccgacaactccgagtcctgtgtgcacggcaagcacgactcctcttgggtcgaagaactgctgatgctgcaccgggccagaatcaccgatgtggaacacatcaccggcctgagcttctaccagcagcggaaagaacctgtgtccgatatcctgaagctgaaaacccatctgccaaccttcagccaagaggacctgatcaacgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggaggcccctctgtgttcctgtttccacctaagccaaaggacacactgatgatctctcggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaagatcccgaagtcaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgactgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaagtgtccaacaaggctctgcccgctcctatcgaaaagaccatctccaaggctaagggccagcctcgggaacctcaggtttacaccctgcctccatctcgggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagtccaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactctaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcaaggcaatgtgttttcctgctctgtgatgcacgaggccctccacaatcactacacccagaagtccctgtctctgtcccctggcaaa 标签 反恐精英 [4129] 传奇 - 粗体字 = 起始/终止密码子; 下划线 =信号肽的核苷酸序列。 [4130] 序列号:79 - 天青苷-ENPP3-FC 核苷酸序列 [4131]atgaccagactgaccgtgctggccctgctggccggcctgctggccagcagcagagccgccaagcagggcagctgcagaaagaagtgcttcgacgccagcttcagaggcctggagaactgcagatgcgacgtggcctgcaaggacagaggcgactgctgctgggacttcgaggacacctgcgtggagagcaccagaatctggatgtgcaacaagttcagatgcggcgagaccagactggaggccagcctgtgcagctgcagcgacgactgcctgcagagaaaggactgctgcgccgactacaagagcgtgtgccagggcgagaccagctggctggaggagaactgcgacaccgcccagcagagccagtgccccgagggcttcgacctgccccccgtgatcctgttcagcatggacggcttcagagccgagtacctgtacacctgggacaccctgatgcccaacatcaacaagctgaagacctgcggcatccacagcaagtacatgagagccatgtaccccaccaagaccttccccaaccactacaccatcgtgaccggcctgtaccccgagagccacggcatcatcgacaacaacatgtacgacgtgaacctgaacaagaacttcagcctgagcagcaaggagcagaacaaccccgcctggtggcacggccagcccatgaacctgaccgccatgtaccagggcctgaaggccgccacctacttctggcccggcagcgaggtggccatcaacggcagcttccccagcatctacatgccctacaacggcagcgtgcccttcgaggagagaatcagcaccctgctgaagtggctggacctgcccaaggccgagagacccagattctacaccatgtacttcgaggagcccgacagcagcggccacgccggcggccccgtgagcgccagagtgatcaaggccctgcaggtggtggaccacgccttcggcatgctgatggagggcctgaagcagagaaacctgcacaactgcgtgaacatcatcctgctggccgaccacggcatggaccagacctactgcaacaagatggagtacatgaccgactacttccccagaatcaacttcttctacatgtacgagggccccgcccccagaatcagagcccacaacatcccccacgacttcttcagcttcaacagcgaggagatcgtgagaaacctgagctgcagaaagcccgaccagcacttcaagccctacctgacccccgacctgcccaagagactgcactacgccaagaacgtgagaatcgacaaggtgcacctgttcgtggaccagcagtggctggccgtgagaagcaagagcaacaccaactgcggcggcggcaaccacggctacaacaacgagttcagaagcatggaggccatcttcctggcccacggccccagcttcaaggagaagaccgaggtggagcccttcgagaacatcgaggtgtacaacctgatgtgcgacctgctgagaatccagcccgcccccaacaacggcacccacggcagcctgaaccacctgctgaaggtgcccttctacgagcccagccacgccgaggaggtgagcaagttcagcgtgtgcggcttcgccaaccccctgcccaccgagagcctggactgcttctgcccccacctgcagaacagcacccagctggagcaggtgaaccagatgctgaacctgacccaggaggagatcaccgccaccgtgaaggtgaacctgcccttcggcagacccagagtgctgcagaagaacgtggaccactgcctgctgtaccacagagagtacgtgagcggcttcggcaaggccatgagaatgcccatgtggagcagctacaccgtgccccagctgggcgacaccagccccctgccccccaccgtgcccgactgcctgagagccgacgtgagagtgccccccagcgagagccagaagtgcagcttctacctggccgacaagaacatcacccacggcttcctgtacccccccgccagcaacagaaccagcgacagccagtacgacgccctgatcaccagcaacctggtgcccatgtacgaggagttcagaaagatgtgggactacttccacagcgtgctgctgatcaagcacgccaccgagagaaacggcgtgaacgtggtgagcggccccatcttcgactacaactacgacggccacttcgacgcccccgacgagatcaccaagcacctggccaacaccgacgtgcccatccccacccactacttcgtggtgctgaccagctgcaagaacaagagccacacccccgagaactgccccggctggctggacgtgctgcccttcatcatcccccacagacccaccaacgtggagagctgccccgagggcaagcccgaggccctgtgggtggaggagagattcaccgcccacatcgccagagtgagagacgtggagctgctgaccggcctggacttctaccaggacaaggtgcagcccgtgagcgagatcctgcagctgaagacctacctgcccaccttcgagaccaccatcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccccaggtgtacaccctgccccccagcagagaggagatgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagccccggcaag [4132] ENPP1和ENPP3融合多肽的克隆和表达 [4133] ENPP1,或 ENPP1 多肽,如 US 2015/0359858 A1 中所述制备,其通过引用整体并入本文。 ENPP1 是一种跨膜蛋白,具有不同的膜内结构域并定位于细胞表面。 为了将 ENPP1 表达为可溶性细胞外蛋白,将 ENPP1 的跨膜结构域替换为 ENPP2 的跨膜结构域或信号肽序列(如天青苷),可溶性重组 ENPP1 在杆状病毒培养物的细胞外液中积累。 来自任何其他已知蛋白质的信号序列可用于靶向 ENPP1 的细胞外结构域以进行分泌,例如但不限于免疫球蛋白 kappa 和 lambda 轻链蛋白的信号序列。 此外,本公开不应解释为限于本文所述的多肽,还包括包含ENPP1胞外结构域的任何酶促活性截断的多肽。 [4134] ENPP1 通过省略跨膜结构域而变得可溶。 人 ENPP1 (SEQ ID NO: 1)将其跨膜区(例如,残基 77 至 98)结合至人 ENPP2(NCBI 登录号 NP 00112433 5,例如,残基 12 至 30)或 azurosi 的相应亚域。它被修饰以表达通过用 Dean 信号序列 (SEQ ID NO: 42) 替换可溶性重组蛋白。 [4135] 将修饰的 ENPP1 序列克隆到修饰的 pFastbac FIT 载体中,在 TEV 蛋白酶切割位点后具有 C 端 9-F lIS 标签,在昆虫细胞中克隆和表达,两种蛋白质都在杆状病毒系统中,如上所述。通过表达( Albright 等人,2012 年,Blood 120:4432-4440;Saunders 等人,2011 年,J. Biol. Chem. 18:994-1004;Saunders 等人,2008 年,Mol. Cancer Ther. 7: 3352-3362), 允许可溶性重组蛋白在细胞外液中积累。 [4136]ENPP3 很少输出到细胞表面。 通过用另一种 ENPP 或天青苷的天然信号序列或适当的信号序列替换 ENPP3 的信号序列来构建可溶性 ENPP3 多肽。 WO 2017/087936 中公开了 ENPP3 融合构建体的一些实例。 可溶性 ENPP3 构建体是使用来自其他 ENPP 酶(例如但不限于 ENPP7 和/或 ENPP5)的信号流出信号序列制成的。 使用由 ENPP1 和 ENPP2 的信号序列组合组成的信号序列(下文称为“ENPP1-2-1”或“ENPP121”)制备可溶性 ENPP3 构建体。 来自任何其他已知蛋白质的信号序列可用于靶向 ENPP3 的细胞外结构域用于分泌,例如但不限于免疫球蛋白κ和λ轻链蛋白质的信号序列。 此外,本公开不应解释为限于本文所述的多肽,还包括包含ENPP3胞外结构域的任何酶促活性截断的多肽。 [4137] 在某些实施方案中,ENPP3多肽是可溶的。 在一些实施方案中,本公开的多肽包括缺乏ENPP3跨膜结构域的ENPP3多肽。 在另一个实施例中,本发明的多肽包括ENPP3多肽,其中ENPP3跨膜结构域被去除,而其他多肽,例如但不限于ENPP2、ENPPS或ENPP7或天青苷信号序列被跨膜取代领域。 [4138] 在一些实施例中,本发明的多肽包含 IgG Fc 结构域。 在某些实施方案中,本公开的多肽包含白蛋白结构域。 在另一个实施方案中,白蛋白结构域位于 ENPP3 多肽的 C 末端区域。 在另一个实施方案中,IgG Fc 结构域位于 ENPP3 多肽的 C 端区域。 在另一个实施方案中,IgG Fc 结构域或白蛋白结构域的存在改善了 ENPP3 多肽的半衰期、溶解度、降低了免疫原性并增加了活性。 [4139] 在某些实施方案中,本公开的多肽包括导致ENPP3多肽前体分泌的信号肽,其经受蛋白水解加工以获得ENPP3多肽。 在另一个实施方案中,信号肽选自ENPP2、ENPP5和ENPP7信号肽。 在另一个实施方案中,信号肽选自由SEQ ID NO:36-42组成的组。 [4140] 在某些实施方案中,IgG Fc结构域或白蛋白结构域通过接头区域连接至ENPP3多肽的C末端区域。 在另一个实施方案中,接头选自SEQ ID NO:43-75,其中n是1-20范围内的整数。 [4141] ENPP1和ENPP3融合多肽的生产和纯化 [4142] 为了产生用于体外使用的可溶性重组 ENPP1 多肽,将编码 ENPP1 细胞外结构域的多核苷酸(人 NPP1(NCBI 登录号 NP_006199))融合到 IgG 的 Fc 结构域(称为“ENPP1-Fc”)并表达在稳定的 CHO 细胞系中。 在一些实例中,编码 NCBI 登录号 NP_006199 的第 96 至 925 位残基的 ENPP1 多核苷酸与 Fc 结构域融合以产生 ENPP1 多肽。 [4143] 或者,可以使用合适的载体从 HEK293 细胞、杆状病毒昆虫细胞系统或 CHO 细胞或酵母毕赤酵母表达系统表达 ENPP1 多肽。 ENPP1多肽可以在贴壁细胞或悬浮细胞中产生。 优选地,ENPP1多肽在CHO细胞中表达。 为了建立稳定的细胞系,将编码 ENPP1 构建体的核酸序列克隆到适合大规模蛋白质生产的载体中。 [4144] ENPP3 是通过在 CHO 或 HEK293 哺乳动物细胞中建立稳定转染而产生的。 将编码 ENPP3 的 ENPP3 多核苷酸(人 NPP3 (UniProtKB/Swiss-Prot: 014638.2))融合到 IgG 的 Fc 结构域(称为“ENPP3-Fc”)并在稳定的 CHO 细胞系中表达。在一些实例中, UniProtKB/Swiss-Prot:将编码 O14638.2 的 49-875 残基的 ENPP3 多核苷酸与 Fc 结构域融合以产生 ENPP3 多肽。ENPP3 多肽可以在贴壁细胞或悬浮细胞中产生。为了建立,编码将本公开的 NPP3 多肽融合到适合大规模蛋白质生产的载体中。有多种此类载体可从商业来源获得,并且可以使用任何载体。ENPP3 多肽描述于 WO 2017/087936 ENPP1 多肽的生产根据 Albright et al., 2015, Nat Commun. 6:10006 中建立的方案,其全部内容通过引用并入本文。 [4145] 可以使用已建立的技术例如电穿孔或lipofectamine将包含所需的ENPP1或ENPP3多肽构建体的适当质粒稳定转染到表达质粒中,并且在抗生素选择下生长的细胞可以获得稳定转染的细胞。 然后建立稳定转染的单细胞克隆并筛选所需融合蛋白的高表达克隆。 如上所述,使用合成酶底物 pNP-TMP,可以在 96 孔板中以高通量方式筛选 ENPP1 或 ENPP3 多肽表达的单细胞克隆(Saunders 等人,2008 年,Mol. Cancer Therap 7(10 ):3352-62;Albright 等人,2015 年,Nat Commun. 6:10006)。 [4146] 一旦筛选鉴定出 ENPP3 或 ENPP1 多肽的高表达克隆,就可以实现如前所述在摇瓶或生物反应器中生产 ENPP1 的蛋白质( Albright 等人,2015 年,Nat Commun。 6:10006 ). ENPP3或ENPP1多肽的纯化可以使用本领域已知的标准纯化技术的组合来完成。 这些技术是本领域众所周知的并且选自诸如柱层析、超速离心、过滤和沉淀的技术。 柱层析纯化可以通过Protein-A和Protein-G树脂等亲和层析、镍或铜等金属亲和树脂、疏水交换层析以及使用C8-C14树脂的反相高压层析(HPLC)来实现。使用 离子交换,例如,使用市售树脂如Q-Sepharose(阴离子交换)和SP-Sepharose(阳离子交换),blue sepharose树脂和blue-sephadex树脂,以及羟基磷灰石树脂。也可以使用阴离子和阳离子交换层析. 如本领域已知的,也可以使用使用市售的S-75和S200 Superdex树脂的尺寸排阻色谱法。 用于溶解蛋白质和为上述色谱步骤提供选择介质的缓冲液是蛋白质化学和科学从业者已知的标准生物缓冲液。 [4147] 制备中使用的缓冲液的一些实例包括柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三(羟基荞麦)氨基甲烷、盐水缓冲液、甘氨酸-HCL缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液和巴比妥钠缓冲液,这些都是本领域众所周知的。 使用单一技术或一系列技术的组合,适当的缓冲系统在单个纯化步骤后在考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶上并排纯化 ENPP3 和粗原料。 然后可以使用如上所述的额外技术和/或层析步骤进一步纯化 ENPP3 蛋白,以达到显着更高的纯度,例如调整到适当 pH 值和上述 ENPP1 的约 99% 纯度。或者,可以从中纯化 ENPP3 多肽粗物质纯度大于 99%。 [4148]纯化后,ENPP1-Fc 或 ENPP3-Fc 针对补充有 Zn2+ 和 Mg2+ 的 PBS (PBSplus) 进行透析,浓缩至 5-7 mg/ml,并以 200-500 μl 的等分试样冷冻于 -80°C。 等分试样在使用前立即解冻并在 PBSplus 中稀释以将溶液的比活性调节至 31.25 au/ml(或约 0.7 mg/ml,取决于制造商)。 [4149] 剂量与给药 [4150] 在另一个实施方案中,hsNPP1或hsNPP3以一个或多个剂量给药,分别含有约1.0mg/kg至约5.0mg/kg的NPP1或约1.0mg/kg至约5.0mg/kg的NPP3。 在另一个实施方案中,hsNPP1或hsNPP3以包含约1.0mg/kg至约10.0mg/kg的NPP1或约1.0mg/kg至约10.0mg/kg的NPP3的一个或多个剂量施用。 [4151] hsNPP1或hsNPP3剂量之间的时间间隔至少为2天,并且可以更长,例如至少3天、至少1周、2周或1个月。 在一个实施方案中,给药是每周一次、每两周一次或每月一次。 [4152] 重组hsNPP1或hsNPP3可以任何合适的方式施用,例如静脉内、皮下或腹膜内。 [4153] 重组hsNPP1或hsNPP3可以与一种或多种另外的治疗剂联合施用。 示例性治疗剂包括但不限于双膦酸盐、他汀类药物、贝特类药物、烟酸、阿司匹林、氯吡格雷和华法林。 [4154] 在一些实施方案中,重组hsNPP1或hsNPP3和另外的治疗剂分开施用并且同时或顺序施用。 在一些实施方案中,重组hsNPP1或hsNPP3在施用另外的治疗剂之前施用。 在一些实施方案中,重组hsNPP1或hsNPP3在施用另外的治疗剂之后施用。 在另一个实施方案中,重组hsNPP1或hsNPP3与另外的治疗剂一起施用。 [4155] 核酸给药和治疗 [4156] ENPP1 和 ENPP3 体内 表达用病毒载体 [4157] 编码在本公开中有用的多肽的核酸可用于治疗本文考虑的疾病或病症的基因治疗方案。 可以将编码多肽以治疗或预防感兴趣的疾病或病症的改进构建体插入合适的基因治疗载体中并施用于患者。 [4158] 载体,例如病毒载体,已在现有技术中用于将基因引入多种不同的靶细胞。 通常,将载体暴露于靶细胞以允许转化在足以通过所需多肽(例如,受体)的表达提供有用的治疗或预防效果的一定比例的细胞中发生。 转染的核酸可以永久性地整合到每个靶细胞的基因组中,提供持久的效果,或者,可能必须定期重复治疗。 在某些实施方案中,(病毒)载体用编码本公开的多肽的遗传物质在体内转染肝细胞。 [4159] 多种载体、病毒载体和质粒载体都是本领域已知的(参见例如美国专利号5,252,479和WO 93/07282)。 许多病毒已被用作基因转移载体,包括乳多空病毒如 SV40、牛痘病毒、疱疹病毒(包括 HSV 和 EBV)和逆转录病毒。 现有技术中的许多基因治疗方案都使用了受损的鼠类逆转录病毒。 最近发布的几项专利涉及用于进行基因治疗的方法和组合物(参见例如美国专利号 6,168,916;6,135,976;5,965,541 和 6,129,705)。 前述专利中的每一个都通过引用整体并入本文。 因此,遗传物质,例如包含 NPP1 或 NPP3 序列的多核苷酸,可被引入哺乳动物以治疗 VSMC 增殖。 [4160] 某些经过修饰的病毒通常用作携带编码序列的载体,因为在给予哺乳动物后,病毒会感染细胞并表达编码的蛋白质。 根据本公开有用的修饰病毒包括例如细小病毒、小核糖核酸病毒、伪狂犬病病毒、甲型、乙型或丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、乳头瘤病毒(例如,多瘤病毒和 SV40)或疱疹病毒(例如,Epstein-Barr 病毒,水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、带状疱疹和单纯疱疹病毒 1 型和 2 型)、RNA 病毒或逆转录病毒,例如莫洛尼鼠病毒 来源于包括白血病病毒或慢病毒在内的病毒(即来自人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒等)。 根据本公开有用的DNA病毒包括:腺伴随病毒腺病毒、甲病毒和慢病毒。 [4161] 病毒载体直接施用于身体,通常通过注射,最常见的是静脉注射 (IV),或直接施用于特定组织,在那里它们被单个细胞吸收。 或者,病毒载体可以与患者细胞样本一起使用,并且 体外 它可以通过接触细胞中的病毒载体来施用,由此病毒载体感染细胞,然后将含有该载体的细胞返回给患者。 一旦病毒载体被递送,编码序列被表达以产生功能性蛋白质。 一般而言,病毒载体对细胞的感染和转导通过一系列连续事件发生:病毒衣壳与靶细胞表面受体的相互作用,通过内吞作用进行内化,细胞内转运,通过细胞内/蛋白酶体隔室的细胞内转运,核内体逃逸、核输入、病毒体涂层脱落和病毒 DNA 双链转化导致感兴趣的重组编码序列的转录和表达。 ( Colella 等人,Mol Ther Methods Clin Dev。 2017 年 12 月 1 日;8:87-104。)。 [4162] 根据本公开的腺相关病毒载体 [4163] AAV 是指属于细小病毒科依赖病毒属的病毒。 AAV 基因组长约 4.7 千碱基,由线性单链脱氧核糖核酸 (ssDNA) 组成,可以是正义的,也可以是正义的。 基因组包含位于 DNA 链两端的反向末端重复序列 (ITR) 和两个开放阅读框 (ORF):rep 和 cap。 rep 框架由四个重叠的基因组成,这些基因编码 AAV 生命周期所需的非结构复制 (Rep) 蛋白。 帽框包含以下结构性 VP 衣壳蛋白的重叠核苷酸序列:VP1、VP2 和 VP3,它们相互作用形成二十面体对称衣壳。 [4164] 末端的 145 个核苷酸是自互补的,并被组织形成能量稳定的分子内双链体,形成 T 形发夹。 这种发夹结构是病毒 DNA 复制的起点,也是细胞 DNA 聚合酶复合物的引物。 在哺乳动物细胞中感染野生型 AAV 后,rep 基因(即 Rep78 和 Rep52)分别从 P5 启动子和 P19 启动子表达,并且两种 Rep 蛋白都具有复制病毒基因组的功能。 rep ORF 内的剪接事件实际上导致四种 Rep 蛋白(即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40)的表达。 然而,在哺乳动物细胞中,编码 Rep78 和 Rep52 蛋白的未剪接 mRNA 已被证明足以用于 AAV 载体的生产。 此外,在昆虫细胞中,Rep78 和 Rep52 蛋白足以用于 AAV 载体的生产。 [4165]AAV 是辅助依赖性病毒,即需要与辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)共同感染才能形成功能完整的 AAV 病毒颗粒。 在没有与辅助病毒共感染的情况下,AAV 建立了一种潜伏状态,在这种状态下,病毒基因组整合到宿主细胞染色体中或以游离形式存在,但不产生感染性病毒颗粒。 随后用辅助病毒感染“拯救”了整合的基因组,使其能够复制并包装到病毒衣壳中,从而重建具有感染性的病毒颗粒。 AAV可以感染不同物种的细胞,但辅助病毒必须与宿主细胞属于同一物种。 因此,例如,人 AAV 在共感染犬腺病毒的犬细胞中复制。 [4166] 为了产生含有异源核酸序列的感染性重组 AAV (rAAV),可以用含有异源核酸序列但缺少 AAV 辅助功能基因 rep 和 cap 的 AAV 载体转染合适的宿主细胞系。 然后可以在单独的载体上提供 AAV 辅助功能基因。 此外,可以在载体上仅提供AAV生产所需的辅助病毒基因(即,辅助功能基因),而不是提供具有复制能力的辅助病毒(例如,腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)。 [4167] 总的来说,可以在一个或多个载体上提供 AAV 辅助功能基因(即 rep 和 cap)和辅助功能基因。 然后可以在宿主细胞中表达辅助和辅助功能基因产物,在那里它们将在含有异源核酸序列的 rAAV 载体上反式发挥作用。 包含异源核酸序列的 rAAV 载体随后将被克隆和包装,就像它是野生型 (wt) AAV 基因组一样,形成重组病毒体。 当患者的细胞被产生的 rAAV 病毒体感染时,异源核酸序列进入患者的细胞并表达。 [4168] 由于患者的细胞缺乏rep和cap基因以及辅助功能基因,rAAV无法进一步复制和包装基因组。 此外,如果没有五个 rep 和 cap 基因的来源,wtAAV 就无法在患者的细胞中形成。 [4169] AAV 向量通常缺少 rep 和 cap 框架。 当存在于用编码和表达 rep 和 cap 基因产物(即 AAV Rep 和 Cap 蛋白)的载体转染的宿主细胞中时,此类 AAV 载体可以复制并包装成感染性病毒颗粒,其中宿主细胞是腺病毒 A 载体编码和表达来自开放阅读框 E4orf6 的蛋白质被转染。 [4170] 将感兴趣的蛋白质递送至哺乳动物细胞是通过首先生成含有编码感兴趣蛋白质的 DNA 的 AAV 载体,然后将该载体施用于哺乳动物来实现的。 因此,本公开内容应解释为包括含有编码感兴趣的多肽的DNA的AAV载体。 一旦掌握了本公开内容,包含编码这些/这些多肽的 DNA 的 AAV 载体的创建对本领域技术人员来说将是显而易见的。 [4171] 在一个实施例中,本公开内容涉及一种包含编码哺乳动物 ENPP1 或哺乳动物 ENPP3 的序列的腺相关病毒 (AAV) 表达载体,其中当施用于哺乳动物时,该载体在细胞中产生 ENPP1 或 ENPP3 前体表达。 ,其中前体包含在其羧基末端融合到 ENPP1 或 ENPP3 的氨基末端的天青苷信号肽。 ENPP1 或 ENPP3 前体可包括稳定结构域,例如 IgG Fc 区或人白蛋白。 在细胞分泌前体后,信号肽被切除,并在细胞外提供具有酶促活性的可溶性哺乳动物 ENPP1 或 ENPP3。 [4172] AAV 表达载体包含包含转录调节区的核苷酸,该核苷酸可操作地连接至编码多肽的重组核酸序列,所述多肽包含天青苷信号肽序列和外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ENPP1)多肽序列。它可以包括表达盒,其包含转录与序列可操作连接的调节区。 [4173] 在一些实施方案中,表达盒包含启动子和增强子、Kozak序列GCCACCATGG、编码哺乳动物NPP1蛋白的核苷酸序列或编码哺乳动物NPP3蛋白的核苷酸序列、其他合适的调节元件和聚腺苷酸化信号。 [4174] 在一些实施例中,根据本公开的AAV载体的AAV重组基因组缺少rep开放阅读框和/或帽开放阅读框。 [4175] 根据本公开的 AAV 载体包括来自任何血清型的衣壳。 通常,AAV 血清型在氨基酸和核酸水平上具有显着同源性的基因组序列,提供相同的遗传功能集,并通过基本相同的机制进行复制和组装。 具体地,本公开的AAV包括AAV(AAV1)、AAV2、AAV3(包括类型3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、禽AAV、牛AAV、犬 AAV、马 AAV 或绵羊 AAV 血清型 1。 [4176] 不同 AAV 血清型的基因组序列的例子可以在文献或公共数据库如 GenBank 中找到。 例如,GenBank 登录号 NC_001401.2 (AAV2)、NC_001829.1 (AAV4)、NC_006152.1 (AAV5)、AF028704.1 (AAV6)、NC_006260.1 (AAV7)、NC_006261.1 (AAV8)、AX753250。 1 (AAV9) 和 AX753362.1 (AAV10)。 [4177] 在一些实施方案中,根据本公开的腺相关病毒载体包含源自选自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAVrh10血清型的血清型的衣壳。 在另一个实施方案中,AAV 的血清型是 AAV8。 当病毒载体包含编码衣壳蛋白的序列时,它们将 AAV 引导至特定的一种或多种细胞类型,提高将靶向载体递送到细胞中的效率,促进 AAV 的纯化或检测,或者,可以进行修饰以包含外源序列以减少宿主回复。 [4178] 在某些实施方案中,本公开的 rAAV 载体包括几个必需的 DNA 元件。 在某些实施方案中,这些 DNA 元件包括 AAV ITR 序列、启动子/增强子元件、转录终止信号、编码感兴趣的蛋白质或其生物活性片段的任何必需的 5' 或 3' 非翻译侧翼 DNA。包含至少 2 个拷贝的区域. 本公开的 rAAV 载体还可以包括感兴趣的蛋白质的内含子的一部分。 此外,任选地,本公开的rAAV载体包括编码感兴趣的突变多肽的DNA。 [4179] 在某些实施方案中,载体含有启动子/调控序列,包括能够指导异源基因在许多不同细胞类型中高水平表达的乱序启动子。 这样的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子序列、松散肉瘤病毒启动子/增强子序列等。 在某些实施方案中,本公开的 rAAV 载体中的启动子/调控序列是 CMV 立即早期启动子/增强子。 然而,用于驱动异源基因表达的启动子序列也可以是诱导型启动子,例如但不限于类固醇诱导型启动子,或肌肉组织特异性骨骼肌动蛋白启动子和肌肉肌酸激酶启动子。/增强子等,但不限于组织特异性启动子。 [4180] 在某些实施方案中,本公开的rAAV载体包括转录终止信号。 尽管本公开的载体中可以包括任何转录终止信号,但在某些实施例中,转录终止信号是SV40转录终止信号。 [4181]在某些实施方案中,本公开的rAAV载体包含编码感兴趣的多肽或感兴趣的多肽的生物活性片段的5个分离的DNA。 本公开内容应解释为包括已知或未知的目的多肽的任何哺乳动物序列。 因此,本公开内容应被解释为包括非人类哺乳动物来源的基因,其中多肽以与人类多肽基本相似的方式发挥作用。 优选地,包含编码目的多肽的基因的核苷酸序列与编码目的多肽的基因具有约50%同源性,更优选约70%同源性,甚至更优选约80%同源性,最优选约90%同源性。 [4182] 此外,本公开内容应解释为包括野生型蛋白质序列的天然存在的变体或重组衍生的突变体,此类变体或突变体使由此编码的多肽与全长多肽一样具有治疗效果,或使它们的治疗效果更佳比本公开的基因治疗方法中的全长多肽。 [4183] 本公开还应解释为包括编码保留多肽生物学活性的变体的DNA。 此类变体包括已经或可以使用重组 DNA 技术进行修饰的蛋白质或多肽,使得变体具有增强其适用于本文所述方法的额外特征,例如但不限于血浆允许蛋白质或多肽以保留赋予蛋白质增强稳定性和增强蛋白质比活性的物质。 类似物可能因保守的氨基酸序列差异或因不影响序列的修饰或两者而不同于天然存在的蛋白质或肽。 例如,保守的氨基酸改变可以改变蛋白质或肽的一级序列,但通常不会改变其功能。 [4184] 本公开不限于实验例中例示的特定rAAV载体; 相反,本公开内容应解释为包括基于但不限于AAV-1、AAV-3、AAV-4和AAV-6等的任何合适的AAV载体。 本公开还包括以有效提供治疗效果的量治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法。 [4185] 该方法包括给哺乳动物施用编码目的多肽的rAAV载体。 优选地,哺乳动物是人。 通常,在一次注射中施用的病毒载体基因组/哺乳动物的数量范围为约1×10 8 至约5×10 16 。 优选地,在一次注射中施用的病毒载体基因组/哺乳动物的数量为约1x10 ¹⁰ 到大约 lx10 ¹⁵ 自我; 更优选地,在一次注射中施用的病毒载体基因组/哺乳动物的数量约为 5 x 10 ¹⁰ 约 5 x 10 ¹⁵ 自我; 最优选地,在一次注射中给予哺乳动物的病毒载体基因组的数量约为 5 x 10 ¹⁰ 5×10 ¹⁴ 是。 [4186] 当本公开的方法涉及多位点同时注射,或多次多位点注射,包括在数小时内注射到不同位点(例如,少于约 1 小时至约 2 或 3 小时)时,施用病毒的总数注入的载体基因组可以与单点注入法中提到的15个相同,是15个的一部分或倍数。 [4187] 为了通过单点注射施用本公开的rAAV载体,在某些实施方案中,将包含病毒的组合物直接注射到受试者的器官(例如但不限于受试者的肝脏)中。 [4188] 为了对哺乳动物给药,rAAV 载体可以悬浮在药学上可接受的载体中,例如,pH 值约为 7.8 的 HEPES 缓冲盐水中。 其他有用的药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的盐溶液,例如甘油、水、盐水、乙醇以及磷酸盐和有机酸盐。 这些和其他药学上可接受的载体的例子在 Remington's Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., New Jersey) 中有所描述。 本公开的 rAAV 载体也可以以试剂盒的形式提供,其包括例如在干燥盐制剂中的载体的冻干制剂、用于悬浮载体/盐组合物的无菌水,以及载体. 哺乳动物的使用说明和使用说明。 [4189] 已公布的申请 US 2017/0290926—Smith 等人,其内容通过引用整体并入本文,详细描述了 AAV 载体的生成、递送和管理过程。 [4190] ENPP1 和 ENPP3 多肽的基于 RNA 的体内表达 [4191] 本公开提供了用于产生和递送重组双链RNA分子(编码本文所述的ENPP1或ENPP3多肽的dsRNA)的组合物和方法。 双链 RNA 颗粒 (dsRP) 可能包含封闭在衣壳或外壳蛋白中的 dsRNA 分子。 dsRNA分子可以是病毒基因组或基因组的一部分,其可以源自野生型病毒基因组。 RNA分子可以编码RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)和形成衣壳或外壳蛋白的至少一部分的多蛋白。 RNA分子还可以包含编码由宿主细胞的细胞组分翻译的ENPP1或ENPP3多肽的RNA子序列。 当 dsRP 被转染到宿主细胞中时,子序列可以被宿主细胞的细胞机器翻译以产生 ENPP1 或 ENPP3 多肽。 [4192] 另一方面,本公开提供了一种在宿主细胞中产生蛋白质产物的方法。 该方法包括用重组双链 RNA 分子 (dsRNA) 和带有衣壳或外壳蛋白的 dsRP 转染宿主细胞。 RNA分子可以编码RNA依赖性RNA聚合酶和形成衣壳或外壳蛋白的至少一部分的多蛋白,并且dsRP能够在宿主细胞中复制。 RNA分子具有至少一个编码由宿主细胞的细胞组分翻译的ENPP1或ENPP3多肽的RNA子序列。 [4193] 另一方面,本公开提供了一种能够被宿主细胞翻译的RNA分子。 RNA分子可以是编码本文所述的ENPP1或ENPP3多肽的任何RNA分子。 在一个实施方案中,RNA分子编码RNA依赖性RNA聚合酶和形成dsRP衣壳蛋白或外壳蛋白的至少一部分的多蛋白,以及任选地编码另一种蛋白质产物的RNA的至少一个亚序列。 [4194] dsRP的生产 [4195] 还可以通过将编码本公开的dsRP或编码dsRP的基因的质粒或其他DNA分子呈递给宿主细胞来产生本公开的dsRP。 然后将含有编码所需蛋白质如ENPP1或ENPP3多肽的核苷酸序列的质粒或DNA分子转染到宿主细胞中,并且宿主细胞开始产生本公开的dsRP。 通过将编码 dsRP 基因的 RNA 分子呈递给宿主细胞,也可以在宿主细胞中产生 dsRP。 RNA分子可以是(+)链RNA。 [4196]如果本公开的 dsRP 存在于宿主细胞中(或编码本公开的 dsRP 基因的质粒,或编码 dsRP 基因的 RNA 分子),则可以使用以下方法在宿主细胞中产生 dsRP宿主细胞的细胞成分。 因此,本公开的dsRP在宿主细胞内自我维持和繁殖。 宿主细胞可以是任何合适的宿主细胞,例如真核细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、细菌细胞、昆虫细胞或酵母细胞。 在本公开的重组dsRNA分子或编码本公开的dsRP的DNA分子被呈递给宿主细胞并被宿主细胞摄取后,宿主细胞可以繁殖重组dsRP。 [4197] 产生dsRNA病毒或dsRP的方法 [4198] 本公开还提供了产生本公开的dsRP的方法。 可以将双链或单链 RNA 或 DNA 分子呈递给宿主细胞。 宿主细胞内 dsRNA 分子的扩增利用已经存在于许多类型的宿主细胞(例如酵母)中的自然生产和组装过程。 因此,可以通过将本公开的单链或双链RNA或DNA分子呈递给宿主细胞来应用本公开,该分子被宿主细胞吸收并使用宿主细胞的细胞成分转化为RNA亚序列。宿主细胞。用于生产重组 dsRP 和由其编码的蛋白质或肽 本公开内容还涉及编码 RNA 依赖性 RNA 聚合酶的一个或多个序列、形成 dsRP 的衣壳或外壳蛋白的至少一部分的多蛋白、以及编码感兴趣的蛋白质(例如 ENPP1 或 ENPP3)的子结构域可以通过向宿主细胞提供包含该序列的线性或环状DNA分子(例如,质粒或载体)来应用。 [4199] 本公开的dsRNA或ssRNA分子的呈递可以以任何合适的方式进行,例如通过将本公开的RNA分子作为“裸”或未修饰的单链或双链RNA直接呈递给宿主细胞。能 RNA分子可以通过任何合适的方法制备,例如通过电穿孔、将宿主细胞暴露于磷酸钙,或通过在酵母、细菌或哺乳动物中产生与细胞膜融合以在其中沉积病毒序列的脂质体。 (或转化)成宿主细胞。 这也可以通过一种特定的机制来完成,该机制直接将来自 kill 病毒的 dsRNA 或异源 dsRNA 引入宿主细胞。 可以使用报告系统(如红色荧光蛋白 (RFP))或通过靶向宿主细胞基因组内的特定组成基因转录本来优化此步骤。 这可以通过使用具有不同表型的目标或通过定量逆转录酶 PCR (RT-PCR) 进行监测来完成。 [4200] 在一些实施方案中,将编码本公开的RNA分子的DNA分子(例如,质粒或其他载体)引入宿主细胞中。 DNA分子可以包含编码本公开的dsRP的RNA分子的序列。 DNA分子可以编码dsRP的整个基因组或其一部分。 DNA分子可进一步编码至少一种产生额外(异源)蛋白质产物的RNA亚序列。 DNA序列还可以编码gag蛋白或gag-pol蛋白,以及任何必需或期望的启动子或支持分子表达和目的的其他序列。 DNA 分子可以是线性 DNA、环状 DNA、质粒、酵母人工染色体,或者可以采用便于特定应用的任何其他形式。 [4201] 在一个实施方案中,DNA分子可进一步包括T7末端以产生多联体和发夹结构,从而允许病毒或dsRP序列在宿主细胞中繁殖。 可以将DNA分子转染或转化到宿主细胞中,然后使用宿主细胞机器复制宿主细胞,从而为宿主细胞提供具有至少一个RNA子序列的dsRNA分子。 然后宿主细胞可以产生编码的所需 ENPP1 或 ENPP3 多肽。 dsRNA 可以使用与野生型病毒相同的方式包装,利用宿主细胞的代谢过程和机制。 ENPP1 或 ENPP3 多肽也是使用宿主细胞的代谢过程和细胞成分产生的。 [4202] Brown 等人的 US 10266834 详细描述了编码多肽的 dsRNA 颗粒的产生、递送和施用的过程,其内容通过引用整体并入本文。 [4203] 药物组合物和制剂 [4204] 本公开在本文描述的方法内提供了包含本公开的多肽的药物组合物。 这样的药物组合物可以是适合施用于受试者的形式,或者药物组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种另外的成分,或它们的一些组合。 药物组合物的各种组分可以生理学上可接受的盐的形式存在,例如与生理学上可接受的阳离子或阴离子组合,如本领域所熟知的。 [4205] 在一个实施方案中,可施用用于实践本公开的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。 在另一个实施方案中,可施用可用于实践本公开的药物组合物以递送1ng/kg/天至500mg/kg/天的剂量。 [4206] 本公开的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何附加成分的相对量将随着接受治疗的受试者的身份、大小和状况而变化,并且将进一步随着治疗的途径而变化composition is to be administed. will be. composition is to be administered. 将要执行。 举例来说,组合物可包含约0.1%至约100%(w/w)的活性成分。 [4207] 在本公开的方法中有用的药物组合物可以被开发为适用于吸入、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、透皮、肺部、鼻内、口腔、眼部、鞘内、静脉内或其他给药途径。 其他预期的制剂包括投射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫的制剂。 给药途径对本领域技术人员来说是显而易见的,并且取决于许多因素,包括所治疗疾病的类型和严重程度、所治疗动物或人类患者的类型和年龄,以及喜欢。 [4208] 本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或下文开发的任何方法来制备。 通常,此类制造方法包括将活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合,然后,如果需要或需要,将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单位。 . [4209] 如本文所用,“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。 活性成分的量通常与施用于受试者的活性成分的剂量相同,或该剂量的方便分数,例如该剂量的一半或三分之一。 单位剂型可以是每天一次给药或每天多次给药(例如,每天约1至4次或更多次)。 当使用多个日剂量时,每个剂量的单位剂型可以相同或不同。 [4210]给药方案可以影响有效量的构成。 例如,可以每天或顺序地多次分开和交错给药,剂量可以连续输注,或者可以是团注。 此外,可以根据治疗或预防情况的紧迫性指示,按比例增加或减少治疗制剂的施用。 在某些实施方案中,向受试者施用本公开的化合物使受试者的血浆PPi升高至接近正常的水平,其中哺乳动物中PPi的正常水平为1-3μM。 “接近正常”是小于或大于 0-1.2 μM 或正常的 0-40%,小于或大于 30 nM-0.9 μM 或正常的 1-30%15,0-0.6 μM 或小于 0-正常值的 20% 或更高,或低于或高于 0-0.3 μM 或正常值的 0-10%。 [4211] 可以使用已知的程序以有效治疗患者的疾病或病症的一段时间的剂量向患者(例如人,例如哺乳动物)施用本公开的组合物。 达到治疗效果所需的治疗化合物的有效量取决于所用特定化合物的活性; 给药时间; 化合物的排泄率; 治疗持续时间; 其他药物、化合物或与化合物结合使用的物质; 接受治疗的患者的疾病或病症的状况、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史,以及医学领域众所周知的其他因素。 可以调整给药方案以提供最佳治疗反应。 剂量是根据治疗化合物的生物活性确定的,而这又取决于血浆时间下的面积和治疗化合物曲线的半衰期。 根据本公开内容的多肽每 2 天、或每 4 天、或每周施用以实现接近正常水平(1-3μM)或高于正常水平(高 30-50%)的连续血浆 PPi 水平。或每月在适当的时间间隔。 本公开的多肽的治疗性施用也可以基于半衰期或治疗性多肽从体内清除的速率来确定。 根据本公开内容的多肽以适当的时间间隔施用,例如每2天或每4天、每周或每月施用,以实现ENPP1或ENPP3多肽的恒定水平的酶活性。 [4212] 例如,每天可以分几次给药,或者根据治疗情况的紧迫性按比例减少剂量。 本公开的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例在约0.01和50mg/kg体重/天之间。 在某些实施方案中,本公开的治疗化合物的有效剂量范围为约50ng/kg至500ng/kg体重,优选100ng至300ng/kg体重。 本领域的技术人员将能够研究所涉及的因素并做出关于治疗化合物的有效量的决定而无需过多的实验。 [4213] 化合物可以每天数次或更少的频率如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或什至更少的频率如每隔几个月一次向患者施用化合物,甚至每年一次或更少。 应当理解,在非限制性实例中,每天施用的化合物的量可以每天、每2天、每2天、每3天、每4天或每5天施用。 例如,当每隔一天给药时,可以在星期一开始 5 毫克/天的剂量,在星期三给药第一个后续的 5 毫克/天剂量,并且在星期五给药第二个后续的 5 毫克/天剂量等。 给药频率对于本领域技术人员而言是显而易见的并且取决于许多因素,例如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度,以及患者的类型和年龄。 可以改变本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得有效实现针对特定患者、组合物和施用方式的期望治疗反应而不对患者有毒的活性成分的量。有。 [4214] 医师,例如本领域技术人员,可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。 例如,医生或兽医可以开始以低于实现所需治疗效果所需水平的水平给药用于药物组合物的本公开的化合物,并逐渐增加剂量直至实现所需效果。 [4215] 在某些实施方案中,本公开的组合物以每天1至5次或更多次的剂量施用于患者。 在另一个实施方案中,本公开的组合物以包括但不限于每1天一次、每2天一次、每3天一次至每周一次和每2周一次的剂量范围施用于患者。 本公开的各种组合组合物的施用频率因受试者而异并且取决于许多因素,包括但不限于年龄、待治疗的疾病或病症、性别、一般健康状况和其他因素。 因此,不应将本公开内容解释为限于任何特定的给药方案,并且要对任何患者给药的确切剂量和组合物将由参与机构考虑患者的所有其他因素来确定。 [4216] 在某些实施方案中,本公开提供了一种容器,用于容纳治疗有效量的本公开化合物单独或与第二药剂的组合; 以及使用该化合物治疗、预防或减轻患者疾病或病症的一种或多种症状的说明。 [4217] 给药途径 [4218] 本公开的任何一种组合物的给药途径可以是吸入、口服、鼻腔、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如舌下、经舌、(经)颊、(经)尿道)、阴道(例如,经阴道和阴道旁)、(内)鼻和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内,包括吸入和局部给药. [4219] 合适的组合物和剂型包括,例如,片剂、胶囊剂、囊片剂、丸剂、凝胶帽、锭剂、分散剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、珠子、透皮贴剂、凝胶剂、粉末剂、丸剂、岩浆剂、糖果、乳膏、糊剂、膏药、洗剂、圆盘剂、栓剂、用于鼻腔或口服给药的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或气溶胶制剂、用于膀胱内给药的组合物和制剂等。 可用于本公开的制剂和组合物不限于本文所述的特定制剂和组合物。 [4220] 药物组合物的“肠胃外给药”包括任何给药途径,其特征在于物理刺穿受试者的组织并通过组织中的穿刺来给药药物组合物。 因此,肠胃外给药包括通过注射组合物来给药药物组合物、通过手术切口应用组合物、通过组织穿透性非手术伤口应用组合物等,但不限于此。 特别地,考虑肠胃外给药,包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。 [4221] 是的 [4222] 本公开通过以下实施例进一步说明。 这些示例仅用于说明目的,无意且不应被解释为以任何方式限制本公开。 [4223] 实施例 1:ENPP1 和 ENPP1-Fc 融合蛋白在小鼠主动脉同种异体移植物中的功效 [4224] 同种异体移植物血管病仍然是阻碍器官移植物存活的主要并发症之一,因此是实体器官移植患者死亡的主要危险因素。 本例的目的是评估 ENPP1-Fc 融合蛋白或 ENPP1 蛋白在小鼠模型中用于主动脉同种异体移植物的功效。 ENPP1 或 ENPP1-Fc 融合蛋白的治疗效果是根据它们在实体器官移植后抑制狭窄的能力来评估的。 [4225] 5-6 周龄女性 DBA/2 (H-2 ^d ) 和 C57BL/6J (H-2 ^b ) 小鼠分别作为供体和受体小鼠。 ( Bickerstaff 等人,小鼠肾同种异体移植:自发接受与受调节的 T 细胞介导的免疫有关,2001 年,J. Immunol。 167、4821-4827 ). 如前所述,将 DBA/2 小鼠的降胸主动脉移植到肾下位置的 C57CL/6 小鼠中。 ( Seppelt 等人,马凡小鼠内皮屏障缺失 (mgR/mgR) 导致腺病毒基因治疗后严重炎症,2016 年,PLoS ONE 11,e0148012 .) [4226]CO供体小鼠 ₂ 安乐死 打开胸腔,刺破左心室,用 5 mL NaCl(4 °C,0.9%)灌注动脉循环。 采集降主动脉并将其移植到受体小鼠体内,以创建主动脉同种异体移植模型。 或者,可以从供体小鼠采集整个心脏并将其移植到受体小鼠中,以创建实体器官移植小鼠模型,如图 2 所示。 [4227] 受体 C57BL/6J 小鼠通过吸入 5% 异氟醚进行麻醉。 腹膜内注射 Novalgin(500 毫克/毫升;200 毫克/千克体重)和 Carprieve(50 毫克/毫升卡洛芬,5 毫克/千克体重)。 打开受体小鼠的腹腔并解剖肾下主动脉。 应用钛夹并横切主动脉。 移植物通过两个端对端吻合(Prolene 11-0,尼龙黑色,S&T,Neuhausen,Switzerland)连接到受体主动脉。 夹子移除后,移植物被再灌注。 ( Remes 等人,分子疗法:方法与临床开发卷。 2019 年 12 月 15 日 ). [4228] 带有移植主动脉的受体小鼠的对照子集 (n=5) 用 Tris 缓冲盐水处理,带有移植主动脉的受体小鼠的实验子集 (n=5) 用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理。确定效果ENPP1 或 ENPP1-Fc 对同种异体移植物中血管平滑肌细胞增殖的影响。 ENPP1 或 ENPP1-Fc 治疗(每天皮下注射 ENPP1 或 ENPP1-Fc,10 mg/kg 体重)在一组实验小鼠的主动脉移植后开始,并持续 28 天,直到收获移植的主动脉。 类似地,在主动脉移植后每天通过皮下注射对对照组小鼠进行 tris 缓冲盐水 pH 值 7.4 治疗,持续 28 天,直至收获移植的主动脉。 对于形态学分析,动脉用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定。 [4229] 收集连续切片(每片 5 μm)。 冷冻主动脉切片(Microtom,HM 500 O),5 μm 厚,从整个植入移植物的不同间隔中随机选择,并使用 Elastica van Gieson 染色剂(Roth,Karlsruhe,Germany)进行染色。 使用 ImageJ 软件测量外弹性层、内弹性层和发光边界的周长。 然后,使用 ImageJ(斐济版本 1.51p,美国国立卫生研究院,美国),由两名对治疗方案不知情的研究人员测量子宫内膜和正中区域。 所分析的两个参数的比率被用作管腔阻塞的量度。 计算中值面积、内膜面积和内膜/中膜比(I/M 比)。 [4230] 使用 Student's t 检验(未配对的 2 样本平均值检验)进行统计分析。 使用单向方差分析对多个组进行比较,然后使用 GraphPad Prism 软件版本 7 进行 Bonferroni 事后检验。 p < 0.05 的概率值被认为是显着的。 形态学分析表明,未经治疗的对照小鼠出现血管病变和强烈的重塑,并伴有高水平的血管腔闭塞。 [4231] 在移植后用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 治疗的实验小鼠中,将内膜增生的程度与未给予 ENPP1 或 ENPP1-Fc 的对照小鼠进行比较。 与移植后第 28 天或之后用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的小鼠相比,未经处理的对照小鼠的移植主动脉连续切片的定量分析预计将显示显着增加的子宫内膜增殖。 与治疗小鼠相比,对照小鼠预计会显示动脉内壁增厚。 相应地,比较了对照小鼠和治疗小鼠的 I/M 比率。 [4232] 实施例2:ENPP1-Fc的预防效果 [4233] 实施例1相同实验的改进,如图1所示,通过在主动脉移植前1周给予实验组ENPP1或ENPP1-Fc预防或减轻移植物血管病变,ENPP1或ENPP1-Fc确定预防剂Fc的作用。 同样,对照组在主动脉移植前 1 周给予 Tris 缓冲盐水。 然后,对用 10 mg/kg 剂量的 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的移植后实验组和用 Tris 缓冲盐水处理的移植后对照组重复该程序。 形态学分析显示,与对照小鼠相比,接受皮下 ENPP1 或 ENPP1-Fc 的实验小鼠的内膜面积预计会显着减少,而外膜和内膜之间的中值面积预计将保持不变。 与用载体处理的对照小鼠相比,用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的实验小鼠的 I/M 比率预计会显示出统计学上显着的降低,这表明在主动脉移植之前用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 进行预防性治疗会导致 I It表明它将通过降低 /M 比值起到保护作用。 [4234] 实施例3:大鼠同种异体主动脉模型 [4235] 可以使用大鼠模型代替小鼠模型进行与实施例1中描述的相同的实验。 用于移植的大鼠模型是 Bogossian 等人 (2016) Cardiovasc Ther 34(4):183 描述于 在移植后第 28 天,将接受主动脉同种异体移植的 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的大鼠与对照大鼠(接受 Tris 缓冲盐水)进行比较。 [4236] 实施例 4:ENPP1 或 ENPP1-Fc 融合蛋白在猪心脏移植模型中心脏同种异体移植血管病 (CAV) 中的功效 [4237] 供体-受体对的选择基于混合淋巴细胞反应 (MLR) 的主要组织相容性复合体不相容性。 刺激指数 (SI) 通过以下公式计算:(同种异体 MLR 的平均 cpm)/(自体 MLR 的平均 cpm)。 供体心脏通过肾下同种异体移植原位移植到受体猪的腹部。 选定的移植供体和受体用唑来(替来他明 + 唑拉西泮,5 mg/kg)、琥珀胆碱(1.1 mg/kg)和阿托品(0.6 mg/kg)麻醉,插管,然后置于呼吸机上。使用麻醉维持异氟醚 (3%/1.5 L/min) 通过 接受者被置于左侧仰卧位,并确保血管通路用于免疫抑制药物的给药。 [4238] 进行右侧切口,并通过腹膜后通路分离肾下主动脉和下腔静脉(见图 3)。 接下来,对捐赠者进行肝素化(300 IU/kg 静脉注射 (i.v.),使用冷 (4 °C) 心脏骤停溶液实现心脏骤停),并收获捐赠者心脏。每个捐赠者心脏均存在房间隔缺损。二尖瓣功能失调,以尽量减少左心室萎缩和腔内血栓形成 接受者被肝素化(300 IU/kg i.v.),供者的肺动脉在下腔静脉处用连续的 5-0 聚丙烯缝线结扎在 1- End-to-通过 2 cm 静脉切开术进行侧向吻合接下来,以类似的方式将供体心脏的升主动脉与受体的腹主动脉吻合,然后给予鱼精蛋白 (1.5 mg/kg;) 止血 ( Hsu 等,移植。 2018 年 12 月; 102(12): 2002-2011 .) [4239] 心脏同种异体移植率每天通过心悸进行监测,心电图每周进行两次。 如果同种异体移植物的速率降低,则执行超声心动图以评估收缩功能。 随访一直持续到同种异体移植停止或研究结束日期(150 天)。 [4240] 用 Tris 缓冲盐水处理移植心脏的受体猪的对照子集 (n=12),用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理移植心脏的实验子集 (n=12)。 ENPP1对实体器官移植血管平滑肌细胞增殖的影响。 ENPP1 或 ENPP1-Fc 治疗(ENPP1-Fc 或 ENPP1 每 4 天皮下注射一次,10 mg/kg 体重)在实验猪组心脏移植后开始,持续 150 天,直至收获移植心脏。 类似地,一组对照猪在心脏移植后每 4 天通过腹膜内注射用 pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水处理 150 天,直到收获移植的心脏。 [4241]福尔马林固定的心脏标本经过石蜡包埋、切片、去石蜡、再水化,然后进行苏木精和伊红 (HE) 或地衣红染色。 使用蔡司显微镜检查血管移植物的内膜增生,并根据奥赛因染色切片的计算机图像确定。 使用图像分析程序(图像 J,版本 1.46r,NIH 图像)计算内部弹性板(IELA)和管腔区域(LA)所包围的区域。 使用以下公式计算内膜增生的严重程度:[(IELA - LA)/IELA] Х 100%。 计数后,每根移植物的内膜增生严重程度以盲法在每5个冠状动脉切片的3个视野中以盲法评估5个横截面,并将评估的严重程度水平平均用于统计分析。 [4242] 使用 Student's t 检验(未配对的 2 样本平均值检验)进行统计分析。 使用单向方差分析对多个组进行比较,然后使用 GraphPad Prism 软件版本 7 进行 Bonferroni 事后检验。 p < 0.05 的概率值被认为是显着的。 形态学分析表明,未经处理的对照猪发生血管病变和强烈重塑,并伴有高水平的血管腔闭塞。 [4243] 在移植后用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的实验猪中,对连续切片进行定量和定性分析以确定对照和 ENPP1 或 ENPP1 处理的猪的内膜增生程度。 预期对照猪在移植后 150 天表现出显着增加的子宫内膜增殖。 预期对照猪显示出内膜增厚,并将经处理的猪与对照进行比较。 相应地,比较对照猪和处理猪的I/M比率。 还确定了对照组和 ENPP1 或 ENPP1 治疗组的中位生存期。 还确定了对照组和 ENPP1 或 ENPP1 治疗组的移植物存活时间。 [4244] 实施例5:ENPP3或ENPP3-Fc融合蛋白在小鼠主动脉同种异体移植物中的功效 [4245] 5-6 周龄女性 DBA/2 (H-2 ^d ) 和 C57BL/6J (H-2 ^b ) 小鼠分别作为供体和受体小鼠。 ( Bickerstaff 等人,小鼠肾同种异体移植:自发接受与受调节的 T 细胞介导的免疫有关,2001 年,J. Immunol。 167、4821-4827 ). 如前所述,将 DBA/2 小鼠的降胸主动脉移植到肾下位置的 C57CL/6 小鼠中。 ( Seppelt 等人,马凡小鼠内皮屏障缺失 (mgR/mgR) 导致腺病毒基因治疗后严重炎症,2016 年,PLoS ONE 11,e0148012 .) [4246] CO供体小鼠 ₂ 安乐死 打开胸腔,刺破左心室,用 5 mL NaCl(4 °C,0.9%)灌注动脉循环。 采集降主动脉并将其移植到受体小鼠体内,以创建主动脉同种异体移植模型。 或者,可以从供体小鼠采集整个心脏并将其移植到受体小鼠中,以创建实体器官移植小鼠模型,如图 2 所示。 [4247] 受体 C57BL/6J 小鼠通过吸入 5% 异氟醚进行麻醉。 腹膜内注射 Novalgin(500 毫克/毫升;200 毫克/千克体重)和 Carprieve(50 毫克/毫升卡洛芬,5 毫克/千克体重)。 打开受体小鼠的腹腔并解剖肾下主动脉。 应用钛夹并横切主动脉。 移植物通过两个端对端吻合(Prolene 11-0,尼龙黑色,S&T,Neuhausen,Switzerland)连接到受体主动脉。 夹子移除后,移植物被再灌注。 ( Remes 等人,分子疗法:方法与临床开发卷。 2019 年 12 月 15 日 ). [4248] 带有移植主动脉的受体小鼠的对照子集 (n=5) 用 Tris 缓冲盐水处理,带有移植主动脉的受体小鼠的实验子集 (n=5) 用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理。确定效果ENPP3-Fc 对同种异体移植物中血管平滑肌细胞增殖的影响。 ENPP3-Fc 治疗(每天皮下注射 ENPP3-Fc,10 mg/kg 体重)在一组实验小鼠的主动脉移植后开始,并持续 28 天,直到收获移植的主动脉。 类似地,在主动脉移植后每天通过皮下注射对对照组小鼠进行 tris 缓冲盐水 pH 值 7.4 治疗,持续 28 天,直至收获移植的主动脉。 对于形态学分析,动脉用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定。 [4249] 收集连续切片(每片 5 μm)。 冷冻主动脉切片(Microtom,HM 500 O),5 μm 厚,从整个植入移植物的不同间隔中随机选择,并使用 Elastica van Gieson 染色剂(Roth,Karlsruhe,Germany)进行染色。 使用 ImageJ 软件测量外弹性层、内弹性层和发光边界的周长。 然后,使用 ImageJ(斐济版本 1.51p,美国国立卫生研究院,美国),由两名对治疗方案不知情的研究人员测量子宫内膜和正中区域。 所分析的两个参数的比率被用作管腔阻塞的量度。 计算中值面积、内膜面积和内膜/中膜比(I/M 比)。 [4250] 使用 Student's t 检验(未配对的 2 样本平均值检验)进行统计分析。 使用单向方差分析对多个组进行比较,然后使用 GraphPad Prism 软件版本 7 进行 Bonferroni 事后检验。 p < 0.05 的概率值被认为是显着的。 形态学分析表明,未经治疗的对照小鼠出现血管病变和强烈的重塑,并伴有高水平的血管腔闭塞。 [4251] 在移植后用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的实验小鼠中,将内膜增生的程度与未施用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 的对照小鼠进行比较。 与移植后第 28 天或之后用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的小鼠相比,未经处理的对照小鼠的移植主动脉连续切片的定量分析预计将显示显着增加的子宫内膜增殖。 与治疗小鼠相比,对照小鼠预计会显示动脉内壁增厚。 相应地,比较了对照小鼠和治疗小鼠的 I/M 比率。 [4252] 实施例 6:ENPP3 或 ENPP3-Fc 的预防作用 [4253] 实施例5相同实验的改进,如图1所示,在主动脉移植前1周给予实验组ENPP3或ENPP3-Fc预防或减轻移植物血管病变,测定Fc的预防效果。 同样,对照组在主动脉移植前 1 周给予 Tris 缓冲盐水。 然后,对用 10 mg/kg 剂量的 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的移植后实验组和用 Tris 缓冲盐水处理的移植后对照组重复该程序。 形态学分析显示,与对照小鼠相比,接受皮下 ENPP3 或 ENPP3-Fc 的实验小鼠的内膜面积预计会显着减少,而外膜和内膜之间的中值面积预计将保持不变。 与用载体处理的对照小鼠相比,用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的实验小鼠的 I/M 比率预计会显示出统计学上的显着降低,表明在主动脉移植之前用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 进行预防性治疗会导致 It表明它将通过降低 /M 比值起到保护作用。 [4254] 实施例7:大鼠同种异体主动脉模型 [4255] 可以使用大鼠模型代替小鼠模型进行与实施例5中描述的相同的实验。 用于移植的大鼠模型是 Bogossian 等人 (2016) Cardiovasc Ther 34(4):183 描述于 在移植后第 28 天,将接受主动脉同种异体移植的 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的大鼠与对照大鼠(接受 Tris 缓冲盐水)进行比较。 [4256] 实施例8:ENPP3-Fc融合蛋白在猪心脏移植模型中心脏同种异体移植物血管病(CAV)中的功效 [4257]CAV 仍然是移植后 1 年同种异体移植物失败的主要原因。 心脏同种异体移植物血管病表现为加速的弥漫性冠状动脉粥样硬化,其发病机制与传统的自发性冠状动脉疾病 (CAD) 不同。 ENPP3 或 ENPP3-Fc 融合蛋白的功效在器官移植的大型动物模型中进行评估,特别是家养(约克郡)猪心脏移植。 ENPP3 或 ENPP3-Fc 融合蛋白的治疗效果是通过其抑制约克夏猪心脏移植后狭窄的能力来评估的。 [4258] 供体-受体对的选择基于混合淋巴细胞反应 (MLR) 的主要组织相容性复合体不相容性。 刺激指数 (SI) 通过以下公式计算:(同种异体 MLR 的平均 cpm)/(自体 MLR 的平均 cpm)。 供体心脏通过肾下同种异体移植原位移植到受体猪的腹部。 选定的移植供体和受体用唑来(替来他明 + 唑拉西泮,5 mg/kg)、琥珀胆碱(1.1 mg/kg)和阿托品(0.6 mg/kg)麻醉,插管并置于呼吸机上。使用异氟醚维持麻醉状态( 3%/1.5 升/分钟)通过 接受者被置于左侧仰卧位,并确保血管通路用于免疫抑制药物的给药。 [4259] 进行右侧切口,并通过腹膜后通路分离肾下主动脉和下腔静脉(见图 3)。 接下来,对捐赠者进行肝素化(300 IU/kg 静脉注射 (i.v.),使用冷 (4 °C) 心脏骤停溶液实现心脏骤停),并收获捐赠者心脏。每个捐赠者心脏均存在房间隔缺损。二尖瓣功能失调,以尽量减少左心室萎缩和腔内血栓形成 接受者被肝素化(300 IU/kg i.v.),供者的肺动脉在下腔静脉处用连续的 5-0 聚丙烯缝线结扎在 1- End-to-通过 2 cm 静脉切开术进行侧向吻合 接下来,以类似的方式将供体心脏的升主动脉与受体的腹主动脉吻合,并给予鱼精蛋白 (1.5 mg/kg;) 止血 ( Hsu 等,移植。 2018 年 12 月; 102(12): 2002-2011 .) [4260] 心脏同种异体移植率每天通过心悸进行监测,心电图每周进行两次。 如果同种异体移植物的速率降低,则执行超声心动图以评估收缩功能。 随访一直持续到同种异体移植停止或研究结束日期(150 天)。 [4261] 用 Tris 缓冲盐水处理移植心脏的受体猪的对照子集 (n=12),用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理移植心脏的实验子集 (n=12)。 ENPP3 多肽对实体器官移植中血管平滑肌细胞增殖的影响。 ENPP3 或 ENPP3-Fc 治疗(ENPP3 或 ENPP3-Fc 每 4 天皮下注射一次,10 mg/kg 体重)在实验猪组心脏移植后开始,持续 150 天,直至收获移植心脏。 类似地,一组对照猪在心脏移植后每 4 天通过腹膜内注射用 pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水处理 150 天,直到收获移植的心脏。 [4262] 福尔马林固定的心脏标本经过石蜡包埋、切片、去石蜡、再水化,然后进行苏木精和伊红 (HE) 或地衣红染色。 使用蔡司显微镜检查血管移植物的内膜增生,并根据奥赛因染色切片的计算机图像确定。 使用图像分析程序(图像 J,版本 1.46r,NIH 图像)计算内部弹性板(IELA)和管腔区域(LA)所包围的区域。 使用以下公式计算内膜增生的严重程度:[(IELA - LA)/IELA] Х 100%。 计数后,每根移植物的内膜增生严重程度以盲法在每5个冠状动脉切片的3个视野中以盲法评估5个横截面,并将评估的严重程度水平平均用于统计分析。 [4263] 使用 Student's t 检验(未配对的 2 样本平均值检验)进行统计分析。 使用单向方差分析对多个组进行比较,然后使用 GraphPad Prism 软件版本 7 进行 Bonferroni 事后检验。 p < 0.05 的概率值被认为是显着的。 形态学分析表明,未经处理的对照猪发生血管病变和强烈重塑,并伴有高水平的血管腔闭塞。 [4264] 在植入后用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的实验猪中,对连续切片进行定量和定性分析以确定对照和 ENPP3 处理的猪的内膜增生程度。 预期对照猪在移植后 150 天表现出显着增加的子宫内膜增殖。 预期对照猪显示出内膜增厚,并将经处理的猪与对照进行比较。 相应地,比较对照猪和处理猪的I/M比率。 还确定了对照组和 ENPP3 治疗组的中位生存期。 还确定了对照组和 ENPP3 治疗组的移植物存活时间。 [4265] 实施例9:ENPP1-Fc融合蛋白在支架内再狭窄模型中的功效 [4266] ENPP1-Fc 融合蛋白的功效在大型动物模型中进行了外周血管损伤评估,特别是家养(约克郡)猪外周血管支架内再狭窄病变。 对 ENPP1-Fc 融合蛋白的治疗效果进行了评估,以确定其在先前受伤的约克夏猪的外周动脉血管成形术后抑制狭窄的能力。 [4267] 在每只动物中,创建了 4 个外周动脉部位以引发肾内反应; 为四个动脉(双侧股深动脉和股浅动脉)中的每一个选择了一个部位。 [4268] 所有目标部位均在第 0 天、首次施用 ENPP1-Fc 或单独控制车辆前 10 天以及重复受伤前 14 天受伤,以创建支架内再狭窄模型。 使用定量血管造影 (QVA) 绘制四个外周动脉部位,以选择治疗部位和正确尺寸的球囊和支架。 使用标准血管成形术气囊导管以目标 130% 的过度伸展使动脉过度伸展造成损伤; 进行了三个扩展。 受伤后立即放置裸金属支架。 外周支架是自扩张的,目标是过度伸展约 120%。 [4269] ENPP1-Fc 治疗从第 10 天开始进行全身治疗,每 4 天皮下给药一次直至终止。 第 14 天,所有血管均通过血管造影和光学相干断层扫描 (OCT) 进行评估。 然后,使用标准血管成形术球囊导管的单次扩张,将先前受伤的支架动脉部位重新植入支架,使其达到与原始支架前损伤相同的压力/直径(基线基线直径的 130%)。损坏事件发生。 在再次受伤干预后,还记录了选定外周部位的最终术后血管造影和 OCT。 [4270] 在第 14 天再次受伤事件发生后 4 周,对动脉进行了血管造影和血管内成像 (OCT) 的重复成像。 处理过的外围部分被外植并储存在 10% 中性缓冲福尔马林中。 [4271] 如图4所示,血管造影术显示与给予载体对照的动物在第14天的血管形态相比,第42天显着的深度变窄。 相反,在用 ENPP1-Fc 处理的动物中,在第 14 天和第 42 天之间几乎没有观察到深层形态的可见变化。 类似地,如通过 OCT 测量的那样,与用载体对照处理的动物在第 14 天的血管形态相比,在第 42 天的深核内观察到显着的内膜增厚。 相反,在第 14 天和第 42 天之间,在用 ENPP1-Fc 处理的动物的深部观察到很少可见的内膜增厚(图 5)。 [4272] 表 1 和表 2(下)总结了治疗组所有深动脉的平均 OCT 值。 [4273] [4274] [4275]如表中所示,与载体对照相比,用 ENPP1-Fc 处理的动物的深动脉在第 42 天具有更高的管腔面积。 两组之间的支架面积相似。 此外,与载体对照动物相比,用 ENPP1-Fc 治疗的动物在第 42 天时子宫内膜厚度和子宫内膜面积减少。 此外,与载体对照相比,用 ENPP1-Fc 治疗的动物的狭窄区域百分比明显较低(参见图 6)。 这些数据表明ENPP1多肽尤其可用于抑制外周血管损伤和/或与外周血管损伤相关的内膜增厚。 : [4276] 实施例10:ENPP3-Fc融合蛋白在支架内再狭窄模型中的功效 [4277] ENPP3-Fc 融合蛋白的功效在大型动物模型中进行了外周血管损伤评估,特别是家养(约克郡)猪外周血管支架内再狭窄病变。 对 ENPP3-Fc 融合蛋白的治疗效果进行了评估,以确定其在先前受伤的约克夏猪的外周动脉血管成形术后抑制狭窄的能力。 [4278] 建立了 4 个外周动脉部位用于在每只动物中诱导肾内反应; 为四个动脉(双侧股深动脉和股浅动脉)中的每一个选择一个部位。 [4279] 所有目标部位均在第 0 天、ENPP3-Fc 第一次给药前 10 天或单独对照车辆前 10 天以及重复受伤前 14 天受伤,以创建支架内再狭窄模型。 使用定量血管造影 (QVA) 绘制四个外周动脉部位,以选择治疗部位和正确尺寸的球囊和支架。 使用标准血管成形术球囊导管以 130% 的过度伸展为目标,通过动脉过度伸展产生损伤; 执行三个扩展。 受伤后立即放置裸金属支架。 外周支架是自扩张的,目标是过度伸展约 120%。 [4280] 从第 10 天开始每 4 天皮下施用 ENPP3-Fc 治疗直至终止。 在第 14 天,所有血管均通过血管造影和光学相干断层扫描 (OCT) 进行评估。 然后,使用标准血管成形术球囊导管的单次扩张,将先前受伤的支架动脉部位重新固定到与原始支架前损伤相同的压力/直径(基线基线直径的 130%)。 - 已发生的损坏事件。 再损伤干预后,最终的术后血管造影和 OCT 也被记录为选定的外周部位。 [4281] 在第 14 天再次受伤事件后 4 周,将对动脉进行血管造影和血管内成像 (OCT) 的重复成像。 处理过的外围部分将被移植并储存在 10% 中性缓冲福尔马林中。 [4282] 实施例11:ENPP1或ENPP1-Fc融合蛋白在MMD小鼠模型中的功效 [4283] 烟雾病是一种脑血管疾病,其特征是颅内颈内动脉进行性变窄,导致出血性和缺血性中风。 最终通过 ICA 的血流受限“ 香烟烟雾 ”(日语中的 moyamoya)。本实施例的目的是评估 ENPP1-Fc 融合蛋白或 ENPP1 在 MMD 小鼠模型中的治疗效果。ENPP1-Fc 融合蛋白或 ENPP1 的治疗效果是通过其对抑制血管平滑肌细胞增殖,减少或预防 MMD 中的脑闭塞。 [4284] MMD 表型的产生 [4285] 从 Jackson Laboratories 获得的 C57Bl/6 雄性小鼠(5-6 周龄)使用基于重量的比例的氯胺酮和甲苯噻嗪混合物进行麻醉。 将小鼠麻醉后,将它们的颈部区域剃毛,将小鼠置于仰卧位,头部、前爪和尾巴固定(图8)。 当鼠标处于仰卧位时,剃毛区域用酒精和优碘清洗。 从下颌骨到胸骨的角度做中线切口,暴露气管、颈总动脉 (CCA) 及其进入颈内动脉和颈外动脉 (ICA/ECA) 的分支。 牵开器用于固定皮肤并隔离唾液腺,以保持手术区域完好无损。 为了扩大视野,SCM 和二腹肌 (PBD) 的后腹分别向下和向上暴露。 将一对弯曲的钳尖从 SCM 的内部向外部轻轻定位,并在其下方穿过一段 4±0 缝合线。 缝合线环绕在 SCM 周围并用胶带固定。 对 PBD 重复此过程。 [4286] ICA 分离后,使用 6±0 缝线作为线圈放置的锚。 使用细尖钳抓住线圈的一端并将其倾斜放入 ICA 中,以便将血管插入线圈的最后一个横档中。 将容器放在线圈的最后一个梯级上,翻转线圈,使其与 ICA 平行。 使用 6±0 缝线,容器围绕线圈轻轻旋转,以便将一定长度的容器放置在线圈的每个梯级上。 评估血管放置以确保不会跳过横梁; 在这种情况下,血管的线圈被展开并重新定位,直到线圈完全覆盖血管。 因此,小鼠对照和实验子集中的 MMD 表型与 Roberts 等人的相似。 Roberts 等人,颈内动脉狭窄:烟雾病综合征的新型手术模型,PLoS One。 2018; 13(1): e0191312 .) 是按照中讨论的程序导出的 [4287] MMD 模型小鼠的对照子集 (n=5) 用 Tris 缓冲盐水处理,MMD 小鼠的实验子集 (n=5) 用 ENPP1 或 ENPP1 处理 MMD 大脑中的血管平滑肌细胞增殖和脑闭塞小鼠。在诱导 MMD 表型后用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理以确定-Fc 的作用。 ENPP1 或 ENPP1-Fc 治疗(ENPP1 或 ENPP1-Fc,10 mg/kg 体重,每天皮下注射)在通过手术在一组实验小鼠中诱导 MMD 表型后开始,如上所述,ENPP1 或 ENPP1-Fc给药持续 28 天,直到大脑动脉被切除。 [4288] 类似地,对照组的小鼠在通过手术诱导 MMD 表型后用 pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水处理,每天通过皮下注射给予 Tris 缓冲盐水并维持 28 天直至脑动脉摘除术。好几天 然后,将患有 MMD 的对照和实验小鼠的动脉用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定以进行形态学分析。 [4289] 脑血管系统的可视化 [4290] 为了可视化脑血管系统,每组中的所有动物都灌注了荧光染料 Di I( Li 等人,用亲脂性羰花青染料 DiI 直接标记和可视化血管。 自然协议。 2008; 3(11):1703±8 ). 使用灌注泵(设置为 1 ml/min)对小鼠灌注 5 ml PBS(室温),然后立即注射 10 ml Di I 工作液,随后注射 10 ml 10% 缓冲福尔马林以注射鼠标 transcardially. 执行 transcardial 灌注。 大脑被小心地从头骨中取出,以便威利斯环 (CoW) 保持完整。 [4291] 然后,在 4°C 的 10% 缓冲福尔马林中将提取的大脑固定过夜。 然后,将大脑转移到 PBS 中,在 4°C 下长期储存并遮蔽它。 使用 1 X 显微镜(Nikon Eclipse E800/Nikon DS-Ril)对荧光标记的大脑进行成像。 拍摄皮质血管图像以检查吻合情况,并使用 CoW 图像测量血管直径。 图像分析是通过使用尼康 NES 分析软件测量容器直径 (μm) 来执行的。 [4292] 从同源颈内动脉、大脑中动脉 M1 段和大脑前动脉 A1 段的分叉处大约 20 μm 处进行直径测量。 吻合分析是通过计算同侧和对侧半球的 ACA 和 MCA 之间的吻合数(放大图像上每个交界点的圆圈)来进行的。 ICA、ACA 和 MCA 血管的直径通过测量靠近同侧和对侧分叉处的每个血管的宽度来检查,以确定实验组和对照组之间的大小是否存在差异。 [4293] 形态分析 [4294] 为对照组和实验组收集 MCA、ACA 和 ICA 等脑动脉的连续切片(每片 5 μm)。 5 μm 厚的冷冻主动脉切片(Microtome,HM 500 O)使用 Elastica van Gieson 染色剂(Roth,Karlsruhe,Germany)进行染色。 使用 ImageJ 软件测量外弹性层、内弹性层和发光边界的周长。 然后,使用 ImageJ(斐济版本 1.51p,美国国立卫生研究院,美国),由两名对治疗方案不知情的研究人员测量子宫内膜和正中区域。 所分析的两个参数的比率被用作管腔阻塞的量度。 计算中值面积、内膜面积和内膜/中膜比(I/M 比)。 (见图 2)。 [4295] 使用 Student's t 检验(未配对的 2 样本平均值检验)进行统计分析。 使用单向方差分析对多个组进行比较,然后使用 GraphPad Prism 软件版本 7 进行 Bonferroni 事后检验。 p < 0.05 的概率值被认为是显着的。 形态学分析表明,未经治疗的具有 MMD 表型的对照小鼠会出现血管病变、闭塞和狭窄,并伴有高水平的血管腔闭塞。 [4296] 在诱导 MMD 表型后用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的实验小鼠中,将内膜增生的程度与未施用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 的对照小鼠进行比较。 与在术后第 28 天或之后用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 治疗的小鼠相比,具有 MMD 表型的未治疗对照小鼠的脑动脉定量分析预计会显示显着增加的子宫内膜增殖。 与治疗小鼠相比,对照小鼠预计会显示动脉内壁增厚。 相应地,还比较了对照小鼠和治疗小鼠的 I/M 比率。 [4297] 实施例12:ENPP1或ENPP1-Fc的预防作用 [4298] 修改与实施例11所述相同的实验,如图7所示,通过在诱导MMD表型前一周向实验组施用ENPP1或ENPP1-Fc来预防或减少血管平滑肌增生和脑闭塞。确定预防措施ENPP1 或 ENPP1-Fc 的作用。 类似地,在诱导 MMD 表型之前 1 周,对对照组施用 Tris 缓冲盐水。 然后,在手术后用 10 mg/kg 的 ENPP1 或 ENPP1-Fc 治疗的实验组和手术后用 Tris 缓冲盐水治疗的对照组重复该程序,如上所述。 [4299] 形态学分析表明,与对照小鼠相比,接受皮下 ENPP1 或 ENPP1-Fc 的 MMD 表型实验小鼠的内膜面积预计会显着减少,而外膜和内膜之间的中值面积将保持不变。 与用载体处理的对照小鼠相比,用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 处理的实验小鼠的 I/M 比率预计会降低。 在诱导 MMD 表型之前用 ENPP1 或 ENPP1-Fc 进行预防性治疗预计会通过降低 VSMC 增殖水平来赋予保护作用。 [4300] 实施例13:ENPP3或ENPP3-Fc融合蛋白在MMD小鼠模型中的功效 [4301] 烟雾病是一种脑血管疾病,其特征是颅内颈内动脉进行性变窄,导致出血性和缺血性中风。 最终通过 ICA 的血流受限“ 香烟烟雾 》(日语中的 moyamoya)。本实施例的目的是评估 ENPP3-Fc 融合蛋白或 ENPP3 在 MMD 小鼠模型中的治疗效果。ENPP3-Fc 融合蛋白或 ENPP3 的治疗效果是通过其对抑制血管平滑肌细胞增殖,减少或预防 MMD 中的脑闭塞。 [4302] MMD 表型的产生 [4303] 从 Jackson Laboratories 获得的 C57Bl/6 雄性小鼠(5-6 周龄)使用基于重量的比例的氯胺酮和甲苯噻嗪混合物进行麻醉。 将小鼠麻醉后,将它们的颈部区域剃毛,将小鼠置于仰卧位,头部、前爪和尾巴固定(图8)。 当鼠标处于仰卧位时,剃毛区域用酒精和优碘清洗。 从下颌骨到胸骨的角度做中线切口,暴露气管、颈总动脉 (CCA) 及其进入颈内动脉和颈外动脉 (ICA/ECA) 的分支。 牵开器用于固定皮肤并隔离唾液腺,以保持手术区域完好无损。 为了扩大视野,SCM 和二腹肌 (PBD) 的后腹分别向下和向上暴露。 将一对弯曲的钳尖从 SCM 的内部向外部轻轻定位,并在其下方穿过一段 4±0 缝合线。 缝合线环绕在 SCM 周围并用胶带固定。 对 PBD 重复此过程。 [4304] ICA 分离后,使用 6±0 缝线作为线圈放置的锚。 使用细尖钳抓住线圈的一端并将其倾斜放入 ICA 中,以便将血管插入线圈的最后一个横档中。 将容器放在线圈的最后一个梯级上,翻转线圈,使其与 ICA 平行。 使用 6±0 缝线,容器围绕线圈轻轻旋转,以便将一定长度的容器放置在线圈的每个梯级上。 评估血管放置以确保不会跳过横梁; 在这种情况下,血管的线圈被展开并重新定位,直到线圈完全覆盖血管。 因此,小鼠对照和实验子集中的 MMD 表型与 Roberts 等人的相似。 Roberts 等人,颈内动脉狭窄:烟雾病综合征的新型手术模型,PLoS One。 2018; 13(1): e0191312 .) 是按照中讨论的程序导出的 [4305] MMD 模型小鼠的对照子集 (n=5) 用 Tris 缓冲盐水处理,MMD 小鼠的实验子集 (n=5) 处理 ENPP3-Fc 对 MMD 大脑血管平滑肌细胞增殖和脑闭塞的影响或者,在诱导 MMD 表型后用 ENPP3-Fc 或 ENPP3 处理以确定 ENPP3 的作用。 ENPP3-Fc 治疗(ENPP3 或 ENPP3-Fc,10 mg/kg 体重,每天皮下注射)在一组实验小鼠通过手术诱导 MMD 表型后开始,如上所述,并给予 ENPP3-Fc 或 ENPP3这将持续 28 天,直到大脑动脉被切除。 [4306] 类似地,对照组的小鼠在通过手术诱导 MMD 表型后用 pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水处理,每天通过皮下注射给予 Tris 缓冲盐水并维持 28 天直至脑动脉摘除术。好几天 然后,将患有 MMD 的对照和实验小鼠的动脉用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定以进行形态学分析。 [4307] 脑血管系统的可视化 [4308] 为了可视化脑血管系统,每组中的所有动物都灌注了荧光染料 Di I( Li 等人,用亲脂性羰花青染料 DiI 直接标记和可视化血管。 自然协议。 2008; 3(11):1703±8 ). 使用灌注泵(设置为 1 ml/min)对小鼠灌注 5 ml PBS(室温),然后立即注射 10 ml Di I 工作液,随后注射 10 ml 10% 缓冲福尔马林以注射鼠标 transcardially. 执行 transcardial 灌注。 大脑被小心地从头骨中取出,以便威利斯环 (CoW) 保持完整。 [4309] 然后,在 4°C 的 10% 缓冲福尔马林中将提取的大脑固定过夜。 然后,将大脑转移到 PBS 中,在 4°C 下长期储存并遮蔽它。 使用 1 X 显微镜(Nikon Eclipse E800/Nikon DS-Ril)对荧光标记的大脑进行成像。 拍摄皮质血管图像以检查吻合情况,并使用 CoW 图像测量血管直径。 图像分析是通过使用尼康 NES 分析软件测量容器直径 (μm) 来执行的。 [4310]从同源颈内动脉、大脑中动脉 M1 段和大脑前动脉 A1 段的分叉处大约 20 μm 处进行直径测量。 吻合分析是通过计算同侧和对侧半球的 ACA 和 MCA 之间的吻合数(放大图像上每个交界点的圆圈)来进行的。 ICA、ACA 和 MCA 血管的直径通过测量靠近同侧和对侧分叉处的每个血管的宽度来检查,以确定实验组和对照组之间的大小是否存在差异。 [4311] 与用具有 MMD 表型的 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的小鼠的血管直径相比,在具有 MMD 表型的对照小鼠中,远端 ICA 和近端 ACA 的测量预计会显示血管直径严重缩小。 [4312] 形态分析 [4313] 为对照组和实验组收集 MCA、ACA 和 ICA 等脑动脉的连续切片(每片 5 μm)。 5 μm 厚的冷冻主动脉切片(Microtome,HM 500 O)使用 Elastica van Gieson 染色剂(Roth,Karlsruhe,Germany)进行染色。 使用 ImageJ 软件测量外弹性层、内弹性层和发光边界的周长。 然后,使用 ImageJ(斐济版本 1.51p,美国国立卫生研究院,美国),由两名对治疗方案不知情的研究人员测量子宫内膜和正中区域。 所分析的两个参数的比率被用作管腔阻塞的量度。 计算中值面积、内膜面积和内膜/中膜比(I/M 比)。 (见图 2)。 [4314] 使用 Student's t 检验(未配对的 2 样本平均值检验)进行统计分析。 使用单向方差分析对多个组进行比较,然后使用 GraphPad Prism 软件版本 7 进行 Bonferroni 事后检验。 p < 0.05 的概率值被认为是显着的。 形态学分析表明,未经治疗的具有 MMD 表型的对照小鼠会出现血管病变、闭塞和狭窄,并伴有高水平的血管腔闭塞。 [4315] 在诱导 MMD 表型后用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的实验小鼠中,将内膜增生的程度与未施用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 的对照小鼠进行比较。 与在术后第 28 天或之后用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 治疗的小鼠相比,来自具有 MMD 表型的未治疗对照小鼠的脑动脉的定量分析预计会显示显着增加的子宫内膜增殖。 与治疗小鼠相比,对照小鼠预计会显示动脉内壁增厚。 相应地,还比较了对照小鼠和治疗小鼠的 I/M 比率。 [4316] 实施例 14:ENPP3 或 ENPP3-Fc 的预防作用 [4317] 修改与实施例13所述相同的实验,如图7所示,通过在诱导MMD表型前一周向实验组施用ENPP3或ENPP3-Fc来预防或减少血管平滑肌增生和脑闭塞。以确定ENPP3 或 ENPP3-Fc 的预防作用。 类似地,在诱导 MMD 表型之前 1 周,对对照组施用 Tris 缓冲盐水。 然后,在手术后用 10 mg/kg 剂量的 ENPP3 或 ENPP3-Fc 治疗的实验组和手术后用 tris 缓冲盐水治疗的对照组重复该程序,如上所述。 [4318] 形态学分析显示,与对照小鼠相比,接受皮下 ENPP3 或 ENPP3-Fc 的具有 MMD 表型的实验小鼠的内膜面积预计会显着减少,而外膜和外膜之间的隔膜面积内膜将保持不变。预期 与用载体处理的对照小鼠相比,用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 处理的实验小鼠的 I/M 比率预计会降低。 在诱导 MMD 表型之前用 ENPP3 或 ENPP3-Fc 进行预防性治疗预计会通过降低 VSMC 增殖水平来赋予保护作用。 [4319] 实施例 15: ENPP1 或 ENPP1-Fc 融合蛋白在 AV 狼疮功能障碍小鼠模型中的功效 [4320] ENPP1 或 ENPP1-Fc 融合蛋白的功效在例如 Wong 等人 (2014) J Vasc Surg 59:192-201 中有所描述。 在雄性 C57bl6 小鼠的颈外静脉和颈总动脉之间产生单侧 AVF。 小鼠分为 4 组:(1) 在 AVF 产生前后接受 ENPP1-Fc 融合蛋白或 ENPP1 慢性皮下治疗的小鼠; (2) 小鼠在 AVF 产生前后皮下接受载体对照治疗; (3) 小鼠在 AVF 产生后开始用 ENPP1-Fc 融合蛋白或 ENPP1 进行慢性皮下治疗; (4) 小鼠在 AVF 产生后皮下接受载体对照治疗。 [4321] 随着时间的推移跟踪小鼠并在不同时间点(例如,AVF 产生后 1、2 和/或 3 周)实施安乐死。 组织学分析是在 AVF 部位或附近的血管切片上进行的。 [4322] 与施用载体对照的小鼠相比,用ENPP1-Fc融合蛋白处理的小鼠的AVF近端血管内膜增生的程度预期显着降低。 [4323] 实施例 16: ENPP3 或 ENPP3-Fc 融合蛋白在 AV 狼疮功能障碍小鼠模型中的功效 [4324] ENPP3-Fc 融合蛋白或 ENPP3 的功效在例如 Wong 等人 (2014) J Vasc Surg 59:192-201 中有所描述。 在雄性 C57bl6 小鼠的颈外静脉和颈总动脉之间产生单侧 AVF。 小鼠分为 4 组:(1) 在 AVF 产生前后接受 ENPP3-Fc 融合蛋白或 ENPP3 慢性皮下治疗的小鼠; (2) 小鼠在 AVF 产生前后皮下接受载体对照治疗; (3) 小鼠在 AVF 产生后开始用 ENPP3-Fc 融合蛋白或 ENPP3 进行慢性皮下治疗; (4) 小鼠在 AVF 产生后皮下接受载体对照治疗。 [4325] 随着时间的推移跟踪小鼠并在不同时间点(例如,AVF 产生后 1、2 和/或 3 周)实施安乐死。 组织学分析是在 AVF 部位或附近的血管切片上进行的。 [4326] 与施用载体对照的小鼠相比,预计用ENPP3-Fc融合蛋白处理的小鼠的AVF近端血管的内膜增生程度显着降低。 [4327] 实施例 17: 治疗患有心脏同种异体移植物血管病的人类心脏移植患者 [4328] 人类成人心脏同种异体移植受者被医生鉴定为患有 CAV。 接受者被施用或长期施用包含融合蛋白的药物组合物,所述融合蛋白包含与Fc区融合的可溶形式的ENPP1。 医疗保健专业人员随着时间的推移监测接受者在同种异体移植心脏的一根或多根血管中的不需要的内膜增殖的停止和/或随着时间的推移同种异体移植心脏的血管闭塞的部分或全部消退。 用融合蛋白进行的治疗预计会停止或大大减少同种异体移植心脏的一根或多根血管中不需要的内膜增殖和/或预计会随着时间的推移部分或完全解决同种异体移植心脏中的血管闭塞。 [4329] 在另一个实例中,包含融合蛋白的药物组合物,该融合蛋白包含与 Fc 区融合的可溶性形式的 ENPP1,可预防、减少或预防同种异体移植心脏的一个或多个血管中不希望的内膜增生的发生。在移植时或接近移植时进行心脏同种异体移植,以降低其严重程度。 医疗专业人员随着时间的推移监测接受者在同种异体移植心脏的一个或多个血管中的不需要的内膜增生的存在和/或水平。 预期用融合蛋白处理会停止或显着减少同种异体移植心脏的一根或多根血管中不需要的内膜增殖。 [4330] 实施例 18: 治疗患有烟雾病的人 [4331]一名成人患者被医生鉴定为患有烟雾病。 接受者被施用或长期施用包含融合蛋白的药物组合物,所述融合蛋白包含与Fc区融合的可溶形式的ENPP1。 医疗保健专业人员随着时间的推移监测接受者一根或多根滋养大脑的血管中不需要的内膜增生的停止和/或随着时间的推移部分或完全消退这样的血管或血管的闭塞。 用融合蛋白进行的治疗预计会停止或显着减少一根或多根血管中不需要的内膜增生和/或预计会随着时间的推移部分或完全解决血管闭塞问题。 [4332] 实施例 19:用血液透析分流器治疗透析患者 [4333] 包含融合蛋白的药物组合物,所述融合蛋白包含与 Fc 区融合的可溶形式的 ENPP1,在血液透析分流器被置于受试者体内时或前后,长期向血液透析患者给药,从而桥接分流器或预防、减少或减少分流中涉及的一根或多根血管发生不需要的内膜增生的可能性的程度。 医疗保健专业人员随着时间的推移监测接受者一个或多个血管中不需要的内膜增生的存在和/或水平。 预计用融合蛋白治疗会停止或显着减少一根或多根血管中不需要的内膜增生。 [4334] 通过引用集成 [4335] 本文提及的每一项美国和外国专利和未决专利申请和出版物的公开内容,以及序列表和附图的内容,均通过引用整体并入本文。 [4336] 相等的 [4337] 本领域的技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的特定实施例的许多等同物。 这些等同物旨在由所附权利要求涵盖。 在任何多个从属权利要求或示例中公开的实施例的任何组合被认为在本公开的范围内。 [4338] 其他例子 [4339] 综上所述,本领域已知的具有不同启动子或增强子或不同细胞类型的不同病毒载体治疗任何以存在病理性钙化或骨化为特征的疾病均在本发明的范围内。此处描述的可用于适应多种用途和条件,包括使用不同的信号序列以不同的方式表达 ENPP1 或 ENPP3 的功能变体,或其组合,这将是清楚的 根据本公开的其他实施例在所附权利要求的范围内。 [4340] 在本文变量的任何定义中列举的元素列表包括将该变量定义为任何单个元素或所列举元素的组合(或子组合)。 此处对实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分的组合的实施例。 [4341] 本文提及的所有出版物和专利申请都表明本公开所属领域的技术人员的技能水平。 所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文,其程度如同每个单独的出版物或专利申请都具体且单独地指明以引用方式并入。 [4342] 其他实施例在所附权利要求的范围内。