技术领域 [0001] 本发明涉及一种利用可特定聚合的乳清蛋白包裹谷胱甘肽(GSH)、3,3'-二吲哚基甲烷(DIM)、辅酶Q10(CoQ10)等疏水性抗氧化化合物的方法。 本文描述了包含聚合乳清蛋白包封的谷胱甘肽、DIM、辅酶Q10等的组合物。 背景技术 [0002] 谷胱甘肽 (GSH) 是一种存在于植物、动物、真菌和一些细菌中的抗氧化剂。 谷胱甘肽是动物细胞中最丰富的硫醇,范围从 0.5 mM 到 10 mM。 它存在于胞质溶胶和细胞器中(Guoyao Wu、Yun-Zhong Fang、Sheng Yang、Joanne R. Lupton、Nancy D. Turner。“谷胱甘肽代谢及其对健康的影响”,Journal of Nutrition (2004) 134 ( 3 ): 489-92). [0003] 谷胱甘肽以还原态 (GSH) 和氧化态 (GSSG) 存在。 细胞中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比率是细胞氧化应激的量度,其中 GSSG 与 GSH 比率的增加表明氧化应激更大(A. Pastore 等人,“血液总谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的测定”在儿科”。临床化学(2001 年 8 月)47 (8):1467-9;SC Lu。“谷胱甘肽合成”。Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects(2013 年 5 月)1830 (5):3143-53 ). 在健康的细胞和组织中,超过 90% 的谷胱甘肽总量为还原型 (GSH),其余为二硫化物形式 (GSSG)(K.M. Halprin, A. Ohkawara“使用谷胱甘肽还原酶”。调查皮肤病学杂志 (1967) 48 (2): 149-52)。 [0004] GSH 通过中和(即减少)活性氧来保护细胞。 这种转化以过氧化物的还原为例: [0005] 2 GSH + R2O2 → GSSG + 2 ROH(R ​​= H,烷基) [0006] 此外,自由基可以在体内消除: [0007] [0008] 此外,谷胱甘肽在细胞调节和新陈代谢中起着重要作用。 关于这些重要的代谢和细胞作用,以稳定和生物可利用的组合物提供谷胱甘肽将是有利的。 [0009] 谷胱甘肽在消化道中的口服生物利用度较差。 虽然以前的包封技术主要是使用脂质包封(如卵磷脂)与合成化学品(如聚山梨醇酯 80)相结合来增加难以吸收的化合物的吸收,但乳清蛋白或聚合乳清蛋白的应用到目前为止还没有以这种方式被应用。 因此,需要安全且不含合成化学品的选择来提高生物利用度。 [0010] 如果可以找到一种方法来提高组合物中谷胱甘肽的稳定性并减少谷胱甘肽的降解,以便递送给哺乳动物,特别是人类受试者,它将对本领域做出有用的贡献。 此外,如果可以找到一种方法来优化人体对谷胱甘肽的吸收和利用,例如增加其生物利用度,这将为本领域提供进一步有用的贡献。 [0011] With regard to the encapsulation of nutrients, certain film-forming compounds and surfactants such as polyvinylpyrrolidone, polyoxyethylene stearate, sodium cholate, deoxycholate and taurocholate phosphatidyl choline, dioleoyl phosphatidyl choline, Phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, sphingomyelin, methylcellulose 、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基乙基纤维素是有用的,并且它们中的一种或多种可以与卵磷脂组合。 [0012] 3,3'-二吲哚基甲烷(“DIM”)是一种源自十字花科蔬菜的吲哚-3-甲醇的活性代谢物,具有广泛的抗癌特性。 DIM 的稳定性是制药行业面临的主要挑战。 此外,DIM由于其低溶解度和高亲脂性,口服生物利用度差。 众所周知,用乳清蛋白包封可以开发出尺寸和特性可控的纳米粒子;这个过程可以提供保护、保存和递送敏感化合物,如芳香剂或营养品。 [0013] 已知某些方法使用超声波封装 3,3'-二吲哚基甲烷(“DIM”)和类似物质。 文学 [A. Khan 等人,“聚合乳清蛋白包裹 3,3'-二吲哚基甲烷纳米颗粒的物理化学和微观结构特性,” 分子 (2019) 24:702]。 [0014] 如果可以找到一种方法来改进包封工艺,以提供聚合乳清蛋白包封的 DIM,这些 DIM 具有其他改进的特性,例如更好的稳定性、溶解度和口服生物利用度,这将有助于化学和制剂领域。 [0015] 描述了包含聚合乳清蛋白包封的谷胱甘肽的组合物。 [0016] 一种生产聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽的方法,包括将乳清蛋白浓缩物粉末以约 8% w/v 至 12% w/v 溶解在水中以提供水溶液; 将浓缩乳清蛋白溶液加热至至少 80°C 约 15 至 25 分钟,以提供聚合的乳清蛋白溶液; 在冷却过程中向聚合乳清蛋白溶液中加入抗氧化化合物; 用均化器或剪切混合器搅拌以提供澄清的均质溶液; 分离聚合的乳清蛋白微囊化的抗氧化化合物,例如通过冷冻干燥或喷雾干燥,以提供粉末。 [0017] 此外,一种制备聚合乳清蛋白微囊化 DIM (PWP-DIM) 的方法包括: (a) 将浓缩乳清蛋白粉末以 10% w/v 溶解在水中以提供水溶液; (b) 将乳清蛋白浓缩物溶液加热至至少约 70°C 至 80°C 以提供聚合的乳清蛋白溶液; (c) 将 DIM 添加到聚合乳清蛋白溶液中; (d) 将 pH 调节至约 6.5 至约 9.0 的范围; (e) 冷却聚合乳清蛋白溶液; (f) 搅拌同时从约 80°C 冷却至约 45°C 以提供澄清的均匀溶液; (g) 分离聚合乳清蛋白微囊化 DIM。 [0018] 一个目标是制造包裹性明显更好的 PWP-DIM,以更好地保护消化道,即胃肠道。 [0019] 另一个目的是制备在消化道中具有改善吸收的PWP-DIM。 [0020]此外,一种制备聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物的方法包括: (b) 将浓缩乳清蛋白溶液加热至约 70°C 至约 80°C 约 15 分钟,以提供聚合乳清蛋白溶液; (c) 在聚合乳清蛋白溶液中加入谷胱甘肽; (d) 搅拌以提供澄清均匀的溶液; (e)分离聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽,例如通过冷冻干燥,以提供粉末。 [0021] 在一个实施方案中,用于制备聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物的方法用于制备聚合乳清蛋白微囊化谷胱甘肽(PWP-GSH)。 [0022] 在另一个实施方案中,制备聚合乳清蛋白微囊化抗氧化化合物的方法用于制备聚合乳清蛋白微囊化辅酶-Q10(PWP-CoQ10)。 附图简要说明 [0023] 图1 显示了使用 HPLC 测定还原型谷胱甘肽 (GSH) 的标准曲线。 绘制标准曲线作为浓度对峰面积的函数。 图 2 显示使用检测试剂盒测定还原型谷胱甘肽 (GSH) 的标准曲线。 标准溶液绘制为绝对 OD 值与 GSH 浓度 (μM)。 图 3 显示在小鼠中口服测试样品后作为时间函数的还原型谷胱甘肽 (GSH) 血浆浓度 (μmol/L)。 图 4 显示了测定血浆抗氧化活性的标准曲线。 通过测定0.1 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.8 mM和1.0 mM不同标准样品的OD值绘制标准曲线。 图 5 ,在一个实施方案中,描述了在口服游离 GSH、WPC/PWPC 基 GSH、WPC/PWPC 后小鼠血浆的体内抗氧化活性,如通过测定试剂盒(ABTS 方法)测量的。 各个时间点的垂直条的顺序从左到右如下:对照、WPC、PWP、GSH、WPC-GSH 和 PWP-GSH。 图 6a 到图 6f 在另一个实施方案中,显示了在口服施用游离 GSH、基于 WPC/PWPC 的 GSH、WPC/PWPC 后测量的小鼠组织中的 GSH 浓度 (μM)。 各个时间点的垂直条的顺序从左到右如下:对照、WPC、PWP、GSH、WPC-GSH 和 PWP-GSH。 6a 至 6f 显示大脑( 图 6a ), 心( 图 6b ), 肺( 图 6c ), 高度( 图 6d ), 肝脏( 图 6e ) 和章节 ( 图 6f )显示在测量值 图 7 在另一个实施方案中,描绘了在饲料中掺入 PWP-GSH 的 28 天喂养试验中大鼠的体重曲线(克)。 图 8 在另一个实施例中,描述了在将 PWP-GSH 纳入其饮食的 28 天饲养试验中大鼠的食物消耗曲线(克/大鼠/天)。 图 9 在另一个实施例中,描述了大鼠在 28 天的饲养试验中将 PWP-GSH 纳入其饮食的食物效率曲线。 图 10a 在一个实施方案中,显示了在 28 天的饲养试验中雄性大鼠的各种器官组织的染色切片的显微图像,与对照相比在饲料中掺入了按重量计 4% 的 PWP-GSH。 图 10b 在一个实施方案中,显示了与对照组相比在饲料中掺入按重量计4%的PWP-GSH的雌性大鼠在28天饲养试验中的各种器官组织的染色切片的显微图像。 图 11 显示使用还原型谷胱甘肽 (GSH) 测定试剂盒 (A006-2-1) 确定固体样品中还原型 GSH 含量的标准曲线。 图 12 图显示了使用标准技术确定的 PWPC 和 PWPC-GSH 的 TEM 图像。 底部的刻度为 1.0 微米。 图 13a 显示乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的粒径分布,例如基于WPC的PWPC-GSH。 图 13b 显示乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的粒径分布,例如基于WPI的PWPI-GSH。 图 14 图显示了乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的多分散指数(PDI),例如,基于 WPC 和 WPI 起始材料的 PWPI-GSH。 字母 a 到字母 c 表示显着 (P ≤ 0.05)。 图 15 显示乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如,基于 WPC 和 WPI 起始材料的 PWPI-GSH)的 zeta 电位 (mV)。 字母 a 到字母 d 表示显着 (P ≤ 0.05)。 图 16a 绘制乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如基于 WPC 的 PWPC-GSH)的表观粘度(mPa-sec)与剪切速率(1/s)的关系图。 图 16b 绘制乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒(例如基于 WPI 的 PWPI-GSH)的表观粘度(mPa-sec)与剪切速率(1/s)的关系图。 图 17a 是乳清蛋白包裹的谷胱甘肽纳米颗粒的圆二色性 [Θ] x 10,例如,基于 WPC 的 PWPC-GSH。 ³ 度厘米 ² 分摩尔 ^-1 它是根据波长 (nm) 绘制的。 图 17b 是乳清蛋白包裹的谷胱甘肽纳米颗粒的圆二色性 [Θ] x 10,例如,基于 WPI 的 PWPI-GSH。 ³ 度厘米 ² 分摩尔 ^-1 它是根据波长 (nm) 绘制的。 图 18a 图显示了使用标准技术获得的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的FT-IR光谱,例如基于WPC的PWPC-GSH。 图 18b 图显示了使用标准技术获得的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的FT-IR光谱,例如基于WPI的PWPI-GSH。 图 19 是通过标准方法测量的 PWPI std.、PWPI-CoQ10 样品的平均粒径 (nm),比例为 100:1、80:1、60:1、40:1 和 20:1 (PWPI:CoQ10) 它是描绘的 图 20 多分散指数 (PDI) 通过标准方法测量 PWPI std.,PWPI-CoQ10 样品的比例为 100:1、80:1、60:1、40:1 和 20:1(PWPI:CoQ10)。 图 21 zeta 电位 (mV) 通过 PWPI 标准方法测量,PWPI-CoQ10 样品的比例为 100:1、80:1、60:1、40:1 和 20:1 (PWPI:CoQ10),如图所示 实施发明的具体细节 [0024] 一方面,本发明涉及聚合乳清蛋白对脂溶性和水溶性抗氧化剂的微囊化,以达到保护营养素免于降解和优化身体吸收和利用的既定目的。 例如,文献 [S. Zhang 等人,“基于聚合乳清蛋白浓缩物的谷胱甘肽递送系统:物理化学表征、生物利用度和亚慢性毒性评估”, 分子 (2021) 26:1824,贡献并描述了制备本发明的聚合乳清蛋白包封的谷胱甘肽 (PWP-GSH) 的方法,其通过引用整体并入本文。 [0025]另一方面,本发明涉及一种通过调节温度和 pH 值来改造乳清蛋白的新方法,以允许将蛋白质包裹在营养物质(特别是抗氧化剂)周围,以实现保护和最佳吸收和利用。 使用本发明的方法成功包封的抗氧化剂是谷胱甘肽、二吲哚基甲烷和辅酶Q10。 这些技术在膳食补充剂中的应用(例如压片、胶囊化、掺入即饮粉末),并成功地将抗氧化剂掺入各种食品和饮料中以增加它们的健康益处。目前正在进行研究以使其成为可能可能的。 [0026] 当前工艺的一个优点是在不使用天然食品或膳食补充剂制造商通常不希望使用的特定化学试剂的情况下实现了技术上简化和更自然的工艺。 [0027] 在一个主要实施例中,抗氧化化合物和其他衍生物的封装更均匀,这可以更好地保护消化道中的活性成分。 另外,当使用例如SEM或TEM在显微镜下观察时,这些工艺实施例提供了更好的包裹。 [0028] 与游离 GSH 相比,本文所述的 PWP-GSH 组合物和制剂表现出改善的体内吸收、更好的药代动力学、更好的生物利用度和更高的抗氧化能力。 与比较的 GSH 产品相比,本文所述的 PWP-GSH 组合物和制剂还显示出改善的体内吸收、更好的药代动力学和更好的生物利用度。 [0029] 微囊化 [0030] 微囊化是一种用于保护范围广泛的生物分子的技术。 参考文献以引用方式并入本文[ 乳清蛋白生产、化学、功能和应用,Ed。 郭明若(发明人之一) 7,“乳清蛋白的功能特性和在食品配方中的应用”,pp. 157-204(以及其中引用的参考文献),(威利:新泽西州霍博肯,2019 年)。 [0031] 制剂可以制备成适用于人类受试者的任何产品形式,包括可重构粉末、即食液体、肠胃外(静脉内)制剂和可稀释液体浓缩物;所有这些产品类型在本领域是众所周知的的营养配方。 如本文所用,存在于制剂或组合物中的成分的量是指制剂或组合物准备好供人类受试者食用时的量。 [0032] 制剂或组合物可以任选地灭菌并随后在即用的基础上使用或作为浓缩物储存。 可以通过喷雾干燥如上制备的液体制剂来制备浓缩物,并且可以通过使浓缩物再水化来重构制剂。 配方浓缩液是稳定的液体,具有合适的保质期。 [0033] 对于本发明方法中使用的包含 GSH、乳清蛋白包封 GSH (WP-GSH) 或聚合乳清蛋白包封 GSH (PWP-GSH) 的制剂或组合物的粉末实施方案,粉末的重构可以在合适的水溶液中进行溶液,液体,最好是水。 可重构粉末通常为可流动或基本可流动的颗粒组合物的形式,或者至少是可以用勺子或其他类似装置容易地舀出和测量的特定组合物的形式,其中该组合物旨在形成液体制剂或组合物.它可以很容易地由用户用合适的水性流体(通常是水)重构。 在本文中,“立即”使用通常是指在约 48 小时内,最典型地在约 24 小时内,优选在重构后立即使用。 这样的粉末实施方案包括喷雾干燥、附聚、干混或其他已知的或其他有效的颗粒形式。 制作适合一份食物的体积所需的营养粉量可能会有所不同。 [0034] 在一次性或多用途容器中包装和密封后,本发明方法中使用的营养配方可在环境条件下储存长达约 36 个月或更长时间,更通常约 12 个月至约 24 个月. 对于多用途容器,这些包装可以打开,然后盖上以供最终用户重复使用,前提是盖好的包装随后储存在环境条件下(例如,避免极端温度),并且内容物应在大约1个月。 [0035] 用于递送包含 GSH、包封乳清蛋白的 GSH (WP-GSH) 或聚合乳清蛋白包封的 GSH (PWP-GSH) 的膳食补充剂组合物的口服剂型组合物,例如有或没有惰性稀释剂。可吸收的可食用载体,或将其包裹在硬壳或软壳明胶或羟丙基甲基纤维素(即羟丙甲纤维素)中,或压制成片剂,或作为膳食补充剂给药,可直接与食物混合。 对于口服施用,将包含 GSH、乳清蛋白包封 GSH (WP-GSH) 或聚合乳清蛋白包封 GSH (PWP-GSH) 的膳食组合物与赋形剂一起掺入并配制成可摄取片剂、口含片剂、小食片剂。它可以以关键剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、威化剂等形式使用。 片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可以含有粘合剂,例如黄芪胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶; 赋形剂,如磷酸氢钙、微晶纤维素等; 马铃薯淀粉、海藻酸等崩解剂; 可能含有润滑剂,例如硬脂酸镁; 可以加入甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。 当单位剂型是胶囊时,除了上述类型的材料外,它还可以包含液体载体。 多种其他材料可作为包衣或以其他方式存在以改变剂量单位的物理形式。 例如,片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。 糖浆或酏剂可能含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙基苯甲酸酯、染料和调味剂如樱桃或橙子调味剂。 水包油乳剂可能更适合婴儿口服使用,因为它们可与水混溶,从而阻断它们的油性。 这种乳液在药物科学中是众所周知的。 [0036] 使用 HPLC 测量 GSH [0037] HPLC 分析的最佳条件: [0038] 柱:对称 C18 [0039] 流动相:水:乙腈 = 90:10 [0040] 流速:0.5 毫升/分钟 [0041] 波长:218 nm(紫外检测器) [0042] 进样体积:0.5 μL [0043] 将 GSH 粉末溶解于超纯水中,制备 10 mg/ml 的储备液。 通过用超纯水稀释储备溶液获得一系列标准溶液(0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml)。 使用 HPLC 测量 GSH。 标准曲线绘制为浓度对峰面积的函数,如图1所示。 [0044] 结合以下实施例可以进一步理解上述实施例中描述的组合物和方法。 此外,提供以下非限制性实施例来说明本发明。 然而,本领域的技术人员将认识到可能需要修改本发明的任何给定实施例的程序,例如,改变方法的顺序或步骤。 [0045] 示例 1 [0046] 乳清蛋白 - GSH 混合物 (WP-GSH) [0047]通过在室温下将乳清浓缩蛋白粉末溶解在去离子水中,然后搅拌 (700 rpm) 2 小时,制备乳清浓缩蛋白 (WPC) 溶液(10% 蛋白质,w/v)。 储备溶液在 4°C 下储存过夜以完全水合。 将乳清蛋白溶液加热至环境温度,然后以 WPC(粉末):GSH = 1:1、1:1.5 和 1:2 的重量比与还原型 GSH 混合。 将混合物搅拌20分钟以实现完全溶解。 [0048] 聚合乳清蛋白包封谷胱甘肽 (PWP-GSH) [0049] 通过在室温下将乳清浓缩蛋白粉末溶解在去离子水中,然后搅拌 (700 rpm) 2 小时,制备乳清浓缩蛋白 (WPC) 溶液(10% 蛋白质,w/v)。 将溶液在 4°C 下储存过夜以完全水合。 将乳清蛋白溶液恢复至常温,调节pH至7或8,80℃加热15分钟。 通过将在混合水-冰中加热的乳清蛋白溶液快速冷却至室温(25℃±1℃)获得聚合乳清蛋白(PWPC)溶液。 然后,将PWPC溶液与GSH粉末以PWPC:GSH=1:1、1:1.5和1:2的重量比混合。 将混合物混合 20 分钟以实现完全溶解。 [0050] 稳定性试验 [0051] 监测所有基于乳清蛋白的 GSH 溶液在室温下 20 小时的稳定性。 下表 1 列出了基于乳清蛋白的谷胱甘肽溶液的稳定性,包括聚合的实施方案。 [0052] [表格1] [0053] [0054] 如表 1 所示,PWP-GSH 样品至少可稳定 4 小时。 [0055] 示例 2 [0056] 药代动力学研究 [0057] ICR小鼠,雄性,SPF,3周龄,体重18g至22g,由北京华富康生物科技有限公司(中国北京)提供。 还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)和总抗氧化能力测定试剂盒(ABTS法)(A015-2-1)购自南京建成生物工程研究所(中国江苏南京)。 [0058] 所有的老鼠都被关在通风良好的房间里的塑料实验室动物笼子里。 房间保持在 20°C ± 2°C 和 60% ± 10% 相对湿度,光照/黑暗循环为 12 小时。 小鼠的水和商业实验室完全食物可随意获得。 他们在治疗前适应了这种环境 7 天。 所有动物实验均经吉林大学动物福利与研究伦理委员会批准(批准号:SY201905018)。 [0059] 抽血。 采血前,将 30 μL 肝素溶液加入 1.5 mL 离心管中并涡旋。 取下小鼠的一只眼睛以获得血样(约 0.5 mL)。 血液在室温下以 6000 rpm 离心 2 分钟。 将上层血浆转移到新的离心管中。 使用 GSH 测定试剂盒测定 GSH 的血浆浓度。 [0060] GSH 储备液 (1 mmol/L) 用一系列标准溶液稀释至浓度为 0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 和 100 μmol/L。 标准溶液绘制为绝对 OD 值与 GSH 浓度(图 2)。 [0061] A. 游离GSH、乳清蛋白基GSH、乳清蛋白、聚合乳清蛋白基在不同时间点(0、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时)灌胃,每组6只小鼠。血液在口服谷胱甘肽和聚合乳清蛋白后采集样品。 基于乳清蛋白的 GSH 的剂量被调整为具有 100 mg/kg GSH 的等量。 血液样本中的 GSH 浓度是用检测试剂盒测量的。 [0062] 表 2 显示了测试组和灌胃体积。 [0063] [表2] [0064] [0065] 如图3所示,PWP-GSH试验物质在口服给药后极好且显着地增加了血浆GSH浓度。 [0066] B. 体内抗氧化活性 [0067] 将 Trolox 储备液 (10 mM) 稀释至 0.1 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.8 mM、1.0 mM。 通过测量不同标准样品的OD值绘制标准曲线(图4)。 血浆抗氧化活性表示为 Trolox 剂量的倍数,以 Trolox 的 TAOC(总抗氧化能力)为 1。 [0068] 还使用测定试剂盒测量了所有样品的总抗氧化能力,结果如图5所示。 口服游离GSH、WPC/PWPC-based GSH和WPC/PWPC后,采用试剂盒(ABTS法)测定小鼠血浆的体内抗氧化活性。 [0069] 如图 5 所示,随着时间的推移,PWP-GSH 样品显示出最有效的抗氧化活性。 [0070] C. GSH 的组织分布 [0071] 评价每组6只小鼠口服给药后0小时、1小时、2小时、4小时和6小时GSH对器官、脑、心脏、肾脏、肝脏、肺和肠道的递送效率。组织样本被带走了。 将组织匀浆,沉淀蛋白质,离心并使用测定试剂盒分析 GSH 含量(图 6A-6F)。 [0072] 如图 6a-6f 所示,游离 GSH 在各种组织中的分布明显大于对照组。 此外,PWP-GSH 组在各种组织中的 GSH 分布明显大于对照组。 [0073] D. 基于聚合乳清蛋白的 GSH (PWP-GSH) 的毒性研究 [0074] 乳清蛋白浓缩物由 Fonterra Co-operative Group(新西兰奥克兰)提供。 戊巴比妥钠、福尔马林和无水乙醇由北京工厂(中国北京)提供。 3周龄的SD大鼠由北京华富康生物科技有限公司(中国北京)提供。 [0075] 膳食配方 [0076] 聚合乳清蛋白浓度为 10%,乳清蛋白与谷胱甘肽的比例为 1:1 示例 1 聚合乳清蛋白浓缩物基谷胱甘肽 (PWP-GSH) 的制备根据 然后,使用冷冻干燥机(Alpha 1-4 LDplus,德国)将制备的聚合乳清蛋白 GSH 干燥。 然后将基于粉末状聚合乳清蛋白的 GSH 以 0.5%、1% 和 4% (w/w) 的百分比掺入常规饮食中,对应于 GSH 的 0.25%、1% 和 2% 百分比。 饮食由北京 HFK Bioscience Co., Ltd(中国北京)准备。 剂量是根据健康人的每日摄入量(每天 100 毫克)设定的。 根据平均体重 60 公斤计算,人类的剂量为 1.6 毫克/公斤。 根据转换方程,这相当于大鼠的 10 mg/kg。 剂量设定为 0.5%、1% 和 4%,相当于人类每日摄入量的 25、50 和 200 倍。 [0077] 实验设计 [0078]80 只 3 周大的大鼠(雄性和雌性各半)购自北京 HFK Bioscience Co., Ltd(中国北京)。 所有的老鼠都被关在通风良好的房间里的塑料实验室动物笼子里。 房间保持在 20°C ± 2°C 和 60% ± 10% 相对湿度,光照/黑暗循环为 12 小时。 水可随意获得。 受试大鼠在治疗前先适应该环境7天,此时一般情况无明显变化。 适应后,根据平均体重将大鼠随机分配到 4 组(每组每性别 10 只)。 在随机分组时,该组的个体体重在总体平均值的 ±20% 以内。 与对照组的动物相比,低、中和高剂量组的动物在其饮食中分别接受了 0.5%、1% 和 4% 乳清蛋白基谷胱甘肽。 所有动物实验均经吉林大学动物福利与研究伦理委员会批准(批准号:SY201905018)。 [0079] 临床观察 [0080] 在整个研究过程中观察每只大鼠的毛发状况、皮肤、粘膜、分泌和排泄、自主神经系统活动、步态变化和姿势。 [0081] 体重和食物摄入量 [0082] 每隔 4 天测量一次个体体重和体重,并记录总计 28 天的时间。 在预定的尸检之前记录最后一次体重(禁食)。 还以相应的时间间隔测量和计算采食量,并表示为平均食物消耗量(以克/大鼠/天表示)。 [0083] 抽血 [0084] 实验结束时,所有动物在采血前禁食 12 小时,但允许饮水。 给大鼠注射浓度为 0.2 ml/100 g 的 2% 戊巴比妥钠溶液。 然后通过心脏抽取两个单独的血液样本用于血液学和血清化学。 对于血液学分析,将血液样本吸入 EDTA-2K 涂层管中,然后使用Exigo动物血液学分析仪,平均细胞体积(MCV),平均血红蛋白(MCH),平均血红蛋白浓度(MCHC),红细胞体积分布(RDW),平均血小板体积(MPV)淋巴细胞(LYM),中性粒细胞(GRAN )、单核细胞 (MONO)、淋巴细胞 (LYM%)、粒细胞 (GRA) 和单核细胞 (MON%)。 [0085] 对于血清化学分析,血液样本在室温下以 10000 rpm 的转速离心 3 分钟。 将上层血清转移至新离心管后,白蛋白(ALB)、钙(Ca)、肌酐(Crea)、总胆红素(TB)、总蛋白(TP)、无机磷(PHOS)、尿素(UREA)、淀粉酶(AMY)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、BUN与CR之比(U/C)、肌酸激酶(CK)、球蛋白(GLOB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)。 [0086] 器官重量、大体尸检和组织病理学 [0087] 在终止时,所有大鼠用戊巴比妥钠麻醉并通过切除无腹腔放血。 然后在尸检期间通过目视检查进行全面的大体病理学检查。 解剖所有动物的脑、心、肺、肝、脾、肾、膀胱、卵巢、子宫、睾丸、附睾和精囊并称重。 每个器官(或配对器官)的相对重量是根据终止当天测量的最终个体重量计算的。 将睾丸固定在 Bouin 溶液中,包埋在石蜡中,切片为 2 μm 至 5 μm,安装在玻璃显微镜载玻片上,用标准苏木精-伊红染色,并使用光学显微镜检查。来自这些器官的组织切片固定在 10% 缓冲溶液中甲醛。 所有组织病理学程序均在吉林大学动物科学与兽医学院进行。 [0088] 结果 [0089] 在实验过程中,与对照组相比,实验组没有观察到副作用。 [0090] 在实验过程中,在动物的临床表现中没有观察到与治疗相关的不良反应迹象。 随着治疗期的进行,体重逐渐增加(图7)。 雌性组间的体重没有统计学上的显着差异。 就男性组而言,从第 16 天起,1% 的男性组与对照组有显着差异。 仅在雄性组中观察到体重变化,并且没有剂量依赖性效应。 [0091] 图 8 和图 9 显示了大鼠 28 天内食物消耗和食物效率的结果。 尽管在某些时间点实验组和对照组之间存在一些显着差异,但在实验组中未观察到 PWPC-GSH 相关的毒性作用。 与对照组相比,0.5% 和 4% 的女性组在第 8 天的食物效率有显着差异 (p<0.05)。 [0092] 表 3 显示了雄性大鼠在 28 天毒性研究中的血清生化指标。 [0093] [表3] [0094] [0095] 注:与对照相比,*表示0.05显着水平,**表示0.01显着水平 [0096] 雄性大鼠的血清生化结果如上表 3 所示。 4%男性组的白蛋白值为33.01 g/L ± 1.34 g/L,显着低于对照组(p<0.05)。 血清中白蛋白含量低可能是由于合成不足所致。 这种变化可能有两个原因。 由于肝炎,肝脏对白蛋白的吸收可能会减少。 另一个原因可能是肾原性低导致肾脏排泄功能障碍,导致大量白蛋白随尿排出。 4% 男性的球蛋白为 28.1 g/L ± 2.77 g/L,显着低于对照组 (p<0.05)。 但是,该值在正常范围内(15 g/L 至 28 g/L)。 4% 男性的天冬氨酸氨基转移酶为 91.17 U/L ± 8.13 U/L,显着低于对照组 (p<0.05)。 但是,该值也在正常范围内(39 U/L 至 111 U/L)。 4% 男性的谷丙转氨酶为 39 U/L ± 7.73 U/L,显着低于对照组 (p<0.05)。 但是,该值在正常范围内(20 U/L 至 61 U/L)。 谷草转氨酶和丙氨酸转氨酶是肝功能的指标。 这两个参数的增加可能表明肝脏有一些病理变化,而减少可能没有临床意义。 与对照组相比,所有实验组均显示出显着较低的有利淀粉酶值(p<0.05),这是一个优势。 实验组的肌酸激酶值是一个有利值,显着低于(p<0.05)对照组,这是一个优势。 4% 男性的血糖显着低于对照组,处于正常范围(2.78 μmol/L 至 7.50 μmol/L)。 1% 和 4% 男性组的钙水平显着低于对照组 (p<0.05)。 钙水平降低可归因于 (1) 甲状旁腺激素缺乏; (2)维生素D缺乏或代谢异常; (3)可能是由于慢性肾脏病。 [0097] 总之,主要在 4% 的男性组中观察到血清生化的显着变化,主要与肝或肾功能有关。 [0098] 表 4 显示了雌性大鼠在 28 天毒性研究中的血清生化指标 (n = 10)。 [0099] [表4] [0100] [0101] 注:与对照相比,*表示0.05显着水平,**表示0.01显着水平 [0102]雌性大鼠血清生化结果见表 4。 1%雌性组的总蛋白为68.02 g/L±4.31 g/L,显着高于对照组(p<0.05)。 但是,它在正常范围内(53 g/L 至 69 g/L)。 总蛋白水平升高可能是由于慢性肝病。 1% 和 4% 女性的淀粉酶和葡萄糖显着低于对照组 (p<0.05)。 1%和4%女性组的无机磷水平明显高于对照组。 然而,它们在正常范围内(1.87 μmol/L 至 3.6 μmol/L)。 [0103] 血液学 [0104] 表 5 显示了 28 天毒性研究中雄性大鼠的血液学(动物数量 = 10)。 [0105] [表5] [0106] [0107] 注:与对照相比,*表示0.05显着水平,**表示0.01显着水平 [0108] PWPC-GSH 粉末对雄性大鼠的血液学参数没有治疗相关的副作用。 然而,对照组和治疗组之间出现了一些统计学上的显着差异。 4%组的PLT和MPV与对照组有显着差异(p<0.05)。 0.5%组的MPV和LYM也与对照组有显着差异(p<0.05)。 [0109] 表 6 显示了 28 天毒性研究中雌性大鼠的血液学(动物数量 = 10)。 [0110] [表6] [0111] [0112] 注:与对照相比,*表示0.05显着水平,**表示0.01显着水平 [0113] PWPC-GSH 粉末对雌性大鼠的血液学参数没有治疗相关的副作用。 然而,对照组和治疗组之间出现了一些统计学上的显着差异。 与对照组相比,1%组的RBC值显着升高,为6.76±0.56×10 12 /L(p<0.05)。 这些变化可能是由缺水引起的,不应被视为与测试物质有关。 1% 女性组 (14.46 g/dL ± 0.88 g/dL) 和 4% 女性组 (14.10 g/dL ± 0.36 g/dL) 的 HGB 显着高于对照组 (p < 0.05)。 然而,这些值在正常范围内(13.2 g/dL 至 16.4 g/dL),不应被视为副作用。 [0114] 相对器官重量 [0115] 相对器官重量的结果列于表 7 和 8。 服用 PWPC-GSH 粉末的雄性大鼠的最终体重明显低于对照组 (p<0.05)。 与对照组相比,除 4% 雄性组的肝脏和肾脏外,喂食 PWPC-GSH 粉末的所有大鼠的器官相对器官重量没有显着差异。 [0116] 表 7 显示了雄性大鼠在 28 天毒性研究中的相对器官重量(动物数量 = 10)。 [0117] [表7] [0118] [0119] 注:与对照相比,*表示0.05显着水平,**表示0.01显着水平 [0120] 对于雌性大鼠,4% 组的大鼠最终体重显着降低 (p<0.05)。 喂食 PWPC-GSH 粉末的大鼠与对照组大鼠的相对器官重量没有显着差异。 [0121] 表 8 显示了雌性大鼠在 28 天毒性研究中的相对器官重量(动物数量 = 10)。 [0122] [表8] [0123] [0124] 注:与对照相比,*表示0.05显着水平,**表示0.01显着水平 [0125] 病理学和组织病理学 [0126] 图 10A 和 10B 显示了喂食 4% 与对照的雄性和雌性大鼠的几个组织的染色切片。 组织样品以常规方式制备和染色,并通过标准显微方法观察。 [0127] 结论 [0128] PK 研究结果表明,聚合乳清蛋白包封 GSH (PWP-GSH) 的血清吸收比 Kyowa 的 Setria GSH 高 3 倍。 与喂食商业 GSH 饮食的大鼠相比,喂食聚合乳清蛋白封装 GSH 的大鼠在给药后 3 至 4 小时脑和肝组织中的 GSH 水平显着更高。 与对照组相比,4%饲喂组的体重、血清生化和相对器官重量等参数均有一定变化。 因此得出结论,估计雄性大鼠的未观察到不良反应水平(NOAEL)至少为 1%,雌性大鼠为 4%,相当于人类每日摄入量的大约 50 倍和 200 倍。 [0129] 总之,与标准对照相比,乳清蛋白包裹的 GSH(WP-GSH、PWP-GSH)的生物利用度显着提高,是一种安全的递送系统形式。 [0130] 示例 3 [0131] 聚合乳清蛋白包裹谷胱甘肽 (PWP-GSH) 的制备 [0132] 将浓缩乳清蛋白 (5 Kg) 溶解在蒸馏水中,浓度为 10% (w/v),并在 4°C 下储存过夜。 然后将乳清蛋白浓缩物溶液在80℃加热15分钟。 冷却至室温后,然后将 PWPC 溶液与 GSH 粉末 (5 Kg) 以 PWPC:GSH = 1:1 的重量比混合。 将混合物搅拌20分钟以完全溶解。 混合后,将混合物冷冻干燥,得到 PWP-GSH 粉末产品。 [0133] 还原型谷胱甘肽 (GSH) 测定试剂盒 (A006-2-1)、总抗氧化能力测定试剂盒 (ABTS 法) (A015-2-1) 购自南京建成生物工程研究所(中国江苏省南京市)。 GSH 含量可以使用多种方法进行测定。 以下程序测量了未经消化的 GSH 含量。 [0134] 将基于 PWPC 的 GSH 粉末 (2 g) 溶解在 20 mL PBS 缓冲液中,然后超声处理 20 分钟以完全提取。 超声处理后,取 1 mL 上清液并稀释 800 倍。 然后,将1mL稀释液与1mL脱蛋白剂混合,然后以3500rpm离心10分钟。 然后使用 GSH 测定试剂盒测量上清液中的 GSH 含量。 [0135] 或者,在胰蛋白酶消化后测量 GSH 含量。 [0136] 释放溶液:将酶活性为1:250的胰蛋白酶(10 g)溶解在1 L NaCl溶液(0.5%,w/v)中,然后用0.1 M NaOH溶液调节pH至8。 将基于 PWPC 的 GSH 粉末 (0.3 g) 添加到 30 mL 释放溶液中,并在 37°C 下以 100 rpm 摇动孵育 6 小时。 然后将混合物以 5,000 x g 离心 20 分钟,然后将上清液稀释 100 倍。 然后将稀释的悬浮液与脱蛋白溶液以 1:1 (v/v) 的比例混合,然后离心。 然后使用 GSH 测定试剂盒测量上清液中的 GSH 含量。 [0137] 参考图11的标准曲线,未经消化,两个样品的OD值分别为0.2883和0.2862,对应PWPC-GSH产物中GSH含量为43.2%和42.9%(w/w) . 经胰蛋白酶消化后,两个样品的OD值分别为0.2654和0.2627,对应PWPC-GSH产物中GSH的含量为49.8%和49.2%(w/w)。 [0138] 据此,建立了乳清蛋白包裹谷胱甘肽(PWP-GSH)的制备工艺,谷胱甘肽从基质中的回收率为99.2%,表明该热敏性化合物在整个过程中的损失仅为0.8%。指向 [0139] 例 4 [0140] PWP-GSH 样品的化学特性。 根据本公开的原理制备的样品可以进行粘度测量和其他流变学测量、FT-IR、TEM/SEM光学显微镜、微观结构和形态学研究、稳定性研究(固相、溶液相、湿度、热),粒径, 很好理解的是,它可以通过本领域熟知的多种手段来表征,包括但不限于zeta电位等。 此类化学分析有望进一步揭示本文所述组合物的独特品质和特性。 参见 [Khan, et al., 2019]。 [0141] 例 4A [0142] 1. 使用浓缩乳清蛋白 (PWC) 制备 PWPC-GSH [0143] 与基于聚氰基丙烯酸异丁酯、Eudragit RS 100/环糊精和蒙脱石的其他载体相比,PWPC-GSH 体系具有简单、温和和不含有机溶剂的优点。 见张等。 (2021)],PWPC 表现出双峰模式,在 594 nm 和 4580 nm 处有两个峰,粒径分布较宽(范围为 9.22),这与之前的研究一致。 与 GSH (287.83 nm ± 6.18 nm) 的组合略微增加了粒径 (D50),从 1085 nm ± 35.35 nm 到 1115 nm ± 7.07 nm,范围从 9.22 ± 0.22 减小到 6.86 ± 0.19。 发现 PWPC-GSH 的 zeta 电位为 30.37 mV ± 0.75 mV。 高表面电荷使 PWPC-GSH 系统具有高稳定性,因为分子间强烈的静电排斥阻止了聚合、沉淀和聚集。 此外,PWPC-GSH 的正表面电荷有利于体内吸收,因为细胞膜带有负电荷。 PWPC-GSH 系统表现出 1 s-1 到 300 s-1 的剪切稀化行为,表明液滴之间的相互作用在较高的剪切速率下减弱。 [0144] GSH 的 DSC 热分析图显示在 198 °C 处有一个放热峰,并且在 PWPC-GSH 系统中该熔化峰消失,表明 GSH 以分子形式分散在 PWPC 颗粒中。 FTIR光谱分析表明,PWPC在1654.39 cm-1处出现酰胺I(C=O振动)光谱峰,与GSH结合后发生红移,表明PWPC发生结构改变,形成分子间氢键。 该 PWPC-GSH 系统显示了互锁聚集体的形态,其中大部分的尺寸约为 200 nm,一些较大的聚集体尺寸约为 400 nm 或更大,如通过标准 TEM 成像技术所确定的(图 12)。 [0145] 2. PWPC-GSH的体内药代动力学和抗氧化活性 [0146] 由于乳清蛋白对胃蛋白酶的消化具有抵抗力、无毒、来源广泛且具有广泛的生物相容性,因此作为一种有效的营养物质输送方式已被广泛研究。 对 PWPC-GSH 递送系统和游离 GSH 进行了药代动力学研究,并确定了所有组的血浆 GSH 浓度-时间曲线。 血浆中 PWPC-GSH 组的 GSH 浓度最高,其次是游离 GSH、PWPC 和对照组。 灌胃 PWPC-GSH 的小鼠血浆中的值高于游离 GSH 组,这可能是由于高粘性 PWPC 通过将 GSH 包埋在内部并防止对胃肠道酶和酸性环境的破坏而发挥保护作用。 这些结果与之前的研究一致,表明通过乳清蛋白包封提高了槲皮素和维生素 D 的生物利用度。 [0147] 使用小鼠模型计算药代动力学参数。 游离 GSH(最大浓度为 7.37 mg/L (C _max ) 和浓度-时间曲线下面积 (AUC) 为 19.23 h x mg/L),更高的 C _max 观察到 (19.41 mg/L) 和 AUC (48.63 h x mg/L) 值,表明给予 PWP-GSH 后小鼠血液循环中 GSH 摄取率和程度更高。 PWPC-GSH 组的 Cmax 高 2.5 倍和 2.6 倍 _max 和 AUC 表明,与纯 GSH 相比,PWPC-GSH 递送系统本身可以有效提高 GSH 的体内生物利用度。 乳清蛋白在肠道吸收过程中作为载体似乎也对 GSH 具有保护作用,这可能是由于它对胃蛋白酶的消化有抵抗力。 除了 GSH 本身的输送,乳清蛋白补充剂也可能导致体内 GSH 水平升高,因为乳清蛋白中固有的半胱氨酸残基丰富,具有促进 GSH 生物合成的能力——限制性氨基酸。 与游离 GSH(2 小时)相比,PWPC-GSH 组达到最大浓度 (Tmax) 的时间更短(1 小时),表明给药后达到最大浓度所需的时间更短。 GSH 组中 GSH 的血浆浓度在 1.5 至 2 小时后达到其最高水平,这反映在与口服游离 GSH 相比的早期文献报道的数据中。 [0148] 使用测定试剂盒在不同时间点测量样品的总抗氧化能力。 在用 PWPC-GSH 灌胃的小鼠中,血浆的抗氧化能力在整个期间显着高于游离 GSH (p < 0.05)。 小鼠灌胃 PWPC-GSH 后血浆抗氧化能力增加的第一个原因是使用 PWPC 作为递送载体提高了 GSH 的血浆浓度。 第二个原因可能是由于乳清蛋白的抗氧化特性。 通过 T-AOC (mM) 测量,用 PWPC 灌胃后小鼠的血浆抗氧化能力也略有提高,其程度可能与累加效应一致,也可能不一致。 [0149] 例 4B [0150] 根据实施例 3、4 和 4A,与乳清浓缩蛋白 (WPC) 和乳清分离蛋白 (WPI) 标准品相比,测量了 PWPC-GSH 和 PWPI-GSC 的各种参数。 [0151] 图13A和13B分别显示了用于WPC和WPI起始材料的包封乳清蛋白的谷胱甘肽纳米颗粒的粒径分布。 [0152] 图14显示了用于WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的多分散指数(PDI)。 [0153] 图 15 显示了 WPC 和 WPI 起始材料的乳清蛋白包封谷胱甘肽纳米颗粒的测量 zeta 电位 (mV)。 [0154] 图16A和16B分别显示了用于WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的表观粘度和剪切率关系。 [0155] 图17A和17B分别显示了用于WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的圆二色性。 [0156] 图18A和18B分别显示了用于WPC和WPI起始材料的乳清蛋白包封的谷胱甘肽纳米颗粒的FT-IR光谱。 [0157] 例 5 [0158] PWP-DIM 的制备。 参见 Khan 等人。 (2019)]修改如下。 [0159]将组分添加到连续划痕式搅拌温度和 pH 控制罐或等效的连续搅拌反应器 (CSTR) 系统中。 特别地,罐被夹套并连接到蒸汽源。 温度由热电偶调节。 其他部件包括侧面的 pH 探头和底部的温度计,以及机械搅拌系统。 [0160] 在添加 DIM 之前,乳清蛋白在罐中分散和聚合。 [0161] 温度范围为 70°C 至 95°C,pH 范围为 6.5 至 9.0。 [0162] 对于3000 mPas,聚合前后材料混合物的实测粘度值分别为100 mPas至300 mPas。 [0163] 结果与讨论。 [0164] DIM 和浓缩乳清蛋白在疏水性/水合特性方面截然相反。 该工艺旨在用在连续相中聚合的乳清蛋白聚合物封装分散相 (DIM)。 通过搅拌和加热,当体系的粘度达到所需范围时,分散相被悬浮并包裹在聚合物中。 材料的两相形成为连续且均匀的微凝胶或聚集体。 [0165] 最后,使用标准方法将反应产物喷雾干燥并收集为包封粉末。 [0166] 例 6 [0167] PWP-DIM 样品的化学特性。 根据本公开的原理制备的样品可以进行粘度测量和其他流变学测量、FT-IR、TEM/SEM光学显微镜、微观结构和形态学研究、稳定性研究(固相、溶液相、湿度、热),粒径, 很好理解的是,它可以通过本领域熟知的多种手段来表征,包括但不限于zeta电位等。 此类化学分析有望进一步揭示本文所述组合物的独特品质和特性。 参见 [Khan, et al., 2019]。 [0168] 例 7 [0169] 以类似的方式,以这种方式制备使用分离乳清蛋白 (WPI) 的聚合乳清蛋白包封辅酶 Q10 (PWP-CoQ10),并将其表征为橙色片状粉末。 含量(HPLC):20.69 重量%。 [0170] 如图 19、20 和 21 所示,通过粒径 (nm) 和多分散指数制备具有范围从 20:1 (PWPI:CoQ10) 到 100:1 1 (PWPI:CoQ10) 的各种比率的 PWP-CoQ10,分别为 (PDI) 和 zeta 电位 (mV)。 [0171] 除非本文另有规定或与上下文明显矛盾,否则在描述本文要求保护的发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中),术语“a”、“an”、“the”)和类似名称应解释为包括单数和复数。 除非本文另有说明,本文对值的范围的列举仅旨在作为单独指代落在该范围内的每个单独值的简写方法,并且每个单独的值在本文中被包括在本说明书中,就好像它是背诵为。 术语“约”的使用意在表示高于或低于约±10%范围的规定值的值; 在其他实施例中,该值的范围可以是大于或小于约±5%范围内的特定值; 在其他实施例中,该值的范围可以是大于或小于约±2%范围内的指定值; 在其他实施例中,该值的范围可以是大于或小于大约±1%范围内的特定值。 前述范围旨在通过上下文阐明,并且不暗示进一步的限制。 除非本文另有说明或与上下文明显矛盾,否则本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。 本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如,“例如”)的使用仅旨在更好地描述本发明,并且除非另有声明,否则它不限制本发明的范围。 本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。 [0172] 虽然在前面的说明书中已经参考其具体实施例描述了本发明,并且出于说明的目的阐述了许多细节,但是本文阐述的具体细节允许进一步的实施例并且本文阐述的具体细节掩盖了基本原理对本领域的技术人员来说显而易见的是,可以在不偏离的情况下做出重大改变。 [0173] 本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。 在不脱离其精神或本质属性的情况下,本发明可以以其他特定形式实施,因此,应当参考所附权利要求而不是前述说明书来指示本发明的范围。