CA3009389C
有效
用于非病毒基因组编辑的crispr纳米复合物及其制备方法
4. 权利要求
1. 一种高分子载体材料偶联成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白, 其中 CRISPR酶蛋白为Cas9,其中聚合物载体材料为支链聚乙烯亚胺、线性聚乙烯亚胺或其共聚物或混合物。
2. 如权利要求1所述的高分子载体材料偶联的CRISPR酶蛋白, 其中 聚合物载体材料和 CRISPR 酶蛋白通过交联剂缀合,交联剂为 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (SMCC)、磺基琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (sulfo-SMCC) ), N-a-马来酰亚胺基乙酰-氧基琥珀酰亚胺酯(AMAS), N-p-马来酰亚胺丙基-氧基琥珀酰亚胺酯(BMPS), N-y-马来酰亚胺基丁酰-氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS), m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS), N-c-马来酰亚胺己酰基-氧基琥珀酰亚胺酯 (EMCS)、聚乙二醇化 SMCC (SM(PEG))、琥珀酰亚胺 3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯 (SPDP)、聚乙二醇化 SPDP (PEG-SPDP)、戊二酸二琥珀酰亚胺 (DSG)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、辛二酸二琥珀酰亚胺 (DSS) , 双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯 (B53), 二硫代双 (琥珀酰亚胺基丙酸酯) (DSP), 乙二醇双 (琥珀酰亚胺基琥珀酸酯) (EGS), 二甲基庚二酸 (DMP), 双马来酰亚胺乙烷 (BMOE), 1,4- 双马来酰亚胺丁烷 (BMB), 二硫代双马来酰亚胺乙烷 (DTME) ), 1-ethy1-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), N-Hydroxysuccinimide (NHS), propargyl-succinimidyl-ester, dibenzocyclooctyne-maleimide (DBCO-maleimide), 二苯并环辛炔-PEG4-马来酰亚胺 (DBCO-PEG) -马来酰亚胺), 二苯并环辛炔-S-S- N-羟基琥珀酰亚胺酯 (DBCO-S-S-NHS 酯), 检索日期/接收日期 2022-03-11 二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯 (DBCO-NHS 酯), 乙炔-PEG-NHS 酯 , 或炔烃-PEG-马来酰亚胺。
3.一种高分子载体材料偶联成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白的制备方法,该方法 包括: (a) 将高分子载体材料的官能团与双功能交联剂反应制备活化的高分子载体材料; 和 (b)将CRISPR酶蛋白的功能基团与活化的高分子载体材料反应制备偶联材料,其中CRISPR酶蛋白为Cas9,步骤(a)中的高分子载体材料为支链聚乙烯亚胺、线型聚乙烯亚胺 ,或其共聚物或混合物。 4.如权利要求3所述的方法, 其中 步骤(a)中的交联剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)、N-a-马来酰亚胺乙酰-氧代琥珀酰亚胺酯 (AMAS)、N-p-马来酰亚胺丙基-氧基琥珀酰亚胺酯 (BMPS)、N-y-马来酰亚胺基丁酰-氧基琥珀酰亚胺酯 (GMBS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯 (MBS)、N-c-马来酰亚胺己酰-氧基琥珀酰亚胺酯 (EMCS)、聚乙二醇化 SMCC (SM (PEG))、琥珀酰亚胺基 3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯 (SPDP)、聚乙二醇化 SPDP (PEG-SPDP)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯 (DSG)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯 (DSS)、辛二酸双磺基琥珀酰亚胺酯 (B53)、二硫双 (琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)、二甲基日期检索/收货日期 2022-03-11 庚二酸 (DMP)、双马来酰亚胺乙烷 (BMOE)、1,4- 双马来酰亚胺丁烷 (BMB)、二硫代双马来酰亚胺乙烷 (DTME)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、炔丙基-琥珀酰亚胺-酯、二苯并环辛炔-马来酰亚胺 (DBCO-马来酰亚胺)、二苯并环辛炔-PEG4-马来酰亚胺 (DBCO -PEG-马来酰亚胺)、二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-S-S-NHS酯)、二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS酯)、乙炔-PEG-NHS酯或炔-PEG-马来酰亚胺。
5.如权利要求3或4所述的方法, 其中 步骤(a)在二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、甲醇、水、二氯甲烷或氯仿的溶剂中进行。
6.如权利要求3至5中任一项所述的方法, 其中 步骤(a)在4-60℃下进行0.5-24小时。
7.如权利要求3至6中任一项所述的方法, 其中 步骤(b)中的高分子载体材料与CRISPR酶蛋白的摩尔比为10-1:1至105:1。
8.如权利要求3至7中任一项所述的方法, 其中 步骤(b)在4-60℃下进行1-48小时。
9.如权利要求3至8中任一项所述的方法, 其中 步骤(b)在pH 4-10下进行。
10. CRISPR 纳米复合物 包括 3.权利要求1或2的聚合物载体材料缀合的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白和单向导RNA(sgRNA)。 接收日期/接收日期 2022-03-11 46
11.如权利要求10所述的CRISPR纳米复合物, 其中 CRISPR 纳米复合物的 zeta 电位为 -100 至 +100 mV。
12.作文 包括 权利要求1或2所述的聚合物载体材料偶联的CRISPR酶蛋白,或权利要求10或11所述的CRISPR纳米复合物和药学上可接受的载体。
13.如权利要求12所述的组合物, 其中 该组合物用于将聚合物载体材料偶联的CRISPR酶蛋白或CRISPR纳米复合物递送至细胞内以诱导基因组编辑。
14.如权利要求13所述的组合物, 其中 细胞是真核细胞或原核细胞。
15.如权利要求13所述的组合物, 其中 细胞是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、HeLa、A549、MDAMB、SK-BR-3 , OVCAR, PC3, PC12, HEK293, Jurkat, CD4+ T 细胞, CD8+ T 细胞, RAW264.7 细胞, 巨噬细胞, 单核细胞, 嗜中性粒细胞, 自然杀伤细胞 (NK 细胞), 树突状细胞, 骨髓源性抑制细胞 (MDSCs), 胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞(iPSCs)、血管内皮细胞、表皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、神经细胞、神经干细胞、脂肪干细胞(ADSCs) )、小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)、真菌细胞或寄生虫细胞。 回收日期/接收日期 2022-03-11 47
16.聚合物载体材料缀合的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)酶蛋白在基因组编辑中的用途, 其中 CRISPR酶蛋白为Cas9,其中高分子载体材料为支链聚乙烯亚胺、线性聚乙烯亚胺或其共聚物或混合物。
17.权利要求16的用途, 其中 聚合物载体材料和 CRISPR 酶蛋白通过交联剂缀合,交联剂为 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (SMCC)、磺基琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (sulfo-SMCC) ), N-a-马来酰亚胺基乙酰-氧基琥珀酰亚胺酯(AMAS), N-p-马来酰亚胺丙基-氧基琥珀酰亚胺酯(BMPS), N-y-马来酰亚胺基丁酰-氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS), m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS), N-c-马来酰亚胺己酰基-氧基琥珀酰亚胺酯 (EMCS)、聚乙二醇化 SMCC (SM(PEG))、琥珀酰亚胺 3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯 (SPDP)、聚乙二醇化 SPDP (PEG-SPDP)、戊二酸二琥珀酰亚胺 (DSG)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、辛二酸二琥珀酰亚胺 (DSS) , 双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯 (B53), 二硫代双 (琥珀酰亚胺基丙酸酯) (DSP), 乙二醇双 (琥珀酰亚胺基琥珀酸酯) (EGS), 二甲基庚二酸 (DMP), 双马来酰亚胺乙烷 (BMOE), 1,4- 双马来酰亚胺丁烷 (BMB), 二硫代双马来酰亚胺乙烷 (DTME) ), 1-ethy1-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), N-Hydroxysuccinimide (NHS), propargyl-succinimidyl-ester, dibenzocyclooctyne-maleimide (DBCO-maleimide), 二苯并环辛炔-PEG4-马来酰亚胺 (DBCO-PEG) -马来酰亚胺)、二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-S-S-NHS酯)、二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS酯)、乙炔-PEG-NHS酯或炔-PEG-Date Recue/Date 收到 2022-03-11 马来酰亚胺。
18. 使用 CRISPR 纳米复合物 包括 权利要求1或2的高分子载体材料偶联的CRISPR酶蛋白和单向导RNA(sgRNA),用于基因组编辑。
19.权利要求18的用途, 其中 CRISPR 纳米复合物的 zeta 电位为 -100 至 +100 mV。
20.权利要求18或19的用途, 其中 CRISPR 纳米复合物用于输送到细胞中以诱导基因组编辑。
21.权利要求20的用途, 其中 细胞是真核细胞或原核细胞。
22.权利要求20的用途, 其中 细胞是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、HeLa、A549、MDAMB、SK-BR-3 , OVCAR, PC3, PC12, HEK293, Jurkat, CD4+ T 细胞, CD8+ T 细胞, RAW264.7 细胞, 巨噬细胞, 单核细胞, 嗜中性粒细胞, 自然杀伤细胞 (NK 细胞), 树突状细胞, 骨髓源性抑制细胞 (MDSCs), 胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞(iPSCs)、血管内皮细胞、表皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、神经细胞、神经干细胞、脂肪干细胞(ADSCs) )、小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)、真菌细胞或寄生虫细胞。 日期 Recue/Date Received 2022-03-11
