技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种具有抑菌功效的胶原蛋白复合物及其应用和生产方法。 背景技术 [0002]胶原蛋白，又称胶原质，是一类生物高分子，动物结蹄组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%~30%。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，其化学、空间结构独特，兼具低免疫原性、可生物裂解性、止血和修复功能，在当代组织工程、医美等领域占据重要地位。 [0003]传统的胶原蛋白主要从动物结缔组织中获得。近年来，重组类人胶原蛋白在骨修复、皮肤创面修复敷料、肌健修复、药物输送、美容等领域相继取得了一定进展，重组类人胶原蛋白是利用合成生物学方法根据人胶原蛋白的特性进行优化，通过重组表达获得的具有类似胶原蛋白特性的蛋白。与传统提取获得的胶原蛋白相比，具有可加工性、无病毒隐患、良好的水溶性、生产工艺稳定和排异反应低等优点。 [0004]然而，传统提取的胶原蛋白或重组类人胶原蛋白是一种富营养的生物大分子，极易受细菌等微生物侵蚀。研究表明，细菌新陈代谢会产生多种蛋白酶，进而破坏胶原化学、空间结构，使其生物活性降低。抗菌防腐是胶原作为医用材料、护肤品高值利用的必要前提。通过外添加抗菌剂被证明是一种行之有效的方法。然而，常用抗菌剂大多具有生理毒性;临床应用时，胶原蛋白被吸收降解后，所含抗菌剂仍有活性，其环境累积可造成细菌耐药性的产生，因此亟需开发新型生物抗菌防腐剂，使胶原蛋白具备抗抑菌功效，而不产生耐药性。 [0005]除高价值医用材料外，胶原蛋白在医美、美容护肤行业也有很大的应用市场。它具有保湿，抗皱使皮肤维持细腻和弹性的功效，同时胶原蛋白也具有皮肤修护，加快组织愈合等功效。皮肤作为人类健康的屏障，由皮肤表皮微生物与表面的组织、细胞，以及各种分泌物、微环境等组成一个生态系统，也就是所谓的皮肤微生态。当皮肤微生态被破坏时会引发一系列的皮肤疾病，如皮肤有害菌的感染和富集。葡萄球菌是人类皮肤感染最常见的病原菌，其次还有大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、破伤风杆菌、鸟分枝杆菌等等,还有比较少见的不动杆菌、沙雷菌属等，可引发皮肤各种炎症，如：皮肤湿疹、红肿、痤疮、激光等微创术及术后部位感染等，目前皮肤炎症常用的方法是使用抗生素或化学杀菌剂辅以各种皮肤保护剂（透明质酸钠、胶原蛋白、海藻糖等）进行治疗，但抗生素和杀菌剂具有广谱性，破坏皮肤表面有益菌，而且抗生素的使用会导致耐药菌株的出现，这对皮肤微生态的稳定是不利的，迫切需要替代治疗方案。 [0006]为了克服这一问题，新型生物抗抑菌剂，如溶菌酶，来源于噬菌体的细胞壁裂解酶成为了一种替代方法，它与传统的抗生素不同，溶菌酶与来源于噬菌体的裂解酶均是一种作用于细菌细胞壁的水解酶,破坏细菌细胞壁肽聚糖结构，温和不产生耐药性；而且大多数来源于噬菌体的裂解酶对其所感染的属或种具有高度特异性，这比经典的广谱抗生素具有显著优势。 [0007]如何使胶原蛋白在使用过程中既具备保湿、维持皮肤弹性的功效又具备裂解酶抗抑菌消炎的作用，而开发具有抑菌功效的胶原蛋白复合物，加快皮肤修护，预防皮肤炎症等具有潜大的应用市场。 [0008] 2014年MikaëlM.Martino等（M. M. Martino, P. S. Briquez, E. Guc, F.Tortelli and W. W. Kilarski et al. Growth Factors Engineered for Super-Affinity to the Extracellular Matrix Enhance Tissue Healing, in Science, vol.343, num. 6173, p. 885-888, 2014.）发现系列细胞外基质ECM（包括胶原蛋白、纤连蛋白等）结合肽，如：PIGF-2等，研究人员将其与生长因子（GFs）结合。生长因子在组织修复中起着关键作用，而细胞外基质ECM在组织患处大量存在，结合肽增加了两者之间的亲和力，使生长因子快速在创面聚集结合，加快了慢性创伤组织修复，与单独使用生长因子GFs治疗相比效果显著增强。2018年，Shin-Hye Park等（“All-in-one” in vitro selection ofcollagen-binding vascular endothelialgrowth factor.Biomaterials 161 (2018)270-278）研究人员利用生长因子又挖掘筛选到了多种胶原蛋白结合肽，如：SP1,SP2等，用于在受损部位定位生长因子，增强生长因子的治疗效果。 [0009]综上所述，利用胶原蛋白结合肽使裂解酶与胶原蛋白形成复合物既可以增加蛋白的稳定性，也可以提高胶原蛋白对细菌的抵抗性延长使用年限，赋予胶原蛋白新的抗抑菌功能，这对降低预防和治疗成本以及维持皮肤微生态平衡治疗皮肤疾病，降低胶原蛋白产品治疗过程中患处细菌感染风险是十分有利的。 发明内容 [0010]基于上述背景本发明通过胶原蛋白结合肽，使一种具有抗菌活性的细胞壁裂解酶与胶原蛋白结合，获得具有抗抑菌功能的胶原蛋白复合物，提升细胞壁裂解酶的稳定性，同时降低胶原蛋白感染细菌的风险，维持胶原蛋白的稳定性，增加胶原蛋白使用的寿命，在胶原蛋白原有功能的基础上拓宽胶原蛋白的应用场景，控制感染风险。 [0011]本发明提供一种融合肽，其由具有细胞壁降解作用的裂解酶与胶原蛋白结合肽融合而成。 [0012]优选地，所述裂解酶来自噬菌体。 [0013] 更优选地，所述裂解酶是噬菌体的裂解酶PlySs2 ，SAL-1，LysK，LysH5，PhiII，MV-L，其中，裂解酶PlySs2，其NCBI登录号为WP_253220091.1。 [0014]另外优选地，所述胶原蛋白结合肽是胶原蛋白结合肽PIGF2。 [0015]本发明提供含有所述的融合肽的表达载体。 [0016]本发明还提供含有所述的融合肽的表达载体的重组菌株。优选地，其是大肠杆菌。 [0017]本发明提供所述的融合肽在制备抑菌产品中的应用。 [0018]本发明尤其提供一种具有抑菌功效的胶原蛋白复合物，其特征在于，是将所述的融合肽与胶原蛋白进行混合得到。 [0019]进而本发明提供所述的具有抑菌功效的胶原蛋白复合物在制备抑菌产品中的应用。 [0020]具体地，所述产品是指药品、化妆品、洗护用品、医用敷料、医用组织填充物、食品、食品包装、抗菌涂层、农药。 [0021]本发明提供了一种通过胶原蛋白结合肽可以赋予胶原蛋白新的功能的技术思路。实验表明本发明构建的裂解酶与胶原蛋白结合肽融合蛋白，对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，与胶原蛋白结合赋予胶原蛋白新的抗抑菌功能，不仅可以提升胶原蛋白的使用寿命，还可以防止胶原蛋白被污染。其中，构建的融合蛋白利用胶原蛋白结合肽PIGF与胶原蛋白结合，形成复合体，增加了裂解酶的稳定性，与单独裂解酶与胶原蛋白直接混合抑菌效果好。所述复合物具有稳定的抗抑菌效果，具备实际应用价值，可应用于当代组织工程、医美、美容护肤等行业，降低胶原蛋白产品使用过程中患处细菌感染风险，也可维持皮肤微生态平衡治疗皮肤疾病等。 附图说明 [0022]图1：PlsSs2蛋白与PlsSs2-PIGF融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果图。其中，1为PlsSs2蛋白，2为PlsSs2-PIGF。 [0023]图2：不同蛋白抑菌效果图。其中，B为阴性对照。 [0024]图3：裂解酶PlySs2、PlySs2-PIGF融合蛋白与胶原蛋白混合后抑菌效果图。其中，B为阴性对照。 [0025]图4：不同蛋白与混合物4℃储存1个月后抑菌效果图。其中，B为阴性对照。 具体实施方式 [0026]下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。 实施例1、裂解酶与裂解酶-胶原蛋白结合肽融合蛋白制备 [0027]首先以来源于噬菌体的裂解酶PlySs2（WP_253220091.1）为例，将裂解酶PlySs2氨基酸序列按照大肠杆菌密码子优化，将DNA序列整合到pET30a表达载体NdeI与XhoI之间，获得的载体转化至BL21(DE3)表达菌株中，获得PlySs2蛋白表达菌株；同时将PlySs2氨基酸序列与MikaëlM.Martino研究中提到的胶原蛋白结合肽PIGF2氨基酸序列融合（即PIGF-2的第123至144位氨基酸，具体序列为RRPKGRGKRRREKQRPTDCHL），按照大肠杆菌密码子优化同步将DNA序列整合到pET30a表达载体NdeI与XhoI之间，获得的载体转化至BL21(DE3)表达菌株中，PlySs2-PIGF融合蛋白表达菌株。 [0028] 将上述表达菌株分别转接到LB培养基中进行活化，37℃培养，待生长至OD₆₀₀为0.8左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃，220 rpm培养过夜。将培养过夜的菌液7500 rpm离心收集菌体，用20 mM PB，150mM NaCl 缓冲液（简称Buffer），pH 7.5重悬细胞；超声细胞破碎仪破碎细胞，细胞破碎液10000 rpm离心30 min以上，收集上清为蛋白粗酶液。然后通过His-Tag亲和层析获得纯化蛋白，通过光度法测定蛋白浓度，用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测此蛋白的纯度与大小，图1结果显示纯化后的各个融合蛋白条带单一，大小正确均在28-30KDa左右，与理论大小相符，评估其纯度>95％。 实施例2、蛋白抑菌活性的测定 [0029]上述实施例1制备的蛋白溶液作为测试对象，检测裂解酶PlySs2与PlySs2-PIGF融合蛋白的抑菌活性，金黄色葡萄球菌GIM 1.481作为抑菌测试菌株,参考WS/T650-20195.1.1悬液定量抑菌实验进行测试，具体如下：先用20 mM PB，150mM NaCl，pH 7.5缓冲液（简称Buffer）将通过LB培养基37℃过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液稀释10000倍，再按照2%(v/v)加入量分别添加到PlySs2与PlySs2-PIGF蛋白溶液中，保持蛋白PlySs2与PlySs2-PIGF融合蛋白浓度一致，为0.5mg/mL，置于37°C孵育1h，然后分别取100uL上述缓冲液进行涂板培养（LB培养基）。阴性对照则用缓冲液对金黄色葡萄球菌培养液进行稀释到相应的梯度进行涂板培养，同时观察金黄色葡萄球菌的生长情况并作对比。 [0030] 实验结果如表1所示，阴性对照平板上金黄色葡萄球菌的数量达10³左右，而裂解酶PlySs2和融合蛋白PlySs2-PIGF处理过的样品平板上金黄色葡萄球菌的数量显著降低，几乎全被杀死（图2）。结果说明将胶原蛋白结合肽与裂解酶融合并没有影响裂解酶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，抑菌率均达99%以上，对应的平板抑菌效果图如图所示。 [0031]表1.平板中金黄色葡萄球菌菌落数量 [0032] 实施例3、裂解酶PlySs2与PlySs2-PIGF融合蛋白分别与胶原蛋白混合后抑菌效果和稳定性评估 [0033]上述实施例1制备的蛋白样品分别与胶原蛋白（伯纳赫重组人源胶原蛋白）按同等体积混合，浓度均为0.5mg/mL。以上述混合物作为测试对象，检测裂解酶PlySs2与PlySs2-PIGF融合蛋白分别与胶原蛋白混合后的抑菌活性及4℃放置一个月后的抑菌活性评估表征其稳定性。首先测试与胶原蛋白混合后的抑菌活性，以金黄色葡萄球菌GIM 1.481作为抑菌测试菌株,参考WS/T650-2019 5.1.1悬液定量抑菌实验进行测试，具体如下：先用20 mMPB，150mM NaCl，pH 7.5缓冲液（简称Buffer）将通过LB培养基37℃过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液稀释10000倍，再按照2%(v/v)加入量添加到复配后的样品中，置于37°C孵育1h，然后取100uL进行涂板培养（LB培养基）。阴性对照则用缓冲液对金黄色葡萄球菌培养液进行稀释到相应的梯度进行涂板培养。观察金黄色葡萄球菌的生长情况并作对比。 [0034] 实验结果如表2所示，阴性对照平板上金黄色葡萄球菌的数量达10⁴左右，而裂解酶PlySs2、融合蛋白PlySs2-PIGF与胶原蛋白形成的混合物处理过的样品平板上金黄色葡萄球菌的数量显著降低，降低3个数量级以上。结果说明本发明将裂解酶或融合蛋白和胶原蛋白混合后均能实现对金黄色葡萄球菌的杀灭作用，抑菌率达99%以上，赋予胶原蛋白新的抗抑菌活性，胶原蛋白混合物对应的平板抑菌效果图如图3所示。 [0035]表2.平板中金黄色葡萄球菌菌落数量 [0036] [0037]在实际应用过程中，蛋白稳定性是生物活性物质一个重要的表征，也是影响生物活性蛋白实际使用寿命的关键因素，文献曾报道裂解酶PlySs2蛋白可以在4℃储存15天，超过15天蛋白会逐渐失活。本发明中将上述混合物4℃放置一个月后，意外发现PlySs2-PIGF融合蛋白与胶原蛋白混合物仍保持较高的抑菌活性，而单独裂解酶PlySs2与胶原蛋白混合物已失活，与文献报道的裂解酶PlySs2活性周期一致，具体抑菌活性测试方法同上，阴性对照则用缓冲液对金黄色葡萄球菌培养液进行稀释到相应的梯度进行涂板培养，其它对照分别为裂解酶PlySs2和融合蛋白PlySs2-PIGF蛋白溶液，观察金黄色葡萄球菌的生长情况并作对比。 [0038] 实验结果如表3所示。 [0039]表3.平板中金黄色葡萄球菌菌落数量 [0040] [0041]从表中结果可知，阴性对照、PlySs2蛋白溶液、融合蛋白PlySs2-PIGF蛋白溶液，单独裂解酶PlySs2与胶原蛋白混合物处理过的金黄色葡萄球菌平板上的数量均达10³左右，而融合蛋白PlySs2-PIGF胶原蛋白混合物处理过的样品平板上金黄色葡萄球菌的数量显著降低，说明蛋白本身与文献报道的一致，在4℃储存周期较短，放置一个月后对金黄色葡萄球菌失去抑菌活性，结合肽PIGF的融合并没有改变蛋白本身的稳定性，同样PlySs2蛋白与胶原蛋白混合后是两个独立的个体，并没有提升蛋白的稳定性；而融合蛋白PlySs2-PIGF与胶原蛋白混合之后，蛋白与胶原蛋白通过PIGF结合肽结合，形成复合体，提升了蛋白的稳定性，从抑菌结果显示该混合物在4℃放置一个月后还保留较强的抑菌活性，抑菌率可达95%以上，对应的平板抑菌效果图如图4所示。