技术领域 [0001]本发明属于农药学及植物保护技术领域，尤其是一种中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒及其制备方法和应用。 背景技术 [0002]中空介孔二氧化硅(HollowMesoporousSilicaNanoparticles,HMSNs)是根据根据国际纯粹与应用化学联合会规定,介孔材料定义为孔径在2～50nm范围内且有序排列使其具有有序结构的材料。在所有可用的纳米材料中,中孔介孔二氧化硅纳米颗粒具有许多优良特性,例如(1)大的表面积和孔体积使其对药物在孔道内的吸附和负载具有巨大的潜力；(2)优异的中孔结构和可调节的孔径使中空介孔二氧化硅更好控制药物的加载和释放；(3)易于修饰的表面,用于受控和有针对性的药物输送,可増强药物治疗效果并降低毒性；(4)中空介孔二氧化硅对生物体的安全性评价取得了满意的结果,包括细胞毒性,在生物体内的降解、分布和排泄；(5)磁性和发光化合物的组合可同时进行药物递送和生物成像；(6)中空介孔二氧化硅具有优异表面性能和孔隙率,己被证明是可作为骨再生的生物活性材料。 [0003]核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary),属真菌界子囊菌门，其是多种植物(例如白菜、油菜、油麦菜等)菌核病的病原菌。病菌菌核初为白色,后表面变黑,由拟薄壁组织及疏丝组织结合形成,―般为(1.3-14)mm×(1.2-5.5)mm。菌核在适宜条件下萌发产生浅褐色子囊盘,初呈乳白色小芽状,后展开成杯状或盘状,成熟后变成褐色或暗褐色,盘中产生许多子囊和侧丝,子囊内的子囊孢子呈烟状弹放。子囊无色,棍棒状,内生8个无色子囊孢子。子囊孢子椭圆形,单胞,无色,大小为(10-15)μm×(5-10)μm。病害常发生于油菜的茎基部和叶片。病斑起初为褐色水渍状,逐渐发展到整个茎基部腐烂。湿度大时,病部表面密生棉絮状白色菌丝体,后形成菌核,大小为长4mm,宽2mm左右。菌核初为白色,后逐渐变成鼠粪样黑色颗粒状物。染病植株叶片变黄凋萎,终致全株枯死,对作物产量造成极其的危害。 [0004]传统的农药喷施会造成大量的农药浪费和环境污染，并且在药剂喷施后由于光照、温湿度、雨水冲刷等都会对药效造成降低。所以开发一种可以缓控释农药并且对其有一定保护作用的方法显得尤为重要。 发明内容 [0005]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒的制备方法，该方法制得的载药纳米颗粒内为中空结构，可以储存农药，外壳部分具有介孔结构可以使药物得到缓控释放，并且其具有对正常组织无毒性、高效递送性、将药物装载进内部对其有一定保护性和缓控释放等优点。 [0006]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备介孔二氧化硅(MesoporousSilicaNanoparticles,MSNs):将十六烷基三甲基氯化铵(Hexadecyltrimethylammoniumchloride,CTAC)溶液、乙醇、三乙醇胺(Triethanolamine,TEA)分别添加于去离子水中,通过高温下混合,并在室温稳定后缓慢而匀速的逐滴添加正硅酸四乙酯(Tetraacetoxysilane,TEOS)溶液使之充分反应,在高速混合后离心洗涤,并在与所得物质回流处理之后,进一步离心洗涤,并在通过冷冻干燥之后制备介孔二氧化硅,②制备中空介孔二氧化硅:将步骤①中得到的介孔二氧化硅加入到去离子水中,在高温下搅拌,随后离心洗涤,冷冻干燥,得到中空介孔二氧化硅,③制备Dim@HMSNs:先将菌核净(Dimethachlon,Dim)加入到乙醇中,再加入一定量的中空介孔二氧化硅通过一锅法制备得到Dim@HMSNs。 [0007]进一步的，所述步骤①中，将460～490mg十六烷基三甲基氯化铵、14～16mL乙醇和0.25～0.75mL三乙醇胺分别加入到90～100mL去离子水中,并在80℃水浴条件下搅拌2h。在溶液温度稳定之后,将2～3mL正硅酸四乙酯的混合物缓慢且匀速地逐滴加入加入到上述溶液中,保持速率在0.1mL/min,使其完全反应。将溶液在80℃水浴条件下搅拌12h后,通过离心时间15min转速8000r/min,收集产物,并用甲醇洗涤3次。为了从孔中去除结构导向剂十六烷基三甲基氯化铵,将获得的沉淀物分散在酸性甲醇溶液(含2mLHCL的100mL甲醇)中冷凝回流洗涤3次,每次将混合物在60～80℃下回流12h。洗涤完全后,离心收集介孔二氧化硅,并用甲醇和去离子水分别洗涤3次,然后真空冷冻干燥24h,得到介孔二氧化硅并在-20℃下保存,备用。 [0008]进一步的，所述步骤③中，先配制成分为菌核净在无水乙醇中的溶液,其中菌核净的质量为A,再将质量为A/2～A/4的中空介孔二氧化硅加入到溶液中,将混合溶液在60～80℃的水浴条件下搅24h,使中空介孔二氧化硅充分吸附菌核净。随后敞口搅拌使乙醇慢慢挥干,待到中空介孔二氧化硅呈湿润状态时,再用10mL的热乙醇溶液洗涤中空介孔二氧化硅表面残留的菌核净,然后用去离子水洗去残留乙醇,此步骤重复3次,上述离心条件为离心时间15min转速8000r/min,最后将洗涤干净的中空介孔二氧化硅放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥,得到中空介孔二氧化硅载药颗粒,即为Dim@HMSNs,并将其置于-20℃保存,备用。 [0009]进一步的，所述步骤②中，将合成得到的介孔二氧化硅加入到100mL的去离子水中,在60～80℃的温度下持续搅拌24h,随后离心收集沉淀,用去离子水洗涤3次,上述离心条件为离心时间15min转速8000r/min,即得到中空介孔二氧化硅。 [0010]进一步的，所述步骤③中，将菌核净装载进中空介孔二氧化硅中时需要在60～80℃的水浴条件下持续搅拌24h,然后先用热乙醇清洗再用去离子水清洗3次,上述离心条件为离心时间15min转速8000r/min。 [0011]进一步的，所述菌核净和中空介孔二氧化硅的投药质量比例为1：2～1：4。 [0012]另一发明目的：本发明还提供了一种中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒，其特征在于：采用上述的制备方法制得。 [0013]另一发明目的：本发明还提供了一种中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒，其特征在于：在制备防治核盘菌中的应用。 [0014]另一发明目的：本发明还提供了一种药物递送系统，其特征在于，包括如权利要求7所述的中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒。 [0015]另一发明目的：本发明还提供了一种防治核盘菌制剂，其特征在于，包括上述的中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒。 [0016]采用上述方案，本发明的中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒，即Dim@HMSNs。中空介孔二氧化硅具有中空介孔结构，其中中空结构可以使农药储存在里面，介孔结构可以缓控释放药物，同时因为整体纳米粒大小在150nm左右，可以在进入叶外质体后在维管束中运输，并且载体纳米粒可以通过叶片气孔进入叶片，从而缓控释放药物，达到治疗菌核病的效果，为复杂多样的菌核病治疗提供了新思路。 [0017]下面结合附图对本发明作进一步描述。 附图说明 [0018]附图1为实施例1中空介孔二氧化硅和包覆载菌核净后的Dim@HMSNs的扫描电子显微镜(SEM)图； [0019]附图2为实施例1中纳米颗粒HMSNs和Dim@HMSNs的热重分析图； [0020]附图3为实施例1中纳米颗粒Dim@HMSNs的粒径分析图(NTA)； [0021]附图4为实施例1中纳米颗粒Dim@HMSNs的电位图； [0022]附图5为实施例1中纳米颗粒Dim@HMSNs的傅里叶光谱图； [0023]附图6为实施例1中纳米颗粒Dim@HMSNs对核盘菌的室内毒力测定试验结果； [0024]附图7为实施例1中纳米颗粒Dim@HMSNs和菌核净对赤子爱胜蚓的安全性试验结果； 具体实施方式 [0025]本发明的具体实施例所采用的试剂及仪器如下： [0026]核盘菌来自华中农业大学菌种保藏中心 [0027]菌核净(Dimethachlon,Dim)购自广州粤之康药业有限公司，广东； [0028]十六烷基三甲基氯化铵(Hexadecyltrimethylammoniumchloride,CATAC，99％)、三乙醇胺(Triethanolamine,TEA)、无水乙醇、正硅酸四乙酯(Tetraacetoxysilane,TEOS)、甲醇、盐酸(37％)，国药集团化学试剂有限公司 [0029]红外光谱(FTIR)仪采用JASCO公司的FT/IR660； [0030]扫描电子显微镜(SEM)采用德国蔡司(Zeiss)的GeminiSEM300； [0031]激光粒度电位仪，美国QuantachromeInstruments公司； [0032]同步热分析仪(TGA)采用德国耐驰仪器公司的STA2500。 [0033]实施例1 [0034]一、制备中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒，即Dim@HMSNs的制备，其具体步骤如下： [0035]步骤一、制备介孔二氧化硅，即MSNs的制备 [0036](1)将460～490mg十六烷基三甲基氯化铵、14～16mL乙醇和0.25～0.75mL三乙醇胺分别加入到90～100mL去离子水中,并在80℃水浴条件下搅拌2h。 [0037](2)在溶液温度稳定之后,将2～3mL正硅酸四乙酯的混合物缓慢且匀速地逐滴加入加入到上述溶液中,保持速率在0.1mL/min,使其完全反应。将溶液在80℃水浴条件下搅拌12h后,通过离心时间15min转速8000r/min,收集产物,并用甲醇洗涤3次。 [0038](3)为了从孔中去除结构导向剂十六烷基三甲基氯化铵,将获得的沉淀物分散在酸性甲醇溶液(含2mLHCL的100mL甲醇)中冷凝回流洗涤3次,每次将混合物在60～80℃下回流12h。洗涤完全后,离心收集介孔二氧化硅,并用甲醇和去离子水分别洗涤3次,然后真空冷冻干燥24h,得到介孔二氧化硅并在-20℃下保存,备用。 [0039]步骤二、制备中空介孔二氧化硅，即HMSNs的制备 [0040]将步骤一合成得到的介孔二氧化硅加入到100mL的去离子水中,在60～80℃的温度下持续搅拌24h,随后离心收集沉淀,用去离子水洗涤3次,上述离心条件为离心时间15min转速8000r/min,即得到中空介孔二氧化硅。 [0041]步骤三、中空介孔二氧化硅包覆载菌核净的纳米颗粒，即Dim@HMSNs的制备 [0042]先配制成分为菌核净在无水乙醇中的溶液,其中菌核净的质量为A,再将质量为A/2～A/4的中空介孔二氧化硅加入到溶液中,将混合溶液在60～80℃的水浴条件下搅24h,使中空介孔二氧化硅充分吸附菌核净。随后敞口搅拌使乙醇慢慢挥干,待到中空介孔二氧化硅呈湿润状态时,再用10mL的热乙醇溶液洗涤中空介孔二氧化硅表面残留的菌核净,然后用去离子水洗去残留乙醇,此步骤重复3次,上述离心条件为离心时间15min转速8000r/min,最后将洗涤干净的中空介孔二氧化硅放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥,得到中空介孔二氧化硅载药颗粒,即为Dim@HMSNs,并将其置于-20℃保存,备用。 [0043]二、表征、应用及安全性试验： [0044]1.对实施例1制备得到的Dim@HMSNs进行测试表征试验如下： [0045]Ⅰ、取实施例1中步骤二和步骤三制得的中空介孔二氧化硅和Dim@HMSNs的固体粉末，溶于去离子水后，取10μL稀释后的中空介孔二氧化硅和Dim@HMSNs溶液分别滴在无定形碳膜铜网载体，经干燥后，通过扫描电子显微镜(GeminiSEM300)进行观察，如图1所示，可见中空介孔二氧化硅(a、b)和Dim@HMSNs(c、d)在150nm左右。 [0046]Ⅱ、取实施例1中步骤二和步骤三制得的中空介孔二氧化硅和Dim@HMSNs的固体粉末，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率程序升温至800℃，通过初始物质质量和试验后物质质量之差计算Dim@HMSNs的载药率。如图2所示，计算出Dim@HMSNs的载药量为33.1％。 [0047]Ⅲ、取实施例1制得的中空介孔二氧化硅和包覆载菌核净后的Dim@HMSNs固体粉末分散至1mL去离子水中，用激光粒度电位仪检测其粒径和电位结果如图3和图4所示，其中中空介孔二氧化硅和Dim@HMSNs纳米粒粒径在150nm左右，电位平均值分别是-6.0600mv、-10.0667mv和-18.3333mv。 [0048]Ⅳ、取菌核净、中空介孔二氧化硅、Dim@HMSNs固体粉末，测其三者傅里叶光谱图结果如图5。 [0049]Ⅴ、取实施例1制得的中空介孔二氧化硅和Dim@HMSNs纳米粒和菌核净(Dim)，对核盘菌室内毒力测定试验结果如图6所示。 [0050]Ⅵ、取实施例1制得的Dim@HMSNs纳米粒和菌核净(Dim)，做两者在不同浓度下对赤子爱胜蚯蚓的安全性试验，各浓度下赤子爱胜蚯蚓死亡率结果如图7。 [0051]本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。