技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种参与调控端粒长度的H3F3Aβ蛋白及其应用。 背景技术 [0002]端粒是指染色体末端重复的TTAGGG序列，有研究发现端粒随着年龄增长而逐渐缩短，并且和细胞老化明显相关。端粒酶是一种反转录DNA聚合酶，它以自身mRNA为模板在hTert的逆转录作用下进行DNA的合成，加到染色体末端，维持端粒的长度，大多数体细胞中检测不到端粒酶活性，而在高度增殖的细胞如干细胞、生殖细胞、85％-95％的肿瘤细胞中可以检测到端粒酶的表达。端粒缩短和端粒酶的再激活在肿瘤发生发展过程中起着很重要的作用，一方面端粒缩短可以引起染色体不稳定和肿瘤的启动，另一方面肿瘤的形成需要端粒酶的再激活来稳定端粒的消耗。端粒酶的活化与肿瘤的进展、不良预后、复发的危险性密切相关。端粒长度的维持和端粒酶的活性与肿瘤细胞的永生化也密切相关。 [0003]组蛋白突变与多种癌症相关，组蛋白翻译后修饰方式出现异常，以及组蛋白修饰位置出现异常都会导致肿瘤发生。其中组蛋白H3家族蛋白3A(H3F3A)编码组蛋白变体H3.3，其K27M突变在儿童与成人胶质瘤中极为常见。K27在所有组蛋白H3变体中都是一个重要残基，既可以被乙酰化修饰，也可以被甲基化修饰，H3F3A蛋白与胶质母细胞瘤相关，根据其突变情况分成6个亚型，各个亚型DNA甲基化形式不同，儿童、成人病理机制也不同。例如弥漫性真性脑桥神经胶质瘤是一种好发于脑干部位、进展迅速的小儿肿瘤，是小儿脑部肿瘤的主要死因。H3F3A蛋白的突变研究的较为清楚，但H3F3A蛋白是否还存在新的亚型蛋白及亚型蛋白的性质研究较少。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种参与调控端粒长度的H3F3Aβ蛋白及其应用。 [0005]一种参与调控端粒长度的H3F3Aβ蛋白，所述H3F3Aβ蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。 [0006]所述H3F3Aβ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。 [0007]含所述H3F3Aβ基因的表达载体。 [0008]扩增所述H3F3Aβ基因的任一片段的引物。 [0009]参与调控端粒长度的H3F3Aβ蛋白突变体，所述H3F3Aβ蛋白突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。 [0010]所述H3F3Aβ突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。 [0011]含所述H3F3Aβ突变基因的表达载体。 [0012]扩增所述H3F3Aβ突变基因的任一片段的引物。 [0013]所述H3F3Aβ基因的表达载体及H3F3Aβ突变基因的表达载体在在制备抗衰老的药物中的应用。 [0014]一种用于抗衰老的药物，包括所述H3F3Aβ基因的表达载体及H3F3Aβ突变基因的表达载体，以及药学上可接受的载体。 [0015]本发明的有益效果：本发明构建H3F3Aβ特异性敲除细胞系及H3F3Aβ突变基因恢复细胞系，发现与野生型对照组相比，该H3F3Aβ特异性敲除细胞系的端粒长度显著缩短，且细胞增殖显著减慢，H3F3Aβ突变恢复细胞系的端粒长度显著加长，且细胞增殖显著加快，证明H3F3Aβ发挥参与端粒长度维持的生物学作用，通过过表达H3F3Aβ具有有效抑制端粒长度缩短的作用。鉴于端粒长度能够直接影响机体衰老进程，因此，本发明提供的H3F3Aβ及其突变体相关基因或重组表达载体具有制备抗衰老药物的潜力。 附图说明 [0016]图1为在HeLa细胞中用H3F3A抗体进行免疫共沉淀富集并识别H3F3A各个亚型的SDS-PAGE结果图。 [0017]图2为野生型HeLa与H3F3Aβ特异性敲除HeLa细胞系以及H3F3Aβ’转基因HeLa细胞恢复系的端粒相对长度柱状图。 具体实施方式 [0018]为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。 [0019]实施例1 [0020]HeLa细胞株，购自中科院上海细胞所细胞库，HeLa细胞以含10％小牛血清的DMEM培养，在37℃、5％CO₂饱和湿度孵箱培养，培养液含有100U/m L的氨苄青霉素和链霉素。 [0021]细胞总mRNA的提取和cDNA的制备： [0022](1)收培养的HeLa细胞，1×PBS洗涤3次，加入1ml/1×10⁶细胞Trizol吹打细胞，室温放置5min，使样品充分裂解，12000rpm 4℃离心10min，取上清； [0023](2)每1ml Trizol加入氯仿200μl，剧烈振荡混匀，室温放置5min使其自然分相；4℃，12000rpm离心30min，样品分成三层：上层无色的水相，中间层和黄色的有机相，RNA主要在上层水相中，再把水相转移到新的1.5ml EP管中，吸取上清液； [0024](3)在上清液中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min，然后，4℃，12000rpm离心20min，弃上清，RNA沉淀于EP管底； [0025](4)在RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇，缓慢振荡EP管，悬浮沉淀，4℃8000rpm快速离心2min，重复洗涤一次，用移液器小心吸弃上清，室温放置20min晾干沉淀； [0026](5)沉淀中加入50-100μl RNase-free水，移液器轻轻吹打溶解混匀，取少量稀释，紫外分光光度计检测RNA的浓度，260/280比值在1.8-2.0之间，260/230在2.0-2.4之间，为合格； [0027](6)吸取定量后的RNA4ug，加入1ul引物oligo(T)18，10m M dNTP1ul，加入无核酶水至12ul，以上的混合物65℃水浴5min后，迅速放置于冰上冷却，短暂离心后，加入0.1MDTT2ul，M-MLV RT 5×buffer4ul，核酸酶抑制剂1ul，轻轻混匀，37℃孵育2min后，室温下加入1ul M-MLV逆转录酶，轻轻混匀，37℃孵育50min，取出后放置-20℃保存备用。 [0028]以制备的HeLa的cDNA为模板，采用H3F3Aβ-F/H3F3Aβ-R引物对进行PCR扩增(表1)，得到H3F3Aβ编码基因，所述的H3F3Aβ-F引物序列如核苷酸序列表SEQ ID NO:5所示；所述的H3F3Aβ-R引物序列如核苷酸序列表SEQ ID NO:6所示。将所述H3F3Aβ编码基因序列插入pEGFP-N1真核表达载体中，得到含所述基因的重组表达载体pEGFP-N1-H3F3Aβ。 [0029]H3F3Aβ-F：ATTGGATCCGGTACCATGGCTCGTACAAAGC(SEQ ID NO:5，引入BamHI酶切位点)； [0030]H3F3Aβ-R：GCAGAATTCAATGAAATGTTTCCCATCATAG(SEQ ID NO:6，引入EcoRI酶切位点)。 [0031]表1 [0032] [0033]PCR反应条件：98℃，2min；98℃，30s，53℃，30s，72℃，90s，36循环；72℃延伸5min。 [0034]实施例2 [0035]利用pEGFP-N1-H3F3Aβ表达载体为模版，通过重叠延伸PCR的方法获得突变体，突变位点为第47和第48位氨基酸残基GK突变为TT，重新构建表达载体pEGFP-N1-H3F3Aβ’。 [0036]具体操作如下： [0037](1)设计引物 [0038]H3F3Aβ-F：ATTGGATCCGGTACCATGGCTCGTACAAAGC(SEQ ID NO:5，引入BamHI酶切位点)； [0039]H3F3Aβ’-R：AAGAAATGTAGTTCTCATTCTGAC(SEQ ID NO:7)； [0040]H3F3Aβ’-F:GAATGAGAACTACATTTCTTGCTG(SEQ ID NO:8)； [0041]H3F3Aβ-R：GCAGAATTCAATGAAATGTTTCCCATCATAG(SEQ ID NO:6，引入EcoRI酶切位点)。 [0042]以H3F3Aβ-F，H3F3Aβ’-R为引物对PCR，得到基因片段1，以H3F3Aβ’-F，H3F3Aβ-R为引物对PCR，得到基因片段2；PCR反应体系为：dNTP0.2mM、10Xpfu Buffer 10uL、pfu DNA聚合酶5U、模板100ng、引物各1mM，加ddH₂O至100uL。PCR程序为：94℃变性2min；30个循环的94℃30s，60℃30s，72℃55s；72℃延伸10min。扩增后的基因片段1和基因片段2分别用1％凝胶电泳回收，并纯化。 [0043]将基因片段1和基因片段2等量混合，进行无引物PCR，片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成长片段，PCR反应体系如下：dNTP 0.2mM、10Xpfu Buffer 2uL、pfu DNA聚合酶1U、基因片段1和基因片段2各加10ng，加ddH₂O至20uL；PCR程序为：94℃变性2min；30个循环的94℃20s，60℃30s，72℃85s；72℃延伸10min。 [0044]全长DNA合成：在上述反应产物中加入50pmol外侧引物H3F3Aβ-F和H3F3Aβ-R，进行PCR扩增，PCR程序为：94℃变性2min；30个循环的94℃20s，60℃30s，72℃90s；72℃延伸10min；反应产物用1％凝胶电泳回收，并用胶回收试剂盒进行纯化。 [0045]将突变基因用BamHI内切酶和EcoRI内切酶酶切后克隆至pEGFP-N1真核表达载体中，得到含所述基因的重组表达载体pEGFP-N1-H3F3Aβ’。 [0046]实施例3 [0047]将HeLa细胞使用含有NP40作为主要功能成分的低渗缓冲液进行裂解并与SDS-PAGE上样缓冲液混合，100℃煮样10min后在6％的SDS-PAGE中电泳并进行免疫印迹实验。其中，电泳条件为80V恒压，共2h，保证10kDa大小的分子量标记位于聚丙烯酰胺凝胶的最底端；转膜条件为100mA恒流6h，使用H3F3A特异性兔源抗体对H3F3A及H3F3A亚型蛋白进行识别，发现各个细胞系在H3F3A条带上方有一未知条带，大小在21kDa。 [0048]用A/G胶珠结合特异性识别H3F3A蛋白序列的自制抗体，在宫颈癌细胞系HeLa的细胞裂解液中进行免疫共沉淀，发现所述21kDa条带可以很好地被H3F3A抗体识别并结合(图1)，证明存在一个未知H3F3A亚型，我们将此未知亚型蛋白命名为H3F3Aβ。 [0049]实施例4 [0050]通过VQR-BE3法构建H3F3Aβ特异性敲除细胞系：设计并构建含有针对H3F3Aβ起始密码子的gRNA的表达载体，其具体方法如下：以将H3F3Aβ起始密码子对应序列突变为无翻译起始能力的序列为目的，根据VQR-BE3的PAM序列NGAN及突变方式G>A或C>T，结合H3F3Aβ起始密码子附近DNA序列，设计gRNA。 [0051]将互补的两条单链gRNA序列经过95℃变性与退火形成双链gRNA，并通过T4连接酶连接到pX459载体中，将pX459载体与pBK-VQR-BE3载体共转染HeLa细胞，条件如表2所示： [0052]表2 [0053] [0054]使用polyplus公司的jetPRIME试剂完成实验，在6cm平皿培养的HeLa细胞中换液，加入5mL DMEM后用上述体系进行转染，鉴定发生纯合目的突变，标记为HeLa’细胞，备用。 [0055]将表达载体pEGFP-N1-H3F3Aβ’转染HeLa’细胞，鉴定阳性细胞，标记为HeLa”细胞。 [0056]实施例5 [0057]通过克隆形成实验明确H3F3Aβ敲除细胞系HeLa’细胞及恢复细胞系HeLa”细胞的增殖情况，包括以下步骤：以野生型HeLa单克隆细胞系为对照组，将H3F3Aβ特异性敲除细胞系以250个/孔的密度种在6孔板中，每6天更换一次培养基。在培养15天后，孔板底部可见由单个细胞形成的克隆。弃培养基，用4％多聚甲醛固定15min后，用吉姆萨染液对单克隆染色30min，用PBS及双蒸水洗涤数次，之后统计各个孔中单克隆数量。 [0058]结果显示，H3F3Aβ特异性敲除细胞系各组形成的单克隆数量显著少于各野生型对照组，即H3F3Aβ的敲除导致了细胞增殖减慢。H3F3Aβ’转染细胞系各组形成的单克隆数量显著多于各野生型对照组，即H3F3Aβ’的转染导致了细胞增殖恢复并超出了原有水平。 [0059]通过实时荧光定量PCR明确H3F3Aβ敲除细胞系及H3F3Aβ’转基因细胞系端粒长度变化，包括以下步骤：通过离心柱法分离纯化H3F3Aβ敲除细胞系、H3F3Aβ’转基因细胞系及对应野生型对照组的基因组DNA，同时纯化一组未处理HeLa细胞基因组DNA，使用无核酸酶水三倍倍比稀释5管基因组DNA作为标准样，用于在后续实验中作为标准制作浓度-吸光度标准曲线，使用如下两对引物分别扩增端粒重复序列与单拷贝内参基因HbG： [0060]端粒重复序列扩增用引物如下： [0061]tel1b：5′-CGGTTT(GTTTGG)5GTT-3′； [0062]tel2b：5′-GGCTTG(CCTTAC)5CCT-3′； [0063]单拷贝内参基因扩增用引物如下： [0064]hbg1：5′GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3′； [0065]hbg2：5′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3′。 [0066]qPCR反应体系见表3。 [0067]表3 [0068] [0069]其中引物部分tel1b与tel2b以1:9的比例加入；hbg1与hbg2以3:7的比例加入；所用mix为赛默飞公司的PowerUp SYBR Green mix，分别配好两部分体系后再进行混合。 [0070]通过两轮qPCR分别扩增端粒重复序列与单拷贝内参基因，其中扩增端粒重复序列的程序为95℃，15s，54℃，2min，共18个循环；扩增单拷贝基因HbG的程序为95℃，15s，58℃，1min，30个循环；用HeLa细胞基因组DNA的相应CT值与浓度做线性拟合，判断在倍比稀释浓度范围内端粒曲线与单拷贝基因曲线的斜率无明显差异，证明该方法在该浓度范围内有效。依照各组实验组端粒测量结果CT值(T)和两个单拷贝基因测量结果CT值(S)计算log2(T/S)，作为评估端粒相对长度的标准。 [0071]结果如图2所示，H3F3Aβ敲除细胞系端粒相对长度整体比野生型对照组更短，H3F3Aβ’细胞恢复系相对长度整体比野生型对照组更长。证明H3F3Aβ参与端粒长度维持，H3F3Aβ’活性更高。 [0072]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。