技术领域 [0001]本发明属于人参培养技术领域，具体涉及一种同时提高人参不定根中多种人参皂苷含量的培养方法。 背景技术 [0002]人参不定根的诱导培养技术已日趋成熟，普遍应用的是，将多年生人参的鲜根洗净、消毒、切割后在含有2,4-D、6-BA和蔗糖的MS固体培养基中进行愈伤组织诱导。再将诱导出的愈伤组织移至IBA和蔗糖的MS中诱导、增殖不定根。然而，此种方式培育的人参不定根中皂苷含量偏低。 [0003]中国专利CN 104509442 B公开了一种“动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法”该专利筛选出有利于人参不定根培养的初始培养基与营养液的比例，在适宜温度下通过鼓泡式生物反应器进行通气培养，将营养添加液充分混合到基础培养基中，可缩短人参栽培周期，避免病虫害的限制，还可定向增加所需皂苷(Re+Rg1含量增至1.22％)的含量，实现人参产品的高值化。 [0004]中国专利CN 111937748 B公开了“一种提高人参不定根皂苷Rg1和Re含量的培养方法”，该方法在人参不定根培育过程中通过向MS液体培养基中添加营养椰壳粉等成分，促进不定根的生长，进而提高了人参不定根中人参皂苷Rg1和Re的含量，提升了人参不定根的营养价值。 [0005]研究表明，在植物次生代谢过程中，生物诱导子或非生物诱导子能作为一种特定的生化信号，快速、专一的和有选择地诱导特定基因的表达，从而调节植物细胞次生代谢产物的合成。人参中含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、Re、Rg1、Rg2、Rh1等，每一种皂苷均有其营养价值和药用价值，全面提高人参皂苷含量能够进一步提高人参不定根的营养价值和药用价值。 [0006]然而，不同诱导子对人参细胞皂苷的合成有不同影响，同一诱导子对具有相同代谢途径或具有同一前体物质的不同次生代谢产物均有影响作用。因此，如何通过对人参不定根培育方式的改进，从而达到同时提高人参中多种人参皂苷的含量，全面提高人参不定根的营养价值和药用价值成为急需解决的技术问题。 发明内容 [0007]本发明的目的在于提供一种同时提高人参不定根中多种人参皂苷含量的培养方法，该方法在人参不定根培养过程中通过两种诱导子分步进行诱导，既能提高PPT皂苷(Rg1、Re)的含量，同时还能显著提高PPD皂苷(Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd)的含量以及稀有人参皂苷(Rg3、Rh2)的含量。 [0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： [0009]一种同时提高人参不定根中多种人参皂苷含量的培养方法，该方法包括以下步骤： [0010]步骤S1、外植体消毒； [0011]步骤S2、愈伤组织诱导； [0012]步骤S3、不定根的诱导； [0013]步骤S4、不定根中期培育：采用SH培养基在低温下进行液体悬浮培养； [0014]步骤S5、不定根培育：超净工作台中将步骤S4培育的不定根接种到一个已灭菌的生物反应器中，生物反应器中采用SH培养基，所述SH培养基包括3/4SH、3％蔗糖、5PPM IBA、3.5N的NaOH 1mL； [0015]培养时，开启空气阀，控制通气量为0.3-0.6vvm，温度23-25℃，湿度30-50％，培养3周；之后打开臭氧阀，通入空气与臭氧的混合气体，通气量为0.3-0.6vvm，臭氧浓度为0.15-0.2mg/m³，温度23-25℃，湿度30-50％，培养1周。 [0016]作为本发明的优选，步骤S1外植体消毒的具体操作步骤如下：在自来水下冲洗人参，放在干净的白钢桶中，装入一定量的乙醇，乙醇浓度为70％，乙醇的量使人参完全浸没，浸泡清洗1-3min；然后利用事先灭菌的无菌水洗涤，洗去人参表面残留的乙醇溶液，之后转移至超净工作台中，把人参浸泡在浓度为2％的NaClO溶液中，浸泡时间为15-20min。 [0017]作为本发明的优选，步骤S2愈伤组织诱导时采用易于诱导愈伤组织的MS培养基，所述MS培养基中添加生长素、细胞分裂素、蔗糖，所述生长素为2，4－二氯苯氧乙酸，细胞分裂素为6－苄基氨基嘌呤，生长素添加量为1PPM，细胞分裂素添加量为0.5PPM，蔗糖的浓度为30g/L；培养条件为：温度23-25℃、湿度30-50％、光照时间Light:8h，Dark:16h。 [0018]作为本发明的优选，步骤S3诱导不定根的培养基采用MS培养基，所述MS培养基中添加生长激素IBA、蔗糖，所述生长激素IBA的添加量为2PPM，蔗糖的浓度为30g/L；培养条件为：温度23-25℃、湿度30-50％、暗培，诱导出不定根。 [0019]作为本发明的优选，步骤S4不定根中期培育时，所述SH培养基包括3/4SH、3％蔗糖、3PPM IBA、0.5PPM萘乙酸、0.3PPM激动素；培养条件为：温度23-25℃，湿度40％，培养3天；温度20-22℃，湿度35％，培养3天；温度17-19℃，湿度35％，培养3天；温度14-16℃，湿度30％，培养4天；温度11-13℃，湿度30％，培养4天，温度8-10℃，湿度30％，培养4天；全部为暗培。 [0020]作为本发明的优选，步骤S5所述的生物反应器的顶端设置有排气口，生物反应器的底部设置有进气口，所述进气口通过分管路与总进气管路连接，所述分管路上设置有进气阀；所述总进气管路与臭氧进气管路和空气进气管路连接，所述臭氧进气管路上安装有臭氧阀、第一流量计，臭氧进气管路与臭氧发生器连接；所述空气进气管路与气源连接，空气进气管路上安装有空气阀、第二流量计。 [0021]本发明的另一目的在于提供一种生物反应系统，该生物反应系统在人参不定根培养时，通过对阀门的控制，可选择通入空气或空气与臭氧的混合气，从而达到利用低浓度臭氧诱导人参不定根的目的。 [0022]本发明提供的生物反应系统，包括多个生物反应器，每个所述的生物反应器的顶端设置有排气口，生物反应器的底部设置有进气口，所述进气口通过分管路与总进气管路连接，所述分管路上设置有进气阀；所述总进气管路与臭氧进气管路和空气进气管路连接，所述臭氧进气管路上安装有臭氧阀、第一流量计，臭氧进气管路与臭氧发生器连接；所述空气进气管路与气源连接，空气进气管路上安装有空气阀、第二流量计。 [0023]本发明的优点和有益效果： [0024](1)本发明提供的培养方法采用两种诱导子在不同培养时期有选择的诱导不同人参皂苷的合成，最终实现同时提高人参皂苷中PPT皂苷(Rg1、Re)、PPD皂苷(Rb1、Rb2、Rb3、Rd)以及稀有人参皂苷(Rg3、Rh2)的含量。 [0025](2)本发明提供的培养方法在不定根中期培育时通过缓慢降温的低温诱导方式使最终获得的不定根中的Rb1、Rb2、Rb3、Rd的含量显著提高，同时向SH培养基中加入IBA、蔗糖、萘乙酸、激动素，IBA与萘乙酸、激动素依一定比例混用后，能够避免低温环境下对人参不定根的生长产生影响。 [0026](3)本发明提供的培养方法在不定根培育后期通过向生物反应系统内通入低浓度的臭氧，臭氧作为非生物诱导子能够调节人参细胞次生代谢产物的合成，显著提高Rg1、Re、Rg3、Rh2、Rd等皂苷的含量。 [0027](4)本发明提供的培养方法所获得的人参皂苷中PPD皂苷含量明显增加，而PPD皂苷经过结构修饰可以转化为高附加值的稀有人参皂苷；因此，将本发明培养的人参不定根作为原料，能够提高高附加值的稀有人参皂苷的产量。 [0028](5)本发明提供的培养方法简单，周期短，已经用于规模化生产人参不定根。 附图说明 [0029]附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中： [0030]图1为实施例1愈伤组织诱导示意图； [0031]图2为实施例1不定根诱导示意图； [0032]图3为实施例1不定根中期培育示意图； [0033]图4为实施例1不定根培育示意图； [0034]图5为实施例1生物反应器的结构示意图。 具体实施方式 [0035]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 [0036]实施例1 [0037]一种同时提高人参不定根中多种人参皂苷含量的培养方法，该方法包括以下步骤： [0038]步骤S1、外植体消毒：在自来水下冲洗人参30s，放在干净的白钢桶中，装入一定量的乙醇，乙醇浓度为70％，乙醇的量使人参完全浸没即可(此过程主要目的是为了洗去人参表面的灰尘及泥土，浸泡清洗1min左右即可)；然后利用事先灭菌的无菌水洗涤数次(主要目的为洗去人参表面残留的乙醇溶液)，之后转移至超净工作台中，把人参浸泡在浓度为2％的NaClO溶液中，浸泡时间为15-20min，浸泡时间的长短依据人参的大小、粗细而定，此过程中人参的表皮的颜色逐渐变白，浸泡完成后，使用无菌水洗涤数次，洗去表面的NaClO溶液，然后放在无菌滤纸上除去人参表面多余的水分。 [0039]步骤S2、愈伤组织诱导：超净工作台中将除去表面水分的人参放在切割盘中，按照根茎(芦头)，主根(表皮)，细根分别进行切片；切片的大小大约控制在1cm左右的长度。采用易于诱导愈伤组织的MS培养基，所述MS培养基中添加一定量的生长素、细胞分裂素、蔗糖，所述生长素为2，4－二氯苯氧乙酸(2,4-D)，细胞分裂素为6－苄基氨基嘌呤(6-BA)，添加量分别为2,4-D为1PPM,6-BA为0.5PPM，蔗糖的浓度为30g/L；将培养基放在灭菌锅中灭菌(灭菌条件：121℃，15min)，使用温度在45℃为宜，将培养液缓缓倒入培养基盖上盖子，待培养基凝固后将人参切片(3-8片)平放到灭菌后培养皿中，放入培养箱中培养。培养条件为：温度23-25℃、湿度40％、光照时间Light:8h，Dark:16h，结果如图1所示。 [0040]步骤S3、不定根的诱导：超净工作台中将生长较好的愈伤组织分割成5mm左右的小段，转移至诱导不定根的培养基中，诱导不定根的培养基采用MS培养基，所述MS培养基中添加的一定量的生长激素IBA、蔗糖，生长激素IBA的添加量为2PPM，蔗糖的浓度为30g/L。将培养基放在灭菌锅中灭菌(灭菌条件：121℃，15min)，使用温度在45℃为宜，将培养液缓缓倒入培养皿盖上盖子，待培养基凝固后将愈伤组织小段平放到灭菌后培养皿培养。培养条件为：温度23-25℃、湿度40％、暗培，诱导出不定根，结果如图2所示。 [0041]步骤S4、不定根中期培育：超净工作台中将诱导出的不定根由培养皿转移至已灭菌的含有SH培养基的250mL三角瓶中(内含80-100mL的SH培养基)，进行液体悬浮培养，所述SH培养基为3/4SH+3％蔗糖+IBA(3PPM)+萘乙酸(0.5PPM)+激动素(0.3PPM)，将培养基放在灭菌锅中灭菌(灭菌条件：121℃，15min)后使用。培养条件为：温度23-25℃，湿度40％，培养3天；温度20-22℃，湿度35％，培养3天；温度17-19℃，湿度35％，培养3天；温度14-16℃，湿度30％，培养4天；温度11-13℃，湿度30％，培养4天，温度8-10℃，湿度30％，培养4天；全部为暗培，结果如图3所示。 [0042]步骤S5、不定根培育：超净工作台中将大约20-30个的三角瓶中的不定根接种到一个已灭菌的生物反应器中，生物反应器中采用SH培养基(3/4SH)+3％蔗糖+IBA(5PPM)+NaOH(3.5N 1mL)。培养时，开启空气阀，控制通气量为0.5vvm，温度23-25℃，湿度40％，培养3周；之后打开臭氧阀，通入空气与臭氧的混合气体，通气量为0.5vvm，臭氧浓度为0.18mg/m³，温度23-25℃，湿度40％，培养1周，全部为暗培，结果如图4所示。 [0043]如图5所示，本发明所述的生物反应器1的顶端设置有排气口11，生物反应器的底部设置有进气口12，所述进气口通过分管路2与总进气管路3连接，所述分管路2上设置有进气阀21；所述总进气管路3与臭氧进气管路4和空气进气管路5连接，所述臭氧进气管路4上安装有臭氧阀41、第一流量计42，臭氧进气管路4与臭氧发生器6连接；所述空气进气管路5与气源7连接，空气进气管路5上安装有空气阀51、第二流量计52；使用时，通过控制进气阀21、臭氧阀41、空气阀51的开关便可控制生物反应器1内的通气情况。 [0044]本发明提供的方法选择在不定根培养后期通入臭氧，臭氧的通入能够调节人参细胞次生代谢产物的合成，显著提高Rg1、Re、Rg3、Rh2、Rd等的含量，其对人参皂苷的生长略有影响，通入臭氧后的人参不定干生长速度略慢，但影响不大。 [0045]对比例1 [0046]与实施例1的区别在于步骤S4不定根中期培育，具体方式如下： [0047]超净工作台中将诱导出的不定根由培养皿转移至已灭菌的含有SH培养基的250mL三角瓶中(内含80-100mL的SH培养基)，进行液体悬浮培养，所述SH培养基为3/4SH+3％糖+IBA(3PPM))，将培养基放在灭菌锅中灭菌(灭菌条件：121℃，15min)后使用。培养条件为：温度23-25℃湿度40％，全部为暗培，培养三周。 [0048]步骤S5不定根培育，具体方式如下： [0049]超净工作台中将大约20-30个的三角瓶中的不定根接种到一个已灭菌的生物反应器中，连接生物反应器系统，开启空气阀，通气量为0.5vvm，即可使用生物反应系统进行培养。生物反应器其中采用SH培养基(3/4SH)+3％糖+IBA(5PPM)+NaOH(3.5N 1mL)。培养条件为：温度23-25℃湿度40％，全部为暗培，培养四周。 [0050]对比例2 [0051]与实施例1的区别在于步骤S4不定根中期培育，具体方式如下： [0052]超净工作台中将诱导出的不定根由培养皿转移至已灭菌的含有SH培养基的250mL三角瓶中(内含80-100mL的SH培养基)，进行液体悬浮培养，所述SH培养基为3/4SH+3％糖+IBA(3PPM))，将培养基放在灭菌锅中灭菌(灭菌条件：121℃，15min)后使用。培养条件为：温度23-25℃湿度40％，全部为暗培，培养三周。 [0053]对比例3 [0054]与实施例1的区别在于步骤S5不定根培育，具体方式如下： [0055]超净工作台中将大约20-30个的三角瓶中的不定根接种到一个已灭菌的生物反应器中，连接生物反应器系统，开启空气阀，通气量为0.5vvm，即可使用生物反应系统进行培养。生物反应器其中采用SH培养基(3/4SH)+3％糖+IBA(5PPM)+NaOH(3.5N 1mL)。培养条件为：温度23-25℃湿度40％，全部为暗培，培养四周。 [0056]本发明中人参不定根中人参皂苷含量的测定方法如下： [0057](1)标准品溶液制备：准确称量人参皂苷Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg3、Rh1标准品各1.5mg，置于10mL容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解后定容至刻度，备用。人参皂苷标准品均由成都曼斯特生物科技有限公司购买。 [0058](2)样品溶液的制备：精密称取人参不定根干燥粉末0.2g，将其置于100ml三角瓶，加入20ml甲醇，60℃水浴1h，趁热抽滤，重复抽提一次，合并滤液并挥干；之后将提取物用10ml蒸馏水溶解，20ml正丁醇萃取两次，收集正丁醇层，旋蒸，甲醇定容至1ml,经过0.22μm的微孔滤膜过滤，得样品溶液。 [0059](3)色谱柱YMC J'sphere ODS-H80(4.6mmx250 mm，4um)，UV检测器，检测波长为203nm，进样量20uL，柱温35℃，流速1mL/mim；流动相A:乙腈，B:水。 [0060]梯度洗脱程序:0min～10min，A:22％；10min～20min，A:22％；20min～25min A:27％；25min～45min，A:31％～38％；45min～45.10min，A:38％～90％；45.10min～60min，A:90％:60min～60.10min，A:90％～22％。 [0061]本发明按照上述方式完成对实施例1、对比例1、对比例2、对比例3所获得的人参不定根中皂苷含量的测定，结果如下： [0062]表1人参不定根中PPD皂苷含量(mg/g)测量结果 [0063] [0064]表2人参不定根中PPT皂苷含量(mg/g)的测量结果 [0065] [0066]表3人参不定根中稀有人参皂苷含量(mg/g)的测量结果 [0067] [0068]结论：本发明提供的培养方法，通过在人参不定根培养过程中不同培养时期选择不同的诱导子能够同时提高人参不定根中多种人参皂苷的含量；其中，在人参不定根中期培育时，通过循序降温的低温诱导方式诱导，能够显著提高Rb1、Rb2、Rb3、Rd等皂苷的含量；在人参不定根培育后期，通过低浓度臭氧诱导方式诱导，能够显著提高人参皂苷Rb3、Rc、Rg1、Rg3、Rh2等的含量。