点击本文中加粗蓝色字体即可一键直达新药情报库免费查阅文章里提到的药物、机构、靶点、适应症的最新研发进展。
反向末端重复序列（ITRs）是生产重组腺相关病毒（rAAV）载体所需的唯一顺式作用元件。这些序列位于AAV基因组的两侧，是AAV基因组自我复制的起点，同时也是触发病毒包装的重要信号，在病毒复制和包装过程中发挥了关键作用。ITR区域的完整性对于rAAV的生产和活性至关重要，缺失或突变的ITR可能导致AAV病毒产量及活性降低。本文将从ITR序列结构、其在基因组复制及表达中的作用，以及ITR突变和缺失对AAV影响等方面介绍ITR的基础知识，并回顾目前已上市的AAV基因治疗产品中ITR的设计。
ITR基本结构
AAV2 ITR是使用最广泛的一种，它可以兼容各种血清型。ITR的Flip构型在3’端靠近B-B’回文结构，而Flop构型则在3’端靠近C-C’回文结构。AAV基因组的两端可以均为Flip构型，也可以均为Flop构型，或者一端为Flip构型而另一端为Flop构型。ITR的D序列在基因组的两端各出现一次，保持单链状态。ITR的A-A’部分包含末端分辨位点（trs）和Rep结合元件（RBE），trs作为复制的起始位点，RBE则是AAV Rep78和Rep68蛋白结合的位置。RBE由一个四核苷酸重复序列（5’-GNGC-3’）构成。ITR的T形结构顶点对应一个额外的RBE (RBE’)，它可以稳定Rep78和Rep68蛋白与ITR之间的结合。据报道，包含145 bp或130 bp版本的ITR质粒在AAV病毒产量及生物活性方面没有明显差异，因此这两个版本均被视为野生型。
ITR在载体基因表达中的作用
在Rep78和Rep68的ATP依赖型DNA解旋酶活性作用下，A-A’区域被重塑，形成一个顶端为单链形式的末端分辨位点（trs）的茎环结构。在这种构型中，Rep78和Rep68的ATP依赖型链与位点特异性内切酶催化域在trs处引入一个切口，启动后续的复制、转录和表达过程。
ITR变异体
ITR最常见的突变是在其中一个ITR的B或C环中出现一个小的缺失。这些小缺失通常被认为不会对AAV产生显著影响，因为ITR在AAV复制过程中具有自我修复的能力，这可能通过位于另一端的完整ITR实现。据报道，缺失B环、C环或B-C环的ITR与野生型（两端ITR完整）的AAV病毒在生物活性方面没有明显差异。即使A区域缺失的ITR质粒，其生产的AAV病毒生物活性与野生型也相近。然而，D序列对基因组包装非常重要，如果D区域缺失，则会显著降低载体生物活性。
支持CMC开发及BLA上市的ITR设计
有报道称，虽然145bp的wtAAV2 ITR质粒在转化stbl3感受态后，大约40%的克隆出现了ITR突变（主要是B环或C环缺失），但一旦挑选出完整的克隆，在后继的扩增和发酵过程中不会再出现突变。目前已上市的8款AAV基因治疗产品中，有5款采用HEK293生产体系，其中3款（Luxturna、Upstaza、Elevidys）的载体ITR均使用了145bp的wtAAV2 ITR，1款（Zolgensma）的载体ITR为5'：106bp、3'：143bp，另1款（Beqvez）的ITR信息不明。这表明145bp的wtAAV2 ITR在产品开发及监管审批过程中得到了充分验证，能够保证药品的安全、有效和质量可控。
免责声明：新药情报内容编辑团队专注于介绍全球生物医药健康研究的最新进展，本文旨在提供信息交流，不代表任何立场或治疗方案推荐。如需专业医疗建议，请咨询正规医疗机构。
