CN115927417A
审中
无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台
技术领域
[0001]本申请涉及mRNA构建技术领域，尤其涉及一种无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台的构建方法及应用，所述应用包含用所述无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台制备mRNA疫苗或药物。
背景技术
[0002]mRNA，也叫信使RNA(messenger RNA)，负责传递DNA中储存的遗传信息，指导细胞中蛋白质的合成。理论上，应用mRNA技术将修饰后的mRNA分子送入细胞质，mRNA利用细胞质内的氨基酸进行翻译，可以生成任何所需的蛋白质。然而mRNA具有极不稳定、易引发不必要的免疫反应、易被体内外广泛存在的RNA酶降解、依赖于靶细胞中的翻译机制等特征，数十年来，科学家们为之探索。
[0003]研究发现mRNA存在许多化学修饰，在mRNA的稳定性方面具有生物学意义。目前，普遍应用于mRNA的化学修饰有以下几种：N1-和N6-甲基腺苷(m1A，m6A，m6Am)、3-和5-甲基胞嘧啶(m3C，m5C)、5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)、2'-O-甲基化(Nm)和假尿苷(Ψ)。
[0004]在上述化学修饰中，m1A上的甲基会阻断Watson-Crick碱基配对，从而改变mRNA结构，促进翻译起始；m6A是可逆的动态RNA修饰，是RNA代谢调控不可或缺的组成部分，可调节mRNA的稳定性，剪接，转运，定位和翻译；5-甲基胞嘧啶(m5C)影响RNA的结构稳定性和翻译效率，可以促进mRNA的核输出；2'-O-甲基化是RNA的共转录或转录后修饰，可以增加RNA的疏水性，保护其免受核酸酶攻击，稳定RNA的螺旋结构，也可影响RNA与蛋白质或其他RNA的相互作用；假尿苷(Ψ)则是首次发现也是含量最丰富的RNA修饰。Katalin Karikó等人相继发现，将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低；用假尿苷完全替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力；2015年，Oliwia Andries等人发现用N1-甲基假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力；已上市的两款新型冠状病毒mRNA疫苗mRNA-1273(Moderna)和BNT162b2(辉瑞-BioNTech)均使用N1-甲基假尿苷三磷酸(N1mψTP)取代尿苷三磷酸(UTP)。
[0005]从结构上看，真核生物mRNA分子通常含有5'帽子、5'非编码区(5'untranslatedregion,5'UTR)、编码区、3'非编码区(3'UTR)和3'尾部结构。mRNA的帽子结构使得5'端封闭起来，可避免核酸外切酶水解；还可作为蛋白合成系统的辨认信号，被帽子结合蛋白(capbinding protein，eIF-4E)识别并结合，促使mRNA与核糖体小亚基结合，启动翻译过程，发挥稳定mRNA和促进翻译的重要作用。通常可采用帽结构类似物，如：m7GpppG共转录加帽或单独使用加帽酶，如：牛痘病毒加帽酶(VCE,Vaccinia caping enzyme)进行转录后加帽。除了用5'帽子来介导核糖体结合、促进翻译，内部核糖体进入位点序列(Internal ribosomeentry site,IRES)也具有与5'帽子相似的功能。1988年，Pelletier等发现脊髓灰质炎病毒的5'UTR有长约450个核苷酸的P2序列可以指导真核mRNA翻译；Jang等也发现脑心肌炎病毒5'UTR中的一段序列能够指导内部核糖体进入，从而起始翻译；1991年，Macejak等发现在细胞免疫球蛋白重链结合蛋白基因的5'UTR中存在IRES元件；有报道证明了IRES可以在环状mRNA中指导蛋白合成，说明蛋白的翻译可特异性依赖于IRES序列。IRES通过招募不同的反式作用因子来促进核糖体的组装并启动翻译，使得蛋白质翻译起始不依赖于5'帽结构成为可能。
[0006]和mRNA技术相辅相成的是递送技术。由于mRNA链是带负电荷的长链大分子，而细胞膜表面也带有负电荷，静电排斥使得mRNA分子难以穿过细胞膜进入细胞内；加之mRNA是单链分子，非常不稳定，体内的多种酶都能将它迅速降解。因此，将mRNA递送到细胞内部需解决酶降解和静电排斥导致的膜屏障问题。
[0007]随着两款mRNA疫苗被批准，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles,LNPs)被公认为最成功的mRNA递送载体。脂质体(Liposome)是由脂质分子组成的囊泡结构，早在1961年由科学家A.D.Bangham和R.W.Horne在显微镜下发现。1995年，美国FDA批准的第一款脂质体药物Doxil通过HSPC/DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)双组分脂质体包封药物阿霉素(doxorubicin)用于卵巢癌与乳腺癌化疗，以降低游离药物对其他器官的毒性；2018年，美国FDA通过了Onpattro的药物许可，这是一款通过脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle)包封核酸片段(siRNA)的药物，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性的多发性神经病；此次针对COVID-19新型冠状病毒的mRNA疫苗，Moderna公司采用了自主开发的可电离脂质SM102，辉瑞和BioNTech则使用了一种名为ALC-0315的可电离脂质。LNPs不仅能够有效地将mRNA递送到特定的靶细胞，使mRNA避免被降解或清除；同时能及时帮助mRNA从细胞内涵体中逃逸到细胞质中，翻译成相应的蛋白质。
[0008]mRNA在作为新一代的疫苗药物上的应用将会更加广泛。而现有以mRNA制备疫苗的技术及应用中，经过修饰的mRNA并不都能表现出强大的蛋白表达能力；另外，在mRNA递送环节，也缺乏能高效、稳定地递送载体将mRNA递送到特定的细胞中以促进其翻译成目标蛋白。
[0009]因此，亟需构建一种高效、稳定的技术平台，提供构建mRNA的技术及应用基础，以促进mRNA技术的进一步发展。
发明内容
[0010]基于上述技术问题，本申请发明构思在于，提供一种mRNA技术平台，该平台在mRNA的构建技术以及在以构建的mRNA作为疫苗的应用提供技术支持。
[0011]基于上述构思，本申请将在mRNA疫苗制备的各个环节寻找解决方法。mRNA疫苗制备主要包含mRNA合成、mRNA修饰及mRNA递送三个环节。mRNA的修饰和递送尤其影响最终mRNA的表达效果，即mRNA作为疫苗药物的药效。
[0012]在mRNA修饰环节，本申请构思在于采用一种非戴帽结构的修饰方法，在修饰过程中不使用传统技术中的“以假尿苷替代尿苷”形式，采用的是与帽结构具有相似功能的“内部核糖体进入位点序列(IRES)”，IRES能介导核糖体结合、促进mRNA翻译，在表达效率上，相比于传统技术中的“加帽技术”更高。在技术实施上，将IRES序列重组到运载质粒上，其一端与启动子序列相连接，另一端与目的基因(GOI)连接，构建重组质粒，以此重组质粒为模板扩增目标mRNA的DNA模板(或将此重组质粒线性化后作为扩增目标mRNA的DNA模板)，最终以DNA模板转录形成线性目标mRNA。
[0013]传统制备的mRNA，在其结构中，存在3'非编码区(3'UTR)，其连接于编码区和PolyA片段区，在以往的研究结果中，3'非编码区(3'UTR)具有增强mRNA稳定性的作用，本申请实施例中，所制得的mRNA中，去除了3'非编码区(3'UTR)，在最终的翻译表达过程中，仍然取得了很高的表达量，在此研究基础上，本申请提供的mRNA，结构简单，制备效率高，表达效率高。
[0014]在mRNA递送环节，本申请提供一种全新的脂质纳米颗粒(LNPs)作为mRNA递送载体，所述LNPs递送载体能有效地将mRNA递送到特定的靶细胞，使mRNA避免被降解或清除；同时能及时帮助mRNA从细胞内涵体中逃逸到细胞质中，翻译成相应的目标蛋白。
[0015]基于以上构思，本申请提供一种mRNA-LNP的构建方法及应用，所述mRNA-LNP是由脂质纳米粒(LNP)包封的信使核糖核酸链(mRNA)。本申请发明人以此构建方法和应用技术为基础形成了高效、稳定的无帽线性且无修饰尿苷的mRNA技术平台。
[0016]第一方面，本申请提供一种无帽mRNA，其由a、b、c区域依次连接形成线性结构；所述a、b、c区域分别由腺嘌呤(A)核糖核苷酸、鸟嘌呤(G)核糖核苷酸、胞嘧啶(C)核糖核苷酸、尿嘧啶(U)核糖核苷酸中的至少一种组成；其中，
[0017]a为5'非编码区；其含内部核糖体进入位点序列(IRES)，所述IRES用于介导核糖体亚基的内部进入从而指导所述mRNA进行翻译；
[0018]b为编码区；其用于转录形成蛋白质；
[0019]c为poly A片段区，其用于调节mRNA的翻译效率及增强mRNA的稳定性。
[0020]第二方面，本申请提供了一种重组质粒，用于制备第一方面所述的无帽mRNA，其中所述重组质粒为A～C的任一种：
[0021]A.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白胞外域基因gDED，序列如SEQ ID NO：1所示；或与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因gDED编码蛋白相同活性的蛋白的基因；
[0022]B.包含的目的基因为II型单纯疱疹病毒的D型囊膜蛋白截短基因gDFR，序列如SEQID NO：2所示；或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与gDFR编码蛋白相同活性的蛋白的基因；
[0023]C.包含的目的基因为新型冠状病毒S蛋白Delta毒株突变基因SδT，序列如SEQ IDNO：3所示；或与SEQ ID NO：3所示序列具有至少90％以上同源性且编码具有与基因SδT编码蛋白相同活性的蛋白的基因。
[0024]第三方面，本申请提供了一种mRNA-LNP，所述mRNA-LNP为脂质纳米粒包裹信使核糖核酸链，其中所述mRNA-LNP中的mRNA为第一方面所述的无帽mRNA。
[0025]进一步地，其中所述mRNA-LNP中的LNP为辛酸，8-[(2-羟乙基)[6-氧基-6-(十一烷氧基)己基]氨基]]，1-辛基壬基酯和Lipid-1脂质的至少一种，其中Lipid-1脂质的化学结构如
所示。
[0026]第四方面，本申请提供了一种mRNA-LNP的制备方法，其包括：
[0027]将阳离子脂质化合物及辅助分子按比例溶解在乙醇中制备得到乙醇相；
[0028]将第一方面所述的无帽mRNA溶于醋酸钠缓冲液并与乙醇相按比例混合,获得mRNA-LNP混合液；
[0029]浓缩、过滤除菌，获得所述mRNA-LNP。
[0030]进一步地，所述阳离子脂质化合物为辛酸，8-[(2-羟乙基)[6-氧基-6-(十一烷氧基)己基]氨基]]，1-辛基壬基酯和Lipid-1脂质的至少一种，其中Lipid-1脂质的化学结构如
所示。
[0031]进一步地，所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000的至少一种，优选的所述辅助分子为为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。
[0032]进一步地，所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)的至少一种。
[0033]优选地，所述辅助分子为为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)。
[0034]进一步地，所述阳离子脂质化合物及辅助分子在乙醇相混合的摩尔比例为阳离子脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)＝(40～55)∶(5～15)∶(30～45)∶(1～5)，优选的比例为50∶10∶38∶2。
[0035]优选地，mRNA的醋酸钠缓冲液为25mM(mMol/L)、pH＝5。
[0036]优选地，所述醋酸钠缓冲液与乙醇相的混合体积比为4：1。
[0037]第五方面，本申请提供了第一方面所述无帽mRNA、第二面所述重组质粒、第三方面所述mRNA-LNP或第四方面所述构建方法获得的mRNA-LNP在制备疫苗或药物的应用。
[0038]第六方面，本申请提供了一种疫苗或药物，其包含第三方面所述mRNA-LNP或第四方面所述构建方法获得的mRNA-LNP以及药学上可接受的辅料。
[0039]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0040]本申请中涉及一种mRNA-LNP的构建方法及应用，并以此构建方法和应用技术为基础形成高效、稳定的mRNA技术平台。所构建的mRNA，其结构为包括5'非编码区(含IRES)、编码区、poly A片段区的线性结构，所述mRNA结构简易，在体内外表达稳定、表达量高。如分别以二种II型单纯疱疹病毒(HSV2)的D型囊膜蛋白基因及新型冠状病毒S蛋白Delta毒株突变基因为目标基因，构建三种重组质粒，并以此为模板制备三种mRNA，最后通过一种全新的脂质纳米粒载体与前述mRNA制备形成mRNA-LNP，所述方法制备mRNA-LNP的效率高，制备产物稳定、性能好、制备成本低，所制得的mRNA-LNP可用于制备疫苗或药物。
附图说明
[0041]图1为本申请实施例提供的重组质粒表达结构示意图。
[0042]图2为本申请实施例提供的PCR扩增的线性IVT模板浓度散点图。
[0043]图3为本申请实施例提供的IVT合成的线性mRNA琼脂糖胶电泳图。
[0044]图4为本申请实施例提供的线性mRNA纯化前后的峰图比较图。
[0045]图5为本申请实施例提供的制备mRNA-LNP的工艺流程图。
[0046]图6为本申请实施例提供的mRNA-LNP电泳图。
[0047]图7为本申请实施例提供的典型包封后粒径图。
[0048]图8为本申请实施例提供的eGFP-mRNA-LNP在BHK细胞体外转染荧光图。
[0049]图9为本申请实施例提供的SM102及自研阳离子脂质(Lipid-1)体外转染eGFP-mRNA-LNP的荧光图。
[0050]图10为本申请实施例提供的自研阳离子脂质(Lipid-1)包封的Fluc-mRNA-LNP不同时间点的荧光强度图。
[0051]图11为本申请实施例提供的SM102包封的Fluc-mRNA-LNP不同时间点的荧光强度图。
[0052]图12为本申请实施例提供的自研阳离子脂质(Lipid-1)包封的Fluc-mRNA-LNP荧光定量图折线图。
[0053]图13为本申请实施例提供的SM102包封的Fluc-mRNA-LNP荧光定量图折线图。
[0054]图14为本申请实施例提供的注射Fluc-mRNAUTP-LNP和Fluc-mRNAN1mψTP-LNP 4小时后的荧光强度对比图。
[0055]图15为本申请实施例提供的注射Fluc-mRNAUTP-LNP和Fluc-mRNAN1mψTP-LNP 4小时后荧光定量直方图。
[0056]图16为本申请实施例提供的C57BL/6小鼠免疫和采血时间示意图。
[0057]图17为本申请实施例提供的UTP组与N1mψTP组免疫C57BL/6小鼠的血清IgG抗体滴度图。
[0058]图18为本申请实施例提供的叙利亚仓鼠免疫和采血时间示意图。
[0059]图19为本申请实施例提供的不同UTP组免疫叙利亚仓鼠的血清IgG抗体滴度图。
[0060]图20为本申请实施例提供的在UTP组免疫叙利亚仓鼠内检测到的新型冠状病毒Delta和Omicron株中和抗体滴度图。
[0061]图21为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠免疫和采血时间示意图。
[0062]图22为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠体内中和oHSV2病毒的荧光显示图。
[0063]图23为本申请实施例提供的日本大耳白兔免疫和采血时间示意图。
[0064]图24为本申请实施例提供的gD-mRNA-LNP免疫日本大耳白兔的实验结果图。
[0065]图25为本申请实施例提供的gD-mRNA-LNP免疫日本大耳白兔的实验中免疫剂量和途径差异的中和滴度图。
[0066]图26为本申请实施例提供的gD-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠时间图。
[0067]图27为本申请实施例提供的SδT-mRNA-LNP免疫刺激C57BL/6小鼠时间图。
[0068]图28为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠形成IFN-γ细胞因子的斑点图。
[0069]图29为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠形成IFN-γ细胞因子的平均斑点数对比。
[0070]图30为本申请实施例提供的SδT-mRNA-LNP激活T细胞。
[0071]图31为本申请实施例提供的SδT-mRNA-LNP激活T细胞平均数水平。
[0072]图32为本申请实施例提供的肌肉注射不同结构线性化mRNA-LNP后各时间点萤火虫荧光素分布情况，比较加帽/无帽和UTP/N1mψTP的优劣。
[0073]图33为本申请实施例提供的不同结构线性化mRNA-LNP注射体内后各时间点总荧光强度的变化图，比较加帽/无帽和UTP/N1mψTP的优劣。
具体实施方式
[0074]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0075]无帽mRNA及其结构
[0076]本申请实施例中，所述的无帽mRNA由a、b、c区域依次连接形成线性结构；所述a、b、c区域分别由腺嘌呤(A)核糖核苷酸、鸟嘌呤(G)核糖核苷酸、胞嘧啶(C)核糖核苷酸、尿嘧啶(U)核糖核苷酸中的至少一种组成；其中，a为5'非编码区；其含内部核糖体进入位点序列(IRES)，所述IRES用于介导核糖体亚基的内部进入从而指导所述mRNA进行翻译；b为编码区；其用于转录形成蛋白质；c为poly A片段区，其用于调节mRNA的翻译效率及增强mRNA的稳定性。
[0077]区别于传统的加帽环节，本申请实施例中，采用的是与其具有相似功能的“内部核糖体进入位点序列(IRES)”，IRES通过招募不同的反式作用因子来促进核糖体的组装并启动翻译，使得蛋白质翻译起始不依赖于5'帽结构，在表达效率上，相比于传统技术中的“加帽技术”更高。在技术实施上，将IRES序列重组到运载质粒上，其一端与启动子序列相连接，另一端与目的基因(GOI)连接，构建重组质粒，以此重组质粒为模板扩增目标mRNA的DNA模板(或将此重组质粒线性化后作为扩增目标mRNA的DNA模板)，最终以DNA模板转录形成线性目标mRNA。
[0078]现有技术中，多使用N1-甲基假尿苷三磷酸(N1mψTP)取代尿苷三磷酸(UTP)。本申请实施例中，仍使用UTP替代N1mψTP作为合成mRNA的原料，合成效率高且能够降低IVT反应原料成本。
[0079]传统制备的mRNA，在其结构中，存在3'非编码区(3'UTR)，其连接于编码区和PolyA片段区，在以往的研究结果中，3'非编码区(3'UTR)具有增强mRNA稳定性的作用，本申请实施例中，所制得的mRNA中，去除了3'非编码区(3'UTR)，其稳定性并无减弱。
[0080]结合以上所述，本申请实施例提供的无帽线性mRNA，具有全新的、更简易的结构，其制备过程简单，制备成本更低。在最终的翻译表达过程中，mRNA仍然取得了很高的表达量。在此研究基础上，可以开发新结构的mRNA-LNP，并可通过mRNA-LNP制备相关疫苗或药物。
[0081]重组质粒构建
[0082]1、构建重组质粒的运载体质粒为pT7AMP，由本申请人构建。
[0083]2、目的基因(GOI)，由金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0084](1)II型单纯疱疹病毒(HSV2)的D型囊膜蛋白基因(氨基酸序列1～316的HSV2gDED)，其序列如SEQ ID NO：1所示。
[0085](2)II型单纯疱疹病毒(HSV2)的D型囊膜蛋白基因(氨基酸序列1～400的HSV2gDFR)，其序列如SEQ ID NO：2所示。
[0086](3)新型冠状病毒S蛋白delta毒株突变基因，毒株膜外域(1～1202aa)引入脯氨酸突变，S1/S2切割位点RRAR(682-685)突变为GGSG和三聚体基序(SARS-CoV-2-SδT)，其序列如SEQ ID NO：3所示。
[0087](4)萤火虫荧光素酶Fluc基因。
[0088](5)增强的绿色荧光蛋白eGFP基因。
[0089]3、多聚腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(poly A，106bp)由金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0090]4、如图1所示，通过同源重组方式将上述合成基因片段插入到氨苄抗性的pT7AMP载体上(BglⅡ限制内切酶位点)获得五个重组质粒，分别为：
[0091]pT7AMP-gDED、pT7AMP-gDFR、pT7AMP-SδT、pT7AMP-Fluc和pT7AMP-eGFP，所有重组质粒均经序列测定予以确认。
[0092]5、将重组质粒转化大肠杆菌，挑单菌落在含氨苄青霉素(购自Biosharp，BS923-5g)(c＝100μg/μl)的LB培养基中37℃、200rpm培养16～24h，后通过
PlasmidMini Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号DC201-01)提取重组质粒，于－20℃分装保存。
[0093]结果：如图1所示，重组质粒，即mRNA的表达盒的元件，包括T7promoter(T7-P)、Internal Ribosome Entry Sites(IRES)、Gene Of Interest(GOI)和poly A。其中poly A含有106个重复的腺苷三磷酸碱基。目的基因(GOI)(gDED、gDFR、SδT、Fluc及GFP)通过同源重组方法插入到pT7AMP的IRES和Poly A序列之间。所有构建的质粒测序结果显示序列正确。
[0094]制备mRNA的线性转录模板DNA
[0095]1、分别以上述质粒作为反应模板，使用引物对(武汉擎科生物科技有限公司合成)序列如下：
[0096]T7P-F：如SEQ ID NO：4所示；
[0097]pA-R：如SEQ ID NO：5所示。
[0098]2、进行PCR扩增(2×
Flash Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，P510-03)以获得线性化mRNA转录模板。
[0099]PCR扩增反应体系如表1所示：
[0100]表1
[0101]
[0102]PCR扩增程序如表2所示：
[0103]表2
[0104]
[0105]3、使用
RNA BR Assay(Thermo)试剂盒在Qubit 4.0荧光定量仪(Thermo)上检测PCR反应产物的浓度，并在1％的琼脂糖凝胶以120V电压电泳30min，用凝胶成像系统拍照。
[0106]转录模板DNA进行体外转录(IVT)
[0107]1、线性mRNA体外转录方法经DOE(Design Of Experiments)优化，优化后反应体系(200μl)为：
[0108]ATP 5mM(CAT:04980824，Roche，Mannheim)、CTP 5mM(CAT:04980875，Roche，Mannheim)、GTP 5mM(CAT:04980859，Roche，Mannheim)、UTP 5mM(CAT:049879818，Roche，Mannheim)、重组T7 RNA聚合酶1200U(CAT:08140669，购自Roche，Mannheim)、4～7μg转录模板DNA、无机焦磷酸酶3U(CAT:08140677，购自Roche，Mannheim)、RNA酶抑制剂40U(CAT:GMP-E125-HC，购自上海近岸蛋白科技股份有限公司)、10×Transcription Buffer 20μl(配方：400mM Tris-HCl(pH＝7.9)、240mM MgCl2、20mM spermidine，100mM DTT和DEPC水)。如需合成N1-甲基假尿苷三磷酸(N1mψTP)修饰的mRNA，则将尿嘧啶核苷酸(UTP，U)替换为伪N1mψTP(CAT:GPNPU-20210802，武汉唐智生物科技股份公司，中国武汉)。
[0109]2、以上反应体系在37℃恒温反应3小时后收集产物，加入Dnase I(上海近岸蛋白生物科技股份公司)降解反应体系中的DNA，得到mRNA产物并分装保存于－80℃。
[0110]结果：用以上五种重组质粒作为模板经PCR扩增得到线性IVT模板。电泳结果显示五种IVT模板条带单一、无明显杂带且与预期片段大小相符，PCR扩增的五种目的基因(gDED、gDFR、SδT、Fluc和eGFP)的IVT模板大小分别为1834bp、2075bp、1670bp、2528bp、4657bp。如图2所示，紫外分光法或Qubit法测定显示IVT模板浓度为240±100ng/μl。多次重复实验均显示采用PCR扩增可快速获得较高浓度和纯度的IVT模板。
[0111]层析柱纯化
[0112]1、使用AKTA avant(GE，Sweden)层析系统及CIMmμltusTM Oligo dT 18(CAT:411.1219-2，BIA Separations，Slovenia)层析柱纯化上述mRNA初产物。
[0113]2、将mRNA样品与OA(Oligo dT Adjust)Buffer(自制，配方为：50mM磷酸缓冲液，2mM EDTA，1M NaCl)以4:1比例混合调节样品溶液的离子浓度；
[0114]3、将混合后的样品注入AKTA样品环，上样使mRNA被层析柱吸附，上样后以OW(Oligo dT wash)Buffer(自制，配方：50mM磷酸缓冲液，2mM EDTA)淋洗层析柱；
[0115]4、使用注射用水(自制)将mRNA自层析柱洗脱收集，获得纯化后的mRNA原液。
[0116]5、将纯化后的mRNA原液使用SEC-HPLC(SHIMADZU，Japan)检测其浓度，分析柱为TSK gel G6000 PWXL(CAT:0008024，TOSOH，Japan)，流动相为0.02M磷酸缓冲液(自制)，流速1ml/min。
[0117]结果：转录后测量mRNA浓度(电泳和Qubit)和纯度(电泳)，如图3所示，泳道1～7为7次重复的IVT产物，点样1μl，所有IVT的模板均为Fluc mRNA；M为5000bp DNAmarker(Vazyme，China)点样5μl；8～10泳道分别为900、500、250ng RNA参比品。7次重复IVT实验合成的mRNA浓度均在4.3±0.5mg/ml之间，说明经过DOE优化后的IVT合成的mRNA产量高且稳定。
[0118]IVT合成的mRNA再通过CIMmultusTM Oligo dT 18层析柱进行纯化，取少量纯化后的mRNA用HPLC检测其纯度和浓度，如图4所示，SEC-HPLC检测结果显示纯化后mRNA样品的杂峰数量和面积减少，可见mRNA单峰且面积占总峰面积的99％。
[0119]制备脂质纳米颗粒mRNA-LNP
[0120]1、将SM-102(厦门赛诺邦格，06040008800)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)(AVT，S01005)、胆固醇(AVT，O01001)、DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)2000，(AVT，O02005)四种脂质以50∶10∶38∶2的摩尔比溶解在乙醇中制备得到乙醇相。
[0121]2、将溶有mRNA的醋酸钠缓冲液(25mM，pH＝5.0)与乙醇相在体积比为4∶1(水相：乙醇相)的条件下，用微流控混合器(精密纳米系统，加拿大；纳米药物包封机，自研)混合，配方中可电离N∶P为4∶1。
[0122]3、使用超滤离心管(Millpore，30KD)或膜包(Sartorius，30KD)对包封后的mRNA-LNP进行换液浓缩。浓缩液通过0.22μm过滤器除菌，分装保存至-70℃(含8％蔗糖的20mMTris溶液，pH＝7.4)。
[0123]4、mRNA包封率检测
[0124]使用
RNA BR Assay(Thermo)试剂盒在Qubit 4.0荧光定量仪(Thermo)上检测mRNA的浓度。参照说明书分别测量同一样本的游离mRNA含量(Cf)和用1％(v/v)TritonX-100(Sigma)破乳后的mRNA含量(Ct)计算mRNA的百分包封率(Encapsulationpercentage，EN％)。包封率计算公式为EN％＝(1-Cf/Ct)×100％。
[0125]结果：对六种mRNA包括gDED-mRNA、gDFR-mRNA、SδT-mRNAN1mψTP(N1mψTP置换了UTP)、SδT、Fluc-mRNA、Fluc-mRNAN1mψTP(合成时N1mψTP置换了UTP)进行了包封用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA-LNP发现，如图5所示，将mRNA和脂质在微流体混合器中混合，制成脂质颗粒mRNA-LNP。用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA-LNP发现，120V电压下电泳至少30分钟，包封后的mRNA不能从点样孔迁出而滞留在点样孔中，如图6所示，相应泳道上未见预期大小的mRNA条带。mRNA浓度测定显示六种mRNA的包封率均大于90％。
[0126]表3显示了4种mRNA包封后的游离mRNA含量(Cf)、总mRNA含量(Ct)和包封效率。去除包封系统中的非水溶剂后，各个mRNA-LNP的粒径(Z-average)均在70～100nm之间，如图7所示，聚合物分散性指数(PDI)均小于0.2。
[0127]表3
[0128]
[0129]mRNA-LNP体外转染
[0130]1、BHK细胞(Baby Hamster Kidney)(购于ATCC)；胎牛血清(购于浙江天杭生物科技股份有限公司；110-11-86-11)；高糖DMEM(购于普诺赛；PM150210)；六孔板(购于BIOFIL；TCP10006)
[0131]2、将BHK细胞以2×105个/孔接种于6孔板中。24小时后细胞汇合度达到60～70％时，将孔内培养基更换成2ml新鲜的5％FBS的高糖DMEM培养基。以3～4μg/孔，沿板壁缓慢加入mRNA-LNP，摇晃均匀。37℃、5％CO2环境下培养4小时，观察细胞转染情况。
[0132]结果：无帽线性结构的eGFP-mRNA-LNP可以转染多种细胞，转染方法简便易行。以BHK细胞为例，如图8所示，转染eGFP-mRNA-LNP(不需移除eGFP-mRNA-LNP和换液)4小时后可观察到eGFP绿色荧光蛋白基因在细胞中表达，且细胞形态完整、边界清晰。说明LNP包封的无帽结构的eGFP-mRNA可以快速地通过细胞内吞作用进入细胞质中，并有效地翻译目的蛋白，同时eGFP-mRNA-LNP未表现出明显的细胞毒性。无帽结构的eGFP-mRNA-LNP还能转染293T等细胞。如图9所示，用SM102或自研阳离子脂质(Lipid-1)包封的eGFP-mRNA-LNP均能简便易行地转染细胞。
[0133]mRNA-LNP的体内动物实验
[0134]1、实验动物来源
[0135]所有动物实验均严格按照湖北省实验动物管理和使用委员会的要求进行。
[0136]本实施例实验动物有6～8周龄的雌性C57BL/6小鼠(合格证号(No.42000600043578)、5周龄雌性叙利亚仓鼠(合格证号：No.42000400012878)、5周龄雌性日本大耳白兔，均购自湖北省疾病预防控制中心。
[0137]动物在受控的环境中自由获得水和食物，光照/黑暗周期为12小时。
[0138]2、动物模型构建
[0139]A.Fluc-LNP模型
[0140]在C57BL/6小鼠大腿肌肉分别注射LNP包封的线性mRNA，即Fluc-mRNAUTP-LNP、Fluc-mRNAN1mψTP-LNP两种mRNA。
[0141]4小时后，在C57BL/6小鼠腹腔注射100μl D-荧光素钾盐(购于上海碧云天生物技术有限公司，15mg/ml)，10min时使用IVIS成像系统(珀金埃尔默)记录成像。
[0142]B、SδT-mRNA-LNP免疫模型
[0143]分别在第0、14天于C57BL/6小鼠大腿肌肉处注射LNP包封的线性mRNA，即SδT-mRNA-LNP；
[0144]分别在第0、21天于叙利亚仓鼠的大腿肌肉处注射LNP包封的线性mRNA，即SδT-mRNA-LNP；
[0145]对免疫前后的C57BL/6小鼠进行眼眶采血、免疫前后叙利亚仓鼠进行心脏采血并分离血清，用于检测IgG抗体滴度和/或中和抗体滴度。
[0146]C、gD-mRNA-LNP免疫模型
[0147]分别在第0、14、49天于C57BL/6小鼠大腿肌肉注射LNP包封的线性mRNA，即gDED-mRNA-LNP、gDFR-mRNA-LNP两种mRNA。对免疫前后的小鼠进行眼眶采血并分离血清，用于检测中和抗体滴度。
[0148]分别在第0、14天于日本大耳白兔的后颈部皮内注射及后腿部肌肉部位注射不同剂量LNP包封的线性mRNA，即gDED-mRNA-LNP、gDFR-mRNA-LNP两种mRNA。采集免疫前后取兔耳中静脉血并分离血清，用于检测中和抗体滴度。
[0149]3、ELISA检测
[0150]A.新型冠状病毒S三聚体特异性IgG表达量检测
[0151]a.试剂：
[0152]SARS-CoV-2(B.1.617.2)Spike(S)Protein购于南京诺唯赞生物科技公司(GC221-01)，初始浓度2.6mg/ml；
[0153]吐温-20购于国药集团化学试剂有限公司(货号：30189328)；
[0154]牛血清白蛋白(BSA)购于BioFroxx公司(货号：4240GR025)；
[0155]96孔酶标板购于Thermo公司(货号：446469)；
[0156]硫酸购于国药集团化学试剂有限公司(货号：10021628)。
[0157]b.实验步骤：
[0158]用SARS-CoV-2(B.1.617.2)Spike(S)Protein以100ng/孔包被，4℃过夜；
[0159]次日，使用洗涤液(0.05％吐温-PBST)洗板，再用1％BSA-PBST封闭酶标板2小时；
[0160]C57BL/6小鼠血清样本从1:1000开始，做2倍连续倍比稀释；叙利亚仓鼠血清样本梯度稀释至1:2×104后，做2倍连续倍比稀释；
[0161]将各浓度血清依次加入到封闭好的酶标板中，37℃孵育60分钟。用洗涤液洗板3次后加入对应的辣根过氧化物酶(HRP)结合抗体(羊抗鼠IgG 1:2000，proteintech，SA00001-1；兔抗仓鼠IgG 1:5000，Jackson ImmunoResearch，307-035-003)，37℃孵育60分钟；
[0162]用洗涤液充分洗板后加入TMB显色液(索莱宝，PR1200)，37℃孵育5分钟后，用2M硫酸终止显色。使用酶标仪(赛默飞)读取吸光度(450nm)。
[0163]4、抗体中和作用测定
[0164]通过固定病毒数量-稀释血清法评价血清抗体的中和作用。将血清样本从1:8开始做2倍连续倍比稀释。将稀释后血清与含有100CCID50的oHSV2-GFP(in house)病毒液充分混合，得到血清-病毒混合液。按照混合液体积补充青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)，37℃孵育1小时。向培养有单层Vero细胞的96孔微量滴定板接种等量血清-病毒混合液，37℃，5％CO2孵育48小时。使用High Content Analysis System(PE)检测孔内荧光表达情况。通过GFP表达率评估抗体中和滴度。
[0165]通过固定血清稀释度-稀释病毒法评价血清内抗体的中和能力。将oHSV2-GFP病毒从1:2开始做2倍连续倍比稀释，得到含不同数量病毒(1.5×103～1.0×105CCID50)的悬液。将各病毒悬液与血清混匀得到病毒-血清混合液。按照混合液体积补充青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)，37℃孵育1小时。向培养有单层Vero细胞的96孔微量滴定板接种病毒-血清混合液，37℃，5％CO2孵育48小时。使用High Content Analysis System检测到的荧光表达情况和细胞病变程度评价血清内抗体的中和能力。
[0166]结果：
[0167]1、无帽线性结构的Fluc-mRNA-LNP(分别包封有本申请发明人自研阳离子脂质Lipid-1和脂质SM102)体内转染可产生持久和高产量的表达。如图10～11所示，对小鼠肌肉给药(n＝5，Lipid-1；n＝3，SM102)，在不同时间点观察小鼠体内Fluc激发的荧光强度，如图12～13所示，发现注射部位附近荧光强度随时间先增后减，自研阳离子脂质Lipid-1和脂质SM102包封的mRNA-LNP-Fluc分别在体内持续至少72和94小时。说明在体内无帽线性结构的Fluc-mRNA可通过LNP在小鼠体内高效地表达。
[0168]2、如图14～15所示，C57BL/6小鼠肌肉注射Fluc-mRNAN1mψTP-LNP于4小时后平均荧光强度为8.04×105±1.43×106(均值±标准差，n＝8)，而注射Fluc-mRNAUTP-LNP的平均荧光强度(Radiance/p/sec/cm2/sr)为2.29×108±1.04×108(均值±标准差，n＝4)。说明无帽线性结构的mRNA-LNP，采用UTP的mRNA可获得更高的表达量。
[0169]3、初次免疫记为第0天，按图16所示，在第0、14天对C57BL/6小鼠分别免疫。实验分为三个组，分别为：
[0170]UTP组：30μg/100μl/只(n＝3)；
[0171]N1mψTP组：30μg/100μl/只(n＝3)；
[0172]空白组：无免疫(n＝3)。
[0173]第28天采血分离血清并检测血清IgG抗体滴度。
[0174]结果：如图17所示，UTP组平均滴度为1：26666；N1mψTP组和空白组均为0。统计学分析显示UTP组滴度与空白小鼠组和N1mψTP组比较存在显著性差异(P＝0.0075；t-test)。
[0175]4、在另一个实验中，初次给药记为第0天，按如图18所示，在第0和21天对叙利亚仓鼠肌肉注射SδT-mRNA-LNP进行免疫。实验分四组，分别为：
[0176]UTP组25μg：25μg/100μl/只(n＝3)；
[0177]UTP组50μg：50μg/100μl/只(n＝3)；
[0178]UTP组100μg：100μg/100μl/只(n＝3)；
[0179]空白组(n＝3)无免疫。
[0180]第35天采血分离血清并检测血清IgG抗体滴度。
[0181]结果：如图19所示，三个UTP组(25μg,50μg和100μg剂量组)的IgG抗体平均滴度分别为(3.47±1.62)×106、(2.35±1.40)×107、(1.92±0.64)×107。
[0182]如图20所示，在三只UTP组的叙利亚仓鼠体内注射SδT-mRNA-LNP产生的抗体能有效中和新型冠状病毒Delta和Omicron株
[0183]5、gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP免疫后动物产生中和力强的抗体，初次免疫记为第0天，按图21所示，在第0、14和49天对实验组小鼠肌肉注射gDED-mRNA-LNP(30μg/100μl/只，n＝5)和gDFR-mRNA-LNP(30μg/100μl/只，n＝5)。
[0184]在第0、28、52天采血分离血清检测中和抗体。将1μl血清与含6250CCID50的oHSV2-GFP病毒充分混合并孵育1小时后接种到单层Vero细胞孔中，通过GFP表达率评估抗体中和滴度。
[0185]结果：如图22示所示，所有未免疫组血清病毒混合液处理的细胞均有GFP产生，且可见典型的病毒复制导致的噬毒斑；
[0186]gDED-mRNA-LNP组以及gDFR-mRNA-LNP组的血清病毒混合液(含6250CCID50病毒)处理的细胞均未见GFP和噬毒斑：
[0187]以上结果说明无帽线性且无修饰尿苷结构的mRNA体内表达的两种gD抗原免疫C57BL/6小鼠均能诱导产生中和抗体。
[0188]6、在另一个实验中，初次免疫记为第0天，如图23所示，在第0和14天，在日本大耳白兔后颈部皮内注射200μl(20μg)mRNA-LNP-gDED，在另外两只日本大耳白兔后腿部肌肉部位分别注射250μl(25μg)mRNA-LNP-gDED和500μl(50μg)mRNA-LNP-gDED。
[0189]在0、14、28天于耳中动脉采血分离血清检测中和抗体。为了评估mRNA-LNP-gDED免疫日本大耳白兔后产生抗体的中和效力，进行了活病毒中和滴定。
[0190]结果：如图24所示，免疫前后的血清比较，免疫后的血清对病毒有明显的中和作用。在皮内注射组，1μl血清可完全中和40960CCID50病毒(oHSV2-GFP)，无GFP和噬毒斑产生；血清稀释128倍时还能完全中和100CCID50病毒。而肌肉注射两组的中和效果均弱于皮内注射组，50μg肌肉注射组，血清稀释至64倍时，不能完全中和病毒，出现噬毒斑；25μg肌肉注射组，血清稀释16倍时就不能完全中和病毒。图25显示了免疫剂量和途径差异的中和滴度，为了排除补体对于实验的影响，本申请实施例中进行了补体灭活，实验结果显示补体灭活组与未灭活组效果一致，补体对中和实验未造成影响。最后的结论是，gDED-mRNA-LNP免疫(经皮内或肌内注射)后的兔血清样品可以中和oHSV2-eGFP病毒。
[0191]无帽线性mRNA-LNP激活细胞免疫实验
[0192]1、实验材料和试剂：
[0193]小鼠IFN-γELISpot PLUS试剂盒购自Mabtech(CAT：3321-4APW-2)；PMA+离子霉素购自深圳大科威生物工程有限公司(CAT：2030421)；SARS-CoV-2(B.1.617.2)S蛋白购自南京维泽生物科技有限公司(CAT：GC221-01)；OH2病毒，来源于HSV2 HG52株的oHSV2 hGM-CSF(47)，由本申请发明人自制。
[0194]2、分别在第0天、第14天和第21天，将gDED-mRNA-LNP、gDFR-mRNA-LNP及SδT-mRNA-LNP注射到C57BL/6小鼠大腿肌肉。在指定的时间点，移除免疫小鼠的脾脏，分离脾细胞以检测特异性T细胞。
[0195]3、T细胞检测：
[0196]gD特异性或SδT特异性T细胞的检测步骤如下：将3～5×105个脾细胞/孔和106个经紫外线灭活30分钟的CCID50/孔OH2病毒(或4μg/孔SARS-CoV-2S蛋白)混合并在37℃孵育。
[0197]48小时后，第一次用PBS洗涤5次，然后加入探针抗体(R4-6A2-生物素，1μg/μl)并在室温下孵育2小时。
[0198]第二次用PBS洗涤5次后，添加标记有链霉亲和素的碱性磷酸酶(链霉亲和素ALP，1:1000)，并在室温下培养1小时。
[0199]第三次用PBS洗涤5次后，添加标记有链霉亲和素的碱性磷酸酶(链霉亲和素ALP，1:1000)，并在室温下培养1小时。
[0200]再次用PBS洗涤5次后，添加显色溶液(BCIP/NBT plus)，并在室温下培养10分钟；然后用去离子水停止显色。
[0201]溶液干燥后，使用酶联斑点分析仪(AID ELISpot Reader Classic，AutomuninDiagnostika GmbH)读取和分析ELISpot平板上孔中出现的斑点数量。采用GraphPad Prismv8.0.1软件对数据进行Student's t-test检验分析。
[0202]4、实验结果：
[0203](1)ELISpot分析表明，注射过gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP或SδT-mRNA-LNP的动物产生针对特定抗原的特异性T细胞。第一次免疫记录为第0天，如图26～27所示，在指定日期对C57BL/6小鼠进行免疫。在gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP免疫的实验中，分为三组，注射量分别为：gDED-mRNA-LNP组(30μg/100μl/单位，n＝8)、gDFR-mRNA-LNP组(30μg/100μl/单位，n＝8)和免疫前(未接种)组(未接种，n＝8)。
[0204]第21天时，每组取4只C57BL/6小鼠的脾脏组织进行ELISpot检测，每组剩余4只C57BL/6小鼠进行相同剂量的二次强化免疫，第28天取小鼠脾脏组织检测特异性T细胞。
[0205]将3×105个脾细胞与106个经紫外线灭活的OH2病毒CCID50混合30分钟，孵育48小时后，通过脾细胞分泌的IFN-γ细胞因子形成的斑点数检测特异性T细胞。如图28～29所示，对于第28天采集的脾脏数据，两个实验组(gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP)中IFN-γ细胞因子形成的平均斑点数与对照组中IFN-γ细胞因子形成的平均斑点数相比存在显著差异。
[0206]结果表明，在C57BL/6小鼠体内，由无帽线性且无修饰尿苷的mRNA结构翻译的两种gD抗原可激活特异性T细胞。
[0207](2)如图27所示，将第32天获得的SδT-mRNA-LNP免疫脾细胞与SARS-CoV-2S蛋白(作为刺激物)混合，然后进行ELISpot分析，如图30～31所示，在C57BL/6小鼠体内，由无帽线性且无修饰尿苷的mRNA结构翻译的S蛋白三聚体抗原可激活特异性T细胞。
[0208]无帽线性和加帽mRNA体内转染对比实验
[0209]为了进一步验证不同结构的mRNA在体内递送与表达效率，本申请实施例进行了加帽mRNA和无帽线性mRNA体内转染对比实验。本申请实施例中的重组质粒构建、mRNA-LNP制备、小鼠模型构建等参考本申请前述方法。
[0210]将7周龄的雌性BABL/c小鼠分成加帽mRNA组、无帽线性mRNA组及对照组，其中：
[0211]加帽mRNA组有两组，一组为加帽天然尿苷组(Cap UTP 30μg)、另一组为加帽修饰尿苷(Cap N1mΨTP 30μg)；每组有6只小鼠；
[0212]无帽线性mRNA组有两组，一组为30μg无帽天然尿苷组(Uncapped UTP 30μg)、另一组为10μg无帽天然尿苷组(Uncapped UTP 10μg)；每组有6只小鼠；
[0213]空白对照组(Negative control)：不处理，3只小鼠；
[0214]实验时，以上各实验组肌肉注射相应剂量的经LNP包封的加帽或无帽萤火虫荧光素酶mRNA，于各时间点观察小鼠体内荧光强度以及持续时间。
[0215]结果：如图32～33所示，小鼠体内注射部位以及肝脏部位荧光强度在注射后4小时均可达到108P/S(Photons per second)，随着时间推移，荧光强度逐渐下降，第7天，荧光强度降低到103P/S，且无帽线性结构和加帽结构mRNA的总体表达趋势一致。
[0216]以上结果表明，本申请实施例中，本申请提供的无帽天然尿苷结构的线性mRNA与传统加帽、修饰尿苷的mRNA体内递送与表达效率基本一致，均可实现目的基因的体内高效、持久表达。
[0217]以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
所示。
[0026]第四方面，本申请提供了一种mRNA-LNP的制备方法，其包括：
[0027]将阳离子脂质化合物及辅助分子按比例溶解在乙醇中制备得到乙醇相；
[0028]将第一方面所述的无帽mRNA溶于醋酸钠缓冲液并与乙醇相按比例混合,获得mRNA-LNP混合液；
[0029]浓缩、过滤除菌，获得所述mRNA-LNP。
[0030]进一步地，所述阳离子脂质化合物为辛酸，8-[(2-羟乙基)[6-氧基-6-(十一烷氧基)己基]氨基]]，1-辛基壬基酯和Lipid-1脂质的至少一种，其中Lipid-1脂质的化学结构如所示。
[0031]进一步地，所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000的至少一种，优选的所述辅助分子为为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。
[0032]进一步地，所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)的至少一种。
[0033]优选地，所述辅助分子为为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇及DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)。
[0034]进一步地，所述阳离子脂质化合物及辅助分子在乙醇相混合的摩尔比例为阳离子脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)＝(40～55)∶(5～15)∶(30～45)∶(1～5)，优选的比例为50∶10∶38∶2。
[0035]优选地，mRNA的醋酸钠缓冲液为25mM(mMol/L)、pH＝5。
[0036]优选地，所述醋酸钠缓冲液与乙醇相的混合体积比为4：1。
[0037]第五方面，本申请提供了第一方面所述无帽mRNA、第二面所述重组质粒、第三方面所述mRNA-LNP或第四方面所述构建方法获得的mRNA-LNP在制备疫苗或药物的应用。
[0038]第六方面，本申请提供了一种疫苗或药物，其包含第三方面所述mRNA-LNP或第四方面所述构建方法获得的mRNA-LNP以及药学上可接受的辅料。
[0039]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0040]本申请中涉及一种mRNA-LNP的构建方法及应用，并以此构建方法和应用技术为基础形成高效、稳定的mRNA技术平台。所构建的mRNA，其结构为包括5'非编码区(含IRES)、编码区、poly A片段区的线性结构，所述mRNA结构简易，在体内外表达稳定、表达量高。如分别以二种II型单纯疱疹病毒(HSV2)的D型囊膜蛋白基因及新型冠状病毒S蛋白Delta毒株突变基因为目标基因，构建三种重组质粒，并以此为模板制备三种mRNA，最后通过一种全新的脂质纳米粒载体与前述mRNA制备形成mRNA-LNP，所述方法制备mRNA-LNP的效率高，制备产物稳定、性能好、制备成本低，所制得的mRNA-LNP可用于制备疫苗或药物。
附图说明
[0041]图1为本申请实施例提供的重组质粒表达结构示意图。
[0042]图2为本申请实施例提供的PCR扩增的线性IVT模板浓度散点图。
[0043]图3为本申请实施例提供的IVT合成的线性mRNA琼脂糖胶电泳图。
[0044]图4为本申请实施例提供的线性mRNA纯化前后的峰图比较图。
[0045]图5为本申请实施例提供的制备mRNA-LNP的工艺流程图。
[0046]图6为本申请实施例提供的mRNA-LNP电泳图。
[0047]图7为本申请实施例提供的典型包封后粒径图。
[0048]图8为本申请实施例提供的eGFP-mRNA-LNP在BHK细胞体外转染荧光图。
[0049]图9为本申请实施例提供的SM102及自研阳离子脂质(Lipid-1)体外转染eGFP-mRNA-LNP的荧光图。
[0050]图10为本申请实施例提供的自研阳离子脂质(Lipid-1)包封的Fluc-mRNA-LNP不同时间点的荧光强度图。
[0051]图11为本申请实施例提供的SM102包封的Fluc-mRNA-LNP不同时间点的荧光强度图。
[0052]图12为本申请实施例提供的自研阳离子脂质(Lipid-1)包封的Fluc-mRNA-LNP荧光定量图折线图。
[0053]图13为本申请实施例提供的SM102包封的Fluc-mRNA-LNP荧光定量图折线图。
[0054]图14为本申请实施例提供的注射Fluc-mRNAUTP-LNP和Fluc-mRNAN1mψTP-LNP 4小时后的荧光强度对比图。
[0055]图15为本申请实施例提供的注射Fluc-mRNAUTP-LNP和Fluc-mRNAN1mψTP-LNP 4小时后荧光定量直方图。
[0056]图16为本申请实施例提供的C57BL/6小鼠免疫和采血时间示意图。
[0057]图17为本申请实施例提供的UTP组与N1mψTP组免疫C57BL/6小鼠的血清IgG抗体滴度图。
[0058]图18为本申请实施例提供的叙利亚仓鼠免疫和采血时间示意图。
[0059]图19为本申请实施例提供的不同UTP组免疫叙利亚仓鼠的血清IgG抗体滴度图。
[0060]图20为本申请实施例提供的在UTP组免疫叙利亚仓鼠内检测到的新型冠状病毒Delta和Omicron株中和抗体滴度图。
[0061]图21为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠免疫和采血时间示意图。
[0062]图22为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠体内中和oHSV2病毒的荧光显示图。
[0063]图23为本申请实施例提供的日本大耳白兔免疫和采血时间示意图。
[0064]图24为本申请实施例提供的gD-mRNA-LNP免疫日本大耳白兔的实验结果图。
[0065]图25为本申请实施例提供的gD-mRNA-LNP免疫日本大耳白兔的实验中免疫剂量和途径差异的中和滴度图。
[0066]图26为本申请实施例提供的gD-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠时间图。
[0067]图27为本申请实施例提供的SδT-mRNA-LNP免疫刺激C57BL/6小鼠时间图。
[0068]图28为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠形成IFN-γ细胞因子的斑点图。
[0069]图29为本申请实施例提供的gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP免疫C57BL/6小鼠形成IFN-γ细胞因子的平均斑点数对比。
[0070]图30为本申请实施例提供的SδT-mRNA-LNP激活T细胞。
[0071]图31为本申请实施例提供的SδT-mRNA-LNP激活T细胞平均数水平。
[0072]图32为本申请实施例提供的肌肉注射不同结构线性化mRNA-LNP后各时间点萤火虫荧光素分布情况，比较加帽/无帽和UTP/N1mψTP的优劣。
[0073]图33为本申请实施例提供的不同结构线性化mRNA-LNP注射体内后各时间点总荧光强度的变化图，比较加帽/无帽和UTP/N1mψTP的优劣。
具体实施方式
[0074]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0075]无帽mRNA及其结构
[0076]本申请实施例中，所述的无帽mRNA由a、b、c区域依次连接形成线性结构；所述a、b、c区域分别由腺嘌呤(A)核糖核苷酸、鸟嘌呤(G)核糖核苷酸、胞嘧啶(C)核糖核苷酸、尿嘧啶(U)核糖核苷酸中的至少一种组成；其中，a为5'非编码区；其含内部核糖体进入位点序列(IRES)，所述IRES用于介导核糖体亚基的内部进入从而指导所述mRNA进行翻译；b为编码区；其用于转录形成蛋白质；c为poly A片段区，其用于调节mRNA的翻译效率及增强mRNA的稳定性。
[0077]区别于传统的加帽环节，本申请实施例中，采用的是与其具有相似功能的“内部核糖体进入位点序列(IRES)”，IRES通过招募不同的反式作用因子来促进核糖体的组装并启动翻译，使得蛋白质翻译起始不依赖于5'帽结构，在表达效率上，相比于传统技术中的“加帽技术”更高。在技术实施上，将IRES序列重组到运载质粒上，其一端与启动子序列相连接，另一端与目的基因(GOI)连接，构建重组质粒，以此重组质粒为模板扩增目标mRNA的DNA模板(或将此重组质粒线性化后作为扩增目标mRNA的DNA模板)，最终以DNA模板转录形成线性目标mRNA。
[0078]现有技术中，多使用N1-甲基假尿苷三磷酸(N1mψTP)取代尿苷三磷酸(UTP)。本申请实施例中，仍使用UTP替代N1mψTP作为合成mRNA的原料，合成效率高且能够降低IVT反应原料成本。
[0079]传统制备的mRNA，在其结构中，存在3'非编码区(3'UTR)，其连接于编码区和PolyA片段区，在以往的研究结果中，3'非编码区(3'UTR)具有增强mRNA稳定性的作用，本申请实施例中，所制得的mRNA中，去除了3'非编码区(3'UTR)，其稳定性并无减弱。
[0080]结合以上所述，本申请实施例提供的无帽线性mRNA，具有全新的、更简易的结构，其制备过程简单，制备成本更低。在最终的翻译表达过程中，mRNA仍然取得了很高的表达量。在此研究基础上，可以开发新结构的mRNA-LNP，并可通过mRNA-LNP制备相关疫苗或药物。
[0081]重组质粒构建
[0082]1、构建重组质粒的运载体质粒为pT7AMP，由本申请人构建。
[0083]2、目的基因(GOI)，由金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0084](1)II型单纯疱疹病毒(HSV2)的D型囊膜蛋白基因(氨基酸序列1～316的HSV2gDED)，其序列如SEQ ID NO：1所示。
[0085](2)II型单纯疱疹病毒(HSV2)的D型囊膜蛋白基因(氨基酸序列1～400的HSV2gDFR)，其序列如SEQ ID NO：2所示。
[0086](3)新型冠状病毒S蛋白delta毒株突变基因，毒株膜外域(1～1202aa)引入脯氨酸突变，S1/S2切割位点RRAR(682-685)突变为GGSG和三聚体基序(SARS-CoV-2-SδT)，其序列如SEQ ID NO：3所示。
[0087](4)萤火虫荧光素酶Fluc基因。
[0088](5)增强的绿色荧光蛋白eGFP基因。
[0089]3、多聚腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(poly A，106bp)由金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0090]4、如图1所示，通过同源重组方式将上述合成基因片段插入到氨苄抗性的pT7AMP载体上(BglⅡ限制内切酶位点)获得五个重组质粒，分别为：
[0091]pT7AMP-gDED、pT7AMP-gDFR、pT7AMP-SδT、pT7AMP-Fluc和pT7AMP-eGFP，所有重组质粒均经序列测定予以确认。
[0092]5、将重组质粒转化大肠杆菌，挑单菌落在含氨苄青霉素(购自Biosharp，BS923-5g)(c＝100μg/μl)的LB培养基中37℃、200rpm培养16～24h，后通过PlasmidMini Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号DC201-01)提取重组质粒，于－20℃分装保存。
[0093]结果：如图1所示，重组质粒，即mRNA的表达盒的元件，包括T7promoter(T7-P)、Internal Ribosome Entry Sites(IRES)、Gene Of Interest(GOI)和poly A。其中poly A含有106个重复的腺苷三磷酸碱基。目的基因(GOI)(gDED、gDFR、SδT、Fluc及GFP)通过同源重组方法插入到pT7AMP的IRES和Poly A序列之间。所有构建的质粒测序结果显示序列正确。
[0094]制备mRNA的线性转录模板DNA
[0095]1、分别以上述质粒作为反应模板，使用引物对(武汉擎科生物科技有限公司合成)序列如下：
[0096]T7P-F：如SEQ ID NO：4所示；
[0097]pA-R：如SEQ ID NO：5所示。
[0098]2、进行PCR扩增(2×Flash Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，P510-03)以获得线性化mRNA转录模板。
[0099]PCR扩增反应体系如表1所示：
[0100]表1
[0101]
[0102]PCR扩增程序如表2所示：
[0103]表2
[0104]
[0105]3、使用RNA BR Assay(Thermo)试剂盒在Qubit 4.0荧光定量仪(Thermo)上检测PCR反应产物的浓度，并在1％的琼脂糖凝胶以120V电压电泳30min，用凝胶成像系统拍照。
[0106]转录模板DNA进行体外转录(IVT)
[0107]1、线性mRNA体外转录方法经DOE(Design Of Experiments)优化，优化后反应体系(200μl)为：
[0108]ATP 5mM(CAT:04980824，Roche，Mannheim)、CTP 5mM(CAT:04980875，Roche，Mannheim)、GTP 5mM(CAT:04980859，Roche，Mannheim)、UTP 5mM(CAT:049879818，Roche，Mannheim)、重组T7 RNA聚合酶1200U(CAT:08140669，购自Roche，Mannheim)、4～7μg转录模板DNA、无机焦磷酸酶3U(CAT:08140677，购自Roche，Mannheim)、RNA酶抑制剂40U(CAT:GMP-E125-HC，购自上海近岸蛋白科技股份有限公司)、10×Transcription Buffer 20μl(配方：400mM Tris-HCl(pH＝7.9)、240mM MgCl2、20mM spermidine，100mM DTT和DEPC水)。如需合成N1-甲基假尿苷三磷酸(N1mψTP)修饰的mRNA，则将尿嘧啶核苷酸(UTP，U)替换为伪N1mψTP(CAT:GPNPU-20210802，武汉唐智生物科技股份公司，中国武汉)。
[0109]2、以上反应体系在37℃恒温反应3小时后收集产物，加入Dnase I(上海近岸蛋白生物科技股份公司)降解反应体系中的DNA，得到mRNA产物并分装保存于－80℃。
[0110]结果：用以上五种重组质粒作为模板经PCR扩增得到线性IVT模板。电泳结果显示五种IVT模板条带单一、无明显杂带且与预期片段大小相符，PCR扩增的五种目的基因(gDED、gDFR、SδT、Fluc和eGFP)的IVT模板大小分别为1834bp、2075bp、1670bp、2528bp、4657bp。如图2所示，紫外分光法或Qubit法测定显示IVT模板浓度为240±100ng/μl。多次重复实验均显示采用PCR扩增可快速获得较高浓度和纯度的IVT模板。
[0111]层析柱纯化
[0112]1、使用AKTA avant(GE，Sweden)层析系统及CIMmμltusTM Oligo dT 18(CAT:411.1219-2，BIA Separations，Slovenia)层析柱纯化上述mRNA初产物。
[0113]2、将mRNA样品与OA(Oligo dT Adjust)Buffer(自制，配方为：50mM磷酸缓冲液，2mM EDTA，1M NaCl)以4:1比例混合调节样品溶液的离子浓度；
[0114]3、将混合后的样品注入AKTA样品环，上样使mRNA被层析柱吸附，上样后以OW(Oligo dT wash)Buffer(自制，配方：50mM磷酸缓冲液，2mM EDTA)淋洗层析柱；
[0115]4、使用注射用水(自制)将mRNA自层析柱洗脱收集，获得纯化后的mRNA原液。
[0116]5、将纯化后的mRNA原液使用SEC-HPLC(SHIMADZU，Japan)检测其浓度，分析柱为TSK gel G6000 PWXL(CAT:0008024，TOSOH，Japan)，流动相为0.02M磷酸缓冲液(自制)，流速1ml/min。
[0117]结果：转录后测量mRNA浓度(电泳和Qubit)和纯度(电泳)，如图3所示，泳道1～7为7次重复的IVT产物，点样1μl，所有IVT的模板均为Fluc mRNA；M为5000bp DNAmarker(Vazyme，China)点样5μl；8～10泳道分别为900、500、250ng RNA参比品。7次重复IVT实验合成的mRNA浓度均在4.3±0.5mg/ml之间，说明经过DOE优化后的IVT合成的mRNA产量高且稳定。
[0118]IVT合成的mRNA再通过CIMmultusTM Oligo dT 18层析柱进行纯化，取少量纯化后的mRNA用HPLC检测其纯度和浓度，如图4所示，SEC-HPLC检测结果显示纯化后mRNA样品的杂峰数量和面积减少，可见mRNA单峰且面积占总峰面积的99％。
[0119]制备脂质纳米颗粒mRNA-LNP
[0120]1、将SM-102(厦门赛诺邦格，06040008800)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)(AVT，S01005)、胆固醇(AVT，O01001)、DMG-1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)2000，(AVT，O02005)四种脂质以50∶10∶38∶2的摩尔比溶解在乙醇中制备得到乙醇相。
[0121]2、将溶有mRNA的醋酸钠缓冲液(25mM，pH＝5.0)与乙醇相在体积比为4∶1(水相：乙醇相)的条件下，用微流控混合器(精密纳米系统，加拿大；纳米药物包封机，自研)混合，配方中可电离N∶P为4∶1。
[0122]3、使用超滤离心管(Millpore，30KD)或膜包(Sartorius，30KD)对包封后的mRNA-LNP进行换液浓缩。浓缩液通过0.22μm过滤器除菌，分装保存至-70℃(含8％蔗糖的20mMTris溶液，pH＝7.4)。
[0123]4、mRNA包封率检测
[0124]使用RNA BR Assay(Thermo)试剂盒在Qubit 4.0荧光定量仪(Thermo)上检测mRNA的浓度。参照说明书分别测量同一样本的游离mRNA含量(Cf)和用1％(v/v)TritonX-100(Sigma)破乳后的mRNA含量(Ct)计算mRNA的百分包封率(Encapsulationpercentage，EN％)。包封率计算公式为EN％＝(1-Cf/Ct)×100％。
[0125]结果：对六种mRNA包括gDED-mRNA、gDFR-mRNA、SδT-mRNAN1mψTP(N1mψTP置换了UTP)、SδT、Fluc-mRNA、Fluc-mRNAN1mψTP(合成时N1mψTP置换了UTP)进行了包封用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA-LNP发现，如图5所示，将mRNA和脂质在微流体混合器中混合，制成脂质颗粒mRNA-LNP。用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA-LNP发现，120V电压下电泳至少30分钟，包封后的mRNA不能从点样孔迁出而滞留在点样孔中，如图6所示，相应泳道上未见预期大小的mRNA条带。mRNA浓度测定显示六种mRNA的包封率均大于90％。
[0126]表3显示了4种mRNA包封后的游离mRNA含量(Cf)、总mRNA含量(Ct)和包封效率。去除包封系统中的非水溶剂后，各个mRNA-LNP的粒径(Z-average)均在70～100nm之间，如图7所示，聚合物分散性指数(PDI)均小于0.2。
[0127]表3
[0128]
[0129]mRNA-LNP体外转染
[0130]1、BHK细胞(Baby Hamster Kidney)(购于ATCC)；胎牛血清(购于浙江天杭生物科技股份有限公司；110-11-86-11)；高糖DMEM(购于普诺赛；PM150210)；六孔板(购于BIOFIL；TCP10006)
[0131]2、将BHK细胞以2×105个/孔接种于6孔板中。24小时后细胞汇合度达到60～70％时，将孔内培养基更换成2ml新鲜的5％FBS的高糖DMEM培养基。以3～4μg/孔，沿板壁缓慢加入mRNA-LNP，摇晃均匀。37℃、5％CO2环境下培养4小时，观察细胞转染情况。
[0132]结果：无帽线性结构的eGFP-mRNA-LNP可以转染多种细胞，转染方法简便易行。以BHK细胞为例，如图8所示，转染eGFP-mRNA-LNP(不需移除eGFP-mRNA-LNP和换液)4小时后可观察到eGFP绿色荧光蛋白基因在细胞中表达，且细胞形态完整、边界清晰。说明LNP包封的无帽结构的eGFP-mRNA可以快速地通过细胞内吞作用进入细胞质中，并有效地翻译目的蛋白，同时eGFP-mRNA-LNP未表现出明显的细胞毒性。无帽结构的eGFP-mRNA-LNP还能转染293T等细胞。如图9所示，用SM102或自研阳离子脂质(Lipid-1)包封的eGFP-mRNA-LNP均能简便易行地转染细胞。
[0133]mRNA-LNP的体内动物实验
[0134]1、实验动物来源
[0135]所有动物实验均严格按照湖北省实验动物管理和使用委员会的要求进行。
[0136]本实施例实验动物有6～8周龄的雌性C57BL/6小鼠(合格证号(No.42000600043578)、5周龄雌性叙利亚仓鼠(合格证号：No.42000400012878)、5周龄雌性日本大耳白兔，均购自湖北省疾病预防控制中心。
[0137]动物在受控的环境中自由获得水和食物，光照/黑暗周期为12小时。
[0138]2、动物模型构建
[0139]A.Fluc-LNP模型
[0140]在C57BL/6小鼠大腿肌肉分别注射LNP包封的线性mRNA，即Fluc-mRNAUTP-LNP、Fluc-mRNAN1mψTP-LNP两种mRNA。
[0141]4小时后，在C57BL/6小鼠腹腔注射100μl D-荧光素钾盐(购于上海碧云天生物技术有限公司，15mg/ml)，10min时使用IVIS成像系统(珀金埃尔默)记录成像。
[0142]B、SδT-mRNA-LNP免疫模型
[0143]分别在第0、14天于C57BL/6小鼠大腿肌肉处注射LNP包封的线性mRNA，即SδT-mRNA-LNP；
[0144]分别在第0、21天于叙利亚仓鼠的大腿肌肉处注射LNP包封的线性mRNA，即SδT-mRNA-LNP；
[0145]对免疫前后的C57BL/6小鼠进行眼眶采血、免疫前后叙利亚仓鼠进行心脏采血并分离血清，用于检测IgG抗体滴度和/或中和抗体滴度。
[0146]C、gD-mRNA-LNP免疫模型
[0147]分别在第0、14、49天于C57BL/6小鼠大腿肌肉注射LNP包封的线性mRNA，即gDED-mRNA-LNP、gDFR-mRNA-LNP两种mRNA。对免疫前后的小鼠进行眼眶采血并分离血清，用于检测中和抗体滴度。
[0148]分别在第0、14天于日本大耳白兔的后颈部皮内注射及后腿部肌肉部位注射不同剂量LNP包封的线性mRNA，即gDED-mRNA-LNP、gDFR-mRNA-LNP两种mRNA。采集免疫前后取兔耳中静脉血并分离血清，用于检测中和抗体滴度。
[0149]3、ELISA检测
[0150]A.新型冠状病毒S三聚体特异性IgG表达量检测
[0151]a.试剂：
[0152]SARS-CoV-2(B.1.617.2)Spike(S)Protein购于南京诺唯赞生物科技公司(GC221-01)，初始浓度2.6mg/ml；
[0153]吐温-20购于国药集团化学试剂有限公司(货号：30189328)；
[0154]牛血清白蛋白(BSA)购于BioFroxx公司(货号：4240GR025)；
[0155]96孔酶标板购于Thermo公司(货号：446469)；
[0156]硫酸购于国药集团化学试剂有限公司(货号：10021628)。
[0157]b.实验步骤：
[0158]用SARS-CoV-2(B.1.617.2)Spike(S)Protein以100ng/孔包被，4℃过夜；
[0159]次日，使用洗涤液(0.05％吐温-PBST)洗板，再用1％BSA-PBST封闭酶标板2小时；
[0160]C57BL/6小鼠血清样本从1:1000开始，做2倍连续倍比稀释；叙利亚仓鼠血清样本梯度稀释至1:2×104后，做2倍连续倍比稀释；
[0161]将各浓度血清依次加入到封闭好的酶标板中，37℃孵育60分钟。用洗涤液洗板3次后加入对应的辣根过氧化物酶(HRP)结合抗体(羊抗鼠IgG 1:2000，proteintech，SA00001-1；兔抗仓鼠IgG 1:5000，Jackson ImmunoResearch，307-035-003)，37℃孵育60分钟；
[0162]用洗涤液充分洗板后加入TMB显色液(索莱宝，PR1200)，37℃孵育5分钟后，用2M硫酸终止显色。使用酶标仪(赛默飞)读取吸光度(450nm)。
[0163]4、抗体中和作用测定
[0164]通过固定病毒数量-稀释血清法评价血清抗体的中和作用。将血清样本从1:8开始做2倍连续倍比稀释。将稀释后血清与含有100CCID50的oHSV2-GFP(in house)病毒液充分混合，得到血清-病毒混合液。按照混合液体积补充青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)，37℃孵育1小时。向培养有单层Vero细胞的96孔微量滴定板接种等量血清-病毒混合液，37℃，5％CO2孵育48小时。使用High Content Analysis System(PE)检测孔内荧光表达情况。通过GFP表达率评估抗体中和滴度。
[0165]通过固定血清稀释度-稀释病毒法评价血清内抗体的中和能力。将oHSV2-GFP病毒从1:2开始做2倍连续倍比稀释，得到含不同数量病毒(1.5×103～1.0×105CCID50)的悬液。将各病毒悬液与血清混匀得到病毒-血清混合液。按照混合液体积补充青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)，37℃孵育1小时。向培养有单层Vero细胞的96孔微量滴定板接种病毒-血清混合液，37℃，5％CO2孵育48小时。使用High Content Analysis System检测到的荧光表达情况和细胞病变程度评价血清内抗体的中和能力。
[0166]结果：
[0167]1、无帽线性结构的Fluc-mRNA-LNP(分别包封有本申请发明人自研阳离子脂质Lipid-1和脂质SM102)体内转染可产生持久和高产量的表达。如图10～11所示，对小鼠肌肉给药(n＝5，Lipid-1；n＝3，SM102)，在不同时间点观察小鼠体内Fluc激发的荧光强度，如图12～13所示，发现注射部位附近荧光强度随时间先增后减，自研阳离子脂质Lipid-1和脂质SM102包封的mRNA-LNP-Fluc分别在体内持续至少72和94小时。说明在体内无帽线性结构的Fluc-mRNA可通过LNP在小鼠体内高效地表达。
[0168]2、如图14～15所示，C57BL/6小鼠肌肉注射Fluc-mRNAN1mψTP-LNP于4小时后平均荧光强度为8.04×105±1.43×106(均值±标准差，n＝8)，而注射Fluc-mRNAUTP-LNP的平均荧光强度(Radiance/p/sec/cm2/sr)为2.29×108±1.04×108(均值±标准差，n＝4)。说明无帽线性结构的mRNA-LNP，采用UTP的mRNA可获得更高的表达量。
[0169]3、初次免疫记为第0天，按图16所示，在第0、14天对C57BL/6小鼠分别免疫。实验分为三个组，分别为：
[0170]UTP组：30μg/100μl/只(n＝3)；
[0171]N1mψTP组：30μg/100μl/只(n＝3)；
[0172]空白组：无免疫(n＝3)。
[0173]第28天采血分离血清并检测血清IgG抗体滴度。
[0174]结果：如图17所示，UTP组平均滴度为1：26666；N1mψTP组和空白组均为0。统计学分析显示UTP组滴度与空白小鼠组和N1mψTP组比较存在显著性差异(P＝0.0075；t-test)。
[0175]4、在另一个实验中，初次给药记为第0天，按如图18所示，在第0和21天对叙利亚仓鼠肌肉注射SδT-mRNA-LNP进行免疫。实验分四组，分别为：
[0176]UTP组25μg：25μg/100μl/只(n＝3)；
[0177]UTP组50μg：50μg/100μl/只(n＝3)；
[0178]UTP组100μg：100μg/100μl/只(n＝3)；
[0179]空白组(n＝3)无免疫。
[0180]第35天采血分离血清并检测血清IgG抗体滴度。
[0181]结果：如图19所示，三个UTP组(25μg,50μg和100μg剂量组)的IgG抗体平均滴度分别为(3.47±1.62)×106、(2.35±1.40)×107、(1.92±0.64)×107。
[0182]如图20所示，在三只UTP组的叙利亚仓鼠体内注射SδT-mRNA-LNP产生的抗体能有效中和新型冠状病毒Delta和Omicron株
[0183]5、gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP免疫后动物产生中和力强的抗体，初次免疫记为第0天，按图21所示，在第0、14和49天对实验组小鼠肌肉注射gDED-mRNA-LNP(30μg/100μl/只，n＝5)和gDFR-mRNA-LNP(30μg/100μl/只，n＝5)。
[0184]在第0、28、52天采血分离血清检测中和抗体。将1μl血清与含6250CCID50的oHSV2-GFP病毒充分混合并孵育1小时后接种到单层Vero细胞孔中，通过GFP表达率评估抗体中和滴度。
[0185]结果：如图22示所示，所有未免疫组血清病毒混合液处理的细胞均有GFP产生，且可见典型的病毒复制导致的噬毒斑；
[0186]gDED-mRNA-LNP组以及gDFR-mRNA-LNP组的血清病毒混合液(含6250CCID50病毒)处理的细胞均未见GFP和噬毒斑：
[0187]以上结果说明无帽线性且无修饰尿苷结构的mRNA体内表达的两种gD抗原免疫C57BL/6小鼠均能诱导产生中和抗体。
[0188]6、在另一个实验中，初次免疫记为第0天，如图23所示，在第0和14天，在日本大耳白兔后颈部皮内注射200μl(20μg)mRNA-LNP-gDED，在另外两只日本大耳白兔后腿部肌肉部位分别注射250μl(25μg)mRNA-LNP-gDED和500μl(50μg)mRNA-LNP-gDED。
[0189]在0、14、28天于耳中动脉采血分离血清检测中和抗体。为了评估mRNA-LNP-gDED免疫日本大耳白兔后产生抗体的中和效力，进行了活病毒中和滴定。
[0190]结果：如图24所示，免疫前后的血清比较，免疫后的血清对病毒有明显的中和作用。在皮内注射组，1μl血清可完全中和40960CCID50病毒(oHSV2-GFP)，无GFP和噬毒斑产生；血清稀释128倍时还能完全中和100CCID50病毒。而肌肉注射两组的中和效果均弱于皮内注射组，50μg肌肉注射组，血清稀释至64倍时，不能完全中和病毒，出现噬毒斑；25μg肌肉注射组，血清稀释16倍时就不能完全中和病毒。图25显示了免疫剂量和途径差异的中和滴度，为了排除补体对于实验的影响，本申请实施例中进行了补体灭活，实验结果显示补体灭活组与未灭活组效果一致，补体对中和实验未造成影响。最后的结论是，gDED-mRNA-LNP免疫(经皮内或肌内注射)后的兔血清样品可以中和oHSV2-eGFP病毒。
[0191]无帽线性mRNA-LNP激活细胞免疫实验
[0192]1、实验材料和试剂：
[0193]小鼠IFN-γELISpot PLUS试剂盒购自Mabtech(CAT：3321-4APW-2)；PMA+离子霉素购自深圳大科威生物工程有限公司(CAT：2030421)；SARS-CoV-2(B.1.617.2)S蛋白购自南京维泽生物科技有限公司(CAT：GC221-01)；OH2病毒，来源于HSV2 HG52株的oHSV2 hGM-CSF(47)，由本申请发明人自制。
[0194]2、分别在第0天、第14天和第21天，将gDED-mRNA-LNP、gDFR-mRNA-LNP及SδT-mRNA-LNP注射到C57BL/6小鼠大腿肌肉。在指定的时间点，移除免疫小鼠的脾脏，分离脾细胞以检测特异性T细胞。
[0195]3、T细胞检测：
[0196]gD特异性或SδT特异性T细胞的检测步骤如下：将3～5×105个脾细胞/孔和106个经紫外线灭活30分钟的CCID50/孔OH2病毒(或4μg/孔SARS-CoV-2S蛋白)混合并在37℃孵育。
[0197]48小时后，第一次用PBS洗涤5次，然后加入探针抗体(R4-6A2-生物素，1μg/μl)并在室温下孵育2小时。
[0198]第二次用PBS洗涤5次后，添加标记有链霉亲和素的碱性磷酸酶(链霉亲和素ALP，1:1000)，并在室温下培养1小时。
[0199]第三次用PBS洗涤5次后，添加标记有链霉亲和素的碱性磷酸酶(链霉亲和素ALP，1:1000)，并在室温下培养1小时。
[0200]再次用PBS洗涤5次后，添加显色溶液(BCIP/NBT plus)，并在室温下培养10分钟；然后用去离子水停止显色。
[0201]溶液干燥后，使用酶联斑点分析仪(AID ELISpot Reader Classic，AutomuninDiagnostika GmbH)读取和分析ELISpot平板上孔中出现的斑点数量。采用GraphPad Prismv8.0.1软件对数据进行Student's t-test检验分析。
[0202]4、实验结果：
[0203](1)ELISpot分析表明，注射过gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP或SδT-mRNA-LNP的动物产生针对特定抗原的特异性T细胞。第一次免疫记录为第0天，如图26～27所示，在指定日期对C57BL/6小鼠进行免疫。在gDED-mRNA-LNP/gDFR-mRNA-LNP免疫的实验中，分为三组，注射量分别为：gDED-mRNA-LNP组(30μg/100μl/单位，n＝8)、gDFR-mRNA-LNP组(30μg/100μl/单位，n＝8)和免疫前(未接种)组(未接种，n＝8)。
[0204]第21天时，每组取4只C57BL/6小鼠的脾脏组织进行ELISpot检测，每组剩余4只C57BL/6小鼠进行相同剂量的二次强化免疫，第28天取小鼠脾脏组织检测特异性T细胞。
[0205]将3×105个脾细胞与106个经紫外线灭活的OH2病毒CCID50混合30分钟，孵育48小时后，通过脾细胞分泌的IFN-γ细胞因子形成的斑点数检测特异性T细胞。如图28～29所示，对于第28天采集的脾脏数据，两个实验组(gDED-mRNA-LNP和gDFR-mRNA-LNP)中IFN-γ细胞因子形成的平均斑点数与对照组中IFN-γ细胞因子形成的平均斑点数相比存在显著差异。
[0206]结果表明，在C57BL/6小鼠体内，由无帽线性且无修饰尿苷的mRNA结构翻译的两种gD抗原可激活特异性T细胞。
[0207](2)如图27所示，将第32天获得的SδT-mRNA-LNP免疫脾细胞与SARS-CoV-2S蛋白(作为刺激物)混合，然后进行ELISpot分析，如图30～31所示，在C57BL/6小鼠体内，由无帽线性且无修饰尿苷的mRNA结构翻译的S蛋白三聚体抗原可激活特异性T细胞。
[0208]无帽线性和加帽mRNA体内转染对比实验
[0209]为了进一步验证不同结构的mRNA在体内递送与表达效率，本申请实施例进行了加帽mRNA和无帽线性mRNA体内转染对比实验。本申请实施例中的重组质粒构建、mRNA-LNP制备、小鼠模型构建等参考本申请前述方法。
[0210]将7周龄的雌性BABL/c小鼠分成加帽mRNA组、无帽线性mRNA组及对照组，其中：
[0211]加帽mRNA组有两组，一组为加帽天然尿苷组(Cap UTP 30μg)、另一组为加帽修饰尿苷(Cap N1mΨTP 30μg)；每组有6只小鼠；
[0212]无帽线性mRNA组有两组，一组为30μg无帽天然尿苷组(Uncapped UTP 30μg)、另一组为10μg无帽天然尿苷组(Uncapped UTP 10μg)；每组有6只小鼠；
[0213]空白对照组(Negative control)：不处理，3只小鼠；
[0214]实验时，以上各实验组肌肉注射相应剂量的经LNP包封的加帽或无帽萤火虫荧光素酶mRNA，于各时间点观察小鼠体内荧光强度以及持续时间。
[0215]结果：如图32～33所示，小鼠体内注射部位以及肝脏部位荧光强度在注射后4小时均可达到108P/S(Photons per second)，随着时间推移，荧光强度逐渐下降，第7天，荧光强度降低到103P/S，且无帽线性结构和加帽结构mRNA的总体表达趋势一致。
[0216]以上结果表明，本申请实施例中，本申请提供的无帽天然尿苷结构的线性mRNA与传统加帽、修饰尿苷的mRNA体内递送与表达效率基本一致，均可实现目的基因的体内高效、持久表达。
[0217]以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
