用于非病毒基因组编辑的 CRISPR 纳米复合物及其制备方法 技术领域 本发明是在韩国卫生和福利部的支持下完成的,项目编号为 HI15C1948,该项目在题为“快速检测”的计划中进行 2015 年 11 月 1 日至 10 月 31 日,在韩国健康产业振兴院管理下的韩国科学技术院名为“传染病危机应对技术的发展”的项目中,纳米探针对多药耐药细菌的诊断和诊断 2018. 本发明也是在韩国卫生和福利部的支持下完成的,项目编号为 HI14C2270,该项目在题为“通过检测循环肿瘤细胞开发癌症分子诊断”的项目中进行 于 2014 年 12 月 1 日至 2017 年 10 月 31 日,由韩国科学技术高等研究院在韩国健康产业发展研究所管理下,在名为“世界领先的生命科学家培养企业”的项目中进行了研究。本发明还与 韩国卫生福利部资助,项目编号2015R1C1A1A02036647,在“瑞星科研人员支持项目”项目“多药耐药病原体感染的超灵敏诊断方法开发”项目中进行 ”,由韩国国家研究基金会管理的韩国高级科学技术研究所于 2015 年 7 月 1 日至 2018 年 6 月 30 日期间提出。本申请要求韩国专利申请 CA 3009389 2018-06-26 的优先权和权益 6 月 14 日在韩国知识产权局提交的第 10-2017-0075053 号本发明涉及一种用于非病毒基因组编辑的 CRISPR 纳米复合物及其制备方法。 并且更具体地,本发明涉及由sgRNA与化学缀合有CRISPR基因组编辑系统的酶蛋白的载体材料络合形成的纳米复合物、制备该纳米复合物的方法以及使用该纳米复合物作为非病毒载体的方法。 通过将纳米复合物输送到细胞中来构建基因组编辑系统。 背景技术在过去几十年中,抗生素的滥用显着增加,结果,多重耐药菌的出现和传播增加。 在许多情况下,这些细菌可能获得严重的致病性,感染人类,并传播到其他个人、社区、卫生机构和医院。 这些病原体中的大多数来自人类共生细菌,并在免疫力低下或患有某些疾病的个体中引起机会性感染。 抗生素的持续治疗自然会选择具有抗生素耐药性的突变细菌克隆,这种抗生素耐药性是通过基因的内在表达或水平扩散获得的,与药物的酶促降解或药效抑制有关。 全球发病率最高的多重耐药菌类型包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、碳青霉烯类-CA 3009389 2019-10-10耐药肠杆菌科(ORE)、多重耐药鲍曼不动杆菌(MRAB)、多重耐药假单胞菌 铜绿假单胞菌 (MRPA) 和耐万古霉素肠球菌 (VRE),以及最近的耐万古霉素金黄色葡萄球菌 (VRSA)。 多重耐药菌的传播限制了治疗细菌感染的治疗药物的选择,需要使用和开发更有效的药物。 然而,使用更高效力的药物只会导致更多致病性或耐药性菌株的出现,并可能在治疗期间对患者造成更高的毒性。 另一个问题是,目前用于治疗细菌感染的药物大多是广谱的低分子抗生素。 因此,使用可以特异性靶向特定病原体的药物将在最大程度地减少细菌生长中的选择压力方面提供很大的优势。 不幸的是,由于缺乏特定的生物标志物和耐药性等技术问题,窄谱药物或抗体治疗剂的开发存在困难。与传统的低分子量药物或抗体治疗剂相比,基因治疗剂作为一种创新方法被引入,因为针对具有高特异性的靶标设计药物的简单性和多功能性。 可以使用质粒 DNA、反义寡核苷酸、siRNA 或基于病毒的载体形式的遗传药物来诱导或抑制疾病靶点的表达。 病毒载体因其高转染效率而具有优势,但也可能由于诱导 CA 3009389 2018-06-26 细胞免疫反应或抗体或中和等问题而显示出临床局限性。 在哺乳动物细胞作为靶标的情况下,使用 siRNA 沉默某些基因的表达已显示出作为治疗剂的前景,目前正在进行临床试验,用于治疗各种类型的癌症、青光眼、血友病和家族性淀粉样疾病。 然而,直接施用这种基因治疗剂会由于体液中的立即酶促降解或向靶位点的低递送效率而导致疗效不佳。 因此,载体材料,如阳离子聚合物、脂质基材料、无机纳米粒子、细胞穿透肽和树枝状聚合物,已被用于凝聚生物活性分子并将其递送至靶标。 然而,对于细菌细胞,由于基因通过细胞壁的传递效率低以及基因治疗剂的低功效,使用非病毒基因传递策略的尝试受到严重限制。 最近,基因组编辑技术的巨大进步为基因治疗药物的开发和模式生物的基因操作开辟了一个新时代。 目前的基因组编辑技术根据特定基因的识别或突变方式,采用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)等。 其中,被称为微生物获得性免疫系统的CRISPR系统分为I型、II型和III型。 特别是,来自化脓性链球菌的 Cas9 蛋白(SpCas9)对应于 II 型 CRISPR 系统,在靶向特定分子的单向导 RNA(sgRNA)的帮助下,起到引起 DNA 双链切割的作用。 基因通过 CA 3009389 2018-06-26 互补结合。 特别是,sgRNA 的目标特异性 crRNA(CRISPR RNA)通过识别具有 5'-NGG-3' 序列的原型间隔子相邻基序(PAM)核苷酸序列显示出高靶向效率,长度约为 20 个核苷酸,这非常 与最初的基因剪刀锌指核酸酶 (ZFN) 或转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 相比,短,并且通过与其他常规基因组编辑策略相比简化的设计和制造提供了巨大的优势。 因此,CRISPR系统通过诱导靶基因的特异性切割被广泛用于动物模型构建,并不断尝试利用该系统通过沉默或编辑靶基因的功能作为治疗剂的研究。 然而,直到现在,高表达效率的病毒编辑一直被最常用于CRISPR,并且由于载体的毒性、细胞免疫反应的诱导和抗体中和反应而在临床应用中受到限制。 据报道,CRISPR 核酸内切酶蛋白和 sgRNA 的非病毒细胞内递送效率低于使用病毒载体,克服这一缺点是一个关键问题。 特别是,基于蛋白质的递送通常由于体内立即酶促降解或递送至靶位点的效率低而具有较差的效果。 因此,在使用CRISPR的治疗中需要具有安全、合成步骤简单、递送效率高等优点的非病毒基因组编辑。 此外,用于引入治疗剂、载体材料,例如阳离子聚合物、基于脂质的材料(基于脂质的载体材料,例如,lipofectamine)、无机纳米颗粒、细胞穿透肽和CA 3009389 2019-10-10树枝状聚合物 , 已被报道为基因/药物递送材料。然而,这些材料由于其阳离子或脂溶性特性可以凝聚生物活性分子,因此,对于非病毒 CRISPR 系统的递送,已经报道了许多提高 Cas 蛋白和 sgRNA 相对于靶标的递送和操作效率的努力。 使用基于脂质的材料物理和非共价包封Cas蛋白和sgRNA由于包封效率低而在实际应用中受到限制,因此由此产生的高剂量给药会引起毒性问题。 因此,迫切需要开发一种新型的CRISPR递送方法,能够高效无毒地进行细胞内递送。 发明详述技术问题本发明人努力并研究开发一种新型非病毒基因组编辑方法,其能够克服常规病毒基因组编辑方法或使用基于脂质的制剂的基因组编辑方法中的低递送效率和毒性问题。 结果,本发明人证实,当通过将聚合物载体材料缀合到 CRISPR 酶蛋白上并将缀合物与 sgRNA 混合来制备 CRISPR 纳米复合物时,CRISPR 纳米复合物在基因组编辑酶和基因组编辑的递送效率方面优异 效果,并能解决生物毒性等问题,从而完成了本发明。 因此,本发明的一个方面是提供一种聚合物载体材料缀合的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白。 CA 3009389 2018-06-26 本发明的另一方面在于提供一种高分子载体材料偶联CRISPR酶蛋白的制备方法。 本发明的又一方面是提供一种CRISPR纳米复合物,其包含高分子载体材料-缀合的CRISPR酶蛋白和单向导RNA(sgRNA)。 本发明的又一方面是提供一种CRISPR纳米复合物的制备方法,该方法包括将高分子载体材料偶联的CRISPR酶蛋白与sgRNA混合的步骤。 本发明的又一方面是提供一种基因组编辑组合物,其包含高分子载体材料偶联的CRISPR酶蛋白或CRISPR纳米复合物。 技术方案根据本发明的一个方面,提供了一种聚合物载体材料偶联的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白。 CRISPR是clustered regularly interspaced short palindromic repeats的缩写,是指来源于细菌免疫系统的第三代基因剪刀。 大多数被病毒感染的细菌都会死亡,但有些会存活下来,并将部分病毒 DNA 储存在基因组中。 此后,再感染的发生会根据存储的信息生成小向导 RNA (sgRNA),它与 ​​Cas9 核酸内切酶结合以切割外部 DNA。 在此,指导RNA通过互补核苷酸对与所需的靶基因结合以确定其特异性,而Cas9蛋白充当切割靶基因的核酸酶。 因此,指导RNA可以根据指导RNA CA 3009389 2018-06-26核苷酸序列切割任何DNA核苷酸序列,因此目前正在积极开展使用CRISPR-Cas9基因剪刀的研究。 根据本发明的一个实施例,CRISPR酶蛋白是一种可以通过CRISPR基因组编辑程序切割或编辑基因组上目标位点的酶蛋白,可以是选自以下的任意一种: Casl、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas9、Csel、Cse2、Cse3、Cse4、Cas5d、Cas5e、Csyl、Csy2、Csy3、Csy4、Cpfl、Csnl、Csn2、Csdl、Csd2、Cstl、Cst2、Cas5t , Cshl, Csh2, Cas5h, Csal, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csml, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmrl, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, dCas9 (死Cas9), Cas9, C2c2 (Cas13a)、胞苷脱氨酶 (CDA)、载脂蛋白 B 编辑复合物 (APOBEC) 14、尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI) 和激活诱导脱氨酶 (AID); 或其重组蛋白,但不限于此。如本文所用,术语“载体”、“递送系统”或“载体”是指聚合物、蛋白质、脂质等,其用于允许表现出生理活性或可以以活性作用于 体内,例如蛋白质、激素、酶和核酸通过生物膜,例如细胞膜,并将物质引入细胞。 根据本发明的一个方面,载体为不具有细胞毒性或组织毒性的生物相容性聚合物,并且为合成聚合物或天然聚合物。 如本文所用,术语“货物”是指可以在体内发挥活性的物质,例如生理活性物质和酶,例如蛋白质、激素或核酸,其将被引入 通过与载体结合或缀合而进入细胞。 根据本发明的一个方面,本文使用的术语“货物”CA 3009389 2018-06-26是指遗传剪刀酶蛋白,更具体地,CRISPR酶蛋白,和单向导RNA(sgRNA),但不限于 至此。 根据本发明的一个实施例,聚合物载体材料可以选自支链聚乙烯亚胺、线性聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚酰胺胺、聚乙二醇、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸 , 聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物), 聚己内酯, 聚磷酯, 聚磷腈, 聚(β-氨基酯), 支链聚(氨基酯), 聚氨基丁基-乙醇酸, 聚原酸酯, 聚(羟基脯氨酸)酯, 聚丙烯酰胺 、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PDMAEMA)、树枝状聚合物、透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖、葡聚糖、环糊精、精胺、聚精氨酸、聚赖氨酸及其共聚物或混合物,但 不限于此。 根据本发明的一个实施例,本发明采用支化聚乙烯亚胺作为聚合物载体材料。 高分子载体材料与CRISPR酶蛋白偶联,以提高CRISPR酶蛋白在靶细胞中对包括细菌和真核细胞在内的原核细胞的递送效率。 作为CIRSPR酶蛋白的细胞内递送的现有方法,有使用病毒载体的方法和使用非病毒载体材料如lipofectamine的方法。 然而,在使用病毒载体的情况下,会发生很多非特异性反应,而在使用基于脂质的非病毒载体材料(例如 Lipofectamine)的情况下,递送 CA 3009389 2018-06-26 效率是有利的 在真核细胞中,但在细菌等原核细胞中的传递效率很差,因此非病毒载体材料的使用存在困难。 本发明的载体材料偶联的CRISPR酶蛋白在水溶液中具有DNA切割或编辑作用。根据本发明的一个实施例,聚合物载体材料和CRISPR酶蛋白可以通过选自琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-a-马来酰亚胺乙酰-氧代琥珀酰亚胺酯(AMAS)、N-对-马来酰亚胺丙基-氧代琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-y-马来酰亚胺丁酰-氧代琥珀酰亚胺酯(GMBS)、间-马来酰亚胺苯甲酰- N-羟基琥珀酰亚胺酯 (MBS)、N-c-马来酰氨基己酰-氧琥珀酰亚胺酯 (EMCS)、聚乙二醇化 SMCC (SM(PEG))、琥珀酰亚胺 3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯 (SPDP)、聚乙二醇化 SPDP (PEG-SPDP)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯 (DSG)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯 (DSS)、辛二酸双磺基琥珀酰亚胺酯 (BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、庚二酸二甲酯 (DMP)、双马来酰亚胺乙烷 (BMOE) )、1,4-双马来酰亚胺丁烷 (BMB)、二硫代双马来酰亚胺乙烷 (DTME)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、炔丙基-琥珀酰亚胺-酯、二苯并环辛炔-马来酰亚胺 ( DBCO-马来酰亚胺)、二苯并环辛炔-PEG4-马来酰亚胺(DBCO-PEG-马来酰亚胺)、二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-S-S-NHS酯)、二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS酯)、乙炔- PEG-NHS 酯和炔烃-PEG-CA 3009389 2018-06-26 马来酰亚胺。 所列交联剂为化学交联剂,诱导交联剂的反应基团与待结合蛋白的活性基团发生结合反应,从而使本发明的高分子载体材料与CRISPR酶蛋白结合。 化学交联剂的反应基团和目标活性基团的实例如表1所示,但不限于此。 [表 1] 交联剂 交联剂 目标活性 目标反应活性基团 活性基团 -NH2(伯芳基叠氮胺或非马来酰亚胺巯基特异性) 碳酰亚胺胺/羧基 NHS-酯胺碳水化合物 酰肼 PFP-酯胺(氧化) 羟甲基胺 Solarene 胸腺嘧啶 膦 吡啶基亚胺酯胺 巯基二硫化物 巯基、羟基乙烯基异氰酸酯胺、(不溶性)砜羟基羰基肼 本发明实施例中,采用磺基-SMCC作为化学交联剂,将磺基-SMCC加入支化聚乙烯亚胺(bPEI )通过马来酰亚胺基团的取代激活支链聚乙烯亚胺的胺基,然后聚乙烯亚胺的活化伯胺基与SpCas9蛋白半胱氨酸残基上的游离巯基反应,制备出与bPEI偶联的SpCas9(SpCas9 -bPEI)。 此外,验证了聚合物载体 CA 3009389 2018-06-26 材料与 CRISPR 酶蛋白(例如 SpCas9-bPEI)的结合在以下实施例中成功实现。 在本发明中,聚乙烯亚胺是最广泛使用的基因传递载体材料之一(例如,siRNA、质粒 DNA),由于聚乙烯亚胺可以支链或线性形式与多种载体一起使用,因此选择用于修饰货物。 分子量。 此外,选择支链形式的胺是因为与直链胺相比,支链形式富含胺基,尤其包括伯胺,从而实现有效的包装和递送。 选择蛋白质的直接共价结合修饰,而不是物理封装,以尽量减少给药载体材料的量,以试图解决由于释放不充分而导致的生物毒性和功效降低的问题。 bPEI 被共价引入到 Cas9 核酸内切酶上,通过静电相互作用诱导包装,从而改善蛋白质本身以及 sgRNA 向细菌的递送。根据本发明的另一个方面,提供了一种制备高分子载体材料偶联的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白的方法,该方法包括:(a)使高分子载体的官能团反应 具有双功能交联剂的材料制备活化聚合物载体材料; (b)使CRISPR酶蛋白的功能基团与活化的聚合物载体材料反应制备结合材料。 下面对本发明的制备方法进行详细的步骤说明。 CA 3009389 2018-06-26 步骤(a):聚合物载体材料的官能团与双功能交联剂反应制备活化聚合物载体材料的步骤聚合物载体材料的官能团通过与双功能化学交联剂反应活化。 直到聚合物载体材料的官能团被激活,聚合物载体材料才能与其他分子连接。 交联剂是指化学连接两种或多种不同分子的试剂,术语双功能是指诱导具有相同或不同官能团的两个分子之间连接的性质。 聚合物载体材料的活化反应可以在选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、甲醇、水、二氯甲烷和氯仿的溶剂中进行,但不限于此,任何 可以不受限制地使用本领域中可用于分子间缀合反应的活化反应的溶剂。 聚合物载体材料的活化反应可以在4-60n,具体为4-500、4-40H、4-30P或4-25H的温度条件下进行,但不限于此。 另外,聚合物载体材料的活化反应可以进行0.5-24h,具体为0.5-12h、0.5-6h、1-24h、1-12h或1-6h,但不 限于此。 上述步骤中,高分子载体材料种类的内容与上述高分子载体材料偶联CRISPR酶蛋白的内容重复,在此不再赘述。 CA 3009389 2018-06-26 步骤(b):CRISPR酶蛋白的官能团与活化的高分子载体材料反应制备结合材料的步骤 步骤(a)中活化的高分子载体材料的官能团与 CRISPR酶蛋白制备结合材料。 其中,步骤(b)中的高分子载体材料与CIRSPR酶蛋白的摩尔比例如可以为1:10-6至1:106、1:10-5至1:105、1:10- 4至1:104、1:10-3至1:103、1:10-2至1:102或1:10-1至1:101,但不限于此。 另外,聚合物载体材料与CRISPR酶蛋白的偶联反应可以在4-60U,具体为4-50E、4-40E、4-300或4-25D的温度条件下进行,但不限于 至此。 聚合物载体材料与CRISPR酶蛋白的偶联反应可进行0.5-48小时,具体为0.5-36小时、0.5-24小时、0.5-12小时,更具体为1-48小时、1-24小时、 1-12小时,或4-12小时,但不限于此。 这里,高分子载体材料与CRISPR酶蛋白的偶联反应可以在pH为4-10的水性溶剂中进行,可以使用任何能够保持pH值范围的水性缓冲液,没有限制。 另外,CRISPR酶蛋白种类的内容与上文关于本发明的高分子载体材料结合CRISPR酶蛋白的描述相同,因此不再赘述。 根据本发明的又一方面,本发明提供了一种CRISPR CA 3009389 2018-06-26纳米复合物,其包含聚合物载体材料-缀合的CRISPR酶蛋白和单向导RNA(sgRNA)。 在本发明中,CRISPR纳米复合物是载体材料偶联的CRISPR酶蛋白与目标基因的sgRNA混合的剂型,是指上述载体材料偶联的物理相互作用形成的复合物。 CRISPR 酶蛋白和 sgRNA。更具体地,CRISPR纳米复合物是指由载体材料缀合的CRISPR酶蛋白和sgRNA组成的复合物,而不是使用病毒或DNA载体,因此具有非病毒纳米复合物的特征。 根据本发明的一个实施例,CRISPR纳米复合物是一种可以分散在水溶液中的复合物,粒径为1-10,000nm,但不限于此。 根据本发明的另一个实施例,CRISPR纳米复合物具有-100至+100mV的zeta电位。 本发明的sgRNA是将CRISPR酶蛋白引导至基因组上靶基因特定位点的核糖核酸,其特征在于包括相对于 protospacer,它是靠近 protospacer-adjacent motif (PAM) 序列的目标位点。 作为sgRNA的靶基因,可以选择发明人期望的任何靶基因。 目标基因的例子可以包括 mecA、mecR1、aph、NDM-1、KPC、oxa、ure、lrg、cap、spl、KPC、GES、IMP、VIM、KRAS、Stkll、TP53、PTEN、BRCA1、BRCA2、Akt , Stat, Stat4, JAK3, JAK2, WT1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, NF1, NOTCH1, NOTCH3, ATM, ATR, HIF, HIFI a, HIF3 a, Met, 3c12, FGFR1, CA 3009389 2018-06-26 FGFR2, CDKN2a、APC、RB、MEN1、PEAR a、PPAR y、AR、TSG101、IGF、Igfl、Igf2、Bax、Bc12、caspase、Kras、Apc、NF1、MTOR、Grml、Grm5、Grm7、Grm8、mGlurR1、mG1urR5、 mG1urR8、PLC、AMPK、MAPK、Raf、ERR、TLR4、BRAF、PI3K、F8、F80、F9、HEMB、KIR3DL1、NKAT3、NKB1、AMB1I、KIR3DS1、IFNG、CXCLI2、IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4、CCR5、 SCYA5、D17S136E、TCP228、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR4、CCR6、CCR7、CX3CR1、CD4、CFTR、EBB、HBA2、HBD、HBA1、LCRB、SCN1A、CHD8、FMR1、VEGF、EGFR、myc、Bc1-2、 生存素、SOX2、Nrgl、Erb4、Cp1x1、Tphl、Tph2、GSK3、GSK3a、GSK3 p、El、UBB、PICALM、PSI、SORL1、CR1、Ubal、Uba3、CHIP、UCH、Tau、LRP、CH1P28、Uchll、Uch13 , APP, Cx3cr1, ptpn22, TNF-a, NOD2, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12, IL-1a, IL-1b IL-13, IL-17a, IL- 17b、IL-17c、IL-17d、IL-17f、CT1LA4、Cx3c11J、DJ-1、PINK1、Prp、DJ-1、PINK1、LRRK2、ALAS2、ASB、ANH1、ABCB7、ABC7、ASAT、CDAN1、CDA1、 DBA、PKLR、PK1、RIPS19、NT5C3、UMPH1、PSN1、RHAG、RH50A、NRAMP2、SPTB、TBXA2R、P2X1P、2RX1、HF1、CFH、HUS、MCFD2、Drd2、Drd4、ABAT、BCL7A、BCL7、TALI、TCL5、 TAL2、FLT3、NBS1、NBS、ZNEN1A1、TYR、ALDH、ALDH1A1、ADH、FASN、PI、ATT、F5、MDC1C、LAMA2、LAMM、LARGE、MDC1D、FOND、TTID、MYOT、CAPN3、CANP3、DYSF、SGCG、 DMDA1, SCG3, SGCA,ADL, DAG2, DMDA2, SGCB, LGMD2B, LGMD2C, LGMD2D, LGMD2E, LGMD2F, LGMD2G, LGMD2H, LGMD2I, SGCD, SGD, CMD1L, TCAP, CMD1N, TRIM32, HT2A, FKRP, POMT1, CAV3, LGMD1C、SEPN1、SELN、RSMD1、PLEC1、PLTN、EBS1、PPP2R1A、PPP2CA、PPP1CC、PPP2R5C、GFP、RFP、YFP、tdTomato、mCherry 和荧光素酶。 这些仅是为了说明,但不限于此。 根据本发明的又一方面,本发明提供了一种制备上述CRISPR纳米复合物的方法。 该CRISPR纳米复合物的制备方法包括将上述高分子载体材料偶联CRISPR酶蛋白与目标基因CA 3009389 2018-06-26 sgRNA混合的步骤。 根据本发明的一个实施例,所述CRISPR纳米复合物制备中所述载体材料偶联CRISPR酶蛋白与sgRNA的混合摩尔比为1:10-6至1:106,具体为1:10-5至 1:105、1:10-4 至 1:104,最具体为 1:10-3 至 1:103,但不限于此。 此外,混合温度可为4-37D,具体地为4-25E、15-37D或15-25D,但不限于此。 混合反应可进行0.1-12小时,具体为0.1-6小时,0.1-3小时,0.1-1小时,最具体为0.1-0.5小时以制备纳米复合物,但不限于此。 根据本发明的又一方面,本发明提供了一种基因组编辑组合物,其包含上述高分子载体材料偶联的CRISPR酶蛋白,或上述CRISPR纳米复合物。 所述基因组编辑组合物中包含的高分子载体材料偶联CRISPR酶蛋白和上述CRISPR纳米复合物对应于上述本发明另一方面中描述的发明。 当本发明的组合物为药物组合物时,本发明的组合物含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在配制时异常使用,其实例可包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、 微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、CA 3009389 2018-06-26 甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。 除上述成分外,本发明的组合物还可以含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。 本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给药,可以通过例如静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、鼻内给药、肺内给药、直肠给药、鞘内给药、 眼部给药、皮肤给药、透皮给药等。 本发明的药物组合物的合适剂量取决于诸如配制方法、给药方式、患者年龄、体重、性别、疾病严重程度、食物、给药时间、给药途径、排泄率、 和反应敏感性,普通熟练的从业者可以很容易地判断和开出对所需治疗或预防有效的剂量。 根据本发明的一个具体实施例,本发明的药物组合物的日剂量为0.0001-1000mg/Kg,但不限于此。 如本文所用,术语“药学有效量”是指足以诱导所需基因编辑的量。 根据本发明所属领域的普通技术人员容易实施的方法,使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制本发明的组合物,以及 本发明的组合物可制成单位剂型或可装入多剂量容器中。 这里,组合物的剂型可以是油性或水性介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂,并且组合物还可以包括分散剂或稳定剂。 根据本发明的一个实施例,该组合物在施用于分离的细胞、组织或个体时,将上述聚合物载体材料缀合的CRISPR酶蛋白或CRISPR纳米复合物递送到细胞中以诱导基因组进行基因组编辑 CRISPR酶蛋白的编辑作用。 这里,允许细胞内递送的细胞的例子包括:真核细胞,例如HeLa、A549、MDAMB、SK-BR-3、OVCAR、PC3、PC12、HEK293、Jurkat、0D4+T细胞、0D8+T细胞、RAW264。 7、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、树突状细胞(DCs)、髓系抑制细胞(MDSCs)、胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞(iPSCs)、血管内皮细胞 、表皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、神经细胞、神经干细胞、脂肪干细胞(ADSCs)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、真菌细胞和寄生虫细胞; 或原核细胞,例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌。 本发明实施例证实,本发明的高分子载体材料偶联CRISPR酶蛋白和CRISPR纳米复合物摄取到细菌细胞中表现出基因组编辑效果,甚至表现出高递送效率 CA 3009389 2018-06 -26 在哺乳动物细胞中。 本发明的聚合物载体材料偶联CRISPR酶蛋白和CRISPR纳米复合物与现有的脂类载体材料如lipofectamine相比表现出优异的细胞内递送效率,从而也表现出优异的靶基因编辑效果。如上所述,本发明人致力于开发一种将CRISPR基因组编辑高效递送至包括细菌和哺乳动物细胞在内的细胞的新型递送方法,并证实了通过直接共价键修饰的聚合物衍生的CRISPR Cas9蛋白和纳米 使用其形成了一个大小的复合物,可作为针对多重耐药菌的特异性杀灭用途。 有报道称,现有的基于质粒的CRISPR基因组编辑会诱导逃逸突变体,但这些克隆的目标位点不会发生遗传变化,并且基因组编辑功能会因传递载体的突变而出错,导致细菌死亡率低。 与之前报道的基于脂质的非共价制剂相比,本发明通过诱导Cas9与聚合物之间的直接缀合,使Cas9蛋白的每个单分子与载体材料结合,从而解决了发现的加载效率问题 在以前的非共价制剂的情况下,并且可以仅使用最少量的载体材料(2 wt% 或更少的蛋白质),因为只有一个或两个聚合物载体材料 (bPEI) 分子与每个 Cas9 分子缀合 , 从而可以最大限度地减少毒性或副作用,并可以以更高的剂量给药,因此与现有的基于质粒的制剂相比,本发明具有更高的递送效率和特异性 CA 3009389 2018-06-26。 有益效果本发明的用于非病毒基因组编辑的CRISPR纳米复合物具有几纳米至几微米的尺寸,无需外界物理刺激即可实现细胞内递送,可用于通过非病毒途径对细胞靶基因进行基因组编辑。 因此,当用于动物模型制备、微生物工程、疾病治疗的细胞工程或生物给药制剂时,CRISPR Nanocomplex表现出高细胞内递送和基因编辑效率,并且可以最大限度地减少非特异性编辑、基因编辑等问题。 突变,以及细胞毒性和生物毒性的诱导。 附图说明图1a至1e显示了从本发明的克隆的化脓性链球菌获得的重组Cas9核酸内切酶(SpCas9)的核苷酸序列。 该序列包含从 N 端到 C 端的 6x His、FLAG、核定位序列 (NLS)、SpCas9 和绿色荧光蛋白 (GFPuv)。 小写字母的序列显示 GFP 区域。 图2为本发明表达纯化的SpCas9蛋白的SDS-PAGE结果。 观察到 SpCas9 的大小约为 190 kDa。 图3显示了本发明的GFP融合的SpCas9蛋白在紫外光照射下的荧光观察结果。 图4a至4c显示靶向mecA基因的单向导RNA(sgRNA)序列(1至3)。 图5a和5b显示了用于制备靶向mecA基因的sgRNA序列的CA 3009389 2018-06-26 mecA基因模板的核苷酸序列。 图6显示了用于扩增mecA基因模板的引物序列。 图7显示了用于sgRNA合成的模板的核苷酸序列。 图8显示了用于sgRNA模板合成的引物序列。 图9显示合成的sgRNA的电泳结果。 图10显示电泳结果以确认在本发明中合成的三种sgRNA。 图11为本发明的SpCas9与bPEI的结合过程示意图。 图12显示凝胶阻滞测定结果以证实bPEI成功缀合到SpCas9上。 图13显示了SDS-PAGE分析结果以确认bPEI成功缀合到SpCas9上。 图14是显示本发明的SpCas9-bPEI和sgRNA之间的复合物(Cr-Nanocomplex)和作为对照的未修饰的SpCas9蛋白和sgRNA之间的复合物(天然复合物)的制备的示意图。 图15显示了本发明的Cr-纳米复合物与天然复合物之间的粒径比较。 图16显示了将合成的靶DNA与Cr-纳米复合物一起加入以诱导切割后的凝胶电泳结果。 图17显示了本发明的聚合物衍生的SpCas9通过共聚焦显微镜观察到细菌中的递送结果。图18显示了与对照组相比,本发明的CA 3009389 2018-06-26聚合物衍生化的SpCas9进入细菌的递送效率。 图 19 至 20 和图 21a 至 21c 显示了从共焦图像部分重建的 3D 图像,显示细菌细胞中 SpCas9 的存在来自 spCas9 和核染色的荧光信号的重叠,以便检查聚合物衍生的 SpCas9 的细菌摄取。 图22显示了来自SpCas9和核染色的荧光信号的重叠,以检查用具有不同分子量(Mw 25,000)的聚合物载体衍生的SpCas9聚合物的细菌摄取。 图23为Cr-纳米复合物在A549细胞中的摄取效率的共聚焦显微镜观察分析结果。 图24为Cr-纳米复合物在HaCat细胞中的摄取效率的共聚焦显微镜观察分析结果。 图 25 显示了从共焦图像部分重建的 3D 图像,显示了来自 Cr-纳米复合物和核染色的荧光信号的重叠在动物细胞中复合物的存在,以便检查 Cr-纳米复合物摄取到 HaCat 细胞中。 图26为Cr-纳米复合物在Raw 264.7细胞中的摄取效率的共聚焦显微镜观察分析结果。 图27为Cr-纳米复合物在Jurkat细胞中的摄取效率的共聚焦显微镜观察分析结果。 图28为Cr-Nanocomplex在神经干细胞中的摄取效率的共聚焦显微镜观察分析结果。 图29为CA 3009389 2018-06-26共聚焦显微镜观察及Cr-Nanocomplex在诱导多能干细胞(iPSCs)中的摄取效率分析结果。 图30是说明评价本发明的Cr-纳米复合物的基因组编辑效率的实验过程的示意图。 图31显示了在用本发明的Cr-纳米复合物处理的细菌悬浮培养后测量0D600值的生长速率。 图32a至32b显示了在用Cr-纳米复合物或对照处理细菌后在存在或不存在苯唑西林的情况下通过计算CFU的数量获得的结果,以进一步评估基因组编辑的模式。 图33显示了用本发明的Cr-纳米复合物处理的细菌的相对生长(%)。 图34显示了本发明不同浓度的Cr-纳米复合物的基因组编辑效率。 图35显示了用本发明的Cr-纳米复合物处理的细菌的复制培养实验结果。 具体实施方式在下文中,将参考实施例详细描述本发明。 这些实施例仅用于更具体地说明本发明,对于本领域技术人员来说显而易见的是,本发明的范围不受这些实施例的限制。 实施例实施例1:载体材料缀合的CA 3009389 2018-06-26 CRISPR酶蛋白1-1的制备。 SpCas9 蛋白的表达和纯化使用聚合物衍生的 Cas9 蛋白和 sgRNA 的复合物开发了 Cr-纳米复合物(CRISPR 纳米复合物)系统,用于将基因组编辑货物有效地递送到细菌中。 首先,为了表达 SpCas9 蛋白,将从 lentiCRISPR (Addgene) 获得的 SpCas9 基因克隆到 pET21a (Novagen) 中。 引物 5'- GGGCATATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACGATTACAAAGACGATGACGA TAAGATGGCC-3' 和 5'-CCCAAGCTTTTTCTTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTT-3' 用于 SpCas9,5'- CCCAAGCTTATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3' 和 5'- CCCAAGCTTTATTTGTAGAGCTCATCCA-3'(用于荧光蛋白)。 SpCas9 包含 6x His、FLAG、核定位序列 (NLS)、SpCas9 和从 N 端到 C 端的绿色荧光蛋白 (GFPuv)。 克隆的序列通过DNA测序确认。 将表达载体转化入 BL21-(DE3) 大肠杆菌感受态细胞后,将细胞接种于 Luria-Bertani (LB) 肉汤(含 100 pg/ml 氨苄青霉素)中,在 300 (01)600 - 0.4) 下生长过夜, 并添加 0.5 mM 异丙基 p-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 以诱导 SpCas9 表达。培养 16 小时后收集细胞,然后以 5,000 rpm 离心 10 分钟,并用裂解缓冲液(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑、0.05% 对-巯基乙醇,pH 8.0)和程序( 41% 的负荷,2 秒的脉冲和 5 秒的休息,在冰上总共 30 分钟)。 然后将细胞裂解物与 Ni-NTA 琼脂糖珠 (Qiagen) 一起孵育以结合 His 标记的 SpCas9,洗涤并用含有 50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、200 mM 咪唑、0.05% 对巯基乙醇的缓冲液洗脱 CA 3009389 2018 -06-26(pH 值 8.0)。 然后将洗脱液针对储存缓冲液(50 mM Tris HCl、pH 8.0、200 mM KC11、0.1 mM EDTA、20% 甘油、1 mM OTT 和 0.5 mM PMSF)透析总共 12 小时,每 2 小时更换一次缓冲液, 并储存在-70H。 来自链球菌 pyo 基因 (SpCas9) 的重组 Cas9 核酸内切酶是通过将表达质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,然后通过亲和层析纯化获得的。 克隆的 SpCas9 的序列如图 1 所示。通过 SDS-PAGE 电泳分析纯化的 SpCas9。 本发明纯化的SpCas9蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。观察到SpCas9的大小约为190kDa。 SpCas9 的 GFP 荧光也通过在 UV 照明器下观察得到证实(图 3)。 1-2。 单向导 RNA (sgRNA) 的设计和合成 sgRNA 的设计 靶向 MRSA 中 mecA 基因的单向导 RNA (sgRNA) 旨在通过 SpCas9 诱导细菌基因组中的双链断裂。 根据 mecA 基因内的各种靶位点确定了三种不同的 sgRNA 序列作为原型间隔子(图 4)。 原型间隔子区域都与原型间隔子附着基序 (PAM) 序列 (NGG) 相邻,目标切割将在上游三个碱基的位点发生。 sgRNA 包括用于靶向 mecA 的 CrRNA (CRISPR RNA) 和反式激活 RNA 序列 (TracrRNA)。 接头 (GG) 也包含在 5' 端。 通过使用 HelixAmp Power-Pfu (NanoHelix) 和寡核苷酸引物 (Bioneer) 在 60 C 退火 40 秒和在 72 C 延伸 30 秒重复 30 个循环来制备 sgRNA 的模板 CA 3009389 2018-06-26,随后 通过凝胶提取(QIAquiCT,Qiagen)。 使用噬菌体 T7 RNA 聚合酶 (Promega) 在 37r 下进行 120 m 的体外转录。 扩增子和引物的序列显示在图 4 中。转录的 sgRNA 通过使用 5 M 乙酸铵沉淀,然后乙醇沉淀来纯化。 为了制备sgRNA,首先使用图8所示的引物合成用于体外转录的各个sgRNA的DNA模板。 每个 sgRNA 的 DNA 模板包括 T7 启动子区域、CrRNA 模板区域和 TracrRNA 模板区域(图 7)。 合成的 DNA 模板如图 9 所示。然后使用合成的 DNA 模板和 T7 聚合酶进行体外转录以产生相应的 sgRNA。 图10显示成功合成了三种不同类型的sgRNA——sgRNA(1)、sgRNA(2)和sgRNA(3),它们均靶向mecA的不同区域。 所有三种合成的 sgRNA 均显示具有 -100 个核苷酸的大小。 sgRNA 的选择 还检查了上面制备的 sgRNA 指导双链切割的功能。 作为目标 DNA,通过 RT-PCR 从培养的 MRSA 的总 RNA 中 mecA 基因(图 5)的 1803 bp 区域制备纯的无细胞 DNA 溶液。 sgRNA(1)、sgRNA(2) 和 sgRNA(3) 分别与纯化的天然 SpCas9 蛋白混合,并加入 PCR 扩增的 mecA 靶 DNA,以诱导核酸内切酶切割。 sgRNA(3) 的切割效率最高,凝胶电泳结果中出现了两个片段(648 bp 和 1155 bp)。 sgRNA(2) 在 CA 3009389 2019-10-10 未切割 DNA 正下方显示了一个清晰的片段,对应于 1463 bp 片段,但其他切割产物很难观察到。 对于 sgRNA(1),两种切割产物都不可见,表明要么效率太低而无法检测,要么 sgRNA 在诱导特定双链断裂方面不起作用。 因此,sgRNA(3) 用于形成本发明的纳米复合物并进一步检查细菌递送。 1-3。细菌菌株和培养物 MRSA菌株CCARM 3798、3803、3877获自抗菌素耐药微生物培养物保藏中心(CCARM),并用作具有耐药性的目标细菌。 MSSA菌株KCTC 3881获自韩国典型培养物保藏中心(KCTC),并用作非抗性菌株。 对于培养,将每种细菌菌株接种到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB,BD Biosciences)中并在振荡培养箱中以 37r 悬浮培养 12-16 小时。 通过测量 600 nm (0.4-0.6) 的 OD 来确定细菌生长和浓度。 实施例2:聚合物衍生化的SpCas9 2-1的制备。 SpCas9-bPEI的制备为了将聚乙烯亚胺作为阴离子载体材料与基因组编辑蛋白Cas9核酸内切酶偶联,进行了以下实验。 支化聚乙烯亚胺(bPEI,Mw 2,000 和 25,000)通过在超纯水中加入 16 mg bPEI 至 5 mg sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC, Thermo Scientific),随后 通过在 25r 下反应 3 小时(bPEI : sulfo-SMCC 的摩尔比 = 1:10)。 然后将反应溶液对去离子水(MWCO 500-CA 3009389 2018-06-26 1,000,Spectra/Por)透析 48 小时,并将胺基被马来酰亚胺取代的聚乙烯亚胺聚合物冷冻干燥(FD8508,IlshinBioBase) . 此外,为了使用如上所述的基因组编辑蛋白生产Cas9核酸内切酶,来自化脓性链球菌的Cas9蛋白载体(SpCas9)在大肠杆菌中表达,然后使用组氨酸进行纯化。 为了将聚乙烯亚胺与基因组编辑蛋白 (SpCas9) 结合,将 2 mg 纯化的 SpCas9 蛋白溶解在 1.2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中; 马来酰亚胺活化的聚乙烯亚胺聚合物在其中以1:100的摩尔比在pH 6.9、4℃下反应4小时; 然后将最终产物 (SpCas9-bPEI) 针对储存缓冲液(pH 8.0 的 50 mM Tris HC1、200 mM KCl、0.1 mM EDTA、20% 甘油、1 mM DTT 和 0.5 mM PMSF)透析 24 小时,以及 在液氮中快速冷冻,然后在 80°C 下保存。SpCas9-bPEI 的合成过程示意图如图 11 所示。使用 0.5% 琼脂糖凝胶和 5% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。 图12显示凝胶阻滞测定结果以证实bPEI成功缀合到SpCas9上。 如图 12 所示,与 bPEI 缀合的 SpCas9 (SpCas9-bPEI) 似乎向 (-) 方向轻微迁移,这与显示向 (-) 方向大量迁移的天然 SpCas9 相反。 SpCas9-bPEI 的凝胶阻滞测定结果可能是由于聚合物的修饰导致蛋白质分子的迁移率和聚集的变化。 尽管通过将蛋白质的分子量仅增加 4,000 Da,最多可以将两个 bPEI 分子 CA 3009389 2018-06-26 缀合到每个蛋白质分子上,但这种微小的变化 (1-2%) 可能会显着影响蛋白质的流动性 由于结构或尺寸的变化,电泳过程中的蛋白质。 GFP 融合的 SpCas9 蛋白的理论电荷预计为高度负电荷。 由于 bPEI 由于极高密度的胺官能团而具有高度阳离子性,因此 bPEI 与 SpCas9 的结合可能会影响蛋白质的分子电荷或通过静电蛋白质-聚合物相互作用诱导它们的聚集。 此外,证实bPEI成功缀合到SpCas9上的SDS-PAGE结果显示在图13中。如图13所示,SpCas9-bPEI和天然SpCas9出现在相似区域,表明共价交联的SpCas9蛋白在之后不存在 缀合反应(图13)。 因此,证实成功实现了SpCas9与bPEI的结合,SpCas9蛋白分子之间没有发生交联。 实施例3:CRISPR基因组编辑纳米复合物(Cr-Nanocomplex)的制备和表征 3-1. Cr-纳米复合物的制备为了制备本发明的 Cr-纳米复合物,将 SpCas9-bPEI (990 nM) 和 sgRNA(3) (1.8 pM) 在去离子水 (pH 6.5) 中混合,并在 25°C 下孵育 15 分钟在静态条件下。 作为对照,在与上述相同的条件下将天然 SpCas9 (990 nM) 与 sgRNA(3) (1.8 pM) 混合。结果,制备了其中 Spcas9-bPEI 和 sgRNA (3) 自组装的纳米级复合物(图 14)。 作为 sgRNA,使用了靶向耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 CA 3009389 2018-06-26 (MRSA) 的抗生素抗性基因 mecA 的序列。 复合过程中的 pH 值为 -6.4,低于 bPEI (2 kDa) 的 pKa (-8.6),并且会质子化它们的胺官能团以诱导与阴离子 sgRNA 的静电结合。 复合物的尺寸测量和 zeta 电位测量 对于动态光散射 (DLS) 和 zeta 电位测量,将复合溶液在 PBS 或去离子水中稀释至最终浓度分别为 168 nM SpCas9 和 300 nM sgRNA(3)。 使用 ELSZ-2000ZS (Otsuka) 测量 Cr-纳米复合物或天然复合物的流体动力学尺寸和 zeta 电位。 动态光散射测量结果显示 Cr-纳米复合物的粒径(Z 平均值)为 163.3 nm,大于 82.6 nm,即未修饰的 Cas9 蛋白和 sgRNA 的天然复合物的尺寸(图 15)。 这些结果证实,通过 SpCas9-bPEI 中带负电荷的 sgRNA 和带正电荷的聚合物之间的电荷相互作用,成功形成了小型纳米级蛋白质-聚合物偶联物/RNA 复合物。 每个复合体将包括几个 SpCas9-bPEI 和 sgRNA 分子,形成更大的复杂结构,这与未修饰的 SpCas9 不同,后者主要作为与单个 sgRNA 分子结合的单个蛋白质存在。 由于存在与蛋白质表面结合的 sgRNA,Cr-纳米复合物和天然复合物的 zeta 电位值均显示为负值,而 Cr-纳米复合物的 zeta 电位相对较低的阴离子 (-12.1 mV) 相比 到原生复合体 (-19.0 mV)。 此外,由于 CA 3009389 2018-06-26 引入了 阳离子聚合物。 Cr-Nanocomplex 的阴离子特性较低,预计有助于改善向细菌的输送。 3-2. 核酸内切酶活性的切割测定 为了研究聚合物衍生化和 Cr-纳米复合物形成后的 Cas9 核酸内切酶是否保留了诱导双链 DNA 切割的功能活性,使用来自培养细菌的 PCR 扩增模板 DNA 进行了体外切割测定。 首先培养MRSA和MSSA菌株,使用Trizoid试剂(Invitrogen)提取总RNA,然后使用amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT)逆转录60t 1 min(变性),25t for 5 分钟(退火)、55 吨 60 分钟(延伸)和 85 吨 1 分钟(失活)。 然后用 power pfu 聚合酶 (Nanohelix) 和 mecA 基因的特异性引物 (Bioneer) 扩增 cDNA,使用以下条件:在 95t 起始 2 分钟; 35 个循环 95t 20 s(变性),59t 40$(退火),72t 3 min 38 s(延伸); 并在 72t 处终止 5 分钟。 然后用 SpCas9-bPEI 或与 sgRNA(3) 复合的天然 SpCas9 以 10:10:1 的 SpCas9:sgRNA:target DNA 摩尔比处理扩增的模板 DNA,然后在 Cas9 核酸酶反应缓冲液(20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, pH 6.5) 在 37t 下 1 小时。 通过琼脂糖凝胶电泳观察最终产物以确认 DNA 片段的存在和大小。 结果如图16所示。如图16所示,确认出现了一个较大的DNA片段和一个较小的DNA片段,分别对应1155 CA 3009389 2019-10-10 bp和648 bp的预期大小,表明 SpCas9,即使在与 bPEI 直接共价修饰并与 sgRNA 复合后,也能够诱导靶 DNA 的双链切割。 3-3。 聚合物衍生化的 SpCas9 的细菌递送和共聚焦显微术与天然 Cas9 相比,本发明的 Cas9 蛋白的聚合物衍生化预计会增加细菌摄取。 为了证明聚合物衍生的 SpCas9 进入细菌的递送效率,SpCas9-bPEI 用体外培养的 MRSA 处理,然后通过共聚焦显微镜观察。 MRSA 菌株 3798 和 3803 在如上所述的处理之前进行培养。将 PBS 中的 SpCas9-bPEI (200 nM) 或天然 SpCas9 (200 nM) 处理至 1x107 培养的 MRSA。 作为对照,还使用与 bPEI 简单混合的天然 SpCas9,首先将浓缩的 SpCas9 与 bPEI(Mw 2,000)混合,在 251.7 下孵育 15 分钟,然后在 PBS 中稀释(7X)进行处理(SpCas9 的最终浓度 - 200 nM , bPEI - 3 皮克/毫升)。 使用振荡培养箱在 37t 下孵育 2 小时并轻轻搅拌后,离心后用 PBS 反复洗涤细菌以去除残留的复合物。 然后将细菌固定在 4% 多聚甲醛溶液中,使用 Vectashield (Vector Laboratories) 安装在显微镜载玻片上,并使用激光扫描共聚焦显微镜 (LSM780, Carl Zeiss) 进行观察。 为了量化相对摄取,用上述混合物以 1.7x107/m1 处理细菌 4 小时。 作为另一个对照,天然 SpCas9 也根据制造商的方案与 Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) 混合(CA 3009389 2019-10-10 SpCas9 的最终浓度为 400 nM)。 通过共聚焦显微镜获得低倍率图像,并使用 ImageJ (NIH) 将绿色荧光信号 (SpCas9) 归一化为红色荧光 (PI 染色)。 结果如图17和18所示。如图17所示,本发明的聚乙烯亚胺偶联Cas9蛋白(SpCas9-bPEI)为未修饰的Cas9蛋白(SpCas9),但SpCas9-bPEI被细菌摄取的速度显着提高。 与未反应的聚乙烯亚胺聚合物和 Cas9 蛋白的混合物 (SpCas9+bPEI (mix)) 相比效率更高。 在本发明的 SpCas9-bPEI 的情况下,在核染色附近清楚地观察到来自 GFPuv 的亮绿色荧光,而天然 SpCas9 未显示任何显着摄取。 作为对照的天然 SpCas9 与 bPEI(SpCas9+bPEI(混合))简单地(非共价)混合也没有显示任何摄取迹象。 此外,为了进一步研究聚合物衍生化的 SpCas9 在细菌中的摄取,将共聚焦图像切片重建为 3D 图像,显示细菌细胞内 SpCas9 的存在来自复合物和核染色的荧光信号的重叠(图 19 和 20). 还从共聚焦图像内扫描的不同区域获得荧光信号的直方图,结果,来自 SpCas9 的信号仅出现在核染色信号也存在的点上(图 21)。 如图 19 所示,SpCas9-bPEI 的相对摄取值显示为 0.4273,而天然 SpCas9、与 bPEI 简单混合的天然 SpCas9 和与 lipofectamine 混合的天然 SpCas9 分别为 0.0041、0.0001 和 0.0083。 bPEI 结合后 Cas9 蛋白的摄取量大大增加可能是由于聚合物的高度 CA 3009389 2018-06-26 阳离子特性,或由此导致的蛋白质极性增加。 由于 bPEI 聚合物在高分子密度下富含叔胺、仲胺和伯胺基团,因此与天然 SpCas9 相比,SpCas9-bPEI 与革兰氏阳性细菌带负电荷的细胞壁的相互作用将大大增加。 此外,SpCas9 表面存在的 bPEI 允许分子簇的形成或凝聚。 总的来说,SpCas9 与细菌细胞壁的增强结合可能是通过穿透肽聚糖并随后通过细胞膜摄取,因此会导致更高的摄取机会。 此外,bPEI 的强阳离子特性会与细菌 DNA 发生静电相互作用,这有望使 SpCas9 分子吸引到其基因组靶标。 同时,使用传统的 Lipofectamine 作为载体已被证明具有局限性,因为药物的负载效率低且难以释放到细胞中。 本发明人预计这些问题可以通过 SpCas9 蛋白与阳离子聚合物的共价结合来解决。 只要这种修饰不影响功能活性,就可以将阳离子聚合物应用于每个蛋白质分子,同时允许使用最少量的载体材料。 另一个优点是可以避免将货物封装到载体材料中的过程,而这是为了交付而进行的货物释放步骤所必需的。在使用经 bPEI Mw 25,000 修饰的 SpCas9 的治疗实验中可以证实进一步的证据。 图 22 显示当用更大的 bPEI CA 3009389 2018-06-26 聚合物修饰时,该蛋白质在处理细菌时未显示任何显着摄取。 由于只有用较小的 bPEI 进行修饰才显示出高递送效率,因此很明显,使用最佳量的小分子量载体材料对于最大化递送效率和最小化毒性很重要。 3-4。 Cr-纳米复合物的动物细胞递送和显微术与天然Cas9相比,预期本发明的Cas9蛋白的聚合物衍生化增加哺乳动物细胞的吸收。 为了验证 Cr-Nanocomplex 向哺乳动物细胞的递送效率,体外培养的动物细胞用 SpCas9-bPEI 和 sgRNA 处理,并通过共聚焦显微镜观察。 A549、HaCat 和 Raw264.7 动物细胞在处理前 30 小时在 8 孔腔室中以 1x104 个细胞培养。 Jurkat 动物细胞在 48 孔细胞培养板中培养。 用 PBS 中的 SpCas9-bPEI2000/sgRNA (168 nM)、SpCas9-bPEI25000/sgRNA (168 nM) 或天然 SpCas9/sgRNA (168 nM) 处理培养的哺乳动物细胞。 作为另一个对照,根据制造商的方案(SpCas9/sgRNA 的最终浓度各为 168 nM)将天然 SpCas9/sgRNA (168 nM) 与 Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) 混合。 各实验组用细胞培养箱在37℃、5%CO2条件下孵育1-1.6h,然后用PBS反复洗涤3次,去除残留复合物。 然后将细胞固定在 4% 多聚甲醛溶液中,使用封固剂 (Vector Laboratories) 安装在显微镜载玻片上,并使用激光扫描共聚焦显微镜 (LSM780, Carl Zeiss) 进行观察。 结果,通过共聚焦显微镜获得了低倍率图像,并且可以确认绿色荧光信号 CA 3009389 2018-06-26 (SpCas9) 和蓝色荧光(DAPI-核染色)。 如图23所示,可以证实,与未修饰的Cas9相比,本发明的Cas9蛋白与聚乙烯亚胺(Mw:2000)(SpCas9-bPEI)/sgRNA复合物的缀合物显示出以显着高的效率成功摄取到A549动物细胞中 蛋白质 (SpCas9)/sgRNA 复合物,并且即使与含有 Lipofectamine RNAiMAX 的混合物相比,也显示出显着的高吸收。 作为另一个对照,在使用 SpCas9-bPEI25000/sgRNA(bPEI,Mw 25,000,12.5 倍)处理的情况下,未观察到明显的细胞内摄取。 此外,同样在处理HaCat动物细胞的情况下,如图24所示,可以确认本发明的Cas9蛋白缀合物与聚乙烯亚胺(SpCas9-bPEI)/sgRNA复合物显示出以显着高的速度成功摄取到动物细胞中 与未修饰的 Cas9 蛋白 (SpCas9)/sgRNA 复合物相比的效率,以及作为另一个对照,与 lipofectamine RNAiMAX 的混合物相比。 为了进一步研究 Cr-Nanocomplex 的细胞内摄取,共聚焦图像部分被重建为 3D 图像,从复合物(SpCas9/sgRNA:绿色荧光)和核荧光信号的重叠显示 HaCat 动物细胞内复合物的存在 染色(DAPI:蓝色荧光)(图 25)。 图25证实本发明的与聚乙烯亚胺(SpCas9-bPEI)/sgRNA复合物偶联的Cas9蛋白显示绿色荧光信号(SpCas9)和蓝色荧光(DAPI-核染色)的大部分重叠。 对于 Raw 264.7 动物细胞也获得了相同的结果,并且图 26 证实在 SpCas9-bPEI/sgRNA CA 3009389 2018-06-26 复合物的核染色附近清楚地观察到来自 Cas9 蛋白的 GFPuv 亮绿色荧光。 本发明,而天然 SpCas9 显示出相对较弱的荧光。 如图27所示,当处理免疫细胞Jurkat动物细胞时,本发明的SpCas9-bPEI/sgRNA复合物与未修饰的Cas9蛋白(SpCas9)/sgRNA复合物相比,效率大大提高,细胞内摄取略有增加 与含有 Lipofectamine RNAiMAX 的混合物相比。如图28所示,观察到同样对于人体来源的神经干细胞,与未修饰的SpCas9/sgRNA复合物相比,本发明的SpCas9-bPEI/sgRNA复合物显示出显着高的Cas9荧光信号,表明 显着的高细胞摄取效果。 同样对于人源诱导多能干细胞(iPSC),天然SpCas9/sgRNA复合物未显示出细胞摄取效应,但本发明的SpCas9-bPEI/sgRNA复合物显示出显着的细胞摄取效应(图29)。 SpCas9-bPEI/sgRNA 或 SpCas9/sgRNA 复合物的递送效率可以通过 SpCas9 重组蛋白的 GFP 信号来确认,对于所有细胞的复染,细胞核用 DAPI 染色,细胞质用罗丹明-鬼笔环肽染色。 图 28 和 29. 3-5. Cr-纳米复合物对基因组编辑效率的评估本发明人研究了Cr-纳米复合物是否编辑细菌基因组并靶向抗生素抗性。 用靶向 mercA 和 SpCas9-bPEI 的 sgRNA 形成的 Cr-纳米复合物对培养的 MRSA(菌株 3798 和 3803)进行体外处理,并在随后的选择性培养基培养中检查细菌生长。 经证实,培养的 MRSA 菌株对甲氧西林和苯唑西林均具有抗性。 作为实验组,CA 3009389 2018-06-26 本发明的 Cr-纳米复合物通过将 SpCas9-bPEI (990 nM) 与 sgRNA (3) (1.8 pM) 混合并孵育 15 分钟来制备。 作为对照,在与上述相同的条件下将天然 SpCas9 (990 nM) 与 sgRNA(3) (1.8 pM) 混合。 根据制造商的方案,还通过添加天然复合物 (50 μl) 和 Lipofectamine RNAiMAX(15.8 μL,Thermo Fisher Scientific)制备了作为另一种对照的常规脂质制剂。 作为对照,还制备了仅包含蛋白质(不含 sgRNA)、仅包含 SpCas9-bPEI 或仅包含天然 SpCas9 的样品,浓度为 990 nM。 所有样品均在胰蛋白酶大豆肉汤中稀释 6 倍(SpCas9 终浓度:sgRNA = 165 nM:300 nM),然后在 37 C 下用 5x106 MRSA 轻轻搅拌处理 4 小时。 处理过的细菌用 PBS 洗涤,在含有 6 pg/mL 苯唑西林的 TSB 中稀释 (100X),并在 37°C 的振荡培养箱中培养 90 分钟。 培养 90 分钟后,通过测量 600 nm 处的 OD 值(纳米光度计,Implen)来确定细菌生长。 用纳米复合物处理的细菌也在 PBS 中稀释 (105X),铺展到含有 6 pg/mL 苯唑西林的 MRSA 琼脂平板上,并在 30°C 下孵育 21 小时,并对菌落形成单位 (CFU) 进行计数。 如果用 Cr-Nanocomplex 处理的细菌在悬浮液中或在含有苯唑西林 (6 pg/mL) 的琼脂培养基上培养,则双链 DNA 断裂的克隆无法生长,未受影响的克隆将形成细菌菌落。 实验过程的示意图显示在图 28 中。在用 Cr-纳米复合物处理的细菌悬浮培养后,通过测量 ODao 值确定生长速率(图 29)。 如图29所示,表明用本发明的CA 3009389 2018-06-26 Cr-Nanocomplex处理导致显着的生长抑制,即与没有用SpCas9-bPEI处理相比降低了32% sgRNA 作为对照。 此外,为了进一步评估基因组编辑模式,用 Cr-纳米复合物或对照处理细菌,并在苯唑西林存在或不存在的情况下计算 CFU 的数量(图 30)。 如图 30 所示,与对照(仅 SpCas9 为 335x106 CFU/ml;401x106 CFU/ ml 仅用于 SpCas9-bPEI),而使用天然 SpCas9/sgRNA 复合物的处理显示出较小的生长下降(121x106 CFU/ml)。 此外,仅用 SpCas9-bPEI 处理(不含 sgRNA)未显示细菌生长有任何显着减少,表明用 Cr-纳米复合物处理时细菌生长减少并非由 bPEI 的存在引起的毒性所致。 令人惊讶的是,与仅用 SpCas9 作为对照的处理相比,天然 SpCas9/sgRNA 复合物的脂质体制剂显示细菌生长没有显着降低 (361x106 CFU/ml)。使用 lipofectamine 递送 SpCas9/sgRNA 复合物在哺乳动物细胞中表现出显着的递送效率,但在细菌细胞的情况下表现出较差的递送。 此外,考虑到在存在生物活性分子(例如 Cas9 等蛋白质)的情况下培养细菌可以通过充当食物来源或兴奋剂来影响细菌生长这一事实。 因此,“相对增长”是根据(1)用包括 sgRNA 的复合物 CA 3009389 2018-06-26 处理时的 CFU 数计算的,并用(2)用不包括 sgRNA 的复合物处理时的 CFU 数标准化(图 31 ). 如图 31 所示,与仅用 SpCas9-bPEI 处理相比,用本发明的 Cr-纳米复合物处理显示出 16.3% 的相对增长,而用 SpCas9/sgRNA 复合物处理导致 35.9% 的相对增长 与仅使用 SpCas9 的治疗相比。 在 Lipofectamine 存在的情况下用天然 SpCas9/sgRNA 复合物处理导致相对生长 71.6%,与 SpCas9 和没有 sgRNA 的 Lipofectamine 相比(图 31)。 这些结 以更高的效率提取目标 DNA。 此外,通过用不同浓度的 Cr-纳米复合物处理细菌来确定剂量依赖性基因组编辑效率(图 32a 和 32b)。 如图 32 所示,当比较 Cr-纳米复合物与天然复合物时,较低浓度的处理导致 18.7% 的相对生长抑制,而较高浓度的处理导致 57.7% 的相对生长抑制。 尽管与中等浓度的处理相比,较高浓度的处理导致抑制的平均值略高,但这些值仅在中等处理的情况下显示出统计学显着性。 较低浓度的 Cr-Nanocomplex 处理不足以发挥显着的基因组编辑功效,而较高浓度的 Cr-Nanocomplex 处理 CA 3009389 2018-06-26 可能通过影响细菌来干扰基因组编辑过程 功能和摄取,或刺激细菌生长。 另一个关键发现是,在没有苯唑西林的情况下对细菌生长的检查显示了与苯唑西林存在下的值相似的结果,Cr-纳米复合物为 67x106 CFU/ml,天然复合物为 135x106 CFU/ml,以及 414x x106 CFU/ml 仅用于 SpCas9-bPEI(图 30)。 还对由 Cr-纳米复合物处理的细菌形成的细菌菌落进行了复制接种。 此处,将不含苯唑西林的初级平板复制到包含苯唑西林的次级平板上,并在 301° 培养 12 小时,然后对细菌菌落进行计数。 结果显示在非选择性培养基中形成菌落的所有克隆也能够在选择性培养基中生长(图33)。 这些结果表明,Cr-Nanocomplex 进行的基因组编辑导致细菌死亡,而耐受该处理的细菌继续生长。 统计分析计算所有统计数据并显示为平均标准偏差。 通过使用学生 t 检验获得 p 值来确定统计显着性。 CA 3009389 2018-06-26。