技术领域 [0001]本发明属于水产品深加工技术领域，具体涉及一种制备富含蓝蛤小分子肽的方法。 背景技术 [0002]肽是一类分子量介于50 Da-10 000 Da，结构介于氨基酸和蛋白质之间的分子聚合物，经试验证实肽类具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、降血压、降胆固醇、神经调节、免疫调节等生物活性，故称之为生物活性肽。人们通常根据肽的功能定义活性肽，如抗菌肽、免疫肽、降压肽等，也有根据肽的分子量大小定义肽，分子量<1 000 Da称为小肽或寡肽，分子量在1 000 Da-5 000 Da的叫多肽，分子量在5 000 Da- 10 000 Da 的称为大肽，分子量>10 000 Da 的一般为蛋白质。小分子肽要比母体蛋白质具有更大的活性，肽易于消化，比蛋白质更具生物可利用性，能够调节机体的生命活动，具有特殊的生理功能。 [0003]目前，肽的制备方法有酶解法、微生物发酵法、人工合成法等方法。酶解法是最为常用的一种方法。酶解法的优点包括：①制备的生物活性肽性能比较稳定，在酸性条件和较高温度时稳定性良好；②相对于化学提取法，酶解法可利用的蛋白质资源多、酶解工艺操作简单、提取周期快、酶解程度容易控制；③酶解法采用特定的蛋白酶，有目的地剪切肽段，以获得所需功能活性的生物多肽，同时多肽产量相对化学提取法也有很大的提升。酶解法的缺点主要是：在酶解法制备生物活性多肽的过程中，肽分子量的分布是不可控的，一般还有大量的高分子的肽，还需要再进一步进行生物活性多肽的分离，造成肽的浪费。酶解法制备生物活性肽的过程均会产生苦味肽，蛋白质在酶解过程中会产生一些疏水性氨基酸，这些疏水性氨基酸和舌尖上的苦味受体结合便会产生苦味。酶解蛋白苦味的普遍存在性，使生物活性肽的应用受到很大的影响。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题是提供一种制备富含蓝蛤小分子肽的方法，工艺简单，方便操作，获得的肽分子量小，且大部分肽的分子量<500 Da，并且减少了肽的苦味，改善了肽的风味。 [0005]本发明的技术方案是： [0006]一种制备富含蓝蛤小分子肽的方法，其具体步骤如下： [0007]（1）原料的选择 [0008]蓝蛤肉粉碎备用； [0009]（2）超高压处理 [0010]取粉碎的蓝蛤肉按照蓝蛤肉与水质量比1:1加入水中，调pH值为6.5-7.5，加入Novozym复合蛋白酶11039、Flavourzyme风味蛋白酶和酵母粉、乳酸菌，所述Novozym复合蛋白酶11039的添加量占蓝蛤肉重量的0.1-0.2%，Flavourzyme风味蛋白酶的添加量占蓝蛤肉重量的0.1-0.2%，酵母粉的添加量占蓝蛤肉重量的0.1-0.2%，乳酸菌的添加量占蓝蛤肉重量的0.1-0.2%，其中，Novozym复合蛋白酶11039与Flavourzyme风味蛋白酶的质量比为1:1，所述酵母粉与乳酸菌质量比为1:1，在室温下超高压压力为150 MPa-250 MPa进行超高压处理，处理时间为40 min -60 min； [0011]（3）酶解 [0012]超高压后的蓝蛤肉，在温度为45-55℃下，继续酶解3h-4h后，置于95℃-100℃沸水中灭酶10min-20min，离心（8000× g，20 min），取上清液； [0013]（4）喷雾干燥 [0014]离心后的上清液，在进风温度150-180℃、蠕动泵转500mL/h条件下，喷雾干燥，即得蓝蛤肉小分子活性肽粉。 [0015]进一步的，超高压压力为250 MPa，处理时间为60 min。 [0016]进一步的，所步骤（3）进行离心时，离心速度为8000×g，离心时间为20 min。 [0017]进一步的，所步骤（4）喷雾干燥时，进风温度150为℃-180℃、蠕动泵喷雾量为500mL/h。 [0018]进一步的，所述麦芽糊精DE值为8-10。 [0019]进一步的，喷雾干燥时，还可以添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精。 [0020]本发明具有以下有益效果： [0021]蓝蛤肉酶解前通过超高压处理，使蓝蛤蛋白产生聚集、交联和解离；超高压处理改变了蛋白的紫外吸收峰值，影响了荧光及最大发射波长（λmax），暴露大量氨基酸残基和疏水性位点。超高压能破坏蛋白质三四级结构，使蛋白质空间结构变化。当高压继续作用，破坏蛋白二级结构，导致蛋白变性，发色基团和区域发生改变，影响蛋白质结构稳定性，蛋白质微观结构受到破坏，使-C=O与水分子形成新的氢键，从而增加了蛋白水解度，促进了呈味氨基酸的释放，改善了酶解液的风味，提高了蛋白利用率。同时，超高压处理还对风味蛋白酶和复合蛋白酶有激活作用从而减少蛋白酶的使用量，增加小分子肽的含量。 [0022]超高压酶解的酶解液中游离氨基酸、琥珀酸、AMP的含量，味精当量增加。超高压耦合酶解对酶解液滋味影响显著，能提高鲜味，降低苦腥味。结合电子鼻与挥发性物质分析，超高压酶解液中主要挥发性物质种类和含量增加，不良风味物质种类和含量减少，改变了其挥发性物质的组成，从而达到增香的作用。 [0023]酶解过程中加入了酵母粉和乳酸菌，在超高压的作用下进行酶解发酵改善了肽的风味，降低了肽的苦味。 附图说明 [0024]图1是本发明实施例和对比例的蓝蛤蛋白紫外吸收光谱图； [0025]图2是本发明实施例和对比例的蓝蛤蛋白内源荧光强度图； [0026]图3是本发明实施例和对比例的蓝蛤蛋白FT-IR图； [0027]图4本发明实施例和对比例的蓝蛤蛋白电镜图。 具体实施方式 [0028]下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。 [0029]实施例1 [0030]（1）将鲜活蓝蛤静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎； [0031]（2）超高压处理 [0032]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.0，加入原料量1g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1g的酵母菌粉和1g的乳酸菌粉，在超高压压力为250 MPa，温度为25℃，处理时间为60 min； [0033]（3）酶解 [0034]超高压后的蓝蛤肉，在温度为50℃下酶解4 h后，置于95℃-100℃沸水中灭酶20min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用； [0035]（4）喷雾干燥 [0036]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度150℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0037]实施例2 [0038]（1）将鲜活的蓝蛤静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎； [0039]（2）超高压处理 [0040]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.0，加入原料量1g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1g的酵母菌粉和1g的乳酸菌粉，在超高压压力为150 MPa，温度为25℃，处理时间为60 min； [0041]（3）酶解 [0042]超高压后的原蓝蛤肉，在温度为50℃下酶解4 h后置于95-100℃沸水中灭酶20min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用； [0043]（4）喷雾干燥 [0044]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度150℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0045]实施例3 [0046]（1）将鲜活的蓝蛤肉静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎。 [0047]（2）超高压处理 [0048]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.0，加入原料量1g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1g的酵母菌粉和1g的乳酸菌粉，在超高压压力为200 MPa，温度为25℃，处理时间为60 min； [0049]（3）酶解 [0050]超高压后的原蓝蛤肉，在温度为50℃下酶解4 h后置于95-100℃沸水中灭酶20min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用。 [0051]（4）喷雾干燥 [0052]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度150℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0053]实施例4 [0054]（1）将鲜活的蓝蛤静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎。 [0055]（2）超高压处理 [0056]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.0，加入原料量1g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1g的酵母菌粉和1g的乳酸菌粉，在超高压压力为250 MPa，温度为25℃，处理时间为40 min； [0057]（3）酶解 [0058]超高压后的原蓝蛤肉，在温度为50℃下酶解4 h后置于95-100℃沸水中灭酶20min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用。 [0059]（4）喷雾干燥 [0060]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度150℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0061]实施例5 [0062]（1）将鲜活的蓝蛤肉静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎。 [0063]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.0，加入原料量1g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1g的酵母菌粉和1g的乳酸菌粉，在超高压压力为250MPa，温度为25℃，处理时间为50 min； [0064]（3）酶解 [0065]超高压后的原蓝蛤肉，在温度为50℃下酶解4 h后置于95-100℃沸水中灭酶20min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用。 [0066]（4）喷雾干燥 [0067]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度150℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0068]实施例6 [0069]（1）将鲜活蓝蛤静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎； [0070]（2）超高压处理 [0071]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为6.5，加入原料量2g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、2g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、2g的酵母菌粉和2g的乳酸菌粉，在超高压压力为250 MPa，温度为25℃，处理时间为60 min； [0072]（3）酶解 [0073]超高压后的蓝蛤肉，在温度为45℃下酶解3h后，置于95℃-100℃沸水中灭酶15min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用； [0074]（4）喷雾干燥 [0075]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度160℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0076]实施例7 [0077]（1）将鲜活蓝蛤静置于质量浓度为4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次人工海水，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎； [0078]（2）超高压处理 [0079]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.5，加入原料量1.5g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1.5g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1.5g的酵母菌粉和1.5g的乳酸菌粉，在超高压压力为250 MPa，温度为25℃，处理时间为60 min； [0080]（3）酶解 [0081]超高压后的蓝蛤肉，在温度为55℃下酶解3.5h后，置于95℃-100℃沸水中灭酶10min，离心（8000× g，20 min），取上清液备用； [0082]（4）喷雾干燥 [0083]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度180℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0084]对比例1 [0085]（1）将鲜活的蓝蛤静置于4%的人工海水（海水晶配制）中吐沙，每隔2小时换一次水溶液，至吐沙完成，捞起，沥干，在0℃下去壳取肉，打碎。 [0086]（2）酶解 [0087]取1kg粉碎的蓝蛤肉，加入1kg的水，调pH值为7.0，加入原料量1g的复合蛋白酶（Novozym® 11039，酶活1.2 AU-A/g）、1g的Flavourzyme风味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）、1g的酵母菌粉和1g的乳酸菌粉，在50℃下水浴酶解4 h，100℃灭酶20 min，冷却过滤，离心（8000×g，20 min），取上清液备用； [0088]（3）喷雾干燥 [0089]离心后的上清液，添加占蓝蛤肉质量5%的麦芽糊精（DE值8-10），在进风温度150℃、蠕动泵的喷雾量500mL/h条件下，喷雾干燥既得蓝蛤小分子活性肽粉。 [0090]表1是实施例和对比例的评分标准，由10名经过培训小组成员（5名男性，5名女性；年龄23-25岁）对不同产品品评。首先，对他们在滋味、气味、色泽三方面进行培训；其次，在25℃下，小组成员单独接受随机三位数的样本和蒸馏水，以便在样品之间漱口。一组测试结束后，小组成员休息5分钟，然后对另外样本再次进行感官品评。 [0091]表1 感官评价标准 [0092] [0093] 表2是感官评价结果，各实施例和对比例之间有差别，说明超高压耦合酶解对改善风味效果显著。 [0094]表2 感官评价结果 [0095] [0096]电子舌通过模拟人的味觉识别系统，可以在量化感官数据的基础上评价体系的一致性。因而结合感官与电子舌的分析方法，更能真实地反映蓝蛤小分子肽的滋味轮廓。表3表示实施例和对比例的电子舌鲜味值。从表中可以看出，实施例比对比例的鲜味值都要高。结果与感官评价结果一致，进一步证明超高压对改善水产品小分子肽风味有显著效果。 [0097]表3 电子舌（鲜味）结果 [0098] [0099]氨基酸可通过增强食品滋味特性刺激消费者的味觉，可间接参与食品呈味。其中，游离氨基酸（free amino acid，FAA）是一类重要的滋味成分，其呈味机理为ɑ-NH³⁺和γ-COO-两个基团之间产生静电吸引，形成五元环结构，且不同氨基酸之间以及氨基酸与肌苷酸等其他成分之间还存在协同作用。此外，Glu和Arg除了具有呈鲜味作用，还参与人体多种生理活动，并在其中发挥重要的作用。表4是实施例和对比例的游离氨基酸组成及含量。 [0100]表4 实施例和对比例游离氨基酸含量 [0101] [0102]注：ND：未检出或低于检测限；“*”：必需氨基酸；TAA:总游离氨基酸含量； EAA:必需氨基酸含量；游离氨基酸含量单位为mg/100mL；呈味阈值的单位为mg/100mL [0103]核苷酸是生物体内具有特殊生理功能的重要低分子化合物，大部分食品中都含有天然呈味核苷酸。其中，肌苷酸(Inosinemonphosphate，IMP)、腺苷酸（Adenosinemonophosphate，AMP）是对海产品鲜味贡献最大的核苷酸，其阈值分别为为25mg/100g、50mg/100g。表5是实施例和对比例核苷酸的含量及TAV 值。 [0104]表5 实施例和对比例核苷酸含量及TAV 值 [0105] [0106]味精当量(equivalent umami concentrations，EUC)代表的是鲜味强度值，即当鲜味氨基酸与核苷酸协同作用的鲜味值等同于多少含量的味精的鲜味值。为了更加全面地评价其鲜味，可采用味精当量（EUC）评价鲜味强度。表6是实施例和对比例EUC值，由表6可看出实施例的味精当量值均比对比例的高。 [0107]表6 EUC结果值 [0108] [0109]有机酸是一种重要的呈味物质，在食品中被广泛研究。其中，乳酸和琥珀酸是水产品主要呈味物质。表7是实施例和对比例有机酸含量及TAV 值，由表7可知，实施例的琥珀酸含量均比对比例的高。 [0110]表7 实施例和对比例有机酸含量及TAV值 [0111] [0112]气质联用技术已广泛应用于各领域，成为分析复杂混合物最为有效的手段之一。食品中香气是由多种呈香的挥发性物质所组成。为了探讨气体的本质，对气体的分类作了许多研究，在食品界也未形成专门的气味分类法，习惯上根据气味的生物来源和食品加工方法简单分为水果香气，蔬菜、茶叶、肉、烘烤、油炸、发酵香气等。表8是实施例和对比例的挥发性物质相对含量表及气味描述。由表8可知实施例中醇类物质种类明显增多，其含量相对对比例基本有所增加；酮类物质的种类和含量减少；酯类中乙酸丁酯呈水果香气，在实施例中均检出。综上所述，实施例改善了小分子肽的风味。 [0113]表8 挥发性成分相对含量表 [0114] [0115] [0116]注：“ND”表示未检出 [0117]生物酶解技术是通过酶的催化作用，使蛋白质分解成小分子肽及氨基酸等活性成分的过程。酶水解程度不同，还会影响肽的种类。水解程度与酶的性质有关，包括酶的活性和活性类型。超高压（Ultra High Pressure，UHP）属于一种冷处理加工技术，具有普通加工技术无法比肩的加工应用优越性。高压处理极可能改变了蛋白质的构造并暴露了新的酶切位点，对酶具有激活、抑制作用。表9是实施例和对比例中对反应体系只进行超高压处理后测定的酶活值，可知实施例中的酶活性较对比例中的增加。 [0118]表9 实施例和对比例酶活对比表 [0119] [0120]紫外吸收光谱是基于物质的生色团和助色团的特性对紫外光谱的吸收，可用于物质的鉴定和结构分析。参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸收谱带。图1表示使用实施例和对比例中的压力和时间条件处理蛋白得出的的紫外光谱图。由图可看出实施例中超高压处理后，蛋白质的微环境和结构发生了变化，可能导致蛋白质向负向移动或变性，导致蛋白的吸收低于对比例。其次，与对照组相比，在超高压处理期间，由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸被破坏，导致蛋白质空间结构变化，使其在250-280 nm处几乎没有出峰。 [0121]内源荧光分析的主要是色氨酸（Trp）残基，在295 nm处可激发色氨酸残基，从而可以排除酪氨酸残基的干扰。超高压处理会引起蛋白构象的改变，甚至引起蛋白质分子变性。在此过程中，部分氨基酸中的内源荧光生色基团的微环境和位置会发生相应的改变。因此，研究内源荧光光谱是监测超高压处理对蛋白质构象影响的有效手段。图2表示使用实施例和对比例的压力和时间等条件对蓝蛤蛋白进行处理后的荧光光谱图。有图可知，实施例中超高压导致蛋白质结构发生了不同的构象变化，增加了疏水微环境中色氨酸的残留量。同时，超高压可以改变蛋白分子空间排列，破坏疏水蛋白分子间的相互作用，导致疏水基团暴露，进而促进了蛋白质的水解。 [0122]红外光谱是分子振动的一种吸收光谱，分子中化学键具有多种振动模式，得到的光谱反映了所有二级结构总体信息。蛋白质分子中所有氨基酸残基都是红外发色团，蛋白质分子的大小对于实验测定几乎没有影响蛋白质在红外区有若干特征吸收带，其中酰胺I带(1600~1700cm^-1)对于研究其二级结构最有价值。图3是使用实施例和对比例的压力和时间等条件对蓝蛤蛋白进行处理后的的红外光谱图。从图中可以看出，在红外区出现若干个特征吸收峰，蓝蛤蛋白2918.30 cm^-1（酰胺B带）、1658.78 cm^-1（酰胺Ⅰ带，-C=O）、1539.20 cm^-1（酰胺Ⅱ带）处都有吸收峰出现。在实施例超高压处理过程中可能是因为水分子在高压的作用下，进入蛋白分子中，使大分子内部结构发生了一些列的变化，超高压处理使蛋白二级结构发生变化，进而可能影响到蛋白质的水解。 [0123]扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观形貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。图4是使用实施例压力和时间条件对蓝蛤蛋白进行处理后以及对比例未进行超高压处理的在20000倍下的电镜图。 [0124]综上所述，实施例中施加一定压力处理能促进蛋白酶的酶活，增加水解度，提高蛋白利用率，较少资源浪费。 [0125]实施例中超高压处理能改变蛋白质三四级结构，甚至二级结构也能改变。在施加高压后，三四级结构破坏，二级结构暴露，占3.6个氨基酸残基的α螺旋结构也随之改变，氨基酸残基裸露在表面，更易被解离，从而提高了蛋白的水解度，增加了酶解液中呈味物质的含量，改善了酶解液风味。 [0126]肽分子量段在5000～50之间。分子量段在1000～50之间的称为小肽、寡肽、低聚肽，也称为小分子活性多肽。生物学家将肽称为“氨基酸链”，将小分子活性多肽统称为“生物活性肽”。常见的有二肽（Dipeptide），三肽（Tripeptide），甚至多肽（Polypeptide）等。通过酸碱水解或酶解的方法生产的富含不同分子量的小分子肽和氨基酸的混合物呈味称为复合小分子肽。复合小分子肽不仅营养价值高，而且还具有广泛的生物学功能。表10为实施例和对比例肽分子量分布表，由表可看出实施例中的实施例中的小分子肽绝大部分在＜500Da的范围内。 [0127]表10 实施例和对比例肽分子量分布 [0128]