CN115943051A
审中
封闭式生物打印设备
技术领域
[0001]本发明涉及使得人工产生器官和生物组织成为可能的再生医学领域，被称为“组织工程”。在过去的十年中，对组织和器官移植的需求在世界范围内急剧增加。主要原因是平均寿命的延长、重要器官功能障碍和退行性疾病的发生率、以及对减轻肿瘤切除后果的需求。由于器官短缺，仅在欧盟，就有超过63,000名患者在等待器官移植(肾脏、肝脏、心脏、角膜等)，并且每小时有6名新患者加入等待名单。相比之下，2016年仅确定了约33,000位捐助者。尽管一些国家正在采取手段来增加器官捐赠的数量，但是许多等待移植的患者无法及时接受器官捐赠。因此，临床医生需要被良好地表征并且是安全的、是患者特定的并且可能是“现成的”组织和器官替代品。
[0002]在这方面，组织工程领域的科学家和工业家应用生物学和工程学原理来开发功能替代品，这些功能替代品可以恢复、维持或改善组织功能。
[0003]从法规的角度来看，组织工程产品属于先进治疗药品(ATMP：Advanced TherapyMedicinal Product)的类别。它们不同于常规药物，因此提出了独特的挑战。组织工程产品需要质量保证和复杂的后勤工作，并且必须由合格的外科医生移植到患者中，同时满足重要的法规要求，诸如先进治疗药品(ATMP)以及良好实验室规范(GLP：Good LaboratoryPractice)和良好生产规范(GMP：Good Manufacturing Practice)的法规。
[0004]传统地，组织工程方法依赖于生物相容性材料的使用，该材料被成型以形成3D支架，活细胞在生物反应器中成熟之前被种植在该3D支架上。然后，随着细胞的繁殖，它们会填充支架并合成细胞外基质以产生3D组织。
[0005]尽管进行了大量投资以满足临床和商业期望，并且尽管在临床前研究阶段取得了令人瞩目的科学成就，但是这些传统的组织工程方法仍难以既提供临床结果又变得具有成本效益。实际上，迄今为止，只有极少数的组织工程产品已经获得了市场许可，即使在这些情况下，治疗效果也没有达到预期，市场也没有获利。尽管有足够的安全性和有效性，但以下三个ATMP已从市场撤出这一事实说明了这一点：
(2015)、
(2016)和
(已暂停)。
[0006]为了满足临床和商业期望，组织工程产品的制造存在必须解决的几个挑战。这些挑战涉及：
[0007]-制造方法的工业化和自动化，以便提高制造方法的鲁棒性，已知ATMP的制造仍然主要是手动的、无监督的，并且包括多个开放阶段，
[0008]-遵守法规要求，
[0009]-提高利润率和成本效益，例如，通过减少供应消耗品、安装和拥有基础设施(例如无尘室)和装置的高成本，以及减少进行少量较小单个批次的各种制备、制造和质量控制操作所需的专业劳动力，
[0010]-复制天然人类组织的复杂性的能力(即，细胞的时空分布、以及控制细胞微环境并控制细胞行为和组织功能的生化、机械和物理刺激)；
[0011]-移植后需要促进快速血管形成，以便在组织生长期间维持细胞活力，以及
[0012]-在某些情况下，定制组织工程产品以提供患者特定治疗的能力(例如，通过整合自体细胞和/或患者解剖数据)。
[0013]为了克服传统组织工程方法的局限性，已经提出了不同的生物打印方法。根据公开的工作，这些打印方法被称为生物印刷、生物元件的微打印或生物打印(bioprinting)。这些打印方法使用3D打印原理，并根据由数字设计预定义的组织，逐层组装生物组织的成分(诸如，细胞和细胞外基质)。尽管原理上相似，但是应注意，生物打印与通过3D打印制造假体在沉积材料的性质(活的和非惰性的)以及所使用的技术上有所不同。
[0014]生物打印的主要用途涉及通过替换取自生命体的组织来制备用于实验研究的合成生物组织，以便避免法规和道德问题。从长远来看，生物打印将使得用于移植的器官的生产没有排斥风险，例如表皮、骨骼组织、肾脏的部位、肝脏以及其它重要器官、心脏瓣膜或中空结构(诸如血管结构)。
[0015]2014年，全球3D生物打印市场估计为4.5亿欧元，预计在未来十年内将以约16.7％的年增长率大幅增长，到2025年将达到82亿欧元。据分析人士称，由于引入了与ATMP制造兼容的生物打印机，预计生物打印市场的医学领域在2022年将占据超过30.0％的市场份额。
背景技术
[0016]在现有技术中已知专利申请US2017335271，其描述了一种便携式设备，该便携式设备包括用于分配结构材料的第一元件和用于分配生物材料的第二一次性元件。
[0017]输送系统还包括可灭菌外壳、至少一个机械臂组件和在可灭菌腔室内的输送设备。机械臂被配置成使包括第一输送构件和第二输送构件的输送设备移动，第一输送构件能够可移除地连接至第二输送构件。
[0018]与本发明不同，该专利的图10和图11主要涉及井板的处理，其中，打印头和激活模块都容纳在无菌外壳中。
[0019]该解决方案不允许在最佳无菌条件下通过生物组织的增材打印来进行制造。
[0020]还已知美国专利申请US2010206224，其涉及用于沉积多个层的设备，该设备包括：
[0021]-框架，该框架装配有外壳并且还承载：
[0022]·工作台，该工作台旨在支撑要制造的对象；
[0023]·材料分配器，该材料分配器旨在将所述材料放置在工作台上以形成所述对象，
[0024]·压实装置；
[0025]以及控制构件，该控制构件旨在控制材料在工作台上的沉积。
[0026]在外壳内部至少布置有所述板和所述喷嘴的端部，并且在外壳外部至少布置有用于移动工作台和分配器的装置以及控制装置。
[0027]该文献不涉及用于生物打印生物组织的系统。
[0028]专利申请US2018290386描述了现有技术的方法，其具有用于通过3D打印机产生药品的步骤。根据指令来打印产品。测量产品的至少一种属性，并将其与期望的最终产品的期望属性进行比较。如果产品属性与期望属性之间存在差异，则对指令集进行更改并打印新产品。当产品属性与期望属性匹配时，就可以产生安全且准确的医疗产品。
[0029]它不是用于制造生物组织的解决方案。
[0030]专利申请US2017320263描述了一种用于打印至少一种生物墨水的方法，所述方法使用至少一个激光型打印头将至少一种生物墨水的至少一滴沉积在受体基底的沉积表面上，其特征在于，所述打印方法使用至少一个喷嘴打印头来在与激光型打印头相同的受体基底的沉积表面上沉积至少一种生物墨水的至少一滴。毫无疑问，这是最接近的现有技术，但是对于操作员来说需要非常严格的洁净室类型的环境。
[0031]专利申请US2016297152涉及一种旨在容纳一种或更多种生物活性流体和/或一种或更多种制备性流体的可灭菌容器，该可灭菌容器包括：
[0032]-容器内部的一个区域，该区域被配置成容纳至少一个可灭菌3D打印机组件；
[0033]-可灭菌3D打印机组件，该可灭菌3D打印机组件包括：
[0034]·至少一个打印平台；
[0035]·至少一个打印头，该至少一个打印头在打印平台上分配结构材料，以便在其上形成三维结构；以及
[0036]·移动机构，该移动机构允许在打印头与打印平台之间的相对位移，所述区域被配置成使得流体可以到达打印机组件。
[0037]现有技术的缺点
[0038]由国际申请US2017320263提出的解决方案的缺点涉及在无菌状态下包含生物打印设备所需的大量空气的处理，这意味着高气流速率以产生超压，并且在生物打印领域具有湍流的高风险，无论使用哪种生物打印技术，这都特别不利于打印件的再现性。
[0039]另外，这样的流速需要强大的风扇，该风扇是振动和噪声污染的源，并且需要开发一种过滤器以允许大气流通过，同时保留所有粒子。
[0040]此外，机械设备在无菌腔室中的存在导致微粒的产生，这些微粒通过气流传送到生物打印空间中，这违背了预期目的。因此，在现有技术中引用的两个示例中，可以强调打印装置被直接集成到可灭菌区域中。现在，这些要素是导致密闭空间中的颗粒污染的主要因素。
[0041]最后，当改变生物打印顺序时，样品之间污染或交叉污染的风险很高，这是因为不同的样品在同一腔室中彼此跟随，并且在灭菌阶段之外互换。
发明内容
[0042]为了弥补这些缺点，本发明涉及通过使用以下三个不同模块进行生物打印来制造生物组织的方法和单元：
[0043]·集成有打印头的打印模块，该打印模块必须被放置在可灭菌外壳内；
[0044]·激活模块(激光器、换能器等)，该激活模块经由打印头将生物对象转移到目标，该激活模块必须被放置在可灭菌外壳外部；
[0045]·用于使打印头相对于目标移动的模块，该模块被定位在可灭菌外壳内部或外部。
[0046]外壳包括与激活模块的交互区。
[0047]本发明特别涉及通过将包括活细胞以及使得可以重构活生物组织的其它成分的要素统一沉积在目标上来增材打印生物组织的方法和单元。
[0048]从最一般的意义上讲，涉及一种根据权利要求1所述的生物打印系统并且可选地包括从属权利要求的技术特征，其被单独地或按以下描述的其它特征的技术上可行的组合来考虑的。
[0049]本发明的目的是将生物学关注对象从源转移到目标，所述生物学关注对象包括活细胞(例如，多能干细胞或任何其它分化的细胞)(有时是不同类型的)以及诸如胶原蛋白和更一般地细胞外基质材料的生物产品。
[0050]生物学关注对象可以在流体中聚集在一起，以形成包含生物粒子(诸如，活细胞)的“生物墨水”。然后，制备这些生物墨水并以无菌形式封装，以便可以在需要时用于打印生物组织。
[0051]在本专利的含义内，“生物打印”通过执行计算机辅助几何构造的方法来表示活细胞和其它生物产品的空间结构，特别是由生物学关注对象的个体沉积物形成的层叠，以开发用于组织工程、再生医学、药代动力学以及更广泛地用于生物学研究的活组织和器官。生物打印涉及活细胞和生物材料的逐层同时沉积，以制造诸如皮肤、心脏瓣膜、软骨、心脏组织、肾脏、肝脏等人造结构的活组织以及其它重要器官或中空结构(诸如，膀胱以及血管结构)。
[0052]本发明还涉及用于如上所述的生物打印系统的盒，其特征在于，所述盒包括构成打印模块的所述封套的可灭菌密封外壳。
[0053]本发明还涉一种生物打印方法，该生物打印方法用于从至少部分包含生物粒子(细胞和细胞衍生物)的材料制造结构化生物材料，该生物打印方法包括经由机器人控制至少一个目标在面向至少一个打印头的三个维度上的移动，所述至少一个打印头被放置在密封且无菌的外壳中，所述打印头是从所述外壳外部供应和控制的，以便保证生产的组织在临床领域的法规要求方面的安全性。
[0054]本发明的非限制性示例的具体实施方式
[0055]通过参考附图阅读以下对本发明的非限制性示例的详细描述，将更好地理解本发明，其中：
[0056]-图1示出了根据本发明的生物打印机的第一变型的示意图；
[0057]-图2示出了根据本发明的生物打印机的第二变型的示意图；
[0058]-图3示出了根据本发明的生物打印机的第三变型的示意图；
[0059]-图4示出了根据本发明的生物打印机的第四变型的示意图；
[0060]-图5示出了根据本发明的生物打印机的第五变型的示意图；
[0061]-图6示出了本发明的实施方式的立体主视图；
[0062]-图7示出了本发明的实施方式的立体侧视图；
[0063]-图8示出了刚性盒形式的另选实施方式的示意图；
[0064]-图9示出了柔性盒形式的另选实施方式的示意图；
[0065]-图10示出了根据本发明的具有无菌手套箱的单元的视图；
[0066]-图11示出了根据本发明的具有无菌手套箱的单元的视图；
[0067]-图12示出了根据本发明的包括具有由beta型容器固定的联锁装置的alpha转移系统的单元的视图。
[0068]生物打印机的示意描述
[0069]图1至图5示出了根据本发明的生物打印机的硬件架构的变型实施方式的视图。该生物打印机由几个基本构件组成：
[0070]·增材打印头(1)，该增材打印头的配置取决于所使用的技术，包括由生物学关注对象和目标(6)组成的生物墨水转移区域；
[0071]·一个或更多个源(2)，该一个或更多个源向增材打印头(1)供给包含生物学关注对象的生物墨水；
[0072]·机电组件(3)，该机电组件确保转移区域相对于目标(6)的相对位移；
[0073]·可选地，成熟区域(4)；
[0074]·打印激活装置(5)，该打印激活装置的配置取决于所使用的技术。
[0075]术语“生物打印头”是指由支撑件形成的生物打印系统的部分，但不包括激活装置，所述支撑件容纳生物墨水(bio-still)或更一般地要转移至目标的生物学关注对象并且使生物学关注对象的出口区域朝向目标，例如：
[0076]-对于激光生物打印，生物打印头不包括用于脉冲激光生物打印的激光和光学部件；
[0077]-对于喷墨或微阀生物打印，生物打印头不包括使致动器(阀/压电元件(piezo))被激活的发电装置；
[0078]-对于微挤出生物打印，生物打印头不包括注射泵。
[0079]通常，在生物打印装置中可以分成两个部分：
[0080]-在本专利的意义内由“打印头(1)”指定的部分，该部分包括设备的终端部分，其容纳生物墨水和/或要转移的生物学关注对象以及用于转移激活构件的接口；
[0081]-在本专利的意义内由“激活装置(5)”指定的部分，该部分在物理上与打印头(1)可分离，并且与生物打印头(1)机械地、电气地、声学地或光学地联接，包括可以控制存在于生物打印头中的生物学关注对象到目标的物理转移的所有装置。
[0082]本发明旨在优化无菌区域，并且为此目的：
[0083]a)打印头(1)必须被放置在可灭菌外壳(10)中，
[0084]b)打印装置(5)必须被放置在可灭菌外壳(10)外部，
[0085]c)密封交互区(20)允许打印装置(5)激活打印头(1)。
[0086]生物打印机的其它部件可以被放置在可灭菌外壳(10)中或在该外壳(10)外部。
[0087]特别是，供料源(2)可以与可灭菌外壳(10)中的打印头(1)关联，然后形成可以被引入生物打印机中的盒，然后取出该盒以进行打印组织的成熟。
[0088]在有或没有供料源(2)的情况下，用于使目标(6)相对于源移动的机电一体化组件(3)也可以与可灭菌外壳(10)内部的打印头(1)关联。
[0089]在有或没有供料源(2)和/或机电一体化移动组件(3)的情况下，成熟腔室(4)也可以与外壳(10)内部的打印头(1)关联。
[0090]另选实施方式
[0091]本发明可以以不同的方式实现。
[0092]图1示出了通用视图，其中，可灭菌外壳(10)包括：
[0093]-根据要求，打印头(1)以及可选地成熟外壳(4)，在打印头(1)以及可选地成熟外壳(4)中放置有容纳转移的生物学关注对象的目标；
[0094]-可选地，供料源(2)，例如生物墨水储存器和供料系统，根据本发明，供料源还可以被布置在非无菌区域中，并且具有用于将生物学关注对象无菌地转移到可灭菌外壳(10)中的连接器。
[0095]-可选地，用于利用无菌机械连接器移动打印头(1)的移动装置(3)，根据本发明，该移动装置还可以被放置在非无菌区域中。
[0096]激活装置(5)(例如，激光器和相关联的光学部件)被放置在该可灭菌外壳(10)的下方，透明窗口(20)形成允许光束经过的接口。激活装置(5)不被放置在无菌区域中。
[0097]图2示出了一种变型，其中，除激活装置(5)之外的所有构成组件都被放置在可灭菌外壳(10)中。
[0098]图3示出了一种变型，其中，除激活装置(5)和用于移动打印头(1)的移动装置(3)之外的所有构成组件都被放置在可灭菌外壳(10)中。打印头(3)与移动装置(3)之间的联接例如通过磁传输或穿过可灭菌外壳(10)的壁的无菌铰接来实现。
[0099]图4示出了一个变型，其中，仅打印头(1)和成熟区域(4)被放置在可灭菌外壳(10)中。所有其它部件(特别是激活装置(5)和移动装置(3)以及供料源(2))位于可灭菌外壳外部。
[0100]图4示出了一个变型，其中，仅打印头(1)和成熟区域(4)连同移动装置(3)被放置在可灭菌外壳(10)中。所有其它构成组件(特别是激活装置(5)以及供料源(2))位于可灭菌外壳外部。
[0101]图5示出了一个变型，其中，打印头(1)、成熟区域(4)和确保打印头(1)相对于目标的相对位移的机械臂(3)被放置在可灭菌外壳中(10)。仅激活装置(5)和供料源(2)位于可灭菌外壳外部。
[0102]一个实施方式的描述
[0103]生物打印机包括基座，该基座的不可灭菌的下部部分(11)包括激活装置(5)，例如光学头、激光器和激光打印机的成像系统。
[0104]该框架的顶部是可灭菌外壳(10)，该可灭菌外壳包括由鼓风机(15)经由滤芯(16)提供的正压腔室。被放置在该可灭菌外壳(10)中的机械臂(3)确保目标(6)相对于打印头(1)的移动。密封窗口(20)允许激光束和成像束在可灭菌外壳(10)与放置在非可灭菌区域中的打印装置(5)之间传输。
[0105]外壳(10)由玻璃壁(22)密封，该玻璃壁由用于无菌操作手套的接口(21)穿过。
[0106]外壳具有由alpha部件(24)密封的转移系统(23)，由于密封和无风险的连接，该转移系统可以将材料(例如，生物墨水盒)从一个无菌区域移动到另一个无菌区域，穿过非无菌区域。
[0107]这样的系统使得可以满足欧盟委员会在开发“质量程序”的框架内建立的与良好生产规范(GMP)有关的要求，其目的是限制两类风险：
[0108]·产品交叉污染(被另一产品、或内部和外部污染物污染)的风险；
[0109]·混淆的风险，特别是在部件的标签和标识方面。
[0110]他们强调必须在所有级别实现的卫生和组织惯例。
[0111]实现“手套箱”或密封舱口的变型
[0112]根据未示出的变型，可灭菌外壳(10)具有用于密封设备的控制机构，使得可以在该外壳内部在无菌或无尘空气中执行这些任务，以手动处理对象或产品。外壳(10)的壁例如具有凸缘，该凸缘的外周装配有旨在与手套箱的凸缘的压痕配合的耳部。
[0113]外壳(10)的凸缘被插入手套箱的凸缘中。
[0114]可灭菌外壳(10)还可以包括安装在凸缘中的舱口，用于与另一可灭菌外壳连通，例如在打印后进行成熟。
[0115]使用盒的变型
[0116]根据本发明的一种变型，封闭的生物打印系统基于包括目标(6)和打印头的可灭菌盒。该可灭菌盒包括无菌/密封接口(双密封转移门、beta袋、光学窗口、注射器等)，从而允许该可灭菌盒连接至可转移以用于打印的生物学关注对象的至少一个供料源，连接至一个或更多个激活装置，连接至用于使目标(6)相对于打印头和成熟所需的要素(培养基、CO2、O2等)移位的机械联接装置。盒可以用于进行成熟。它可以在打印系统与培养箱之间运输。
[0117]用于打印方法的可转移生物学关注对象的供料源可以连接至由专用储存器构成的细胞培养自动机。
[0118]该解决方案允许根据符合良好生产规范(GMP)的方法在密闭外壳中进行生物制造，从而避免生物污染的风险。
[0119]盒被联接至用于表征组织或器官的装置(在制造期间或在其制造之后对组织进行在线表征(成像、拉曼光谱、OCT、理化分析))。
[0120]盒可以提供单个窗口、多个窗口、两侧(前面和后面)的窗口等。
[0121]对于成熟阶段(生物反应器)，该系统可选地包括用于控制和调节以下要素的装置：
[0122]-pH(pH检测范围为0-14，通过NaOH/CO2调节的精度为0.01)；
[0123]-温度(利用珀耳帖(Peltier)、双封套、低温恒温器进行控制)；
[0124]-溶解的O2(例如，通过气体流量测量)；
[0125]-湿度；
[0126]-用于移除或改变培养基的方式；
[0127]-搅拌和注入方式；
[0128]-等。
[0129]盒可选地包括要打印的组织的标识符以及与数据库(所连接的盒)链接的相关的打印参数(序列、源、CAD模型等)。标识符可以是图形类型(例如，条形码或QRcode矩阵代码)或数字类型，例如以记录在RFT类型的射频标签的存储器中的数字序列的形式。这样的解决方案使得可以确保打印过程。盒可选地配备有以太网端口类型的网络接口卡，以控制制造和数据获取方法，管理警报，将实验保存在本地硬盘上，通过SMS，电子邮件实时通知用户等。
[0130]具有手套箱的单元
[0131]图10和图11示出了具有手套箱(25)的单元的示例。
[0132]在配备有密封舱口(21)的手套箱的背景下实现打印方法可以采用以下形式：
[0133]·激光打印：激光打印模块(1)包括至少一个激光头和目标(6)。激光头包括透明的平坦表面(也称为供体)，墨水膜被沉积在该透明的平坦表面上。所述头的供墨源(2)由由于使用SAS而被放置在无菌外壳中的储存器(借助密封手套或借助与移液器相关的机器人将墨水手动散布在供体的表面上)或由位于外壳外部的储存器和泵(在压力或流量下工作)(通过流体方式自动散布墨水)构成。用于激活将墨水转移到目标(6)的激活装置(5)包括位于外壳外部的激光器。密封交互装置(20)在这种情况下是对激光的波长透明的密封光学窗口。用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括6-轴机械臂。
[0134]·微阀打印：微阀打印模块(1)包括目标和配备有针的一个或更多个阀，这些阀可以具有不同的形状、长度和开口直径(6)。用于所述阀的供墨源(2)包括位于外壳外部的储存器和增压泵。用于激活将墨水转移到目标(6)的激活装置(5)包括压电类型的闸门或螺线管。在这种情况下，密封交互装置(20)可以是连接器、可穿孔的盖(隔膜)或气密密封件。用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括6-轴机械臂。
[0135]·挤出打印：挤出打印模块(1)包括目标和配备有针的最终储存器，该最终储存器可以具有不同的形状、长度和开口直径(6)。用于所述挤出机的供墨源(2)包括位于外壳外部的初始储存器和加压泵。用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)包括加压系统。在这种情况下，密封交互装置(20)可以是连接器、可穿孔的盖(隔膜)或气密密封件。用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括6-轴机械臂。
[0136]通过这种配置，可以实现满足GMP制造要求的组织制造。因此，可以为患者安全地生产临床批次。通过例示的方式，可以提及用于再生医学应用的自体或同种异体皮肤替代品的制造的示例。因此，在此提到的不同方式进而可以制造：
[0137]·真皮，真皮由交替的生物材料层(胶原型)和细胞层(成纤维细胞型)组成，生物材料层通过微阀或挤出来打印，细胞层通过激光来打印。细胞图案的精确度使得可以确保成熟后的真皮的结构和功能接近天然皮肤。
[0138]·表皮，表皮由激光打印的细胞(角质形成细胞型)的汇合层组成。
[0139]根据所述培养箱的布置，在无菌外壳内部或外部的培养箱中进行该真皮的成熟。在此步骤结束时，皮肤已经成熟并且可以植入患者体内。
[0140]制造生物组织的应用
[0141]盒的配置特别适于制造例如用于制造自体组织的一种或更多种组织或生物器官。
[0142]出于成熟度的差异、打印模块与单个细胞类型的兼容性等原因，组织或器官可以基于多个盒的使用。
[0143]盒的另一优点在于，它可以在最后的灭菌步骤之后被引入手术室，并且尽可能地靠近患者被打开。
[0144]可以将基质封装在模块中，该模块可以从盒中取出，以便被放置在专用的生物反应器中。
[0145]盒可以是全部或部分一次性的。
[0146]在内部和外部灭菌后，盒可以重复使用。
[0147]盒的封套可以是刚性的或柔性的(乙烯乙酸乙烯酯、PVC、输液材料的PU型热塑性塑料、低密度聚乙烯、硅树脂、金属(不锈钢304L、316L)或塑料(例如聚碳酸酯))类型。
[0148]刚性盒
[0149]图4示出了刚性盒形式的本发明的实施方式。其使得可以使用包括复杂且昂贵的部件的主要设备项，即，具有一个或更多个打印头的激活装置(例如，激光器)、使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)以及所有IT和光学装置。
[0150]盒包括可灭菌密封外壳(10)，该可灭菌密封外壳被配置成允许其被定位在该设备项上以进行特定操作。
[0151]盒在密封且可灭菌外壳(10)中包含特定装置，即：
[0152]-打印模块(100)，该打印模块包括目标(6)(110)，构成要制造的组织的生物学关注对象被沉积在该目标上；
[0153]-连接杆(131、132、133)，该连接杆确保与相对移位装置的联接并且由气密密封件(134、135、136)穿过外壳(10)。这些连接杆(131、132、133)旨在沿着三个轴X、Y、Z传递目标(6)的相对位移构件相对于源的移动；
[0154]-打印模块(1)，打印模块由承载可转移生物学关注对象的流体流支撑件构成，该支撑件具有供料管(141)和出口管(142)，并连接到外壳(10)外部的储存器(143、144)。
[0155]所述激活装置(5)位于所述可灭菌密封外壳(10)外部，并经由窗口(140)与打印模块(1)相互作用。
[0156]盒与固定设备项之间的联接通过窗口(140)周围的磁体来确保。
[0157]该盒可以通过将组织定位在主设备项上来准备组织，然后确保生物打印组织在另一位置(例如，在成熟外壳中)成熟。
[0158]柔性盒
[0159]图5示出了柔性盒形式的本发明的实施方式。柔性盒与刚性盒的不同之处在于，可灭菌外壳具有柔性壁(200)，该柔性壁将刚性上表面(210)和呈现窗口(140)的刚性下表面(220)连接起来。
[0160]上表面具有位于可灭菌外壳内部的两个插脚(211、212)，以接收目标(6)，从包含可转移的生物学关注对象(148)的生物墨水转移的生物要素被沉积在目标上。
[0161]另选实施方式
[0162]无论使用哪种生物打印技术，传统地，生物打印机都由以下几个基本构件组成：
[0163]-一个或更多个打印头，该一个或更多个打印头包括由生物学关注对象组成的生物墨水转移区域，
[0164]-一个或更多个供料源(2)，该一个或更多个供料源向打印头(1)供给包含生物学关注对象的生物墨水；
[0165]-目标(6)；
[0166]-机电组件(3)，该机电组件确保转移区域相对于目标(6)的相对位移；
[0167]-激活装置(5)；
[0168]-可选地，成熟区域(4)；
[0169]根据第一变型，生物墨水被储存在一个储存器中并通过喷嘴或毛细管形成液滴，这些液滴被转移到目标(6)。
[0170]第一个所谓的喷嘴打印变型包括生物挤出、喷射打印或微阀打印。为了尤其能够时限更高水平的分辨率并提高所打印细胞的活力，已经开发了一种用于在没有喷嘴的情况下打印生物要素的方法。这种称为激光生物打印的打印方法也被称为“激光辅助生物打印”(LAB)。
[0171]关于生物挤出，已经实现了激活打印的多种装置：蜗杆、活塞或甚至是气动系统。它使处理每毫升1亿个细胞数量级的高细胞密度和毫米数量级的分辨率成为可能。生物挤出包括通过直径为几百微米的喷嘴或针机械地推动置于微注射器中的生物要素。该技术的优点在于其成本低和易于实现。然而，它受到与粗分辨率和与在细胞通过喷嘴期间施加在细胞上的剪切力相关的不可忽略的细胞死亡率有关的限制。
[0172]关于喷射生物打印，其包括将包含细胞或生物材料的液体的微滴投射到基底上。该投射是由热或压电方法引起的。热喷射打印通过电阻的瞬态激活(具有很强的热效应)来工作，该电阻的瞬态激活会产生蒸汽泡，蒸汽泡推动液滴通过直径为30μm至200μm的孔。压电喷射打印机使用电脉冲，该电脉冲生成使墨水容器收缩的压电晶体的形状变化。晶体的松弛导致液滴的喷射。无论是在准备时间还是在打印速度方面，该技术都具有快速的优点。然而，该技术的主要缺点在于在打印期间细胞浓度不能超过(小于)500万个细胞/mL以防止打印头堵塞、以及由于通过孔时在细胞上的剪切应力导致的细胞死亡。无论是通过压电技术还是热技术，喷射打印都可以提供约10μm的更好分辨率。
[0173]关于通过微阀进行打印，打印的激活装置是通过压缩空气对液体进行加压。通过致动电磁阀来释放要打印的液体。微阀生物打印类似于喷射技术，但不同之处在于，喷射是通过对墨水加压然后快速打开电磁阀来形成的。与喷射生物打印具有相同的约束条件，该技术的优点是能够打印比喷射系统更粘稠的溶液。通常，压力是从几百毫巴到几巴，并且使得可以获得每毫升几百万个细胞数量级的更低的细胞密度和几十微米数量级的分辨率。
[0174]激光生物打印可以以10μm的分辨率打印具有每毫升1亿个细胞的数量级的高细胞密度的墨水。一种用于借助激光打印生物要素的设备，该技术基于被称为“激光诱导前向转移”(LIFT)的技术，该设备包括：脉冲激光源，该脉冲激光源发射激光束；用于聚焦和定向激光束的系统；供体介质，该供体介质包括至少一种生物墨水；以及受体基底，该受体基底被定位成接收从供体介质发射的液滴。根据这种打印技术，激光束被脉冲化并且在每个脉冲时生成液滴。生物墨水包括基质，例如水性介质，其中，存在要沉积在受体基质上的要素，例如细胞。供体介质包括对激光束的波长透明的载玻片(slide)，并且根据生物墨水以膜的形式附着至其上的配置，载玻片可以涂覆有吸收层(金属、聚合物等)或不涂覆吸收层(“无牺牲层的LIFT”)。
[0175]其它的光学/激光方法可以与使用检流镜的激光扫描相结合实现为激光生物打印的替代或补充(供体表面的成像/点射系统(point-and-shoot system)/光聚合、纹理化、空化、切割等)，以在受体基底上产生图案。
[0176]无论使用哪种技术，通过生物打印制造生物组织都可以分成五个阶段：
[0177]-数字模型的计算机辅助设计(CAD)的预处理，其将定义生物组织的架构，即，组织的所有组成部分在空间(x，y，z)中的位置；
[0178]-对生物墨水(包含细胞和/或生物材料)的打印参数进行编程，从而定义打印机的物理参数和打印头的轨迹；
[0179]-制备和配制由可转移生物学关注对象组成的生物墨水；
[0180]-使用利用各种技术的生物打印机自动进行生物墨水的逐层打印；
[0181]-进行在生物反应器中进行的打印组织的成熟，以使细胞自我组织，直到出现所需的特定生物学功能为止。
[0182]在该序列的上游，可以例如使用显微镜、组织学或医学成像进行断层图像重建；在该序列的下游，生物打印的生物组织在被发送给用户之前先被调节。
[0183]上述制造序列的最后三个步骤以及封装步骤必须在完全无菌的环境中进行，该环境应不含任何可能污染生物打印的组织的粒子，这些粒子可能会改变生物打印的组织在成熟期间的生长及其功能和/或在组织植入后感染患者。
[0184]由于这个原因，这些步骤在提供受控的无菌空气和有利于组织发育的环境的外壳中执行。
[0185]激光打印
[0186]打印组件(1)包括一个或更多个激光头和目标(6)。
[0187]激光头包括透明平坦表面，墨膜借助手套箱手动地或通过机器人或通过与供料源(2)链接的流体装置沉积在该透明平坦表面上。
[0188]用于所述头的供料源(2)包括储存器和加压泵或流量泵。
[0189]用于激活将所述生物对象转移到目标(6)的激活装置(5)包括位于外壳外部的激光器。
[0190]密封交互装置(20)在这种情况下是对激光的波长透明的密封光学窗口。
[0191]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0192]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0193]阀打印
[0194]打印组件(1)包括一个或更多个阀和目标(6)。
[0195]用于所述阀的供料源(2)包括储存器和增压泵。
[0196]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)包括压电类型的闸门或螺线管。
[0197]在这种情况下密封交互装置(20)是可穿孔的盖或气密密封件。
[0198]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0199]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0200]挤出打印
[0201]打印组件(1)包括一个或更多个挤出喷嘴和目标(6)。
[0202]用于所述喷嘴的供料源(2)包括储存器和加压泵。
[0203]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)是用于向喷嘴供料的控制装置，例如借助蜗杆或活塞的机械控制装置或直接气动控制装置。
[0204]在这种情况下，密封交互装置(20)是可穿孔的盖或气密密封件。
[0205]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0206]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0207]喷射打印
[0208]打印组件(1)包括一个或更多个喷射打印头和目标(6)。
[0209]所述喷射打印头的供料源(2)包括储存器和供料泵。
[0210]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)是压电、声学、热、激光等控制装置。
[0211]在这种情况下，密封交互装置(20)是可穿孔的盖或气密密封件。
[0212]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0213]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0214]声波打印
[0215]打印组件(1)包括一个或更多个声波打印头和目标(6)。
[0216]所述声波打印头的供料源(2)包括储存器和供料泵。
[0217]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)是换能器、激光器等。
[0218]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0219]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0220]当然，这些变型实施方式不是限制性的，本发明扩展到用于以受控方式向目标(6)沉积生物要素以制造生物组织的任何技术。
(2015)、(2016)和(已暂停)。
[0006]为了满足临床和商业期望，组织工程产品的制造存在必须解决的几个挑战。这些挑战涉及：
[0007]-制造方法的工业化和自动化，以便提高制造方法的鲁棒性，已知ATMP的制造仍然主要是手动的、无监督的，并且包括多个开放阶段，
[0008]-遵守法规要求，
[0009]-提高利润率和成本效益，例如，通过减少供应消耗品、安装和拥有基础设施(例如无尘室)和装置的高成本，以及减少进行少量较小单个批次的各种制备、制造和质量控制操作所需的专业劳动力，
[0010]-复制天然人类组织的复杂性的能力(即，细胞的时空分布、以及控制细胞微环境并控制细胞行为和组织功能的生化、机械和物理刺激)；
[0011]-移植后需要促进快速血管形成，以便在组织生长期间维持细胞活力，以及
[0012]-在某些情况下，定制组织工程产品以提供患者特定治疗的能力(例如，通过整合自体细胞和/或患者解剖数据)。
[0013]为了克服传统组织工程方法的局限性，已经提出了不同的生物打印方法。根据公开的工作，这些打印方法被称为生物印刷、生物元件的微打印或生物打印(bioprinting)。这些打印方法使用3D打印原理，并根据由数字设计预定义的组织，逐层组装生物组织的成分(诸如，细胞和细胞外基质)。尽管原理上相似，但是应注意，生物打印与通过3D打印制造假体在沉积材料的性质(活的和非惰性的)以及所使用的技术上有所不同。
[0014]生物打印的主要用途涉及通过替换取自生命体的组织来制备用于实验研究的合成生物组织，以便避免法规和道德问题。从长远来看，生物打印将使得用于移植的器官的生产没有排斥风险，例如表皮、骨骼组织、肾脏的部位、肝脏以及其它重要器官、心脏瓣膜或中空结构(诸如血管结构)。
[0015]2014年，全球3D生物打印市场估计为4.5亿欧元，预计在未来十年内将以约16.7％的年增长率大幅增长，到2025年将达到82亿欧元。据分析人士称，由于引入了与ATMP制造兼容的生物打印机，预计生物打印市场的医学领域在2022年将占据超过30.0％的市场份额。
背景技术
[0016]在现有技术中已知专利申请US2017335271，其描述了一种便携式设备，该便携式设备包括用于分配结构材料的第一元件和用于分配生物材料的第二一次性元件。
[0017]输送系统还包括可灭菌外壳、至少一个机械臂组件和在可灭菌腔室内的输送设备。机械臂被配置成使包括第一输送构件和第二输送构件的输送设备移动，第一输送构件能够可移除地连接至第二输送构件。
[0018]与本发明不同，该专利的图10和图11主要涉及井板的处理，其中，打印头和激活模块都容纳在无菌外壳中。
[0019]该解决方案不允许在最佳无菌条件下通过生物组织的增材打印来进行制造。
[0020]还已知美国专利申请US2010206224，其涉及用于沉积多个层的设备，该设备包括：
[0021]-框架，该框架装配有外壳并且还承载：
[0022]·工作台，该工作台旨在支撑要制造的对象；
[0023]·材料分配器，该材料分配器旨在将所述材料放置在工作台上以形成所述对象，
[0024]·压实装置；
[0025]以及控制构件，该控制构件旨在控制材料在工作台上的沉积。
[0026]在外壳内部至少布置有所述板和所述喷嘴的端部，并且在外壳外部至少布置有用于移动工作台和分配器的装置以及控制装置。
[0027]该文献不涉及用于生物打印生物组织的系统。
[0028]专利申请US2018290386描述了现有技术的方法，其具有用于通过3D打印机产生药品的步骤。根据指令来打印产品。测量产品的至少一种属性，并将其与期望的最终产品的期望属性进行比较。如果产品属性与期望属性之间存在差异，则对指令集进行更改并打印新产品。当产品属性与期望属性匹配时，就可以产生安全且准确的医疗产品。
[0029]它不是用于制造生物组织的解决方案。
[0030]专利申请US2017320263描述了一种用于打印至少一种生物墨水的方法，所述方法使用至少一个激光型打印头将至少一种生物墨水的至少一滴沉积在受体基底的沉积表面上，其特征在于，所述打印方法使用至少一个喷嘴打印头来在与激光型打印头相同的受体基底的沉积表面上沉积至少一种生物墨水的至少一滴。毫无疑问，这是最接近的现有技术，但是对于操作员来说需要非常严格的洁净室类型的环境。
[0031]专利申请US2016297152涉及一种旨在容纳一种或更多种生物活性流体和/或一种或更多种制备性流体的可灭菌容器，该可灭菌容器包括：
[0032]-容器内部的一个区域，该区域被配置成容纳至少一个可灭菌3D打印机组件；
[0033]-可灭菌3D打印机组件，该可灭菌3D打印机组件包括：
[0034]·至少一个打印平台；
[0035]·至少一个打印头，该至少一个打印头在打印平台上分配结构材料，以便在其上形成三维结构；以及
[0036]·移动机构，该移动机构允许在打印头与打印平台之间的相对位移，所述区域被配置成使得流体可以到达打印机组件。
[0037]现有技术的缺点
[0038]由国际申请US2017320263提出的解决方案的缺点涉及在无菌状态下包含生物打印设备所需的大量空气的处理，这意味着高气流速率以产生超压，并且在生物打印领域具有湍流的高风险，无论使用哪种生物打印技术，这都特别不利于打印件的再现性。
[0039]另外，这样的流速需要强大的风扇，该风扇是振动和噪声污染的源，并且需要开发一种过滤器以允许大气流通过，同时保留所有粒子。
[0040]此外，机械设备在无菌腔室中的存在导致微粒的产生，这些微粒通过气流传送到生物打印空间中，这违背了预期目的。因此，在现有技术中引用的两个示例中，可以强调打印装置被直接集成到可灭菌区域中。现在，这些要素是导致密闭空间中的颗粒污染的主要因素。
[0041]最后，当改变生物打印顺序时，样品之间污染或交叉污染的风险很高，这是因为不同的样品在同一腔室中彼此跟随，并且在灭菌阶段之外互换。
发明内容
[0042]为了弥补这些缺点，本发明涉及通过使用以下三个不同模块进行生物打印来制造生物组织的方法和单元：
[0043]·集成有打印头的打印模块，该打印模块必须被放置在可灭菌外壳内；
[0044]·激活模块(激光器、换能器等)，该激活模块经由打印头将生物对象转移到目标，该激活模块必须被放置在可灭菌外壳外部；
[0045]·用于使打印头相对于目标移动的模块，该模块被定位在可灭菌外壳内部或外部。
[0046]外壳包括与激活模块的交互区。
[0047]本发明特别涉及通过将包括活细胞以及使得可以重构活生物组织的其它成分的要素统一沉积在目标上来增材打印生物组织的方法和单元。
[0048]从最一般的意义上讲，涉及一种根据权利要求1所述的生物打印系统并且可选地包括从属权利要求的技术特征，其被单独地或按以下描述的其它特征的技术上可行的组合来考虑的。
[0049]本发明的目的是将生物学关注对象从源转移到目标，所述生物学关注对象包括活细胞(例如，多能干细胞或任何其它分化的细胞)(有时是不同类型的)以及诸如胶原蛋白和更一般地细胞外基质材料的生物产品。
[0050]生物学关注对象可以在流体中聚集在一起，以形成包含生物粒子(诸如，活细胞)的“生物墨水”。然后，制备这些生物墨水并以无菌形式封装，以便可以在需要时用于打印生物组织。
[0051]在本专利的含义内，“生物打印”通过执行计算机辅助几何构造的方法来表示活细胞和其它生物产品的空间结构，特别是由生物学关注对象的个体沉积物形成的层叠，以开发用于组织工程、再生医学、药代动力学以及更广泛地用于生物学研究的活组织和器官。生物打印涉及活细胞和生物材料的逐层同时沉积，以制造诸如皮肤、心脏瓣膜、软骨、心脏组织、肾脏、肝脏等人造结构的活组织以及其它重要器官或中空结构(诸如，膀胱以及血管结构)。
[0052]本发明还涉及用于如上所述的生物打印系统的盒，其特征在于，所述盒包括构成打印模块的所述封套的可灭菌密封外壳。
[0053]本发明还涉一种生物打印方法，该生物打印方法用于从至少部分包含生物粒子(细胞和细胞衍生物)的材料制造结构化生物材料，该生物打印方法包括经由机器人控制至少一个目标在面向至少一个打印头的三个维度上的移动，所述至少一个打印头被放置在密封且无菌的外壳中，所述打印头是从所述外壳外部供应和控制的，以便保证生产的组织在临床领域的法规要求方面的安全性。
[0054]本发明的非限制性示例的具体实施方式
[0055]通过参考附图阅读以下对本发明的非限制性示例的详细描述，将更好地理解本发明，其中：
[0056]-图1示出了根据本发明的生物打印机的第一变型的示意图；
[0057]-图2示出了根据本发明的生物打印机的第二变型的示意图；
[0058]-图3示出了根据本发明的生物打印机的第三变型的示意图；
[0059]-图4示出了根据本发明的生物打印机的第四变型的示意图；
[0060]-图5示出了根据本发明的生物打印机的第五变型的示意图；
[0061]-图6示出了本发明的实施方式的立体主视图；
[0062]-图7示出了本发明的实施方式的立体侧视图；
[0063]-图8示出了刚性盒形式的另选实施方式的示意图；
[0064]-图9示出了柔性盒形式的另选实施方式的示意图；
[0065]-图10示出了根据本发明的具有无菌手套箱的单元的视图；
[0066]-图11示出了根据本发明的具有无菌手套箱的单元的视图；
[0067]-图12示出了根据本发明的包括具有由beta型容器固定的联锁装置的alpha转移系统的单元的视图。
[0068]生物打印机的示意描述
[0069]图1至图5示出了根据本发明的生物打印机的硬件架构的变型实施方式的视图。该生物打印机由几个基本构件组成：
[0070]·增材打印头(1)，该增材打印头的配置取决于所使用的技术，包括由生物学关注对象和目标(6)组成的生物墨水转移区域；
[0071]·一个或更多个源(2)，该一个或更多个源向增材打印头(1)供给包含生物学关注对象的生物墨水；
[0072]·机电组件(3)，该机电组件确保转移区域相对于目标(6)的相对位移；
[0073]·可选地，成熟区域(4)；
[0074]·打印激活装置(5)，该打印激活装置的配置取决于所使用的技术。
[0075]术语“生物打印头”是指由支撑件形成的生物打印系统的部分，但不包括激活装置，所述支撑件容纳生物墨水(bio-still)或更一般地要转移至目标的生物学关注对象并且使生物学关注对象的出口区域朝向目标，例如：
[0076]-对于激光生物打印，生物打印头不包括用于脉冲激光生物打印的激光和光学部件；
[0077]-对于喷墨或微阀生物打印，生物打印头不包括使致动器(阀/压电元件(piezo))被激活的发电装置；
[0078]-对于微挤出生物打印，生物打印头不包括注射泵。
[0079]通常，在生物打印装置中可以分成两个部分：
[0080]-在本专利的意义内由“打印头(1)”指定的部分，该部分包括设备的终端部分，其容纳生物墨水和/或要转移的生物学关注对象以及用于转移激活构件的接口；
[0081]-在本专利的意义内由“激活装置(5)”指定的部分，该部分在物理上与打印头(1)可分离，并且与生物打印头(1)机械地、电气地、声学地或光学地联接，包括可以控制存在于生物打印头中的生物学关注对象到目标的物理转移的所有装置。
[0082]本发明旨在优化无菌区域，并且为此目的：
[0083]a)打印头(1)必须被放置在可灭菌外壳(10)中，
[0084]b)打印装置(5)必须被放置在可灭菌外壳(10)外部，
[0085]c)密封交互区(20)允许打印装置(5)激活打印头(1)。
[0086]生物打印机的其它部件可以被放置在可灭菌外壳(10)中或在该外壳(10)外部。
[0087]特别是，供料源(2)可以与可灭菌外壳(10)中的打印头(1)关联，然后形成可以被引入生物打印机中的盒，然后取出该盒以进行打印组织的成熟。
[0088]在有或没有供料源(2)的情况下，用于使目标(6)相对于源移动的机电一体化组件(3)也可以与可灭菌外壳(10)内部的打印头(1)关联。
[0089]在有或没有供料源(2)和/或机电一体化移动组件(3)的情况下，成熟腔室(4)也可以与外壳(10)内部的打印头(1)关联。
[0090]另选实施方式
[0091]本发明可以以不同的方式实现。
[0092]图1示出了通用视图，其中，可灭菌外壳(10)包括：
[0093]-根据要求，打印头(1)以及可选地成熟外壳(4)，在打印头(1)以及可选地成熟外壳(4)中放置有容纳转移的生物学关注对象的目标；
[0094]-可选地，供料源(2)，例如生物墨水储存器和供料系统，根据本发明，供料源还可以被布置在非无菌区域中，并且具有用于将生物学关注对象无菌地转移到可灭菌外壳(10)中的连接器。
[0095]-可选地，用于利用无菌机械连接器移动打印头(1)的移动装置(3)，根据本发明，该移动装置还可以被放置在非无菌区域中。
[0096]激活装置(5)(例如，激光器和相关联的光学部件)被放置在该可灭菌外壳(10)的下方，透明窗口(20)形成允许光束经过的接口。激活装置(5)不被放置在无菌区域中。
[0097]图2示出了一种变型，其中，除激活装置(5)之外的所有构成组件都被放置在可灭菌外壳(10)中。
[0098]图3示出了一种变型，其中，除激活装置(5)和用于移动打印头(1)的移动装置(3)之外的所有构成组件都被放置在可灭菌外壳(10)中。打印头(3)与移动装置(3)之间的联接例如通过磁传输或穿过可灭菌外壳(10)的壁的无菌铰接来实现。
[0099]图4示出了一个变型，其中，仅打印头(1)和成熟区域(4)被放置在可灭菌外壳(10)中。所有其它部件(特别是激活装置(5)和移动装置(3)以及供料源(2))位于可灭菌外壳外部。
[0100]图4示出了一个变型，其中，仅打印头(1)和成熟区域(4)连同移动装置(3)被放置在可灭菌外壳(10)中。所有其它构成组件(特别是激活装置(5)以及供料源(2))位于可灭菌外壳外部。
[0101]图5示出了一个变型，其中，打印头(1)、成熟区域(4)和确保打印头(1)相对于目标的相对位移的机械臂(3)被放置在可灭菌外壳中(10)。仅激活装置(5)和供料源(2)位于可灭菌外壳外部。
[0102]一个实施方式的描述
[0103]生物打印机包括基座，该基座的不可灭菌的下部部分(11)包括激活装置(5)，例如光学头、激光器和激光打印机的成像系统。
[0104]该框架的顶部是可灭菌外壳(10)，该可灭菌外壳包括由鼓风机(15)经由滤芯(16)提供的正压腔室。被放置在该可灭菌外壳(10)中的机械臂(3)确保目标(6)相对于打印头(1)的移动。密封窗口(20)允许激光束和成像束在可灭菌外壳(10)与放置在非可灭菌区域中的打印装置(5)之间传输。
[0105]外壳(10)由玻璃壁(22)密封，该玻璃壁由用于无菌操作手套的接口(21)穿过。
[0106]外壳具有由alpha部件(24)密封的转移系统(23)，由于密封和无风险的连接，该转移系统可以将材料(例如，生物墨水盒)从一个无菌区域移动到另一个无菌区域，穿过非无菌区域。
[0107]这样的系统使得可以满足欧盟委员会在开发“质量程序”的框架内建立的与良好生产规范(GMP)有关的要求，其目的是限制两类风险：
[0108]·产品交叉污染(被另一产品、或内部和外部污染物污染)的风险；
[0109]·混淆的风险，特别是在部件的标签和标识方面。
[0110]他们强调必须在所有级别实现的卫生和组织惯例。
[0111]实现“手套箱”或密封舱口的变型
[0112]根据未示出的变型，可灭菌外壳(10)具有用于密封设备的控制机构，使得可以在该外壳内部在无菌或无尘空气中执行这些任务，以手动处理对象或产品。外壳(10)的壁例如具有凸缘，该凸缘的外周装配有旨在与手套箱的凸缘的压痕配合的耳部。
[0113]外壳(10)的凸缘被插入手套箱的凸缘中。
[0114]可灭菌外壳(10)还可以包括安装在凸缘中的舱口，用于与另一可灭菌外壳连通，例如在打印后进行成熟。
[0115]使用盒的变型
[0116]根据本发明的一种变型，封闭的生物打印系统基于包括目标(6)和打印头的可灭菌盒。该可灭菌盒包括无菌/密封接口(双密封转移门、beta袋、光学窗口、注射器等)，从而允许该可灭菌盒连接至可转移以用于打印的生物学关注对象的至少一个供料源，连接至一个或更多个激活装置，连接至用于使目标(6)相对于打印头和成熟所需的要素(培养基、CO2、O2等)移位的机械联接装置。盒可以用于进行成熟。它可以在打印系统与培养箱之间运输。
[0117]用于打印方法的可转移生物学关注对象的供料源可以连接至由专用储存器构成的细胞培养自动机。
[0118]该解决方案允许根据符合良好生产规范(GMP)的方法在密闭外壳中进行生物制造，从而避免生物污染的风险。
[0119]盒被联接至用于表征组织或器官的装置(在制造期间或在其制造之后对组织进行在线表征(成像、拉曼光谱、OCT、理化分析))。
[0120]盒可以提供单个窗口、多个窗口、两侧(前面和后面)的窗口等。
[0121]对于成熟阶段(生物反应器)，该系统可选地包括用于控制和调节以下要素的装置：
[0122]-pH(pH检测范围为0-14，通过NaOH/CO2调节的精度为0.01)；
[0123]-温度(利用珀耳帖(Peltier)、双封套、低温恒温器进行控制)；
[0124]-溶解的O2(例如，通过气体流量测量)；
[0125]-湿度；
[0126]-用于移除或改变培养基的方式；
[0127]-搅拌和注入方式；
[0128]-等。
[0129]盒可选地包括要打印的组织的标识符以及与数据库(所连接的盒)链接的相关的打印参数(序列、源、CAD模型等)。标识符可以是图形类型(例如，条形码或QRcode矩阵代码)或数字类型，例如以记录在RFT类型的射频标签的存储器中的数字序列的形式。这样的解决方案使得可以确保打印过程。盒可选地配备有以太网端口类型的网络接口卡，以控制制造和数据获取方法，管理警报，将实验保存在本地硬盘上，通过SMS，电子邮件实时通知用户等。
[0130]具有手套箱的单元
[0131]图10和图11示出了具有手套箱(25)的单元的示例。
[0132]在配备有密封舱口(21)的手套箱的背景下实现打印方法可以采用以下形式：
[0133]·激光打印：激光打印模块(1)包括至少一个激光头和目标(6)。激光头包括透明的平坦表面(也称为供体)，墨水膜被沉积在该透明的平坦表面上。所述头的供墨源(2)由由于使用SAS而被放置在无菌外壳中的储存器(借助密封手套或借助与移液器相关的机器人将墨水手动散布在供体的表面上)或由位于外壳外部的储存器和泵(在压力或流量下工作)(通过流体方式自动散布墨水)构成。用于激活将墨水转移到目标(6)的激活装置(5)包括位于外壳外部的激光器。密封交互装置(20)在这种情况下是对激光的波长透明的密封光学窗口。用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括6-轴机械臂。
[0134]·微阀打印：微阀打印模块(1)包括目标和配备有针的一个或更多个阀，这些阀可以具有不同的形状、长度和开口直径(6)。用于所述阀的供墨源(2)包括位于外壳外部的储存器和增压泵。用于激活将墨水转移到目标(6)的激活装置(5)包括压电类型的闸门或螺线管。在这种情况下，密封交互装置(20)可以是连接器、可穿孔的盖(隔膜)或气密密封件。用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括6-轴机械臂。
[0135]·挤出打印：挤出打印模块(1)包括目标和配备有针的最终储存器，该最终储存器可以具有不同的形状、长度和开口直径(6)。用于所述挤出机的供墨源(2)包括位于外壳外部的初始储存器和加压泵。用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)包括加压系统。在这种情况下，密封交互装置(20)可以是连接器、可穿孔的盖(隔膜)或气密密封件。用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括6-轴机械臂。
[0136]通过这种配置，可以实现满足GMP制造要求的组织制造。因此，可以为患者安全地生产临床批次。通过例示的方式，可以提及用于再生医学应用的自体或同种异体皮肤替代品的制造的示例。因此，在此提到的不同方式进而可以制造：
[0137]·真皮，真皮由交替的生物材料层(胶原型)和细胞层(成纤维细胞型)组成，生物材料层通过微阀或挤出来打印，细胞层通过激光来打印。细胞图案的精确度使得可以确保成熟后的真皮的结构和功能接近天然皮肤。
[0138]·表皮，表皮由激光打印的细胞(角质形成细胞型)的汇合层组成。
[0139]根据所述培养箱的布置，在无菌外壳内部或外部的培养箱中进行该真皮的成熟。在此步骤结束时，皮肤已经成熟并且可以植入患者体内。
[0140]制造生物组织的应用
[0141]盒的配置特别适于制造例如用于制造自体组织的一种或更多种组织或生物器官。
[0142]出于成熟度的差异、打印模块与单个细胞类型的兼容性等原因，组织或器官可以基于多个盒的使用。
[0143]盒的另一优点在于，它可以在最后的灭菌步骤之后被引入手术室，并且尽可能地靠近患者被打开。
[0144]可以将基质封装在模块中，该模块可以从盒中取出，以便被放置在专用的生物反应器中。
[0145]盒可以是全部或部分一次性的。
[0146]在内部和外部灭菌后，盒可以重复使用。
[0147]盒的封套可以是刚性的或柔性的(乙烯乙酸乙烯酯、PVC、输液材料的PU型热塑性塑料、低密度聚乙烯、硅树脂、金属(不锈钢304L、316L)或塑料(例如聚碳酸酯))类型。
[0148]刚性盒
[0149]图4示出了刚性盒形式的本发明的实施方式。其使得可以使用包括复杂且昂贵的部件的主要设备项，即，具有一个或更多个打印头的激活装置(例如，激光器)、使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)以及所有IT和光学装置。
[0150]盒包括可灭菌密封外壳(10)，该可灭菌密封外壳被配置成允许其被定位在该设备项上以进行特定操作。
[0151]盒在密封且可灭菌外壳(10)中包含特定装置，即：
[0152]-打印模块(100)，该打印模块包括目标(6)(110)，构成要制造的组织的生物学关注对象被沉积在该目标上；
[0153]-连接杆(131、132、133)，该连接杆确保与相对移位装置的联接并且由气密密封件(134、135、136)穿过外壳(10)。这些连接杆(131、132、133)旨在沿着三个轴X、Y、Z传递目标(6)的相对位移构件相对于源的移动；
[0154]-打印模块(1)，打印模块由承载可转移生物学关注对象的流体流支撑件构成，该支撑件具有供料管(141)和出口管(142)，并连接到外壳(10)外部的储存器(143、144)。
[0155]所述激活装置(5)位于所述可灭菌密封外壳(10)外部，并经由窗口(140)与打印模块(1)相互作用。
[0156]盒与固定设备项之间的联接通过窗口(140)周围的磁体来确保。
[0157]该盒可以通过将组织定位在主设备项上来准备组织，然后确保生物打印组织在另一位置(例如，在成熟外壳中)成熟。
[0158]柔性盒
[0159]图5示出了柔性盒形式的本发明的实施方式。柔性盒与刚性盒的不同之处在于，可灭菌外壳具有柔性壁(200)，该柔性壁将刚性上表面(210)和呈现窗口(140)的刚性下表面(220)连接起来。
[0160]上表面具有位于可灭菌外壳内部的两个插脚(211、212)，以接收目标(6)，从包含可转移的生物学关注对象(148)的生物墨水转移的生物要素被沉积在目标上。
[0161]另选实施方式
[0162]无论使用哪种生物打印技术，传统地，生物打印机都由以下几个基本构件组成：
[0163]-一个或更多个打印头，该一个或更多个打印头包括由生物学关注对象组成的生物墨水转移区域，
[0164]-一个或更多个供料源(2)，该一个或更多个供料源向打印头(1)供给包含生物学关注对象的生物墨水；
[0165]-目标(6)；
[0166]-机电组件(3)，该机电组件确保转移区域相对于目标(6)的相对位移；
[0167]-激活装置(5)；
[0168]-可选地，成熟区域(4)；
[0169]根据第一变型，生物墨水被储存在一个储存器中并通过喷嘴或毛细管形成液滴，这些液滴被转移到目标(6)。
[0170]第一个所谓的喷嘴打印变型包括生物挤出、喷射打印或微阀打印。为了尤其能够时限更高水平的分辨率并提高所打印细胞的活力，已经开发了一种用于在没有喷嘴的情况下打印生物要素的方法。这种称为激光生物打印的打印方法也被称为“激光辅助生物打印”(LAB)。
[0171]关于生物挤出，已经实现了激活打印的多种装置：蜗杆、活塞或甚至是气动系统。它使处理每毫升1亿个细胞数量级的高细胞密度和毫米数量级的分辨率成为可能。生物挤出包括通过直径为几百微米的喷嘴或针机械地推动置于微注射器中的生物要素。该技术的优点在于其成本低和易于实现。然而，它受到与粗分辨率和与在细胞通过喷嘴期间施加在细胞上的剪切力相关的不可忽略的细胞死亡率有关的限制。
[0172]关于喷射生物打印，其包括将包含细胞或生物材料的液体的微滴投射到基底上。该投射是由热或压电方法引起的。热喷射打印通过电阻的瞬态激活(具有很强的热效应)来工作，该电阻的瞬态激活会产生蒸汽泡，蒸汽泡推动液滴通过直径为30μm至200μm的孔。压电喷射打印机使用电脉冲，该电脉冲生成使墨水容器收缩的压电晶体的形状变化。晶体的松弛导致液滴的喷射。无论是在准备时间还是在打印速度方面，该技术都具有快速的优点。然而，该技术的主要缺点在于在打印期间细胞浓度不能超过(小于)500万个细胞/mL以防止打印头堵塞、以及由于通过孔时在细胞上的剪切应力导致的细胞死亡。无论是通过压电技术还是热技术，喷射打印都可以提供约10μm的更好分辨率。
[0173]关于通过微阀进行打印，打印的激活装置是通过压缩空气对液体进行加压。通过致动电磁阀来释放要打印的液体。微阀生物打印类似于喷射技术，但不同之处在于，喷射是通过对墨水加压然后快速打开电磁阀来形成的。与喷射生物打印具有相同的约束条件，该技术的优点是能够打印比喷射系统更粘稠的溶液。通常，压力是从几百毫巴到几巴，并且使得可以获得每毫升几百万个细胞数量级的更低的细胞密度和几十微米数量级的分辨率。
[0174]激光生物打印可以以10μm的分辨率打印具有每毫升1亿个细胞的数量级的高细胞密度的墨水。一种用于借助激光打印生物要素的设备，该技术基于被称为“激光诱导前向转移”(LIFT)的技术，该设备包括：脉冲激光源，该脉冲激光源发射激光束；用于聚焦和定向激光束的系统；供体介质，该供体介质包括至少一种生物墨水；以及受体基底，该受体基底被定位成接收从供体介质发射的液滴。根据这种打印技术，激光束被脉冲化并且在每个脉冲时生成液滴。生物墨水包括基质，例如水性介质，其中，存在要沉积在受体基质上的要素，例如细胞。供体介质包括对激光束的波长透明的载玻片(slide)，并且根据生物墨水以膜的形式附着至其上的配置，载玻片可以涂覆有吸收层(金属、聚合物等)或不涂覆吸收层(“无牺牲层的LIFT”)。
[0175]其它的光学/激光方法可以与使用检流镜的激光扫描相结合实现为激光生物打印的替代或补充(供体表面的成像/点射系统(point-and-shoot system)/光聚合、纹理化、空化、切割等)，以在受体基底上产生图案。
[0176]无论使用哪种技术，通过生物打印制造生物组织都可以分成五个阶段：
[0177]-数字模型的计算机辅助设计(CAD)的预处理，其将定义生物组织的架构，即，组织的所有组成部分在空间(x，y，z)中的位置；
[0178]-对生物墨水(包含细胞和/或生物材料)的打印参数进行编程，从而定义打印机的物理参数和打印头的轨迹；
[0179]-制备和配制由可转移生物学关注对象组成的生物墨水；
[0180]-使用利用各种技术的生物打印机自动进行生物墨水的逐层打印；
[0181]-进行在生物反应器中进行的打印组织的成熟，以使细胞自我组织，直到出现所需的特定生物学功能为止。
[0182]在该序列的上游，可以例如使用显微镜、组织学或医学成像进行断层图像重建；在该序列的下游，生物打印的生物组织在被发送给用户之前先被调节。
[0183]上述制造序列的最后三个步骤以及封装步骤必须在完全无菌的环境中进行，该环境应不含任何可能污染生物打印的组织的粒子，这些粒子可能会改变生物打印的组织在成熟期间的生长及其功能和/或在组织植入后感染患者。
[0184]由于这个原因，这些步骤在提供受控的无菌空气和有利于组织发育的环境的外壳中执行。
[0185]激光打印
[0186]打印组件(1)包括一个或更多个激光头和目标(6)。
[0187]激光头包括透明平坦表面，墨膜借助手套箱手动地或通过机器人或通过与供料源(2)链接的流体装置沉积在该透明平坦表面上。
[0188]用于所述头的供料源(2)包括储存器和加压泵或流量泵。
[0189]用于激活将所述生物对象转移到目标(6)的激活装置(5)包括位于外壳外部的激光器。
[0190]密封交互装置(20)在这种情况下是对激光的波长透明的密封光学窗口。
[0191]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0192]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0193]阀打印
[0194]打印组件(1)包括一个或更多个阀和目标(6)。
[0195]用于所述阀的供料源(2)包括储存器和增压泵。
[0196]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)包括压电类型的闸门或螺线管。
[0197]在这种情况下密封交互装置(20)是可穿孔的盖或气密密封件。
[0198]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0199]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0200]挤出打印
[0201]打印组件(1)包括一个或更多个挤出喷嘴和目标(6)。
[0202]用于所述喷嘴的供料源(2)包括储存器和加压泵。
[0203]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)是用于向喷嘴供料的控制装置，例如借助蜗杆或活塞的机械控制装置或直接气动控制装置。
[0204]在这种情况下，密封交互装置(20)是可穿孔的盖或气密密封件。
[0205]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0206]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0207]喷射打印
[0208]打印组件(1)包括一个或更多个喷射打印头和目标(6)。
[0209]所述喷射打印头的供料源(2)包括储存器和供料泵。
[0210]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)是压电、声学、热、激光等控制装置。
[0211]在这种情况下，密封交互装置(20)是可穿孔的盖或气密密封件。
[0212]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0213]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0214]声波打印
[0215]打印组件(1)包括一个或更多个声波打印头和目标(6)。
[0216]所述声波打印头的供料源(2)包括储存器和供料泵。
[0217]用于激活所述生物对象到目标(6)的转移的激活装置(5)是换能器、激光器等。
[0218]用于使打印头相对于目标(6)相对移位的装置(3)包括机械臂或机电致动器。
[0219]可灭菌密封外壳对应于上述配置中的任一配置。
[0220]当然，这些变型实施方式不是限制性的，本发明扩展到用于以受控方式向目标(6)沉积生物要素以制造生物组织的任何技术。
