【技术领域】 【0001】 1. 相关申请的交叉引用 本申请基于 2020 年 4 月 24 日提交的美国临时专利申请第 63/015,362 号和 2020 年 9 月 1 日提交的美国临时专利申请第 63/015,362 号,每份申请的全部内容均以引用方式并入,且优先权来自它要求申请号 63/073,133 的优先权。 【0002】 二、技术领域 当前公开的主题提供了使用含有特异性靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的细胞来治疗肿瘤(例如,癌症)的方法。 【背景技术】 【0003】 三、背景 基于细胞的免疫疗法是治疗癌症的潜在治愈疗法。 T 细胞和其他免疫细胞可以设计为靶向肿瘤抗原,称为嵌合抗原受体 (CAR),对选定的抗原具有特异性。通过引入编码人工或合成受体的遗传物质 最近的临床成功表明,使用 CAR 的靶向 T 细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤。 【0004】 表达具有源自鼠单克隆抗体的结合结构域的 CD19 特异性 CAR 的 T 细胞已被证明可以治疗 B 细胞恶性肿瘤。 人类患者可能会对 CAR 的小鼠 scFv 抗原结合域产生特异性的 T 细胞介导的免疫反应,导致 CAR T 细胞过早消除,从而增加肿瘤复发的风险。 因此,需要具有降低的毒性和免疫原性和/或提高的安全性和功效的改进的靶向CD19的CAR。 【发明概要】 [解决问题的方法] 【0005】 4.发明概要 目前公开的主题提供了靶向 CD19 的嵌合抗原受体 (CAR)、包含靶向 CD19 的 CAR 的细胞,以及这些细胞用于治疗(例如,治疗肿瘤)的用途。 【0006】 在某些实施方案中,CAR包含特异性结合CD19的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域。 在某些实施方案中,细胞外抗原结合结构域是单链可变片段 (scFv)、Fab 或 F(ab) ₂ 包括。 在某些实施方案中,胞外抗原结合结构域包含scFv。 在某些实施方案中,scFv 是人 scFv。 在某些实施方案中,胞外抗原结合结构域包含(a)包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰、SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1包含CDR2和CDR3的重链可变区,所述CDR2和CDR3包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或其保守修饰;和/或 (乙) i)含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:12所示氨基酸序列NO:13或其保守修饰的CDR3含有; ii)含有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:12所示氨基酸序列NO:17或其保守修饰的CDR3含有; iii)含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:20所示氨基酸序列NO:21或其保守修饰的CDR3含有; iv)包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:12所示氨基酸序列NO:57或其保守修饰的CDR3含有; v)包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:12所示氨基酸序列NO:59或其保守修饰的CDR3含有; vi)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:61的氨基酸序列或其保守修饰其中CDR3含有; vii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:63的氨基酸序列或其保守修饰其中含有 CDR3;或 viii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其保守修饰其中CDR3含有 轻链可变区包含 【0007】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9.包括。 【0008】 在某些实施方案中,轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3 SEQ ID NO:13.包括。 【0009】 在某些实施方案中,轻链可变区包含包含 SEQ ID NO:16 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:12 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:12 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:17.包括。 【0010】 在某些实施方案中,轻链可变区包含包含 SEQ ID NO:11 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:20 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:20 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:21.包括。 【0011】 在某些实施方案中,轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3 SEQ ID NO:57.包括。 【0012】 在某些实施方案中,轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3 SEQ ID NO:59.包括。 【0013】 在某些实施方案中,轻链可变区包含包含 SEQ ID NO:16 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:12 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:12 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:61.包括。 【0014】 在某些实施方案中,轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3 SEQ ID NO:63.包括。 【0015】 在某些实施方案中,轻链可变区包含包含 SEQ ID NO:11 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:65 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:65 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:66.包括。 【0016】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3在 SEQ ID NO:13 中列出。 【0017】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3在 SEQ ID NO:17 中列出。 【0018】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有 SEQ ID NO:11 所示氨基酸序列的 CDR1、含有 SEQ ID NO:20 所示氨基酸序列的 CDR2 和含有 SEQ ID NO:20 所示氨基酸序列的 CDR3在 SEQ ID NO:21 中列出。 【0019】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3在 SEQ ID NO:57 中列出。 【0020】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3在 SEQ ID NO:59 中列出。 【0021】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3在 SEQ ID NO:61 中列出。 【0022】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR3在 SEQ ID NO:63 中列出。 【0023】 在某些实施方案中,重链可变区包含包含 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列的 CDR1、包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR2 和包含 SEQ ID NO:8 所示氨基酸序列的 CDR3 SEQ ID NO:9. 其中轻链可变区包含含有 SEQ ID NO:11 所示氨基酸序列的 CDR1、含有 SEQ ID NO:65 所示氨基酸序列的 CDR2 和含有 SEQ ID NO:65 所示氨基酸序列的 CDR3在 SEQ ID NO:66 中列出。 【0024】 在某些实施方案中,重链可变区至少约 80%、约 81%、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86% 是 SEQ ID NO: 10、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或它包括约 99% 相同或同源的氨基酸序列。 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。 【0025】 在某些实施方案中,轻链可变区具有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO: :62,SEQ ID NO:64,或 SEQ ID NO:67 和至少约 80%,约 81%,约 82%,约 83%,约 84%,约 85%,约 86%,约 87%,约88%、约89%、约90%、约91%,包括约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%的氨基酸序列或大约 99% 相同或同源。 在某些实施方案中,轻链可变区具有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO: :62,SEQ ID NO:64,或 SEQ ID NO:67,包括。 在某些实施方案中,轻链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。 【0026】 在某些实施方案中,重链可变区至少约 80%、约 81%、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86% 是 SEQ ID NO: 10、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98% 或约包含99%相同或同源的氨基酸序列,轻链可变区为SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 60 ID NO:62、SEQ ID NO:64 或 SEQ ID NO:67 和至少约 80%、约 81%、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87 %、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98% 或约 99% 相同或同源氨基酸序列。 在某些实施方案中,重链可变区包含 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含 SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO :58,SEQ ID NO:60,它包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。 在某些实施方案中,重链可变区包含 SEQ ID NO:10 中列出的氨基酸序列,而轻链可变区包含 SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18 或 SEQ ID NO:18 中列出的氨基酸序列编号:22。 【0027】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。 【0028】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。 【0029】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。 【0030】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列。 【0031】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。 【0032】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列。 【0033】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:64中列出的氨基酸序列。 【0034】 在某些实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。 【0035】 在某些实施方案中,细胞外抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区之间的接头。 在某些实施方案中,接头由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列组成。 在某些实施方案中,重链和轻链可变区在 N 端至 C 端 V _L -V _H 它的定位是 【0036】 在某些实施方案中,细胞外抗原结合结构域包含 scFv,其包含或由 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 19 或 SEQ ID NO: 23 或 SEQ ID NO: 15 中所示的氨基酸序列组成, SEQ ID NO:19,或包含或由 SEQ ID NO:23 中所示的氨基酸序列组成的 scFv。 【0037】 在某些实施方案中,跨膜结构域是 CD8 多肽、CD28 多肽、CD3ζ 多肽、CD4 多肽、4-1BB 多肽、OX40 多肽、ICOS 多肽、CTLA-4 多肽、PD-1 多肽、LAG-3 多肽、2B4 多肽,或 BTLA 多肽。 在某些实施方案中,跨膜结构域包含CD28多肽。 【0038】 在某些实施方案中,胞内信号结构域包含CD3ζ多肽。 在某些实施方案中,CD3ζ多肽是修饰的CD3ζ多肽。 在某些实施方案中,修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3。 在某些实施方案中,天然 ITAM1 由 SEQ ID NO:31 中列出的氨基酸序列组成。 在某些实施方案中,ITAM2 变体由 SEQ ID NO:37 中列出的氨基酸序列组成。 在某些实施方案中,ITAM3 变体由 SEQ ID NO:41 中列出的氨基酸序列组成。 在某些实施方案中,修饰的CD3ζ多肽包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列或由其组成。 【0039】 在某些实施方案中,细胞内信号结构域还包含至少一个共刺激信号区域。 在某些实施方案中,至少一个共刺激信号传导区包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽或其组合。 在某些实施方案中,至少一个共刺激信号传导区域是 CD28 的胞内结构域或其一部分、4-1BB 的胞内结构域或其一部分、OX40 的胞内结构域或其一部分、ICOS 或其胞内结构域DAP-10 的结构域或其一部分。 在某些实施方案中,至少一个共刺激信号传导区包含CD28多肽。 【0040】 在某些实施方案中,CAR 从载体表达。 在某些实施例中,载体是逆转录病毒载体。 【0041】 当前公开的主题进一步提供包含本文公开的CAR的细胞。 在某些实施例中,细胞是用CAR转导的。 在某些实施方案中,CAR 在细胞表面组成型表达。 在某些实施方案中,细胞是免疫活性细胞。 在某些实施方案中,细胞属于淋巴或骨髓谱系。 在某些实施方案中,细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、可分化成淋巴样细胞的干细胞和可分化成骨髓细胞的干细胞组成的组。 在某些实施方案中,细胞是T细胞。 在某些实施方案中,T 细胞是辅助性 T 细胞、细胞毒性 T 细胞、记忆 T 细胞、调节性 T 细胞、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)、自然杀伤 T 细胞、粘膜相关不变性 T 细胞和 γδ T 细胞。 在某些实施方案中,细胞是 NK 细胞。 在某些实施例中,NK 细胞源自干细胞。 在某些实施方案中,干细胞是多能干细胞。 在某些实施方案中,多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。 【0042】 此外,目前公开的主题提供编码本文公开的CAR的核酸分子。 在某些实施方案中,核酸分子进一步包含可操作地连接至CAR的启动子。 启动子可以是内源性的或外源性的。 在某些实施方案中,启动子是外源启动子。 在某些实施方案中,外源启动子是延伸因子(EF)-1启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)启动子、猿猴病毒40早期启动子(SV40)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、金属硫蛋白启动子和泛素C 发起人。 在某些实施方案中,启动子是内源性启动子。 在某些实施方案中,内源性启动子选自TCRα启动子、TCRβ启动子和β2-微球蛋白启动子。 在某些实施方案中,启动子是诱导型启动子。 在某些实施方案中,诱导型启动子选自由 NFAT 转录反应元件 (TRE) 启动子、CD69 启动子、CD25 启动子、IL-2 启动子、4-1BB 启动子、PD1 启动子和 LAG3 启动子组成的组。 【0043】 当前公开的主题还提供包含本文公开的核酸分子的载体。 在某些实施例中,载体是逆转录病毒载体。 【0044】 当前公开的主题还提供了表达本文公开的核酸分子的细胞。 在某些实施方案中,细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。 【0045】 当前公开的主题提供包含本文公开的细胞的组合物。 在某些实施方案中,该组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。 在某些实施例中,组合物为约 1 x 10 ⁶ 约 5 x 10 件 ⁸ 包含个体之间的细胞。 在某些实施例中,组合物为约 1 x 10 ⁶ 约 1 x 10 件 ⁸ 包含个体之间的细胞。 在某些实施例中,组合物为约 1 x 10 ⁶ 约 5 x 10 件 ⁷ 包含个体之间的细胞。 在某些实施例中,组合物为约 2.5 x 10 ⁷ 包含单个细胞。 【0046】 所公开的主题还提供了使用所公开的细胞的各种方法。 目前公开的主题提供了减少受试者肿瘤负荷的方法。 在某些实施方案中,该方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。 在某些实施方案中,该方法减少了受试者的肿瘤细胞数量、减小了肿瘤大小和/或根除了肿瘤。 【0047】 当前公开的主题提供增加或延长患有肿瘤的受试者的存活的方法。 在某些实施方案中,该方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。 【0048】 当前公开的主题提供了治疗和/或预防受试者肿瘤的方法。 在某些实施方案中,该方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。 【0049】 本公开的细胞和组合物可用于治疗。 在某些实施方案中,本公开的细胞和组合物用于治疗和/或预防受试者的肿瘤。 在某些实施方案中,本公开的细胞和组合物用于增加或延长患有肿瘤的受试者的存活。 在某些实施方案中,本公开的细胞和组合物用于治疗和/或预防受试者的肿瘤。 【0050】 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物与CD19相关。 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物是血液癌。 在某些实施方案中,血液癌症选自由多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤组成的组。 在某些实施方案中,白血病是急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性早幼粒细胞白血病选自白血病白血病(APL) 、急性白血病混合表型 (MLL)、毛细胞白血病和 B 细胞幼淋巴细胞白血病。 在某些实施方案中,淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物是B细胞恶性肿瘤。 在某些实施方案中,B细胞恶性肿瘤是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤癌(MM)、伴里氏转化的 CLL 和 CNS 淋巴瘤。 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物是B细胞淋巴瘤。 在某些实施方案中,B细胞淋巴瘤是复发性或难治性(R/R) B细胞淋巴瘤。 在某些实施例中,受试者是人类受试者。 【0051】 此外,目前公开的主题提供了用于制备包含本文公开的CAR的细胞的方法。 在某些实施方案中,该方法包括将编码本文公开的CAR的核酸分子引入细胞中。 【0052】 此外,本公开的主题提供了用于降低受试者的肿瘤负荷、治疗和/或预防受试者的肿瘤和/或增加或延长患有肿瘤的受试者的存活的试剂盒。 在某些实施方案中,试剂盒包含本文公开的细胞。 在某些实施方案中,该试剂盒用于减少受试者的肿瘤负荷、治疗和/或预防受试者的肿瘤和/或增加或延长患有肿瘤的受试者的存活。还包括使用所述细胞的说明书。 五、图纸简要说明 【图纸简要说明】 【0053】 【图1】 图 1A 和 1B 显示了含有 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞对表达 CD19 的细胞的细胞毒性。 图1A显示了针对表达CD19的Raji癌细胞系的杀伤。 图1B显示了对CD19敲除Raji细胞的杀伤。 阳性对照是 1928z-1XX CAR。 【0054】 【图2】 图 2A 和 2B 显示了含有 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞对表达 CD19 的细胞的细胞毒性,如通过基于流动的杀伤测定所测量的。 图2A显示了针对表达CD19的Raji癌细胞系的杀伤。 图2B显示了对CD19敲除Raji细胞的杀伤。 阳性对照是 1928z-1XX CAR。 【0055】 [图3] 图 3A 和 3B 显示了含有 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞分泌的 IL-2 细胞因子。 图3A显示当与表达CD19的Raji癌细胞系共培养时含有CD19靶向CAR的T细胞分泌的IL-2细胞因子。 图3B显示当与CD19敲除Raji细胞共培养时含有CD19靶向CAR的T细胞分泌的IL-2细胞因子。 阳性对照是 1928z-1XX CAR。 【0056】 【图4】 图 4A 和 4B 显示了含有 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞分泌的 IFN-γ 细胞因子。 图4A显示当与表达CD19的Raji癌细胞系共培养时含有CD19靶向CAR的T细胞分泌的IFN-γ细胞因子。 图4B显示当与CD19敲除Raji细胞共培养时,含有CD19靶向CAR的T细胞分泌的IFN-γ细胞因子。 阳性对照是 1928z-1XX CAR。 【0057】 [图5] 图 5 显示了含有 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞的体内抗肿瘤活性。 #17 是阴性对照,一种没有可检测的体内活性的靶向 CD19 的 CAR。 【0058】 [图6] 图 6 显示了 CD19-HSA-His10 的氨基酸序列。 【0059】 [图7] 图 7 显示了#2 scFv、SJ25c1 scFv 和 FMC63 scFv 的结合数据。 用 Biacore 表面等离子共振 (SPR) 测定评估可溶性 CD19 抗原内常见表位的相对竞争。 可溶性 CD19 特异性抗体(FMC63 或 SJ25c1)和 CD19 抗原的混合物流过含有 #2 scFv 的芯片,以确定 #2 scFv 是否与 SJ25c1 scFv 和 FMC63 scFv 交叉竞争相同的表位。底部。 19 (T2) 表示“#2 scFv”。 【0060】 [图8] 图 8 显示了包含 #2 CAR 的伽马逆转录病毒载体。 “19(T2)”代表“#2”。 #2 CAR 包含一个 CD19 特异性 T2(19(T2)) scFv(或“#2 scFv”)、一个 CD8 α 前导肽、一个 CD28 基因片段和一个修饰的 CD3zeta 细胞内信号域。 CD28 基因片段包括其胞外铰链、跨膜和胞内结构域。 修饰的 CD3 zeta 链具有一个功能性野生型和两个突变的免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM),称为“1XX”。 修饰的 CD3ζ 细胞内信号结构域的氨基酸序列如 SEQ ID NO:43 所示。 CD3ζ-1XX 和 CD3ζ- 野生型的氨基酸序列比对如图 1 所示。 标记了两个序列之间的氨基酸差异。 【0061】 [图9] 显示了 CD3ζ-1XX 和 CD3ζ- 野生型的氨基酸序列比对。 【0062】 [图10] 图 10 显示了#2 CAR-T 细胞和 1928z-1XX CAR T 细胞的体外细胞毒活性。 “19(T2)28z1xx”代表“#2 CAR”。 【0063】 [图11] 图 11 显示了#2 CAR T 细胞和 1928z-1XX CAR T 细胞的肿瘤消除。 “19(T2)28z1xx”代表“#2 CAR”。 【0064】 [图12] 图 12 显示了包含 1928z CAR 的伽马逆转录病毒载体。 野生型 hCD3ζ 的氨基酸序列如图 9 中的 SEQ ID NO:30 所示。 【0065】 [图13] 图13显示了用γ-逆转录病毒转导的CD4+和CD8+T细胞中的CAR表达。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0066】 [图 14-1] 图 14 显示了表型 1928z CAR T 细胞和#2 CAR T 细胞。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 [图 14-2] 图 14 显示了表型 1928z CAR T 细胞和#2 CAR T 细胞。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0067】 [图15] 图 15 显示了#2 和 1928z CAR T 细胞根除肿瘤的动力学。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 每条曲线代表一只小鼠的肿瘤负荷。 【0068】 【图16】 图 16 显示了在静脉注射 #2 CAR T 细胞或 1928z CAR T 细胞后携带 NALM6 白血病的小鼠的存活率。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0069】 [图 17] 图 17 显示了用 #2 CAR T 细胞或 1928z CAR T 细胞处理的小鼠骨髓中的 CAR T 细胞定量和表型分析(第 17 天)。 所有数据均为平均值±s.e.m.,p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0070】 [图18] 图 18 显示了用 #2 CAR T 细胞或 1928z CAR T 细胞处理后小鼠的体重。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 星号表示计划外死亡发生的时间点。 短曲线表示所有小鼠均在指定时间点死亡。 【0071】 [图19] 图 19 显示了在注射后第 10 天和第 27/28 天用 1 x 106 CAR T 细胞处理的小鼠血清中肝酶的定量。 对同一天的两个队列进行了统计比较。 所有数据均为均值 + s.e.m.;p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0072】 [图20] 图 20 显示了在用 1 x 106 #2 CAR T 细胞或 1928z CAR T 细胞处理的小鼠中注射后 10 天和 27/28 天的人细胞因子水平的量化。 所有数据均为均值 + s.e.m.;p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0073】 [图21] 在用 1×10 6 #2 CAR T 细胞或 1928z CAR T 细胞处理的小鼠中注射后 10 天和 27/28 天小鼠细胞因子水平的定量。 所有数据均为平均值±s.e.m.;p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0074】 [图22] 图 22 显示了在用 #2 CAR T 细胞和 1928z CAR T 细胞处理的小鼠中注射后 27/28 天基本血细胞的定量。 所有数据均为均值 + s.e.m.;p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0075】 [图23] 图 23 显示了用 #2 CAR T 细胞和 1928z CAR T 细胞处理的小鼠在注射后 27/28 天的体重和重要器官重量的比较。 每组小鼠的数量显示在图例中。 所有数据均为均值 + s.e.m.;p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0076】 [图24] 图 24 显示了用 CAR T 细胞治疗的小鼠的肝脏、脾脏和骨髓中淋巴细胞和肿瘤浸润的量化。 所有数据均为平均值±s.e.m.;p 值是使用双尾未配对学生 t 检验计算的。 “19(T2)28z1XX”代表“#2 CAR”。 【0077】 [图25] 图25显示抗CD19抗体与表达CD19的野生型Raji和NALM-6细胞以及CD19敲除Raji和NALM-6细胞结合的示例性流式细胞术色谱图。 【0078】 [图26-1] 图26A-26C显示抗CD19抗体结合NALM-6细胞上的CD19的示例性结合曲线。 [图26-2] 图26A-26C显示抗CD19抗体结合NALM-6细胞上的CD19的示例性结合曲线。 [实施发明的方式] 【0079】 六、详细说明 当前公开的主题提供了特异性靶向 CD19 的嵌合抗原受体 (CAR) 和包含此类靶向 CD19 的 CAR 的细胞。 细胞可以是免疫应答细胞,例如基因修饰的免疫应答细胞(例如,T细胞或NK细胞)。 当前公开的主题进一步提供了细胞和包含它们的组合物用于治疗例如治疗肿瘤的用途。 本公开的靶向 CD19 的 CAR 比其他靶向 CD19 的 CAR 更安全和/或更有效,例如,如更高的持久性所证明的(参见实施例 6 和 7)。 还表明,这种更大的持久性不会造成安全风险。 因此,本公开的靶向CD19的CAR T细胞可以以低于当前免疫疗法中使用的大多数靶向CD19的CAR T细胞的剂量使用。 本公开的靶向 CD19 的 CAR T 细胞更安全,因此没有副作用,包括但不限于细胞因子释放综合征 (CRS) 的发生率较低,神经毒性 (NT) 预计也较少。 【0080】 本文和实施例中描述了本公开的非限制性实施方案。 【0081】 为了公开的清楚,而不是以限制的方式,详细描述分为以下小节: 5.1. 定义; 5.2.CD19; 5.3. 嵌合抗原受体(CAR); 5.4. 细胞; 5.5. 核酸分子和载体; 5.6. 配方和给药;和 5.7. 处理方法 5.1 定义 【0082】 除非另有定义,本文使用的所有科学和技术术语均具有本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义。 【0083】 如本文所用,术语“约”或“大约”是指在由本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围内,该可接受误差范围部分取决于该值是如何测量或确定的,即测量系统的限制。 例如,根据本领域的实践,“约”可以表示在 3 个标准偏差以内或超过 3 个标准偏差。 或者,“约”可表示至多20%、优选至多10%、更优选至多5%、甚至更优选至多1%给定值的范围。 或者,特别是关于生物系统或过程,该术语可以表示在一个数量级内,优选在五倍内,更优选在二倍内。 【0084】 如本文所用,术语“免疫反应性细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞或其前体或后代。 在某些实施方案中,免疫应答细胞是淋巴谱系的细胞。 淋巴谱系细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞和可分化成淋巴谱系细胞的干细胞。 在某些实施方案中,免疫应答细胞是骨髓谱系的细胞。 【0085】 如本文所用,术语“激活免疫应答细胞”是指诱导信号转导或细胞中蛋白质表达的改变,从而导致免疫应答的启动。 例如,响应配体结合和免疫受体酪氨酸抑制基序 (ITAM) 的 CD3 链聚集导致信号转导级联。 在某些实施方案中,CAR 与抗原的结合导致免疫突触的形成,包括许多分子(例如 CD4 或 CD8、CD3 γ/σ/ε/ζ 等)在结合受体附近的聚集。发生。 这种膜结合信号分子的聚集使得 CD3 链中包含的 ITAM 基序变得磷酸化。 这种磷酸化反过来启动 T 细胞激活途径,最终激活转录因子,如 NF-κB 和 AP-1。 T 细胞中的全局基因表达由这些转录因子诱导,导致 IL-2 的产生,用于 T 细胞蛋白的增殖和表达,主要调节剂,以启动 T 细胞介导的免疫反应。 【0086】 如本文所用,术语“刺激免疫应答细胞”是指导致强烈和持续的免疫应答的信号。 在某些实施方案中,这发生在免疫应答细胞(例如 T 细胞)或受体激活之后,包括但不限于 CD28、4-1BB、OX40、CD40 和 ICOS。同时通过 接收到多种刺激信号对于启动强健且持久的 T 细胞介导的免疫反应可能很重要。 T 细胞被迅速抑制并对抗原无反应。 另一方面,这些共刺激信号的影响可能会有所不同,并且通常是长寿、增殖和抗凋亡的 T 细胞,它们对抗原做出强烈反应以实现完全和持续的根除。导致基因表达增加以产生 【0087】 如本文所用,“互补决定区”或“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列,其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。 在某些实施方案中,可变结构域的“CDR”是 Kabat、Chothia、Kabat 和 Chothia 簇、AbM、接触和/或构象定义或本领域已知的任何 CDR 确定方法。是可变区内的氨基酸残基根据定义确定的 抗体 CDR 可以被识别为最初由 Kabat 等人定义的高变区。 参见,例如,Kabat 等人,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public Health Service,NIH,Washington D.C. CDR 的位置也可以确定为 Chothia 等人最初描述的结构环结构。 参见,例如,Chothia 等人,Nature 342:877-883,1989。 CDR 识别的其他方法包括“AbM 定义”,这是 Kabat 和 Chothia 之间的折衷方案,由 Oxford Molecular 的 AbM 抗体建模软件(现为 Accelrys®)或 MacCallum 等人,J. Biol.,262:732-745 指导, 1996 年,CDR“接触定义”基于观察到的抗原接触。 在另一种方法中,在本文中称为 CDR 的“构象定义”,CDR 位置可以被鉴定为对抗原结合有焓贡献的残基。 参见,例如,Makabe 等人,Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008。 还有其他 CDR 边界定义不严格遵循上述方法之一,但至少与 Kabat CDR 的一部分重叠,但不重叠特定残基或残基组,甚至可以根据预测或实验结果缩短或延长整个 CDR 不会显着影响抗原结合。 在一些实施方式中,CDR可以指代由本领域已知的任何技术定义的CDR,包括技术的组合。 本文使用的方法可以利用根据这些方法中的任何方法定义的CDR。 对于包含多于一个 CDR 的任何给定实施例,CDR 可以根据 Kabat、Chothia、extended、AbM、contact 和/或构象定义中的任何一个来定义。 通常,抗体在可变区内包含三个重链CDR或CDR区和三个轻链CDR或CDR区。 CDR 为抗体与抗原或表位的结合提供了大部分接触残基。 在某些实施方案中,CDR 区域使用 Kabat 编号系统指定。 【0088】 如本文所用,术语“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白(例如鼠或人)重链(V _H ) 和轻链 (V _L ) 共价连接到 V _H ::V _L形成异二聚体的融合蛋白。 重链(V _H ) 和轻链 (V _L )要么直接键合或V _H N端和V _L 或 V 的 C 端 _H C端和V _L 由肽编码的接头(例如,10、15、20、25 个氨基酸)连接,该接头连接 N-末端 接头通常富含甘氨酸以提高柔韧性,富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。 接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。 接头的非限制性实例公开于 Shen 等人,Anal. Chem. 80 (6): 1910-1917 (2008) 和 WO2014/087010,其全部内容通过引用并入本文。 在某些实施例中,接头是 G4S 接头。 【0089】 在某些实施方案中,接头包含以下提供的 SEQ ID NO: 1 中列出的氨基酸序列或由其组成: GGGGSGGGGSGGGGS [序列号:1] 【0090】 在某些实施方案中,接头包含以下提供的 SEQ ID NO:2 中所示的氨基酸序列或由其组成: GGGGSGGGGSGGGSGGGGS [序列号:2] 【0091】 在某些实施方案中,接头包含以下提供的 SEQ ID NO: 3 中所示的氨基酸序列或由其组成: GGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGGS [序列号:3] 【0092】 在某些实施方案中,接头包含以下提供的 SEQ ID NO: 4 中列出的氨基酸序列或由其组成: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGGS [序列号:4] 【0093】 如本文所用,术语“基本相同”或“基本同源”是指多肽或核酸分子具有参考氨基酸序列(例如任一)或至少约50%相同或同源于参考核酸序列(例如,本文所述的任何核酸序列)。 在某些实施方案中,此类序列是用于比较的氨基酸或核酸序列的至少约 60%、至少约 65%、至少约 70%、至少约 75%、至少约 80%。约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%或至少约100%相同或同源。 【0094】 使用序列分析软件(例如,Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 或 PILEUP/PRETTYBOX 程序的序列分析软件包)确定序列同一性。可以通过测量 此类软件通过将同源度分配给各种替换、删除和/或其他修改来匹配相同或相似的序列。 保守取代通常包括以下组内的取代:甘氨酸、丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸;赖氨酸、精氨酸;酪氨酸。 用于确定同一性程度的示例性技术可以使用 BLAST 程序,其中 e-3 和 e-100 之间的概率分数指示密切相关的序列。 【0095】 使用 E. Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) 并入 ALIGN 程序(2.0 版)的算法确定两个氨基酸序列之间的百分比同源性。使用 PAM120 权重残差表,空位长度惩罚为 12,空位惩罚为 4。 此外,可以使用 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453)的方法计算两个氨基酸序列之间的百分比同源性,该方法并入 GCG 软件包(可在 www.gcg. com). (1970)) 算法,使用 Blossom62 矩阵或 PAM250 矩阵,间隙权重为 16、14、12、10、8、6 或 4,长度权重为 1. , 2, 3, 4、5 或 6。 此外或备选地,本公开主题的氨基酸序列也可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索,例如,以鉴定相关序列。 此类搜索可以使用 Altschul 等人 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 的 XBLAST 程序(2.0 版)进行。 可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索,得分=50,字长=3,使用本文公开的特定序列(例如,scFv703重链和轻链可变区序列)。可以获得与其同源的氨基酸序列。 为了获得用于比较目的的空位比对,可以如 Altschul 等人,(1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402 中所述使用空位 BLAST。 当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时,可以使用相应程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的默认参数。 【0096】 如本文所用,术语“保守序列修饰”不显着影响包含氨基酸序列的本公开的靶向CD19的CAR(例如,CAR的细胞外抗原结合结构域)的结合特征。指修饰不会引起变化的氨基酸。 保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。 可以通过本领域已知的标准技术,例如定点诱变和PCR介导的诱变,将修饰引入本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域。 氨基酸可根据其物理化学性质(例如电荷和极性)分为几类。 保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被同一组内的氨基酸取代的那些。 例如,氨基酸可以按电荷分类:带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸;带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸;包括的有丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。 此外,氨基酸还可以按极性分类:极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性) ,极性),丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸;非极性氨基酸包括丙氨酸,半胱氨酸,甘氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,蛋氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,色氨酸和缬氨酸。 因此,CDR 区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自同一组的其他氨基酸残基替换,导致具有保留功能的改变的抗体(即,(c) 至 (l) 可以使用描述的功能测定法进行测试在此处。 在某些实施方案中,指定序列或CDR区内不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个残基被改变。 【0097】 如本文所用,术语“有效量”是指足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。 有效量可以一次或多次给药于受试者。 在某些实施方案中,有效量足以减轻、逆转、稳定、逆转或减缓疾病的恶化,或以其他方式减轻疾病的病理后果。可以是大量的。 有效量可由医生根据具体情况并在本领域技术人员的技能范围内确定。 通常,在确定达到有效量的合适剂量时考虑了几个因素。 这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、正在治疗的病症、病症的严重程度以及施用的细胞的形式和有效浓度。 【0098】 如本文所用,术语“肿瘤”是指以细胞或组织的病理性增殖以及随后的其他组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。 肿瘤生长通常是不受控制的、进行性的,并且发生在未引发正常细胞增殖或导致其静止的条件下。 肿瘤包括但不限于膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺。 、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道或其选自下组的器官或组织或细胞类型,可影响多种细胞类型、组织或器官。 肿瘤包括癌症,例如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。 肿瘤可以是原发性肿瘤或原发性癌症。 【0099】 如本文所用,术语“信号序列”或“前导序列”是指存在于新合成蛋白质的N端的肽序列,其指导它们进入分泌途径(例如,5、10、15、20、 25 或 30 个氨基酸)。 【0100】 术语“包含”、“包含”应具有美国专利法赋予它们的广泛含义,包括、“包含”、“包括”等可表示 【0101】 如本文所用,“治疗”是指临床干预以改变被治疗的个体或细胞的病程,并且也可以为了预防而进行并且也可以在临床病理学过程中实施。 治疗的治疗效果包括但不限于预防疾病的出现或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、减缓疾病进展的速度、逆转或改善病情、缓解或改善预后。 治疗不仅可以预防疾病或病症的恶化,还可以预防受该病症影响或诊断患有该病症或疑似患有该病症的受试者中由该病症引起的恶化。该治疗还可以预防该病症或症状的发展有风险或疑似患有该病症的受试者的病症。 【0102】 如本文所用,“个体”或“受试者”是脊椎动物,例如人类或非人类动物,例如哺乳动物。 哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。 非人类动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物,例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠;兔子;狗;猫;人类灵长类动物也包括在内。 5.2.CD19 【0103】 CD19 是一种细胞表面 95 kDa 糖蛋白,存在于发育早期的正常 B 细胞上,直到它们分化为浆细胞。 其他正常组织中不存在 CD19,包括多能血液干细胞。 CD19 在 B 细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、毛细胞白血病和急性髓性白血病的一个子集上表达,表明自体是免疫治疗的一个有吸引力的靶标,免疫风险最小疾病(B 细胞发育不全除外)或不可逆的骨髓毒性。 【0104】 CD19 是免疫球蛋白超家族的成员,也是细胞表面信号转导复合物的组成部分,包括 Leu13、CD81 和 CD21,可通过 B 细胞受体正向调节信号转导。 【0105】 在某些实施方案中,本公开的CAR结合人CD19。 在某些实施方案中,人CD19包含或由NCBI参考编号NP_001171569.1的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)或其片段组成。 SEQ ID NO:5 如下所示: MPPPRLLFFL LFLTPMEVRP EEPLVVKVEE GDNAVLQCLK GTSDGPTQQL TWSRESPLKP FLKLSLGLPG LGIHMRPLAI WLFIFNVSQQ MGGFYLCQPG PPSEKAWQPG WTVNVEGSGE LFRWNVSDLG GLCGLKNRS SEGPSSPSGK LMSPKLYVWA KDRPEIWEGE PPCLPPRDSL NQSLSQDLTM APGSTLWLSC GVPPDSVSRG PLSWTHVHPK GPKSLLSLEL KDDRPARDMW VMETGLLLPR ATAQDAGKYY CHRGNLTMSF HLEITARPVL WHWLLRTGGW KVSAVTLAYL IFCLCSLVGI LHLQRALVLR RKRKRMTDPT RRFFKVTPPP GSGPQNQYGN VLSLPTPTSG LGRAQRWAAG LGGTAPSYGN PSSDVQADGA LGSRSPPGVG PEEEEGEGYE EPDSEEDSEF YENDSNLGQD QLSQDGSGYE NPEDEPLGPE DEDFSSNAES YENEDEELTQ PVARTMDFLS PHGSAWDPSR EATSLAGSQS YEDMRGILYA APQLRSIRGQ PGPNHEEDAD SYENMDNPDG PDPAWGGGGR MGTWSTR [序列号:5] 【0106】 在某些实施方案中,人CD19包含或由NCBI参考编号NP_001761.3的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)或其片段组成。 SEQ ID NO:6如下所示: MPPPRLLFFL LFLTPMEVRP EEPLVVKVEE GDNAVLQCLK GTSDGPTQQL TWSRESPLKP FLKLSLGLPG LGIHMRPLAI WLFIFNVSQQ MGGFYLCQPG PPSEKAWQPG WTVNVEGSGE LFRWNVSDLG GLCGLKNRS SEGPSSPSGK LMSPKLYVWA KDRPEIWEGE PPCLPPRDSL NQSLSQDLTM APGSTLWLSC GVPPDSVSRG PLSWTHVHPK GPKSLLSLEL KDDRPARDMW VMETGLLLPR ATAQDAGKYY CHRGNLTMSF HLEITARPVL WHWLLRTGGW KVSAVTLAYL IFCLCSLVGI LHLQRALVLR RKRKRMTDPT RRFFKVTPPP GSGPQNQYGN VLSLPTPTSG LGRAQRWAAG LGGTAPSYGN PSSDVQADGA LGSRSPPGVG PEEEEGEGYE EPDSEEDSEF YENDSNLGQD QLSQDGSGYE NPEDEPLGPE DEDFSSNAES YENEDEELTQ PVARTMDFLS PHGSAWDPSR EATSLGSQSY EDMRGILYAA PQLRSIRGQP GPNHEEDADS YENMDNPDGP DPAWGGGGRM GTWSTR [序列号:6] 【0107】 在某些实施方案中,CAR 结合 CD19 的胞外结构域。 在某些实施方案中,CAR 结合人 CD19 的细胞外结构域。 在某些实施方案中,人CD19的细胞外结构域包含或由SEQ ID NO:5的氨基酸20-291组成。 在某些实施方案中,人CD19的细胞外结构域包含或由SEQ ID NO:6的氨基酸20-291组成。 【0108】 在某些实施方案中,CD19 是至少约 80%、至少约 85%、至少约 90%、至少约 95%、至少约 96%、至少约 97% 的 SEQ 中列出的氨基酸序列ID NO:5或其片段。%、至少约98%、至少约99%或至少约100%相同的氨基酸序列。 【0109】 在某些实施方案中,CD19 是至少约 80%、至少约 85%、至少约 90%、至少约 95%、至少约 96%、至少约 97% 的 SEQ 中列出的氨基酸序列ID NO:6或其片段。%,至少约98%,至少约99%,或至少约100%相同的氨基酸序列。 5.3. 嵌合抗原受体 (CAR) 【0110】 CAR 是工程化的受体,可移植或赋予免疫效应细胞所需的特异性。 CAR 可用于将单克隆抗体的特异性转移至细胞,例如 T 细胞或 NK 细胞等免疫活性细胞;逆转录病毒载体可促进其编码序列的转移。 【0111】 CAR有3代。 “第一代”CAR通常由细胞外抗原结合结构域(例如,scFv)、与其融合的跨膜结构域和与其融合的细胞内信号结构域组成。 “第一代”CAR 赋予新的抗原识别能力,并且作为单一融合分子,通过它们的 CD3 zeta 链信号域、CD4 ⁺ T 细胞和 CD8 ⁺ 两者都能引起 T 细胞的激活。 在“第二代”CAR 中,来自共刺激分子(包括但不限于 CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的细胞内信号域被添加到 CAR 中,以向细胞提供额外的信号。的尾巴 “第二代”CAR 包括提供共刺激(例如 CD28 或 4-1BB)和激活(CD3zeta)的那些。 “第三代”CAR 包括提供多重共刺激(例如,CD28 和 4-1BB)和激活(CD3zeta)的那些。 在某些实施方案中,靶向 CD19 的 CAR 是第一代 CAR。 在某些实施方案中,靶向CD19的CAR不包含共刺激分子的细胞内信号结构域。 在某些实施方案中,靶向 CD19 的 CAR 是第二代 CAR。 在某些实施方案中,靶向CD19的CAR包含共刺激分子的细胞内信号结构域。 【0112】 在某些实施方案中,CAR包含特异性结合CD19的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域。 在某些实施方案中,细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域融合,并且跨膜结构域与细胞内信号结构域融合。 5.3.1. CAR的胞外抗原结合域 【0113】 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含或者是scFv。 scFv 可以是人 scFv、人源化 scFv 或小鼠 scFv。 在某些实施方案中,scFv 是人 scFv。 scFv可以来源于抗体的重链和轻链可变区的融合。 备选地或另外地,scFv可以源自Fab(不是源自抗体,例如从Fab文库获得)。 【0114】 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含或者是Fab。 在某些实施例中,Fab 是交联的。 在某些实施方案中,CAR 的细胞外抗原结合结构域是 F(ab) ₂ 包含或 F(ab) ₂ 是。 【0115】 任何上述分子都可以包含在具有异源序列的融合蛋白中,以形成 CAR 的细胞外抗原结合结构域。 【0116】 在某些实施方案中,CAR 的细胞外抗原结合结构域结合 CD19(例如,人 CD19)至至少约 1 x 10 ^-6 M,至少约 1 x 10 ^-7 M,至少约 1 x 10 ^-8 M,至少约 1 x 10 ^-9 M,或至少约 1 x 10 ^-10 M的解离常数(K _d ). 在某些实施方案中,CAR 的细胞外抗原结合结构域结合 CD19(例如,人 CD19)至至少约 2 x 10 ^-8 M的解离常数(K _d ). 在某些实施方案中,CAR 的细胞外抗原结合结构域为约 2×10 ^-8 M 到大约 8 x 10 ^-9 M (K _d ). 【0117】 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域以约1nM至50nM、约5nM至30nM、约5nM至25nM或约5nM至25nM与CD19(例如人CD19)连接8 nM 至 20 nM,具有解离常数 (K _d ). 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域以至少约50nM、至少约40nM、至少约35nM、至少约30nM、至少约25nM,至少约20nM,至少约19nM,至少约18nM,至少约17nM,至少约16nM,至少约15nM,至少约14nM,至少约13nM ,至少约12nM,至少约11nM,至少约10nM,至少约9nM,至少约8nM,至少约解离常数(K _d ). 【0118】 CAR胞外抗原结合结构域的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如,生长抑制)或Western印迹测定来确认。 . 这些测定中的每一种通常通过使用对感兴趣的复合物具有特异性的标记试剂(例如,抗体或scFv)来检测特定感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。 例如,scFv 可以被放射性标记并用于放射免疫测定 (RIA)(参见,例如,Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society,通过引用并入本文)。 1986). 放射性同位素可通过诸如使用伽马计数器或闪烁计数器或放射自显影等方式检测。 在某些实施方案中,靶向 CD127 的细胞外抗原结合结构域用荧光标记物标记。 荧光标记的非限制性实例包括绿色荧光蛋白 (GFP)、蓝色荧光蛋白(例如 EBFP、EBFP2、Azurite 和 mKalama1)、青色荧光蛋白(例如 ECFP、Cerulean 和 CyPet)和黄色荧光蛋白( GFP). 包括荧光蛋白(例如,YFP、Citrine、Venus 和 YPet)。 在某些实施方案中,靶向 CD19 的人 scFv 用 GFP 标记。 【0119】 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域是重链可变区(V _H ) 和轻链可变区 (V _L )包括。 【0120】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NOS:7-9如下所示。 SYGMH [序列号:7] LIWYDGSNKYADSVKG [序列号:8] PVEGLLRGFDY [序列号:9] 【0121】 在某些实施例中,V _H “氨基酸序列”包括与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _H 约 80%、约 81%、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89% 的 SEQ ID 所示氨基酸序列NO: 10, 约 90%, 约 91%, 约 92%, 约 93%, 约 94%, 约 95%, 约 96%, 约 97%, 约 98%, 约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _H 含有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:10如下所示。 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFFTFSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPVEGLLRGFDYWGQGTLVTVSS [序列号:10] 【0122】 在某些实施例中,V _L 是包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 13 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NOS:11-13如下所示。 RASQSVSSSYLA [序列号:11] GASSRAT [序列号:12] QQAGAVPIT[序列号:13] 【0123】 在某些实施例中,V _L “序列”包括与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 14, 约 90%, 约 91%, 约 92%, 约 93%, 约 94%, 约 95%, 约 96%, 约 97%, 约 98%, 约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:14如下所示。 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGAVPITFGGGTKVEIK [序列号:14] 【0124】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 含有含有SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO: 所示氨基酸序列:13或其含有CDR3的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的CDR3。 【0125】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。 【0126】 五、 _H 和V _L 可以一个接一个地连接,例如通过接头。 可变区从 N 端到 C 端被 V _L -V _H 或V _L -V _H 可 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H [0080] 和V包含包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,scFv包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列或由其组成。 SEQ ID NO:15如下所示。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#2 scFv”。 【0127】 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGAVPITFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLLRAKEDTAVYGTVYGGTAVYGGTVYGNAGNUMERYNATURE??? 【0128】 在某些实施例中,V _L 是包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 17 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NO:16和17如下所示。 RASQSVRSSYLA [序列号:16] QQLFDSPYT[序列号:17] 【0129】 在某些实施例中,V _L “氨基酸序列”包括与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 18, 约 90%, 约 91%, 约 92%, 约 93%, 约 94%, 约 95%, 约 96%, 约 97%, 约 98%, 约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:18 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:18如下所示。 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQLFDSPYTFGGGTKVEIK [序列号:18] 【0130】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 含有含有SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO: 所示氨基酸序列: 17 或其包含 CDR3 的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR3。 【0131】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:18 所示的氨基酸序列。 【0132】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H [0080] 和V包含包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,scFv包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或由其组成。 SEQ ID NO:19如下所示。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#8 scFv”。 【0133】 IVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQLFDSPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAKEDTAVYGTVYGGTAVYYGNAGTYYGNTLYLQMNSLRAKEDTAVYGTVYGNA # 【0134】 在某些实施例中,V _L 是含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:20所示氨基酸序列: 21 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NO:20和21如下所示。 GASRRAT [序列号:20] QQAGIPPYT [序列号:21] 【0135】 在某些实施例中,V _L 包括与SEQ ID NO:22所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO:22、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:22 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:22如下所示。 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGIPPYTFGGGTKVEIK [序列号:22] 【0136】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 是含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:20所示氨基酸序列: 21 或其包含 CDR3 的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的CDR3。 【0137】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:22 所示的氨基酸序列。 【0138】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H V包含包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO: 22中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,scFv包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或由其组成。 SEQ ID NO:23如下所示。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#15 scFv”。 【0139】 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPVEGLLRGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPGRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGTDFTISRLEPEDFAVGQ[SEQ ID NO. 【0140】 在某些实施方案中,根据 Kabat 编号系统识别 CDR。 【0141】 在某些实施例中,V _L 是包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 57 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NO:57如下所示。 QQVDSLHPFT[序列号:57] 【0142】 在某些实施例中,V _L “氨基酸序列”包括与SEQ ID NO:58所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 58、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:58 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:58如下所示。 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVDSLHPFTFGGGTKVEIK [序列号:58] 【0143】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 含有含有SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO: 所示氨基酸序列: 57 或其包含 CDR3 的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的CDR3。 【0144】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:58 所示的氨基酸序列。 【0145】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _HV包含包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 57所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#4 scFv”。 【0146】 在某些实施方案中,根据 Kabat 编号系统识别 CDR。 【0147】 在某些实施例中,V _L 是包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 59 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NO:59如下所示。 QQAGGVPPLT[序列号:59] 【0148】 在某些实施例中,V _L “氨基酸序列”包括与SEQ ID NO:60所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 60, 约 90%, 约 91%, 约 92%, 约 93%, 约 94%, 约 95%, 约 96%, 约 97%, 约 98%, 约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:60 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:60如下所示。 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGGVPPLTFGGGTKVEIK [序列号:60] 【0149】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 含有含有SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO: 所示氨基酸序列: 59 或其包含 CDR3 的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的CDR3。 【0150】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:60 所示的氨基酸序列。 【0151】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H V包含包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#5 scFv”。 【0152】 在某些实施方案中,根据 Kabat 编号系统识别 CDR。 【0153】 在某些实施例中,V _L 是包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 61 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NO:61如下所示。 QQAGVPPLT[序列号:61] 【0154】 在某些实施例中,V _L “氨基酸序列”包括与SEQ ID NO:62所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 62、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:62 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:62如下所示。 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGVPPLTFGGGTKVEIK [序列号:62] 【0155】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 是包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 61 或其含有 CDR3 的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的CDR3。 【0156】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:62 所示的氨基酸序列。 【0157】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H V包含包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#6 scFv”。 【0158】 在某些实施方案中,根据 Kabat 编号系统识别 CDR。 【0159】 在某些实施例中,V_L 是包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:1所示氨基酸序列: 63 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NO:63如下所示。 QQAGGVPPFT[序列号:63] 【0160】 在某些实施例中,V _L “序列”包括与SEQ ID NO:64所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 64、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:64 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:64如下所示。 EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGGVPPFTFGGGTKVEIK [序列号:64] 【0161】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 含有含有SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO: 所示氨基酸序列: 63 或其含有 CDR3 的保守修饰。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的CDR3。 【0162】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:64 所示的氨基酸序列。 【0163】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H V包含包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 63所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#7 scFv”。 【0164】 在某些实施方案中,根据 Kabat 编号系统识别 CDR。 【0165】 在某些实施例中,V _L 是含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:65所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:65所示氨基酸序列: 66 或其保守修饰,包括含有 CDR3 在某些实施例中,V _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的CDR3。 SEQ ID NOS:66 和 67 如下所示。 GASNRAT [序列号:65] QQAGVFPFT[序列号:66] 【0166】 在某些实施例中,V _L “序列”包括与SEQ ID NO:67所示氨基酸序列至少约80%(例如,至少约85%、至少约90%或至少约95%)相同或同源的氨基酸序列。 例如,V _L 约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%具有SEQ ID中所示的氨基酸序列NO: 67、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99% 或约 100% 相同或同源amino acids 包含数组。 在某些实施例中,V _L 含有 SEQ ID NO:67 所示的氨基酸序列。 SEQ ID NO:67如下所示。 EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGVFPFTFGGGTKVEIK [序列号:67] 【0167】 在某些实施例中,V _H 是含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,CDR2含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其保守修饰,以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列: 9 或其保守修饰包含含有 V 的 CDR3 _L 含有含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR1,含有SEQ ID NO:65所示氨基酸序列或其保守修饰的CDR2,以及SEQ ID NO:65所示氨基酸序列: 66 或其保守修饰。含有 CDR3。 在某些实施例中,V _H 含有包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR3; _L 含有包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR1,包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的CDR2,和包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的CDR3。 【0168】 在某些实施例中,V _H 含有 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列,并且 V _L 含有 SEQ ID NO:67 所示的氨基酸序列。 【0169】 在某些实施例中,V _L 位于细胞外抗原结合结构域的 N 端,即 V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 这就是立场。 在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR2,以及氨基酸序列组在 SEQ ID NO:9 V 中第四位包含 CDR3 包含 _H V包含包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 65所示氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 66所示氨基酸序列的CDR3 _L 是一个 scFv 包含 在某些实施方案中,scFv 包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H ,并且Vh包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列 _L 包括。 在某些实施方案中,抗CD19 scFv被称为“#1 scFv”。 【0170】 在某些实施方案中,根据 Kabat 编号系统识别 CDR。 【0171】 编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:68中给出。 SEQ ID NO:68如下所示。 【0172】 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCACTGATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGCCAGTGGAAGGACTATTAAGAGGATTCGATTACTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA[配列番号68] 【0173】 编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:69中给出。 SEQ ID NO:69如下所示。 【0174】 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCCGGAGCCGTCCCTATCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号69] 【0175】 编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:70中给出。 SEQ ID NO:70如下所示。 【0176】 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGCTCTTCGACAGTCCTTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号70] 【0177】 编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:71中给出。 SEQ ID NO:71如下所示。 【0178】 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGAAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCCGGCATCCCCCCTTACACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号71] 【0179】 编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:72中给出。 SEQ ID NO:72如下所示。 【0180】 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGTCGACAGTCTCCATCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号72] 【0181】 编码SEQ ID NO:60的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:73中给出。 SEQ ID NO:73如下所示。 【0182】 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCCGGAGGCGTCCCTCCTCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号73] 【0183】 编码SEQ ID NO:62的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:74中给出。 SEQ ID NO:74如下所示。 【0184】 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCCGGAGTCCCCCCTCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号74] 【0185】 编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:75中给出。 SEQ ID NO:75如下所示。 【0186】 GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCCGGAGGCGTCCCTCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号75] 【0187】 编码SEQ ID NO:67的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO:76中给出。 SEQ ID NO:76如下所示。 【0188】 GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCCGGAGTCTTCCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA[配列番号76] 【0189】 在某些实施例中,V _H 和V _L 通过链接器链接。 在某些实施方案中,接头包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或由其组成。 在某些实施方案中,接头包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或由其组成。 【0190】 至少约 80% 的特定序列(例如,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO: NO:62、SEQ ID NO:64 或 SEQ ID NO:67)、至少约 80%、至少约 85%、至少约 90%、或至少约 95% (例如,约 81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%)%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、或约 99%)由 V 的同源性或同一性组成 _H 和/或V _L 与指定序列相比,氨基酸序列可以包含取代(例如,保守取代)、插入或缺失,但仍保留结合靶抗原(例如,间皮素)的能力。 在某些实施方案中,特定序列(例如,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO: 62,SEQ ID NO:64,或 SEQ ID NO:67)中总共有 1 至 10 个氨基酸被取代、插入和/或缺失。 在某些实施方案中,取代、插入或缺失是在胞外抗原结合结构域的CDR之外的区域(例如,在FR之内)。 在某些实施方案中,细胞外抗原结合结构域是 Vh _H 和/或V _L ,包括 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:60 的翻译后修饰ID NO:64,或 SEQ ID NO:67。 【0191】 此外,细胞外抗原结合结构域可能包含引导新生蛋白进入内质网的前导肽或信号肽。 如果 CAR 被糖基化并束缚在细胞膜上,信号肽或前导肽可能是必不可少的。 信号序列或前导序列是肽序列(约 5、约 10、约 15、约 20、约 25 或约 30 个氨基酸长)。 在某些实施方案中,信号肽共价连接至细胞外抗原结合结构域的5'末端(N-末端)。 在某些实施方案中,信号肽包含CD8多肽,例如CAR包含截短的CD8信号肽。 在某些实施方案中,信号肽从其来源的抗体产生。 在某些实施方案中,#2 scFv 的信号肽在 SEQ ID NO:54 中列出。 在某些实施方案中,#8 scFv 的信号肽在 SEQ ID NO:54 中列出。 在某些实施方案中,#15 scFv 的信号肽在 SEQ ID NO:55 中列出。 MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC [序列号:54] MEFGLSWVFLVALLRGVQC [序列号:55] 5.3.2.CAR的跨膜结构域 【0192】 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含跨越至少一部分膜的疏水性α螺旋。 不同的跨膜结构域赋予不同的受体稳定性。 抗原识别后,受体聚集并将信号传递给细胞。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域是CD8的天然或修饰的跨膜结构域、CD28的天然或修饰的跨膜结构域、CD3zeta的天然或修饰的跨膜结构域、CD4的天然或改变的跨膜结构域、天然或改变的跨膜结构域4-1BB的结构域,OX40的天然或改变的跨膜结构域,ICOS的天然或改变的跨膜结构域,CD84天然或改变的跨膜结构域,CD166天然或改变的跨膜结构域,CD8a天然或改变的跨膜结构域,CD8b天然或改变的跨膜结构域, ICAM-1天然或修饰的跨膜结构域、CTLA-4天然或修饰的跨膜结构域、CD27天然或修饰的跨膜结构域、CD40天然或修饰的跨膜结构域,包括NKGD2的天然或修饰的跨膜结构域,或其组合。 【0193】 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD28多肽(例如,CD28的跨膜结构域或其部分)。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含人CD28的跨膜结构域或其一部分。 CD28多肽至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或可包含或由100%相同的氨基酸序列组成或同源和/或可任选地包含至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。 在某些实施方案中,CD28多肽至少约20,或至少约30,或至少约40,或至少约50,或至少约60,和/或最多约70,最多约80,最多约90个、最多约100个、最多约150个、最多约200个或最多约220个氨基酸长度。 在某些实施方案中,CD28多肽包含氨基酸1-220、1-50、50-100、100-150、154-179、150-200、153-179或200-220,其包含氨基酸或由其组成顺序。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD28多肽,其包含或由SEQ ID NO:24的氨基酸154-179的氨基酸序列组成。 SEQ ID NO:24如下所示。 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS [序列号:24] 【0194】 编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的示例性核苷酸序列的氨基酸154-179在SEQ ID NO:25中列出,如下所示。 TGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTTTTTTCTGGGTG [序列号:25] 【0195】 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含小鼠CD28的跨膜结构域或其一部分。 CD28多肽至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%具有NCBI参考号NP_031668.3 (SEQ ID NO:26)的序列或其片段。%或100%相同或同源,和/或任选包含至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。 在某些实施方案中,CD28多肽的长度为至少约20个、或至少约30个、或至少约40个、或至少约50个和至多约218个氨基酸,这些氨基酸是SEQ的连续部分ID NO:26. 包含或由数组组成。 在某些实施方案中,CD28多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸1-218、1-50、50-100、100-150、150-200、151-177或200-218的氨基酸序列。或由它组成。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD28多肽,其包含或由SEQ ID NO:26的氨基酸151-177的氨基酸序列组成。 SEQ ID NO:26 如下所示: MTLRLLFLAL NFFSVQVTEN KILVKQSPLL VVDSNEVSLS CRYSYNLLAK EFRASLYKGV NSDVEVCVGN GNFTYQPQFR SNAEFNCDGD FDNETVTFRL WNLHVNHTDI YFCKIEFMYP PPYLDNERSN GTIIHIKEKH LCHTQSSPKL FWALVVVAGV LFCYGLLVTV ALCVIWTNSR RNRLLQSDYM NMTPRRPGLT RKPYQPYAPA RDFAAYRP [序列号:26] 【0196】 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD8多肽(例如,CD8的跨膜结构域或其部分)。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含人CD8的跨膜结构域或其一部分。 在某些实施方案中,CD8多肽至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%是具有NCBI参考号NP_001139345.1 (SEQ ID NO:27)或其片段的序列,包含或具有约 98%、约 99% 或约 100% 相同或同源的氨基酸序列,和/或任选包含最多 1 个或最多 2 个或最多 3 个保守氨基酸取代。没关系。 在某些实施方案中,CD8多肽的长度为至少约20个、或至少约30个、或至少约40个、或至少约50个和至多约235个氨基酸,这些氨基酸是SEQ的连续部分ID NO:27. 包含或由数组组成。 或者或另外,在某些实施方案中,CD8多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-235、1-50、50-100、100-150、150-200、137-209或200。它包含或由~235 个氨基酸序列。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD8多肽,其包含或由SEQ ID NO:27的氨基酸137-209的氨基酸序列组成。 SEQ ID NO:27如下所示。 【0197】 MALPVTALLLPPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARY [sequence number 27V] 【0198】 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含小鼠CD8的跨膜结构域或其一部分。 在某些实施方案中,CD8多肽是至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%的具有NCBI参考号AAA92533.1的序列(SEQ ID NO:28)或其片段,包含或具有约 98%、约 99% 或约 100% 相同或同源的氨基酸序列,和/或任选包含最多 1 个或最多 2 个或最多 3 个保守氨基酸取代。没关系。 在某些实施方案中,CD8多肽是至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、或至少约60、或至少约70、或至少约100、或至少约200,并且具有作为SEQ ID NO:28的连续部分的氨基酸序列,其长达247个氨基酸。 或者或另外,在某些实施方案中,CD8多肽包含氨基酸1-247、1-50、50-100、100-150、150-200、151-219,或包含或由200-247的序列组成氨基酸。 在某些实施方案中,CAR的跨膜结构域包含CD8多肽,其包含或由SEQ ID NO:28的氨基酸151-219的氨基酸序列组成。 SEQ ID NO:28如下所示。 MASPLTRFLS LNLLLMGESI ILGSGEAKPQ APELRIFPKK MDAELGQKVD LVCEVLGSVS QGCSWLFQNS SSKLPQPTFV VYMASSHNKI TWDEKLNSSK LFSAVRDTNN KYVLTLNKFS KENEGYYFCS VISNSVMYFS SVVPVLQKVN STTTKPVLRT PSPVHPTGTS QPQRPEDCRP RGSVKGTGLD FACDIYIWAP LAGICVAPLL SLEITLICYH RSRKRVCKCP RPLVRQEGKP RPSEKIV [序列号:28] 【0199】 在某些非限制性实施方案中,CAR还包含连接细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的间隔区。 间隔区域可以足够灵活以允许抗原结合结构域的不同方向以促进抗原识别,同时保持 CAR 活性的激活。 【0200】 在某些实施方案中,CAR 的铰链/间隔区是 CD8、CD28、CD3ζ、CD40、4-1BB、OX40、CD84、CD166、CD8a、CD8b、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、CD27、CD40、NKGD2 ,或其组合,天然或修饰的铰链区。 铰链/间隔区是 IgG1,或免疫球蛋白的 CH ₂ CH ₃ 源自 CD3 的区域和部分、CD28 多肽的部分(例如,SEQ ID NO:24 或 SEQ ID NO:26 的部分)、CD8 多肽的部分(例如,SEQ ID NO: 的部分:27 或 SEQ ID NO:28)铰链区、任何前述的变体或至少约 80%、至少约 85%、至少约 90%、至少约 95 %,或至少约 100% 与其相同或同源;您可以 【0201】 在某些实施方案中,CAR 铰链域包含 CD28 的天然或工程化铰链区。 在某些实施方案中,CAR 铰链域包含 CD28 的天然铰链区。 在某些实施方案中,CAR铰链结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸114-153的氨基酸序列。 编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的示例性核苷酸序列的氨基酸114-153在SEQ ID NO:56中列出,如下所示。 ATTGAAGTTATGTATCCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCGGACCTTCTAAGCCCTTT [序列号:56] 5.3.3. CAR 细胞内信号域 【0202】 在某些实施方案中,CAR 包含细胞内信号结构域。 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域包含CD3ζ多肽。 CD3ζ可以激活或刺激细胞(例如淋巴谱系的细胞,例如T细胞)。 野生型(“天然”)CD3ζ 包含三个功能性免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM)、三个功能性富碱性拉伸 (BRS) 区域(BRS1、BRS2 和 BRS3)。 抗原结合后,CD3zeta 将激活信号传递给细胞(例如淋巴系细胞,例如 T 细胞)。 CD3 zeta 链的细胞内信号域是内源性 TCR 信号的主要传递者。 【0203】 在某些实施方案中,CAR 的细胞内信号结构域包含天然 CD3ζ。 在某些实施方案中,天然 CD3ζ 至少约 85%、约 90%、约 95%、约 96%、约 97%、包含约 98%、约 99% 或约 100 个氨基酸序列或由其组成%相同或同源,和/或可任选地包含至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。 在某些实施方案中,CD3ζ多肽的长度为至少约20个、或至少约30个、或至少约40个、或至少约50个和最多约164个氨基酸,这些氨基酸是SEQ的连续部分ID NO:29. 包含或由数组组成。 在某些实施方案中,天然CD3ζ包含或由SEQ ID NO:29的氨基酸1-164、1-50、50-100、52-164、100-150或150-164的氨基酸序列组成。 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域包含天然CD3ζ,其包含或由SEQ ID NO:29的氨基酸52-164的氨基酸序列组成。 SEQ ID NO:29 如下所示: MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR [序列号:29] 【0204】 在某些实施方案中,天然 CD3ζ 至少约 85%、约 90%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99% 或包含或由以下氨基酸序列组成:约100% 相同或同源。 SEQ ID NO:30 如下所示: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR [序列号:30] 【0205】 在某些实施方案中,CAR 的细胞内信号结构域包含修饰的 CD3ζ 多肽。 在某些实施方案中,修饰的CD3ζ多肽包含1、2或3个ITAM。 在某些实施方案中,修饰的 CD3ζ 多肽包含天然 ITAM1。 在某些实施方案中,天然 ITAM1 包含或由 SEQ ID NO:31 中列出的氨基酸序列组成。 QNQLYNELNLGRREEYDVLDKR [序列号:31] 【0206】 编码SEQ ID NO:31的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:32中并在下文呈现。 CAGAACCAGCCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTGGACAAGAGA [序列号:32] 【0207】 在某些实施方案中,修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1变体,该变体包含一个或多个功能丧失突变。 在某些实施例中,ITAM1变体包含或由两个功能丧失突变组成。 在某些实施方案中,一个或多个(例如,两个)功能丧失突变中的每一个包含ITAM1中的酪氨酸残基的突变。 在某些实施方案中,ITAM1 变体由两个功能丧失突变组成。 在某些实施方案中,ITAM1 变体包含以下所示的 SEQ ID NO:33 中列出的氨基酸序列或由其组成。 QNQLFNELNLGRREEFDVLDKR [序列号:33] 【0208】 编码SEQ ID NO:33的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:34中并在下文呈现。 CAGAACCAGCTCTTTAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTTCGATGTTTTGGACAAGAGA [序列号:34] 【0209】 在某些实施方案中,修饰的 CD3ζ 多肽包含天然 ITAM2。 在某些实施方案中,天然 ITAM2 包含以下所示的 SEQ ID NO:35 中列出的氨基酸序列或由其组成。 QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK [序列号:35] 【0210】 编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文呈现的SEQ ID NO:36中给出。 CAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAA [序列号:36] 【0211】 在某些实施方案中,修饰的 CD3ζ 多肽包含 ITAM2 变体。 在某些实施方案中,ITAM2变体包含一种或多种功能丧失突变或由一种或多种功能丧失突变组成。 在某些实施例中,ITAM2变体包含或由两个功能丧失突变组成。 在某些实施方案中,一个或多个(例如,两个)功能丧失突变中的每一个包含ITAM2中的酪氨酸残基的突变。 在某些实施方案中,ITAM1 变体由两个功能丧失突变组成。 在某些实施方案中,ITAM2 变体包含以下所示的 SEQ ID NO:37 中列出的氨基酸序列或由其组成。 QEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMK [序列号:37] 【0212】 编码SEQ ID NO:37的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文呈现的SEQ ID NO:38中。 CAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAA [序列号:38] 【0213】 在某些实施方案中,修饰的 CD3ζ 多肽包含天然 ITAM3。 在某些实施方案中,天然 ITAM3 包含以下所示的 SEQ ID NO:39 中列出的氨基酸序列或由其组成。 HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ [序列号:39] 【0214】 编码SEQ ID NO:39的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文呈现的SEQ ID NO:40中。 CACGATGGCCTTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAG [序列号:40] 【0215】 在某些实施方案中,修饰的 CD3ζ 多肽包含 ITAM3 变体。 在某些实施例中,ITAM3变体包含或由两个功能丧失突变组成。 在某些实施方案中,一个或多个(例如,两个)功能丧失突变中的每一个包含ITAM3中的酪氨酸残基的突变。 在某些实施例中,ITAM3变体包含或由两个功能丧失突变组成。 在某些实施方案中,ITAM3 变体包含以下所示的 SEQ ID NO:41 中列出的氨基酸序列或由其组成。 HDGLFQGLSTATKDTFDALHMQ [序列号:41] 【0216】 编码SEQ ID NO:41的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:42中并在下文呈现。 CACGATGGCCTTTTCCAGGGGCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAG [序列号:42] 【0217】 国际专利申请公开号 WO2019/133969 中公开了多种修饰的 CD3ζ 多肽和含有修饰的 CD3ζ 多肽的 CAR,其全文通过引用并入本文。 【0218】 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域是天然ITAM1、包含一个或多个(例如两个)功能丧失突变或由其组成的ITAM2变体,以及一个或多个(例如,修饰的CD3ζ多肽,其包含包含或由 2) 功能丧失突变组成的 ITAM3 变体包括在内。 在某些实施方案中,CAR细胞内信号结构域是修饰的CD3ζ,其包含天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体,包括多肽。 在某些实施方案中,CAR 的细胞内信号结构域是由 SEQ ID NO:31 中列出的氨基酸序列组成的天然 ITAM1、由 SEQ ID NO:37 中列出的氨基酸序列组成的 ITAM2 变体,以及ITAM2 变体由 SEQ ID NO:41 中列出的氨基酸序列组成。包括包含由氨基酸序列组成的 ITAM3 变体的修饰的 CD3ζ 多肽。 在某些实施方案中,CAR 被称为“1XX”。 在某些实施方案中,修饰的CD3ζ多肽包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列或由其组成。 SEQ ID NO:43 如下所示: RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLFN ELQKDKMAEA FSEIGMKGER RRGKGHDGLF QGLSTATKDT FDALHMQALP PR [序列号:43] 【0219】 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约包含或由以下组成:氨基酸序列是 97%、至少约 98%、或至少约 99%、至少约 100% 相同,和/或任选地最多 1 个或最多 2 个或最多 3 个保守氨基酸取代修饰的 CD3ζ多肽,其可包含 【0220】 编码SEQ ID NO:43的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:44中并在下文呈现。 【0221】 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGGCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC[配列番号44] 【0222】 编码SEQ ID NO:43的另一个氨基酸序列的示例性核酸序列在下文呈现的SEQ ID NO:45中列出。 【0223】 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC[配列番号45] 【0224】 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域还包含至少一个共刺激信号区域。 在某些实施方案中,至少一个共刺激区域包含共刺激分子或其部分。 在某些实施方案中,至少一个共刺激区域包含至少一种共刺激分子的细胞内结构域或其部分。 【0225】 如本文所用,“共刺激分子”是指除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子,其可提供淋巴细胞对抗原的有效反应。 在某些实施方案中,共刺激分子可导致最佳的淋巴细胞活化。 共刺激分子的非限制性实例包括CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP-10及其组合。 共刺激分子可以与共刺激配体结合。 共刺激配体在细胞表面表达并与其受体结合导致共刺激反应,即识别抗原的受体(例如,嵌合抗原受体(CAR))与其靶抗原的结合。它是一种产生细胞内反应的蛋白质,可激活所施加的刺激。 例如,4-1BB 配体(即 4-1BBL)可以与 4-1BB 结合,从而将 CAR 信号与 CAR 结合 ⁺ 提供诱导 T 细胞效应细胞功能的细胞内信号。 在某些实施方案中,至少一个共刺激信号传导区域是 CD28 的胞内信号传导结构域或其一部分、4-1BB 的胞内结构域或其一部分、OX40 的胞内结构域或其一部分。 ICOS 的结构域或其一部分,或 DAP-10 的胞内结构域或其一部分。 【0226】 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域包含共刺激信号区域,该共刺激信号区域包含CD28多肽,例如CD28的细胞内结构域或其部分。 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区域,该共刺激信号传导区域包含人CD28的细胞内结构域或其一部分。 【0227】 在某些实施方案中,包含在 CAR 的共刺激信号传导区中的 CD28 多肽至少约 80%、至少约 85%、至少约 90%、至少约 85%、至少约 90%,在至少包含或由约 95%、至少约 96%、至少约 97%、至少约 98%、或至少约 99%、至少约 100%相同或同源的氨基酸序列组成,和/或任选地最多可包含一个或最多两个或最多三个保守氨基酸取代。 在某些实施方案中,包括在共刺激信号传导区中的CD28多肽的长度为至少约20个、或至少约30个、或至少约40个、或至少约50个和最多约220个氨基酸,SEQ ID NO:它包含或由作为 24 的连续部分的氨基酸序列组成。 或者或另外,在某些实施方案中,包括在共刺激信号传导区中的CD28多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸1-220、1-50、50-100、100-150、114。包含或由~ 220、150-200、180-220 或 200-220。 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域包含共刺激信号区域,其包含CD28多肽,其包含或由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成。 【0228】 编码SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:46中并如下所示。 AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC [序列号:46] 【0229】 在某些实施方案中,CAR的细胞内信号结构域包含共刺激信号区域,该共刺激信号区域包含小鼠CD28的细胞内结构域或其一部分。 在某些实施方案中,包含共刺激信号传导区的CD28多肽至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%为SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列%,至少约 96%,至少约 97%,至少约 98%,或至少约 99%,至少约 100%,包含或由相同或相同的氨基酸序列组成同源的,和/或任选地至多1个或可包含至多2个或至多3个保守氨基酸取代。 在某些实施方案中,共刺激信号传导区中包含的 CD28 多肽的长度为至少约 20 个、或至少约 30 个、或至少约 40 个、或至少约 50 个和最多 218 个氨基酸,SEQ ID NO:26 包含或由作为连续部分的氨基酸序列组成 在某些实施方案中,包括在共刺激信号传导区中的CD28多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸1-218、1-50、50-100、100-150、150-218、178-218,或者包含或由200-218个氨基酸的序列组成。 在某些实施方案中,本公开的CAR的共刺激信号传导区域包含CD28多肽,其包含或由SEQ ID NO:26的氨基酸178-218的氨基酸序列组成。 【0230】 在某些实施方案中,CAR的胞内信号结构域包含共刺激信号区,该共刺激信号区包含4-1BB多肽,例如4-1BB的胞内结构域或其一部分。 在某些实施方案中,共刺激信号传导区域包含人4-1BB的细胞内结构域或其一部分。 在某些实施方案中,共刺激信号区中包含的 4-1BB 至少约 80%、至少约 85%、至少约 90% 与具有 NCBI 参考号 NP_001552 (SEQ ID NO:47)的序列或其片段包含或由至少约 95%、至少约 96%、至少约 97%、至少约 98%、或至少约 99%、至少约 100%相同或同源的,和/或任选地可以包含至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。 在某些实施方案中,共刺激信号传导区域中包含的 4-1BB 至少约 20 个,或至少约 30 个,或至少约 40 个,或至少约 50 个,和/或最多约 50 个,最多约 60,其包含或由作为 SEQ ID NO:47 的连续部分的氨基酸序列组成,最多约 70、最多约 80、最多约 90、最多约 100、最多约 200、或最多到大约 255 个氨基酸的长度。 在某些实施方案中,共刺激信号传导区中包含的 4-1BB 多肽包含 SEQ ID NO:47 的氨基酸 1-255、1-50、50-100、100-150、150-200 或 200-255 . 它包含或由 255 个氨基酸的序列组成。 在某些实施方案中,共刺激信号传导区包含4-1BB多肽,其包含或由SEQ ID NO:46的氨基酸214-255的氨基酸序列组成。 SEQ ID NO:47如下所示。 【0231】 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL [序列号:47] 【0232】 在某些实施方案中,CAR的胞内信号域是两个或多个共刺激分子的胞内域或其部分,例如CD28和4-包含胞内域的共刺激信号域或其部分1BB 或其一部分,或 CD28 的胞内结构域或其一部分,以及 OX40 的胞内结构域或其一部分。 5.3.4. 示例 CAR 【0233】 在某些实施方案中,CAR包含(a)(i)由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成的CDR1、由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成的CDR2,以及来自氨基酸SEQ ID NO:9 中列出的序列。V 包含 CDR3_H (ii)由序列号11所示的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12所示的氨基酸序列构成的CDR2、以及序列号12所示的氨基酸序列构成的CDR3 : 13. _L (b) 包含 CD28 多肽的铰链结构域(例如,人 CD28 的铰链结构域或其部分,例如,由 SEQ ID NO: 24 的氨基酸 114 至 153 的氨基酸序列组成的 CD28 多肽)(c )包含CD28多肽的跨膜结构域(例如,人CD28的跨膜结构域或其部分,例如,由SEQ ID NO:24的氨基酸154-179的氨基酸序列组成的CD28多肽),和(d ) (i) CD3ζ多肽(例如,修饰的人CD3ζ多肽,例如,由SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列组成);和(ii)包含CD28多肽的共刺激信号传导区(例如,人CD28的细胞内结构域或其部分,例如由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成的CD28多肽。 在某些实施例中,V _H 和V _L 经由由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的接头连接。 在某些实施例中,V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 它的定位是 在某些实施例中,CAR 被设计为“CAR#2”。 在某些实施方案中,CAR 包含 SEQ ID NO:48 中列出的氨基酸序列,如下所示。 【0234】 MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRCEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAGAVPITFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPVEGLLRGFDYWGQGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR[配列番号48] 【0235】 编码SEQ ID NO:48的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:49中并在下文呈现。 【0236】 ATGGATATGAGAGTACCAGCTCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTTTTGTGGTTGCCGGACACACGCTGTGAGATTGTCCTGACTCAGTCTCCCGGGACTCTGTCCCTCAGCCCCGGTGAACGCGCTACCCTTTCATGCAGAGCCTCTCAGTCTGTGTCCAGCAGCTACCTCGCATGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCCAGGCTGTTGATCTATGGAGCTAGTAGTCGAGCAACAGGCATCCCAGATCGCTTCTCAGGGAGCGGTTCAGGTACAGACTTCACGCTGACGATTTCAAGGCTGGAACCCGAAGATTTTGCCGTCTATTATTGTCAACAGGCAGGGGCTGTGCCAATCACTTTCGGGGGCGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGAGGCGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGGAGCGGTGGAGGAGGGTCACAGGTGCAGCTGGTAGAATCTGGCGGAGGGGTCGTTCAACCAGGGAGGTCATTGCGGTTGAGCTGCGCAGCGAGTGGTTTTACCTTCAGCAGTTATGGAATGCATTGGGTGAGACAAGCACCAGGAAAAGGTCTGGAGTGGGTGGCTTTGATTTGGTACGACGGCAGTAATAAATACTACGCCGATTCTGTTAAGGGCAGATTTACTATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGAGCCGAAGATACAGCAGTGTACTATTGTGCTAAGCCCGTAGAAGGGCTCCTGAGGGGATTCGATTATTGGGGCCAGGGTACGCTTGTGACAGTGTCTAGTCGGGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC[配列番号49] 【0237】 在某些实施方案中,CAR包含(a)(i)由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成的CDR1、由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成的CDR2,以及来自氨基酸SEQ ID NO:9 中列出的序列。V 包含 CDR3 _H (ii)由序列号16所示的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号12所示的氨基酸序列构成的CDR2、以及序列号12所示的氨基酸序列构成的CDR3 : 17. _L (b) 包含 CD28 多肽的铰链结构域(例如,人 CD28 的铰链结构域或其部分,例如,由 SEQ ID NO: 24 的氨基酸 114 至 153 的氨基酸序列组成的 CD28 多肽)(c )包含CD28多肽的跨膜结构域(例如,人CD28的跨膜结构域或其部分,例如,由SEQ ID NO:24的氨基酸114-179的氨基酸序列组成的CD28多肽),和(c ) (i) CD3ζ多肽(例如,修饰的人CD3ζ多肽,例如,由SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列组成)和(ii)包含CD28多肽(例如, ,人CD28的细胞内结构域或其部分,例如由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成的CD28多肽。 在某些实施例中,V _H 和V _L 经由由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的接头连接。 在某些实施例中,V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 它的定位是 在某些实施例中,CAR 被设计为“CAR#8”。 在某些实施方案中,CAR 包含 SEQ ID NO:50 中列出的氨基酸序列,如下所示。 【0238】 MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRCEIVLTQSPGTSLSPGERATLSCRASQSVRSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQLFDSPYT FGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKPVEGLLRGFDYWGQGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSP LFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRK HYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDAL HMQALPPR [序列号:50] 【0239】 编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:51中并在下文呈现。 【0240】 atggatatgagagtaccagctcagctgctgggcctgctgcttttgtggttgccggacacacgctgtgagattgtgctgacacagtctccaggcacactctcccttagcccgggcgagagggccactctgagctgtcgggctagtcagtcagtaaggagctcttatctggcctggtatcagcagaaaccagggcaggctccaaggctgcttatctacggtgcaagttcccgggcaacaggcatcccagatcgctttagcggtagcgggagtgggaccgatttcactctgaccatctcccgccttgagcccgaggatttcgctgtctattattgccagcaactgtttgactcaccctatacgttcggtggagggaccaaagtggagatcaagggaggcggaggaagtggaggaggagggagcggtggaggagggtcacaggtgcagctggtagaatctggcggaggggtcgttcaaccagggaggtcattgcggttgagctgcgcagcgagtggttttaccttcagcagttatggaatgcattgggtgagacaagcaccaggaaaaggtctggagtgggtggctttgatttggtacgacggcagtaataaatactacgccgattctgttaagggcagatttactatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactctctgagagccgaagatacagcagtgtactattgtgctaagcccgtagaagggctcctgaggggattcgattattggggccagggtacgcttgtgacagtgtctagtcgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccaggggctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc[配列番号51] 【0241】 在某些实施方案中,CAR包含(a)(i)由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成的CDR1、由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成的CDR2,以及来自氨基酸SEQ ID NO:9 中列出的序列。V 包含 CDR3 _H (ii)由序列号11所示的氨基酸序列组成的CDR1、由序列号20所示的氨基酸序列组成的CDR2、以及序列号20所示的氨基酸序列组成的CDR3 :21。 _L (b) 包含 CD28 多肽的铰链结构域(例如,人 CD28 的铰链结构域或其部分,例如,由 SEQ ID NO: 24 的氨基酸 114 至 153 的氨基酸序列组成的 CD28 多肽)(c )包含CD28多肽的跨膜结构域(例如,人CD28的跨膜结构域或其部分,例如,由SEQ ID NO:24的氨基酸114-179的氨基酸序列组成的CD28多肽),和(c ) (i) CD3ζ多肽(例如,修饰的人CD3ζ多肽,例如,由SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列组成)和(ii)包含CD28多肽(例如, ,人CD28的细胞内结构域或其部分,例如由SEQ ID NO:24的氨基酸180-220的氨基酸序列组成的CD28多肽。 在某些实施例中,V _H 和V _L 经由由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的接头连接。 在某些实施例中,V _H 和V _L 是 N 端到 C 端,V _L -V _H 它的定位是 在某些实施例中,CAR 被设计为“CAR#15”。 在某些实施方案中,CAR 包含 SEQ ID NO:51 中列出的氨基酸序列,如下所示。 【0242】 MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP GKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPVE GLLRGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS QSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQAGIPPYTFGGGTKVEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFP GPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQ PYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQ ALPPR [序列号:52] 【0243】 编码SEQ ID NO:52的氨基酸序列的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:53中并在下文呈现。 【0244】 atggaattcggcttgtcatgggtgttcctcgtcgcgctgctgcgcggcgttcagtgccaggtgcagctggtagaatctggcggaggggtcgttcaaccagggaggtcattgcggttgagctgcgcagcgagtggttttaccttcagcagttatggaatgcattgggtgagacaagcaccaggaaaaggtctggagtgggtggctttgatttggtacgacggcagtaataaatactacgccgattctgttaagggcagatttactatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactctctgagagccgaagatacagcagtgtactattgtgctaagcccgtagaagggctcctgaggggattcgattattggggccagggtacgcttgtgacagtgtctagtggaggcggaggaagtggaggaggagggagcggtggaggagggtcagaaatcgtgctcacccagtccccgggaacactgagtctctctccaggggaaagagcaacattgtcctgcagagcatcccagagcgtgagctccagctacctcgcctggtatcagcagaaaccaggccaggcaccccgcctgcttatctacggtgcatccaggagagccactgggatccccgatcgattctctggatcagggtctggcactgactttacattgacgatctcacggctggaacccgaggatttcgccgtgtattactgccaacaggccggaattccaccgtataccttcggaggaggtactaaagtagagattaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccaggggctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc[配列番号53] 5.4. 细胞 【0245】 所公开的主题提供包含本公开的靶向CD19的CAR的细胞(例如,第5.3节中所公开的那些)。 在某些实施方案中,细胞选自由淋巴谱系细胞和骨髓谱系细胞组成的组。 在某些实施方案中,细胞是免疫活性细胞。 在某些实施方案中,免疫应答细胞是淋巴谱系的细胞。 【0246】 在某些实施方案中,细胞属于淋巴谱系。 淋巴谱系的细胞可导致抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中异物的检测、宿主外来细胞的检测等。 淋巴谱系细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、树突细胞和可分化成淋巴细胞的干细胞。 在某些实施方案中,干细胞是多能干细胞(例如,胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。 【0247】 在某些实施方案中,细胞是T细胞。 T 细胞是在胸腺中成熟的淋巴细胞,主要负责细胞介导的免疫。 T 细胞参与适应性免疫系统。 本公开主题的 T 细胞包括但不限于辅助性 T 细胞、细胞毒性 T 细胞、记忆 T 细胞(中枢记忆 T 细胞、干细胞样记忆 T 细胞(或干细胞样记忆 T 细胞))、和 2 三种效应记忆 T 细胞:例如,包括 TEM 细胞和 TEMR 细胞)、调节性 T 细胞(也称为抑制性 T 细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)、自然杀伤性 T 细胞、粘膜相关不变性 T 细胞细胞和任何类型的 T 细胞,包括 γδ T 细胞。 细胞毒性 T 细胞(CTL 或杀伤性 T 细胞)是 T 淋巴细胞的一个子集,能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡。 通过引入 CAR,可以对患者自身的 T 细胞进行基因改造以靶向特定抗原。 在某些实施方案中,免疫应答细胞是T细胞。 T细胞是CD4 ⁺ T 细胞或 CD8 ⁺ 它可以是T细胞。 在某些实施方案中,T 细胞是 CD4 ⁺ 是T细胞。 在某些实施方案中,T 细胞是 CD8 ⁺ 是T细胞。 在某些实施方案中,该细胞是T细胞并且已经在T细胞基因组内的遗传基因座处整合了本公开的靶向CD19的CAR。 基因座的非限制性实例包括TRAC基因座、TRBC基因座、TRDC基因座和TRGC基因座。 在某些实施方案中,基因座是TRAC基因座或TRBC基因座。 WO2017180989 和 Eyquem 等人,Nature.(2017 年 3 月 2 日);543 (7643):113-117 中公开了将 CAR 靶向 T 细胞基因组内位点的方法,这两篇文章均通过引用整体并入。荷兰国际集团 【0248】 在某些实施方案中,细胞是 NK 细胞。 自然杀伤 (NK) 细胞是细胞介导免疫的一部​​分,可以是在先天免疫反应期间起作用的淋巴细胞。 NK 细胞无需预激活即可对其靶细胞产生细胞毒作用。 在某些实施方案中,细胞是基因修饰的 NK 细胞。 在某些实施方案中,细胞是编辑过的 NK 细胞。 在某些实施方案中,细胞是干细胞衍生的 NK 细胞。 在某些实施方案中,细胞是源自多能干细胞的NK细胞。 在某些实施方案中,细胞是诱导多能干细胞(iPSC)衍生的 NK 细胞。 【0249】 细胞(例如,T细胞或NK细胞)可以是自体的、非自体的(例如,同种异体的)并且在体外来源于工程化的祖细胞或干细胞。 【0250】 本公开的主题的细胞可以是骨髓谱系的细胞。 骨髓系细胞的非限制性实例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、肥大细胞、红细胞、血小板和骨髓。包括可以分化成细胞的干细胞。 在某些实施方案中,干细胞是多能干细胞(例如,胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。 【0251】 在某些实施方案中,用本公开的靶向CD19的CAR转导细胞,从而允许细胞表达靶向CD19的CAR。 5.5. 核酸分子和载体 【0252】 当前公开的主题提供了编码本公开的靶向CD19的CAR的核酸分子(例如,第5.3节中公开的那些)。 还提供了含有此类核酸分子的细胞。 【0253】 在某些实施方案中,核酸分子还包含可操作地连接至本公开的靶向CD19的CAR的启动子。 【0254】 在某些实施方案中,启动子是内源的或外源的。 在某些实施方案中,外源启动子是延伸因子(EF)-1启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)启动子、猿猴病毒40早期启动子(SV40)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、金属硫蛋白启动子和泛素C 发起人。 在某些实施方案中,内源性启动子选自TCRα启动子、TCRβ启动子和β2-微球蛋白启动子。 在某些实施方案中,启动子是诱导型启动子。 在某些实施方案中,诱导型启动子选自由 NFAT 转录反应元件 (TRE) 启动子、CD69 启动子、CD25 启动子、IL-2 启动子、4-1BB 启动子、PD1 启动子和 LAG3 启动子组成的组。 【0255】 所公开的主题还提供了包含本公开的核酸分子的载体。 【0256】 可以通过本领域已知的方法或如本文所述的方法将核酸分子递送至细胞。 细胞的遗传修饰可以通过用重组DNA构建体转导基本上同质的细胞组合物来实现。 在某些实施方案中,逆转录病毒载体(例如,γ逆转录病毒或慢病毒载体)用于将DNA构建体引入细胞。 例如,可以将编码CAR的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中以从其内源启动子、从逆转录病毒长末端重复序列或从对感兴趣的靶细胞类型特异的启动子驱动表达。 也可以使用非病毒载体。 【0257】 对于细胞的初始遗传修饰以包含本公开的靶向CD19的CAR,可以使用逆转录病毒载体进行转导,尽管可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。 CAR 可以构建为单个多顺反子表达盒、单个载体中的多个表达盒或多个载体。 产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒序列内核糖体进入位点(IRES,例如,FGF-1 IRES、FGF-2 IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES , NF-κB IRES, RUNX1 IRES, p53 IRES, 甲型肝炎 IRES, 丙型肝炎 IRES, 瘟病毒 IRES, aphtovirus IRES, 小核糖核酸病毒 IRES, 脊髓灰质炎病毒 IRES 和脑心肌炎病毒 IRES) 和可裂解接头 (例如, 2A 肽, 如 P2A, T2A, E2A 和 F2A 肽)。 如果衣壳蛋白在人类细胞感染方面具有功能,则逆转录病毒载体和适当包装系统的组合也是合适的。 PA12(Miller 等人,(1985)Mol Cell Biol(1985);5:431-437);PA317(Miller.,等人,Mol Cell Biol(1986);6:2895-2902);和 CRIP( Danos 等人,Proc Natl Acad Sci USA (1988);85:6460-6464)。 例如,针对 VSVG、RD114 或 GALV 包络假型化的粒子以及本领域已知的任何其他明确粒子也是合适的。 【0258】 可能的转导方法包括细胞与生产细胞的直接共培养(Bregni 等人,Blood (1992);80:1418-1422),或单独使用病毒上清液或与浓缩的载体原液一起培养,有或没有适当的生长因子和聚阳离子(Xu 等人,Exp Hemat(1994);22:223-230;和 Hughes 等人,J Clin Invest(1992);89:1817)也包括在内。 【0259】 其他转导病毒载体也可用于细胞修饰。 在某些实施方案中,所选择的载体是表现出高效感染和稳定整合和表达的载体(例如,Cayouette 等人,Human Gene Therapy 8:423-430, 1997 ;Kido 等人,Bloomer 等人,Journal of病毒学 71:6641-6649,1997;Naldini 等人,科学 272:263-267,1996;和 Miyoshi 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319,1997)。 可以使用的其他病毒载体包括,例如,腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体,疱疹病毒如痘苗病毒、牛乳头瘤病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(例如,Miller, Human Gene Thera ( 1990);15-14;Friedman,Science 244:1275-1281,1989;Eglitis 等,BioTechniques (1988);6:608-614;1:55-61;Sharp,The Lancet (1991); 337:1277-78;Cornetta 等,核酸研究和分子生物学 36:311-22,1987;Anderson,Science (1984);401-409;Moen,Blood Cells 17:407-16,1991;Miller 等al.,Biotechnol (1989);7:980-90;LeGal La Salle 等人,Science (1993);259:988-90;和 Johnson,Chest (1995) 107:77S-83S vectors)。 逆转录病毒载体在临床环境中得到了特别好的开发和使用(Rosenberg 等人,N Engl J Med (1990);323:370,1990;Anderson 等人,美国专利号 5,399,346)。 【0260】 非病毒技术也可用于细胞的遗传修饰。 例如,通过在存在脂质转染的情况下向细胞施用核酸分子(Feigner 等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A. (1987);84:7413 ;Ono 等人,Neurosci Lett (1990);17:259 ;Brigham等人,Am J Med Sci (1989);298:278;Staubinger 等人,Methods in Enzymol (1983);101:512,Wu 等人,J Biol Chem (1988);14621;Wu 等人。 , J Biol Chem (1989);264: 16985) 或在手术条件下通过显微注射(Wolff 等人,Science (1990);247: 1465)。 用于基因转移的其他非病毒方法包括使用磷酸钙、DEAE 葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。 脂质体也可能有利于将 DNA 递送至细胞。 或者,可以将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如,自体或异源原代细胞或它们的后代)中,然后将细胞(或后代)注射到目标组织中或全身注射。受试者的患病组织可以通过注射进入。 转座酶或靶向核酸酶(例如,锌指核酸酶、大范围核酸酶或 TALEN、CRISPR)也可用于引发或获得重组受体。 瞬时表达可以通过 RNA 电穿孔获得。 【0261】 任何靶向基因组编辑方法也可用于将本公开的靶向CD19的CAR递送至细胞。 在某些实施方案中,CRISPR系统用于递送本公开的靶向CD19的CAR。 在某些实施方案中,锌指核酸酶用于递送本公开的靶向CD19的CAR。 在某些实施方案中,TALEN系统用于递送本公开的靶向CD19的CAR。 【0262】 成簇规则间隔短批重复 (CRISPR) 系统是一种在原核细胞中发现的基因组编辑工具。 当用于基因组编辑时,该系统包括 Cas9(一种可以使用 crRNA 作为指导来修饰 DNA 的蛋白质)、CRISPR RNA(crRNA。Cas9 被 Cas9 使用以与 Cas9 形成活性复合物)。tracrRNA(通常以发夹环),反式激活 crRNA(tracrRNA,与 crRNA 结合并与 Cas9 结合形成复合物),以及可选的 DNA 修复模板的一部分(指导细胞修复过程的 DNA,允许插入特定的 DNA 序列)。 CRISPR/Cas9 通常使用质粒转染到靶细胞中。 crRNA 是 Cas9 用来识别和直接结合细胞内目标 DNA 的序列,因此需要针对每个应用进行设计。 还必须为每个应用设计携带 CAR 表达盒的修复模板,因为它必须与切割两侧的序列重叠并编码插入序列。 多个 crRNA 和 tracrRNA 可以包装在一起形成单个向导 RNA (sgRNA)。 这种 sgRNA 可以与 Cas9 基因结合成质粒,用于转染到细胞中。 【0263】 锌指核酸酶 (ZFN) 是一种人工限制酶,通过结合锌指 DNA 结合域和 DNA 切割域生成。 锌指结构域可以设计为靶向特定的 DNA 序列,从而允许锌指核酸酶靶向基因组内的所需序列。 单个 ZFN 的 DNA 结合域通常包含多个单独的锌指重复序列,每个重复序列能够识别多个碱基对。 生成新锌指结构域的最常用方法是组合已知特异性的小锌指“模块”。 ZFN 最常见的切割域是来自 II 型限制性核酸内切酶 FokI 的非特异性切割域。 通过使用内源同源重组 (HR) 机制和带有 CAR 表达盒的同源 DNA 模板,ZFN 可用于将 CAR 表达盒插入基因组。 当目标序列被 ZFN 切割时,HR 机器搜索与受损染色体同源的 DNA 模板的同源性,然后在染色体的两个切割末端之间复制模板的序列,同源 DNA 模板是从而整合到基因组中。 【0264】 转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 是一种限制性内切酶,可以进行工程改造以切割特定的 DNA 序列。 TALEN 系统的运行原理与 ZFN 大致相同。 这些是通过将类似转录激活因子的效应子 DNA 结合域与 DNA 切割域相结合而产生的。 转录激活因子样效应子 (TALE) 由 33-34 个氨基酸的重复基序和两个对特定核苷酸具有很强识别能力的可变区段组成。 通过组装这些 TALE 的阵列,TALE DNA 结合结构域被设计为与所需的 DNA 序列结合,从而引导核酸酶在基因组内的特定位置进行切割。 用于多核苷酸治疗的 cDNA 表达可以由任何合适的启动子(例如,人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒 40 (SV40)、金属硫蛋白启动子或泛素 C 启动子)和任何合适的哺乳动物调节元件或内含子(例如延伸因子 1a 增强子/启动子/内含子结构)。 例如,如果需要,已知在特定细胞类型中优先指导基因表达的增强子可用于指导核酸表达。 使用的增强剂可以包括但不限于那些表征为组织特异性或细胞特异性增强剂的增强剂。 或者,当基因组克隆用作治疗构建体时,调节可由同源调节序列介导,或如果需要,可由衍生自异源来源的调节序列介导,包括上述任何启动子或调节元件。 【0265】 递送基因组编辑剂/系统的方法可根据需要而变化。 在某些实施方案中,所选基因组编辑方法的组分作为一种或多种质粒中的 DNA 构建体递送。 在某些实施例中,组分由病毒载体递送。 常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺感染、静水压力、连续输注、超声处理、磁转染、腺相关病毒、病毒载体、包膜蛋白假型、复制型载体顺式和反式提到了作用元件、单纯疱疹病毒和化学载体(例如,寡核苷酸、脂复合物、聚合物囊泡、复合物、树枝状聚合物、无机纳米颗粒和细胞渗透肽)。 5.6. 制剂和给药 【0266】 所公开的主题还提供包含本公开的细胞的组合物,所述细胞包括本公开的靶向CD19的CAR。 在某些实施方案中,该组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。 【0267】 包含本公开内容的细胞的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供,例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物,在选定的pH下,可以被缓冲。 液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。 此外,液体组合物在某种程度上更便于给药,尤其是通过注射。 另一方面,可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长接触时间。 液体或粘性组合物可以包括载体,例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇,及其合适的混合物。它可以是包含溶剂或分散介质。 【0268】 可以全身或直接向受试者提供包含本公开的细胞的组合物以诱导和/或增强对抗原的免疫反应和/或治疗和/或预防肿瘤。 在某些实施方案中,将本公开的细胞或包含其的组合物直接注射到感兴趣的器官(例如,受瘤形成影响的器官)中。 或者,本公开的细胞或包含它们的组合物被间接提供给感兴趣的器官,例如,通过施用至循环系统(例如,肿瘤脉管系统)。 可以在施用细胞或组合物之前、期间或之后提供扩增和分化诱导剂以增加体外或体内细胞的产生。 【0269】 施用的细胞数量可根据接受治疗的受试者而变化。 在一个特定的实施例中,约 10 ⁴ 约 10 个 ¹⁰ 大约 10 之间 ⁴ 约 10 个 ⁷ 大约 10 之间 ⁵ 约 10 个 ⁷ 大约 10 之间 ⁵ 约 10 个 ⁹ 介于或大约 10 ⁶ 约 10 个 ⁸ 将本公开的细胞施用于受试者一段时间。 在一个特定的实施例中,大约 1 x 10 ⁶ 约 5 x 10 件 ⁸ 将本公开的细胞施用于受试者一段时间。 可以以更少的数量施用更有效的细胞。 通常至少约 1 x 10 ⁵ 施用了 10 个细胞,最后施用了约 1 x 10 个细胞。 ¹⁰ 达到1个或更多。 在某些实施例中,至少约 1 x 10 ⁵ 个,5×10 ⁵ 个,1×10 ⁶ 件,约 5 x 10 ⁶ 件,约 1 x 10 ⁷ 件,约 2.5 x 10 ⁷ 件,约 5 x 10 ⁷ 件,约 1 x 10 ⁸ 个,约 1.5 x 10 ⁸ 件,约 2 x 10 ⁸ 件,或约 5 x 10 ⁸ 将本公开的单个细胞施用于受试者。 在一个特定的实施例中,大约 1 x 10 ⁶ 将本公开的单个细胞施用于受试者。 什么构成有效剂量的精确确定可能取决于每个受试者的特定因素,包括受试者的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。 根据本公开内容和本领域的知识,本领域技术人员可以容易地确定剂量。 【0270】 本公开的细胞和组合物可以施用至但不限于静脉内、皮下、结内、瘤内、鞘内、胸膜内、骨内、腹膜内、胸膜内。可以通过本领域已知的任何方法施用至受试者,包括行政和直接行政。 本公开的细胞可以在任何生理学上可接受的载体中施用,通常是血管内的,但可以施用到骨骼或其他方便的部位,细胞可以在这些部位找到合适的再生和分化部位。它也可以被引入一个好的部位(例如胸腺)。 5.7. 处理方法 【0271】 当前公开的主题提供了使用所公开的细胞或包含其的组合物的各种方法。 本公开的细胞和包含它们的组合物可用于治疗或药物。 例如,目前公开的主题提供了在有此需要的受试者中诱导和/或增加免疫反应的方法。 本公开的细胞和包含它们的组合物可用于减少受试者的肿瘤负荷。 所公开的细胞和包含它们的组合物可以减少受试者的肿瘤细胞数量、减小肿瘤大小和/或根除肿瘤。 本公开的细胞和包含它们的组合物可用于治疗和/或预防受试者的肿瘤。 本公开的细胞和包含它们的组合物可用于延长患有瘤形成的受试者的存活期。 在某些实施方案中,上述每种方法都使用本公开的细胞或包含其的组合物(例如,药物组合物)来实现期望的效果,例如,减轻现有病症或预防复发。)。 对于治疗,给药量是有效产生所需效果的量。 有效量可以在一个剂量或一系列剂量中提供。 有效量可以通过推注或连续灌注提供。 【0272】 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物与CD19相关。 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物表达CD19。 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物过表达CD19。 在某些实施方案中,可用本公开的细胞和组合物治疗的肿瘤和/或赘生物是血液癌症。 血液癌症的非限制性实例包括多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。 白血病的非限制性实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性早幼粒细胞白血病。包括白血病伴白血病(APL)、急性混合性白血病表型 (MLL)、毛细胞白血病和 B 细胞幼淋巴细胞白血病。 淋巴瘤可以是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。 在某些实施方案中,淋巴瘤是B细胞淋巴瘤(BCL)。 【0273】 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物是B细胞恶性肿瘤。 B细胞恶性肿瘤的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤(BCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、具有转化的里氏发育不良CLL、和中枢神经系统淋巴瘤。 B细胞淋巴瘤包括B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B细胞霍奇金淋巴瘤。 在某些实施方案中,肿瘤和/或赘生物是B细胞淋巴瘤。 在某些实施方案中,B细胞淋巴瘤是复发性或难治性(R/R) B细胞淋巴瘤。 【0274】 在某些实施例中,受试者是人类受试者。 受试者可能患有疾病的晚期形式,在这种情况下,治疗目标可能包括减轻或逆转疾病进展和/或改善副作用。 受试者可能有已经接受过治疗的病症史,在这种情况下,治疗目标通常包括降低复发风险或延迟复发。 【0275】 作为本公开的靶向CD19的CAR的表面表达的结果,过继转移的细胞在肿瘤部位被赋予增强的和选择性的细胞溶解活性。 此外,随着它们在肿瘤中的定位和增殖,它们将肿瘤部位转变为对参与生理性抗肿瘤反应的各种细胞高度敏感的环境。 【0276】 为了预防或最小化免疫并发症(称为“恶性 T 细胞转化”)的风险,例如可以在表达时将进一步的修饰引入本公开的细胞中,从而导致与 GvHD 相似的结果。 该问题的一个潜在解决方案是用自杀基因改造本公开的细胞。 合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶 (hsv-tk)、诱导型半胱天冬酶 9 自杀基因 (iCasp-9) 和截短的人表皮生长因子受体 (EGFRt) 多肽。 在某些实施方案中,自杀基因是EGFRt多肽。 EGFRt多肽可以通过施用抗EGFR单克隆抗体(例如,西妥昔单抗)来消除T细胞。 EGFRt 可以共价结合到靶向 CD19 的 CAR 的上游。 自杀基因可以包含在包含编码本公开的靶向CD19的CAR的核酸的载体中。 因此,设计用于激活自杀基因的前药(例如,前药(例如,可以激活 iCasp-9 的 AP1903)在恶性 T 细胞转化(例如,GVHD)期间给药。将自杀基因掺入靶向 CAR 的 CD19本公开在表达 CD19 靶向 CAR 的细胞中诱导细胞凋亡,其中自杀基因被激活。在短时间内消除的能力提供了额外的安全水平。已掺入自杀基因的本公开的细胞也可以是细胞注射后在给定时间点抢先清除,降低毒性,也可在出现症状时立即清除。 【例子】 【0277】 7.例子 参考以下实施例可以更好地理解本公开的主题,这些实施例是作为说明性的而不是对本公开的主题的限制。 (例一) 抗CD19抗体的鉴定和表征 【0278】 在这个例子中,本文公开的 scFv 的 V _H 和V _L 我们展示了抗 CD19 抗体的特征,包括: 人抗 CD19 抗体来源于 Adimab 酵母并在其中产生。 使用 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (Thermo Scientific, Cat#21425) 对抗原进行生物素化。 在添加 1:7.5 摩尔比的生物素化试剂之前,将抗原浓缩至大约 1 mg/mL 并用 PBS 交换缓冲液。 将混合物在 4°C 下放置过夜后,进行进一步的缓冲液更换以去除溶液中的游离生物素。 生物素化通过标记蛋白与 ForteBio 上的链霉亲和素传感器的结合得到证实。 【0279】 每个大约10个 ⁹ 如前所述扩展了八个具有多样性的天然人类合成酵母文库(例如 Y. Xu 等人,PEDS 26 (10), 663-70 (2013);WO2009036379;WO2010105256;和 WO2012009568)。 【0280】 对于前两轮选择,如前所述进行利用 Miltenyi MACS 系统的磁珠分选技术(例如 Siegel 等人,J Immunol Methods 286 (1-2), 141-153 (2004))。 简而言之,酵母细胞(约 10 个细胞 ¹⁰ 细胞/文库)在洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.1% 牛血清白蛋白(BSA))中与生物素化抗原在 30°C 下孵育 30 分钟。 用 40 mL 冰冷洗涤缓冲液洗涤一次后,将细胞沉淀重悬于 20 mL 洗涤缓冲液中,并将链霉亲和素微珠 (500 μl) 添加到酵母中并在 4°C 下孵育 15 分钟。 然后将酵母沉淀,重悬于 5 mL 洗涤缓冲液中并加载到 Miltenyi LS 柱上。 上样 5 mL 后,用 3 mL 洗涤缓冲液洗涤柱子 3 次。 然后将柱子从磁场中移除,并使用 5 mL 生长培养基洗脱酵母,然后培养过夜。 【0281】 使用流式细胞术 (FACS) 进行第三轮选择。 大约 2 x 10 ⁷ 沉淀酵母,用洗涤缓冲液洗涤三次,并在平衡条件下与 100-200 nM 生物素化抗原在 30°C 下孵育。 第四轮和第五轮选择通过将生物素化的 NALM-6 和 Raji 细胞与来自第 3 轮 FACS 的选定酵母输出一起孵育来进行。 孵育后,将预洗的 M-280 链霉亲和素 Dynabeads (Cat#60210) 添加到酵母/哺乳动物细胞复合物中并孵育。 然后使用 DynaMag-2 磁体分离复合物并去除未结合的上清液。 用 1 mL 选定的缓冲液将珠子/细胞复合物洗涤 3 次。 然后将捕获的复合物转移到含有酵母生长培养基的烧瓶中进行扩增。 在第六轮选择中,富集的酵母又进行了一轮 NALM-6/Raji 细胞选择,使用 100 nM 重组 CD19 抗原进行选择,或使用多特异性试剂 (PSR) 进行阴性选择,以去除非特异性抗体. 【0282】 对于 PSR 消耗,如前所述(例如 Y. Xu 等人,PEDS 26 (10), 663-70 (2013)),将文库与 1:10 稀释的生物素化 PSR 试剂一起孵育。 然后用洗涤缓冲液洗涤酵母两次并稀释 1:100 山羊 F(ab') ₂ 抗人 Kappa-FITC (LC-FITC)(Southern Biotech,Cat#2062-02)和 Streptavidin-AF633 (SA-633) 稀释 1:500(Life Technologies,Cat#S21375)或 Extravidin 稀释 1:50 -藻红蛋白(EA-PE)(Sigma-Aldrich,目录号 E4011),二级试剂,在 4°C 下染色 15 分钟。 用冰冷的洗涤缓冲液洗涤两次后,将细胞沉淀重悬于 0.3 mL 洗涤缓冲液中,并转移至带滤网盖的分选管中。 使用 FACS ARIA 分选仪(BD Biosciences)进行分选以确定分选门并选择具有所需特征的抗体。 重复选择轮次,直到获得具有所有所需特征的群体。 在最后一轮选择之后,将酵母铺板并挑选单个菌落进行表征。 轻链多样化 【0283】 来自原始输出的重链用于准备轻链多样化文库以用于额外轮次的选择。 从酵母中提取重链质粒,在大肠杆菌中繁殖,随后从大肠杆菌和 5 x 10 ⁶ 被转化为具有多样性的轻链库。 如上所述,对这些文库进行第四轮 MACS、两轮使用 Raji 或 NALM-6 细胞的细胞选择,然后使用重组 CD19 抗原进行 FACS 选择。进行了一轮选择。 特定于轻链多样化,Raji 和 NALM-6 细胞选择使用经过 CD19 基因靶向基因敲除的工程化 Raji 和 NALM-6 细胞进行初始阴性选择。 在 CD19 敲除细胞耗尽后,使用表达和过表达内源性 CD19 的工程化 Raji 和 NALM-6 细胞进行阳性选择。 在不同的 FACS 选择轮次中,通过抗原滴定评估文库的(多特异性试剂)PSR 结合、物种交叉反应性和亲和力压力。 进行筛选以获得具有所需特征的群体。 从上述每一轮 FACS 选择中挑选出单个菌落用于测序和表征。 抗体生产和纯化 【0284】 酵母克隆生长至饱和,然后在 30°C 下振荡诱导 48 小时。 诱导后,沉淀酵母细胞并收集上清液用于纯化。 使用蛋白 A 柱纯化 IgG,并用 pH 2.0 的乙酸洗脱。 复地生物K _D 测量 【0285】 使用 ForteBio Octet 系统(Octet RED384,通常如前所述(例如 Estep 等人,Mabs 5 (2), 270-278 (2013))测试这些抗 CD19 抗体与可溶性 CD19 的结合亲和力。简言之,ForteBio 亲和力通过在线将 IgG 加载到 AHC 传感器上进行测量,将抗体固定在抗人 IgG 引脚上,以及可溶性 CD19-HSA 融合蛋白((CD19 细胞外结构域与人血清白蛋白融合)。传感器在测定缓冲液中离线平衡 30分钟,然后在线监测 60 秒以建立基线。IgG 加载。将融合传感器暴露于 100 nM 可溶性 CD19-HSA 融合蛋白抗原 3 分钟,然后转移到测定缓冲液中 3 分钟以测量解离速率。所有动力学都是在 1:1 结合模型中进行。表 1 中列出了结合动力学的总结。示例性抗体的亲和力范围为 8 nM 至 20 nM。表 1 中显示的所有抗 CD19 抗体都具有包含氨基的序列 V根据编号 10 的酸序列 _H 包括。 【表格1】 【0286】 (例二) 生成 CD19 靶向 CAR 和 CAR 表达 【0287】 生成了三个靶向 CD19 的 CAR,“CAR#2”、“CAR#8”和“CAR#15”。 使用 PE 缀合的抗人 LNGFR 抗体,然后进行流式细胞术分析,研究了 CAR 分子在细胞表面的表达。 LNGFR 通过自切割接头 2A 序列共表达 CAR,因此 LNGFR 的表达被用作 CAR 表达的指标。 表 2 显示了结果。 [表2] 阳性对照是含有小鼠 scFv SJ25c1 和 CD3ζ1XX 的 CD19 靶向 CAR,命名为“1928z1XX CAR”。 (例 3) CD19靶向CAR的体外活性 【0288】 研究了这些靶向 CD19 的 CAR 对表达 CD19 的 Raji 癌细胞系和 CD19 敲除 Raji 细胞的细胞毒性。 将每个靶细胞系接种在 384 孔板中,并以效应细胞与靶细胞 (E:T) 的比例为 4 添加 CD19 CAR-T 或未转导的 T 细胞 (UTD)。 仅包含靶细胞的孔和仅包含效应细胞的孔作为对照。 24 小时后,使用 CellTiter-Glo® One Solution Assay(Promega,G8462)测量细胞活力。 通过从共培养孔的发光信号中减去仅含效应细胞的孔的信号,然后除以仅含靶细胞的孔的信号来计算靶细胞的存活率百分比。 通过从 100% 中减去靶细胞的生存力百分比来计算杀伤百分比。 如图 1A 和 1B 所示,携带 CAR#2-、CAR#8- 和 CAR#15 的 T 细胞均显示 Raji 表达,与 CD19 敲除 Raji 细胞形成对比。细胞杀伤活性被证明是针对细胞的,表明含有这些 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞的杀伤活性是抗原依赖性的。 【0289】 为了确认抗原依赖性细胞毒性,将含有这些 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞与表达 CD19 的 Raji 癌细胞系或 CD19 敲除 Raji 细胞共培养。 每个靶细胞系都用细胞微量紫色染料标记,然后接种在 96 孔板中,并以效应细胞与靶细胞 (E:T) 之比为 2 的比例添加 CD19 CAR-T 或未转导的 T 细胞 (UTD)。 仅包含靶细胞的孔和仅包含效应细胞的孔作为对照。 20 小时后,使用活/死染料染色,然后进行流式细胞术分析,测量细胞活力。 通过从流式细胞术测量的活细胞中减去仅效应细胞孔的信号,然后除以仅靶细胞孔的信号,计算靶细胞的存活率百分比。 通过从 100% 中减去靶细胞的生存力百分比来计算杀伤百分比。 如图 2A 和 2B 所示,携带 CAR#2 的 T 细胞、携带 CAR#8 的 T 细胞和携带 CAR#15 的 T 细胞都显示出针对细胞的 Raji 细胞杀伤活性,证实了杀伤活性含有这些 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞是抗原依赖性的。 【0290】 Raji 癌表达抗原非依赖性细胞因子(IL-2 和 IFN-γ)分泌含 CAR#2 的 T 细胞、含 CAR#8 的 T 细胞和含 CAR#15 的 T 细胞,以及表达 CD19 的 T 细胞在与细胞系和 CD19 敲除 Raji 细胞的共培养中进行了评估。 将每个靶细胞系接种在 384 孔板中,并以效应细胞与靶细胞 (E:T) 的比例为 4 添加 CD19 CAR-T 或未转导的 T 细胞 (UTD)。 仅包含靶细胞的孔和仅包含效应细胞的孔作为对照。 二十四小时后,使用 Intellicyt QBeads Human PlexScreen 试剂盒(Sartorius,90702)检测分泌到上清液和上清液中的 IFN-γ 和 IL2。 IL-2分泌结果如图3A和3B所示,IFN-γ分泌结果如图4A和4B所示。 含有这些 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞在与 Raji 细胞共培养时表现出 IL-2 和 IFN-γ 分泌,这与 CD19 敲除 Raji 细胞形成对比,表明这些 CD19 靶向抗原依赖性细胞因子释放含有 CAR 的 T显示细胞。 (例 4) CD19靶向CAR的体内活性 【0291】 然后研究了含有这些 CD19 靶向 CAR 的 T 细胞的体内活性。 【0292】 NOD-scid IL2Rg ^null (NSG) 向小鼠提供以野生型 CD19 水平(B-ALL 细胞系)(CD19-WT)或降低的 CD19 水平(B-ALL 细胞系)(CD19-Low,生成的 Nalm6 克隆)表达萤火虫荧光素酶的 NALM6 细胞通过 CRISPR-Cas9 编辑 CD19 基因,然后使用慢病毒载体重新表达 CD19)0.5 × 10 ⁶ 静脉注射 (IV)。 4 天后,CD19-WT(蓝色、红色)和 CD19 ^- 携带低(绿色)NALM6 的小鼠是新鲜的 ⁴ 件(红色)或 2 x 10 ⁵个体(蓝色、绿色)接受单次静脉内注射 #17、#8、#15 或 #2 CAR T 细胞治疗。 为了严格评估 CAR T 细胞的功效,对 CAR T 细胞治疗的小鼠进行了 60-100 天的重复成像,以评估肿瘤反应和复发可能性。 在 T 细胞注射后长达 30 天,通过生物发光成像分析肿瘤负荷,在图 5 所示的时间点对每只小鼠进行了证明。 #2 CAR T 细胞表现出快速有效的抗肿瘤活性,导致在所有测试的 T 细胞剂量下完全根除 NALM6 WT 和 NALM6 CD19-Low 细胞的肿瘤。 #17 显示肿瘤控制不佳,导致肿瘤快速进展,并用作对照。 (例 5) #2 scFv 结合表位 【0293】 通过连续稀释和流式细胞术确定抗 CD19 抗体与表达 CD19 的 NALM6 细胞系的结合。 通过 Biacore SPR 评估竞争性结合 CD19 的 CD19-T2 结合物(结合物)、SJ25c1(来自 19-28z CAR)和 FMC63(来自 Kymriah 的“Tisagenlecleucel”和 Yescarta 的“Axicabtagene ciloleucel”)scFvs。 将 100 nM CD19-HSA-His(武田,剑桥)和浓度递增的可溶性 CD19-T2 SJ25c1 或 FMC63 scFv(0、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM 和 800 nM)的混合物添加到固定化 CD19-T2 scFv 在 Biacore CMS 芯片上运行 3 分钟。 通过流动 HBS-EP 缓冲液 (300 mM NaCl) 5 分钟来评估芯片上结合复合物的解离。 CD19-HSA-His 是从用 pcDNA3.4 质粒 (ThermoFisher) 瞬时转染的 HEK293 中分离出来的,该质粒含有与 10-十组氨酸标签融合的 CD19 胞外结构域、TEV 切割位点、GS 接头和表达 HSA 的基因。精制。 使用镍亲和层析纯化重组 CD19-HSA-His10。 CD19-HSA-His10的氨基酸序列如图1所示。 【0294】 SJ25c、FMC63 和#2 scFv 的表位结合数据如图 1 所示。 如图 7 所示,#2 scFv 与 FMC63 和 SJ25C1 竞争结合 CD19。 这些发现证实#2 scFv、FMC63 和 SJ25C1 scFv 结合 CD19 上的重叠表位。 不与 CD19 结合的无关抗体(抗 CTLA4 VHH)无法与 #2 scFv 竞争与 CD19 的结合。 (例 6) 药理试验 包起来 【0295】 为支持首次人体临床试验,进行了一系列研究以证明 #2 CAR T 细胞(在本例中表示为“19(T2)28z1XX CAR”)、1928z CAR T 细胞(先前证明改善与在临床试验中广泛使用的剂量相比,在较低的 T 细胞剂量下,通过提高抗肿瘤功效和提高反应持久性来衡量疗效。 尽管经过改造以表达任一 CAR 的 CAR T 细胞在体外表现出相当的细胞溶解活性、细胞因子分泌和增殖,但#2 CAR T 细胞表现出更大的功能持久性。由于其体积较大,在体内实现了更大的功效(Feucht 等人。自然医学 (2019);25 (1): 82-88)。 结果 【0296】 使用 18 小时生物发光测定法测量#2 CAR T 细胞和 1928z-1XX CAR T 细胞的体外细胞毒活性。 这两个 CAR 相同,但 scFv 不同(#2 与 SJ25c1)。 含有#2 CAR 的逆转录病毒载体如图 1 所示。 重组逆转录病毒颗粒由 HEK293 GalV9 包装细胞产生,如前所述(Przybylowski 等人,(2006);13(1):95-100)。 表达萤火虫荧光素酶 (FFL) 的 NALM6 细胞用作靶细胞。 通过阴性选择从人 PMBCs 中分离出 T 细胞,用与磁珠偶联的 CD3/CD28 抗体激活 48 小时,去除磁珠后,用表达 CAR 的 γ-逆转录病毒载体激活。 CAR+群体通过与CAR基因共表达的LNGFR检测来确定。 在量化 FFL 活性之前,将 CAR+ T 细胞与目标 NALM6 细胞以不同的效应子 (E) 与目标 (T) 比率孵育 18 小时。 #2 CAR T 细胞的细胞毒活性是 ⁺ 我们比较了 1928z-1xx CAR T 细胞的细胞毒活性,该细胞先前显示可在体外有效杀死 NALM6 细胞(Feucht 等人,Nature Medicine (2019);25 (1):82-88)。 非转导 (UT) T 细胞用作阴性对照。 CD19基因的NALM6-CD19KO,一种通过CRISPR-Cas9编辑生成的细胞系(Hamieh et al., Nature (2019);568 (7750): 112-116),是CAR T细胞特有的细胞毒活性,用于证明 显示了一个代表性实验(n=2 个对两个健康供体的独立实验)。 如图 10 所示,#2 CAR T 细胞和 1928z-1XX CAR T 细胞表现出相当的细胞毒性。 【0297】 然后测量#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)和 1928z-1XX CAR T 细胞的体内活性。 NALM6 是一种表达正常 (wt) 或低水平 (low) CD19 抗原的前 B 型急性淋巴细胞白血病人肿瘤细胞系,用萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白 (GFP) 转导(Zhao 等人,Cancer Cell (2015 年);28:415-428)。 CD19 ⁺ 低(蓝色)和 CD19 ⁺ 携带低(红色)NALM6 的小鼠是新鲜的 ⁵ 患者接受单次静脉注射未转导的 T 细胞、#2 CAR T 细胞或 1928z-1XX CAR T 细胞治疗。 通过生物发光成像 (BLI) 监测每只小鼠的肿瘤负荷 85 天。 每组使用五只小鼠。 每个鼠标的响应显示在图 2 中。 如图 11 所示,#2 和 1928z1XX CAR T 细胞的肿瘤根除动力学相似。 CAR cDNA 与 LNGFR 报告基因共表达(以监测向 T 细胞的转导)。 “19(T2)28z1XX CAR”代表“#2 CAR”。 【0298】 测试并比较了#2 CAR T 细胞和 1928z CAR T 细胞的活性。 首先,测量了 1928z CAR T 细胞和#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的 CAR 表达和表型。 包含 1928z CAR 的载体如图 1 所示。 CD4 ⁺ T 细胞和 CD8 ⁺ T 细胞表达 1928z CAR 或 #2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)和使用临床制造的典型过程产生的 γ-逆转录病毒载体。进行转导。 由于 SGF-1928z 中的 SJ25c1 scFv 来自小鼠,#2 scFv(表示为“19(T2)scFv”)是人源化的,因此使用 IgG 重链小鼠 (GAM) 或人 (GAH) CAR 表面表达进行检测两种不同的山羊抗体对任一 Fc 部分具有特异性。 如图13所示,CD4 ⁺ T 细胞和 CD8 ⁺ 超过 50% 的 T 细胞表达 CAR。 【0299】 然后使用识别幼稚、中央记忆、效应记忆和效应 T 细胞标记以及耗竭标记(LAG3、PD1 和 Tim3)的抗体通过流式细胞仪确定 CAR T 细胞表型。通过细胞计数确定。 “SFG-T2-1XX-GAH”是指用表达 19(T2)28z1XX CAR(指定为“#2 CAR”)的 γ-逆转录病毒载体转导的 CD4/CD8 T 细胞。而“SFG-1928z-GAM”是源自用表达 1928z CAR 的 γ 逆转录病毒载体转导的 T 细胞。 如图 14 所示,1928z 和 #2 CAR T 细胞在表型上相似。 CD4/CD8 T 细胞比率在 1928z 和 #2 CAR T 细胞之间相似,并且通过 CD62L/CD45RA 和 CD45RA/CCR7 染色确定的 T 细胞分化状态在两个 CAR 组之间也相当(对于 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞) . 耗竭标志物 PD1、LAG3 和 TIM3 的表达并未揭示两种 CAR T 细胞群之间的主要差异。 【0300】 随后,对#2 CAR T 细胞和 1928z CAR T 细胞的体内活性进行了评估和比较。 5×10 ⁵ CD19 ⁺ 在将 NALM6-FFLuc/GFP 细胞注射到小鼠尾静脉后四天,它们接受了未经转导或冷冻保存并解冻的 CAR T 细胞的攻击。 如图 15 所示,与 1928z CAR T 细胞相比,#2 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)提供了更好的肿瘤控制。 用非转导的 T 细胞或 CAR T 细胞处理的 CD19 ⁺ 携带 NALM6 的小鼠的存活绘制在图 2 所示的 Kaplan-Meier 曲线图中。 如图 16 所示,用 #2 CAR T 细胞(称为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理 CD19。 ⁺ 携带 NALM6 的小鼠每只小鼠有 1 x 10 个细胞。 ⁶ 所有剂量低于 100 的 CAR T 细胞比用 1928z CAR T 细胞治疗的小鼠存活时间更长。 所有 1928z CAR T 细胞接受者均在第 25 天死亡,而接受#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的测试组中只有一只小鼠死亡。 最高剂量 (1 x 10 ⁶ ), 一只小鼠在对照组和测试组中均死亡。 【0301】 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)和 1928z CAR T 细胞的 CD19 ⁺ 还测量了 NALM6 白血病小鼠模型中的体内持久性。 治疗后 17 天后 CAR T 细胞的持续存在和骨髓中 CAR T 细胞的数量(每组 n = 5)如图 1 所示。 CAR T 细胞中的 PD1、LAG3 和 TIM3 表达百分比以及 CAR T 细胞中的 T _n , 吨 _cm , 吨 _eff , 和T _em 百分比显示在图 1 中。 【0302】 如图 17 所示,到第 17 天和 CD4 ⁺ CAR T细胞和CD8 ⁺ 包括两种 CAR T 细胞。 1928z CAR T 细胞稀少,与其有限的持久性一致(Zhao 等人,Cancer Cell (2015);28:415-428)。 在第 17 天检测到的每个持久性 T 细胞的表型与 #2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)组中的效应 T 相似(Tn、Tcm 和 Tem)。结果表明,细胞比例(Teff) 略高。 后者表达了更多的 PD1 和相当水平的 LAG3 和 TIM3。 这一观察证实了表达 CD28/CD3z-1XX 信号基序的 CAR T 细胞的持久性更强(Feucht 等人,Nature Medicine (2019);25 (1):82-88)。 【0303】 这些结果表明,与 1928z CAR T 细胞相比,#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)更有效(在 4 个剂量水平下肿瘤根除率更高)。已得到证实。 从这项研究中,#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的表型在全球范围内与 1928z CAR T 细胞相似,#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX”) CAR T 细胞”) 19(T2)28z1XX CAR T 细胞) 由于与寿命较短的 1928z CAR T 细胞相比具有更强的持久性,因此实现了更好的肿瘤控制。已确认。 方法和材料 溶细胞试验 【0304】 基于荧光素酶的测定用于测量用不同 CAR 构建体转导的 T 细胞的细胞毒性。 表达 FFLuc-GFP 的 NALM6 作为靶细胞。 效应细胞和肿瘤靶细胞在黑壁 96 孔板中以指定的效应细胞/靶细胞比例一式三份共培养。 5 x 10 靶细胞 ⁴ 个体以每孔 100 μL 的总体积接种 X-VIVO15,X-VIVO15 补充有 5% 人 AB 血清 (Gemini)、10 U/ml IL7 和 10 U/ml IL15 (PeproTech, Inc)。 最大荧光素酶表达(相对光单位 (RLU))是使用以相同细胞密度单独接种的靶细胞来确定的。 共培养 18 小时后,将 100 μL 荧光素酶底物 (Bright-Glo;Promega) 直接添加到每个孔中。 使用发光板读数器测定发射光。 肿瘤细胞裂解计算为 (1−(RLU 样本)/(RLU 最大值))×100。 转基因人类 T 细胞的分离、转导和扩增 【0305】 匿名健康捐赠者的血沉棕黄层购自纽约血液中心(机构审查委员会豁免)。 所有血样均按照规定的道德和安全程序进行处理。 外周血单核细胞的分离通过密度梯度离心和用 Dynabeads® ClinExVivo™ CD3/CD28 抗体珠激活,然后通过在 RetroNectin 包被的平板(Takara Bio Inc.)上离心使用逆转录病毒载体进行 γ-转导( Zhao 等人,Cancer Cell (2015);28:415-428)。 两天后,如前所述(Hollyman 等人,J. Immunotherapy (2009);32 (2) : 160-180),对活化的 T 细胞进行微珠去除和转导。 然后根据制造商的说明(Wilson Wolf Corporation)在 G-Rex 6M 孔板中扩增转导的细胞。 转导后 5 天确定转导效率。 CAR-T 细胞在 PlasmaLyte 中的 50% CS10 和 5% HSA 中新鲜使用或解冻冷冻保存。 小鼠全身肿瘤模型 【0306】 根据纪念斯隆凯特琳癌症中心 (MSKCC) 机构动物护理和使用委员会批准的方案,使用 6 至 12 周大的 NOD/SCID/IL-2Rγ 无效雄性小鼠。 遵循所有相关的动物使用指南和道德规范。 一般来说,小鼠 0.5 × 10 ⁶ NALM6 (CD19 ⁺ wt 或低表达)-FFLuc-GFP 肿瘤细胞通过尾静脉注射接种,随后在肿瘤注射后 4 天用特定剂量的 CAR-T 细胞处理每只小鼠。 NALM6 细胞导致相同的肿瘤负荷,并且在 CAR-T 细胞治疗之前没有小鼠被排除在外。 未使用随机化或盲法。 生物发光成像 【0307】 如前所述评估肿瘤负荷(Gade 等人,Cancer Research (2005);65(16):9080-9088)。 简而言之,小鼠在 2% 异氟醚麻醉下 10 分钟,腹膜内注射重悬于 PBS 中的 D-荧光素(Xenogen,每只小鼠 3 mg)并成像。 使用 IVIS 成像系统 (PerkinElmer) 对注射的肿瘤进行生物发光成像。 使用 Living Image 软件 (PerkinElmer) 分析数据。 用于流式细胞术的抗体 【0308】 1×10 ⁶ 在使用以下荧光团偶联抗体用 CAR T 细胞处理 17 天后,体外产生或从小鼠骨髓和脾脏中分离的 CAR T 细胞的表面标志物的表达:通过以下方法检测:APC-Cy7 抗人 CD8 (SK1)、APC -Cy7鼠抗人CD45(2D1)、BUV395鼠抗人CD4(SK3)、BV421鼠抗人CD62L(DREG-56)、BV650鼠抗人CD45RA(HI100)、BV480或BV510鼠抗人PD-1 (EH12.1) 和 BUV737 小鼠抗人 CD19 (SJ25C1) (BD Bioscience);PE-Cy7 抗人 CD8 (SK1) 和 PerCP-eFluor 710 抗人 LAG-3 (3DS223H) (eBioscience) ; PerCP 抗人 CD45RA (HI100)、Brilliant Violet785 抗人 Tim-3 (F38-2E2) 和 PE 抗人 CD127 (IL7Ra) (Biolegend)。 使用 Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 AffiniPure IgG,F(ab') 测量 1928z CAR 的表达 ₂使用碎片检测。 为了检测 #2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”),Alexa Fluor 647-山羊抗人 IgG,F(ab’) ₂ 用过的片段。 7-AAD (Beckman Coulter) 用作活性染料。 流式细胞术用Cytek Aurora仪器(Cytek Biosciences)进行。 使用 FlowJo 软件 v.10.1 (FlowJo LLC) 分析数据。 统计分析 【0309】 所有统计分析均使用 Prism 8 (GraphPad) 软件进行。 两组之间的统计比较由未配对的双尾 t 检验确定。 对于体内研究,Kaplan-Meier 曲线用于呈现总生存期。 统计显着性定义为 p 值 <0.05。 (例 7) 毒性评估 包起来 【0310】 #2 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的体内毒性在携带 NALM6 白血病的 NSG 小鼠中进行了评估。 给小鼠静脉注射相同剂量的 1928z CAR T 细胞作为对照。 记录的参数包括所有小鼠的总体重、肿瘤负荷和存活率。 更广泛的毒理学研究的重点是超过该小鼠模型的最小治疗(治愈)剂量 (10x) 以及临床使用的 CAR T 细胞剂量占受体体重的百分比 (10x)。~100x) 剂量, 最高剂量 (1×10 ⁶ CAR T 细胞/接受者)治疗的小鼠。 这些研究包括原发性肿瘤部位(骨髓)的 T 细胞计数和表型分析、血清细胞因子测量(人,即 T 细胞来源和小鼠,即宿主来源)、肝酶。基础血清生物化学,包括研究结束时(第 27-28 天)的外周血细胞计数和器官重量以及综合免疫组织化学。 输注的 CAR T 细胞以临床相关的方式生产,两种 CAR T 细胞产品具有可比性。 【0311】 总体体重和存活率在试验组和对照组之间没有显着差异。 血清细胞因子水平也相似,并未表明两组中存在 CRS。 在第 10 天,两个测试组的 ALT 和 AST 酶水平相当。 在第 27/28 天,用#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)治疗的小鼠体内的酶水平高于用 1928z CAR T 细胞治疗的小鼠。 【0312】 正如预期的那样,#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)比 1928z CAR T 细胞更持久。 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)治疗组的小鼠淋巴细胞和网织红细胞计数高于 1928z CAR T 细胞组。 接受 1928z CAR T 细胞但未接受#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的小鼠显示出弥漫性肿瘤浸润。 具有持久性#2 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的小鼠表现出轻度至中度异质性 GVHD 和肝细胞坏死。 【0313】 预计在接受高剂量人 CAR T 细胞治疗的 NSG 小鼠中会发生 GVHD,尽管后者的机制尚不清楚。 考虑到该研究的异质性(人类 T 细胞对小鼠组织容易产生异反应性)以及它是使用单一供体进行的(潜在的 T 细胞受体库未知),这一有害事件对于自我治疗的意义人类是未知的。 动物模型原理 【0314】 NSG 小鼠中的 NALM6 模型由 Sadelain 实验室开发(Zhao et al., Cancer Cell (2015);28: 415-428, Feucht, et al. Nature Medicine (2019);25 (1): 82-88, Hamieh 等人,Nature (2019);568 (7750):112-116,Eyquem 等人,Nature (2017);543 (7643):113-117) 和其他人评估 CD19 特异性 CAR 的活性T细胞已广泛应用于 NALM6 是一种人类前 B 型急性淋巴细胞白血病 (ALL),它表达 CD19,但不表达 CD80、CD86、4-1BBL 或任何其他主要共刺激配体。 剂量和时间表的基本原理 【0315】 1 x 10 基于 % 转导效率和总活细胞 ⁶ 单次静脉注射 10 个活的 CAR T 细胞与 10 × 最低有效治疗相关(1 × 10 ⁵ CAR T 细胞)(参见图 15)。 CAR T 细胞剂量类似于批准的成人 CD19 CAR T 细胞剂量(例如,0.1-1.5 × 10 ⁸ 大约 10-100 倍的活 CAR T 细胞批准剂量)。 人体临床试验方案中 #2 CAR T 细胞的建议起始剂量为 25 x 10 ⁶ CAR T 细胞。 方法 测试物品和车辆 【0316】 测试品由 MSKCC 的细胞治疗和细胞工程设施 (CTCEF) 制备,1928z CAR T 细胞,#2 CAR T 细胞(在本例中指定为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”),以及未转导的T 细胞。 在研究开始之前,细胞一直冷冻在液氮中。 在 T 细胞注射当天,细胞在 37°C 下解冻并用 PlasmaLyte 中的 1% HSA 洗涤。 然后使用 PlasmaLyte 中的 1% HSA 以每只小鼠 200 µL 的体积 1 x 10 个细胞对细胞进行电镀。 ⁶ 个,5×10 ⁵ 个,2 x 10 ⁵ 个,和 1×10 ⁵ 配制 CAR-T 细胞剂量。 CAR T 细胞的数量被添加到先前使用流式细胞术确定的 CAR T 细胞总数中。 ⁺ 乘以百分比确定。 测试系统 【0317】 0.5×10 ⁶ 使用注射了 FFLuc-GFP NALM6 癌细胞的 6 至 12 周大的 NOD/SCID/IL-2Rγ 缺失雄性小鼠进行实验。 CD4/CD8 选择的 T 细胞转导了带有 1928z CAR 或 #2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)的 γ-逆转录病毒载体,已冷冻保存并解冻 1×10 ⁶ 个体在注射肿瘤细胞后 4 天被注射到小鼠体内。 预计未经治疗的小鼠会在第 16-18 天时因骨髓侵袭性白血病而出现后肢麻痹。 【0318】 野生型 NALM6 人肿瘤细胞系是前 B 型急性淋巴细胞白血病的一种特征良好的模型,Sadelain 实验室已在许多同行评审的出版物中使用该模型(Zhao 等人,Cancer Cell (2015);28: 415-428, Feucht, et al. Nature Medicine (2019);25 (1): 82-88, Hamieh et al., Nature (2019);568 (7750): 112-116, Eyquem et al., Nature ( 2017);543 (7643):113-117)。 测试设计 【0319】 115 只小鼠被分为 1928z CAR 组、#2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)组和非转导组。 在 T 细胞治疗前 4 天,所有小鼠均接受 0.5 x 10 个细胞 ⁶ FFLuc-GFP NALM6 肿瘤细胞通过尾静脉注射接受。 在研究第 0 天,小鼠被分配到治疗组。 每组接受单剂量(200μl)的供试品一次静脉给药。 表 3 概述了组分配。 [表3] 毒理学参数 【0320】 毒性是通过试验品给药后体重的变化来监测的。 1×10 个 1928z CAR T 细胞和#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)在测试物品给药后 10 天和 28 天。 ⁶在 2% 异氟醚麻醉后,从眼眶静脉丛收集单剂量组的血样。 血液样本被收集到含有血清分离器的试管中,并用于测量细胞因子和肝酶的水平。 在第 27 天和第 28 天,1 x 10 1928z CAR 和 #2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”) ⁶ 在指定的每一天对各个剂量组中的小鼠进行完整的尸检分析。 细胞因子分析 【0321】 在 CAR T 治疗后第 1 × 10 天和第 28 天从小鼠身上取出血清。 ⁶ 从接受 1928z CAR T 细胞剂量的 1928z CAR 组和#2 CAR(表示为“19(T2)28z1XX CAR”)组收集。 样品储存在 -80°C 直至分析。 使用 ProcartaPlex 测定法测量小鼠细胞因子(MCP-1、IL-6 和 G-CSF)以及人类细胞因子(IL2、IL3、IFN-g、GM-CSF、颗粒酶 B 和 TNF-a)的水平。量化。 本研究中所有 ProcartaPlex 相关试剂均购自 ThermoFisher Scientific。 来自严重细胞因子释放综合征小鼠模型的血清用作阳性对照(Giavridis 等人,Nature Medicine (2018);24 (6):731-738)。 根据制造商的方案,汇集来自单个细胞因子单纯试剂盒的 60 μL 珠子,并将 50 μL 珠子混合物分配到 96 孔板的每个孔中。 将使用通用测定缓冲液按 1:4 稀释的标准品、质量控制和样品添加到孔中。 将板密封,在室温下以 500 rpm 摇动 30 分钟,然后转移至 4°C。 孵育过夜后,将板在室温下以 500 rpm 的速度再摇动 30 分钟。 洗涤板并将检测抗体加入每个孔中。 将板密封并在室温下以 500 rpm 摇动 30 分钟。 洗涤后,将链霉亲和素RPE溶液加入每个孔中。 将板密封并在室温下以 500 rpm 摇动 30 分钟。 在最后的洗涤步骤后,将珠子重新悬浮在读数缓冲液中,并在 Luminex 200 仪器上获取测定信号。 使用 5 参数逻辑方程生成单个细胞因子的标准曲线,并通过 xPONENT 软件(版本 4.2.1509.0)计算每个样品中单个细胞因子的浓度。 统计数据 【0322】 所有统计分析均使用 Prism 8 (GraphPad) 软件进行。 两组之间的统计比较由未配对的双尾 t 检验确定。 统计显着性定义为 p 值 <0.05。 结果 【0323】 测量了用 1928z CAR T 细胞和#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)治疗期间小鼠体重的变化。 NALM6 荷瘤小鼠,1 x 10 ⁶ 个,5×10 ⁵ 个,2 x 10 ⁵ 个,或 1×10 ⁵ 处理 1928z CAR T 细胞或#2 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)(每组 n=10),而未转导的 T 细胞治疗用作对照组(n=5)。 结果显示在图 1 中。 如图 18 所示,两种 CAR T 细胞治疗的体重变化相似。 【0324】 然后测量用 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)和 1928z CAR T 细胞处理的小鼠血清中的肝酶。 在第 10 天和第 27/28 天(剂量水平 = 1 x 10 ⁶ CAR T,每组 n = 10)呈现在图 1 中。 1×10 ⁶ 用 1928z CAR T 细胞或#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)治疗的 NALM6 荷瘤小鼠在第 10 天和第 27/28 天用 ALT 和#2 CAR T 细胞治疗。AST水平进行了评估。 如图 19 所示,第 10 天的 ALT 和 AST 酶水平在两个测试组中相当。 在第 27/28 天用#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠中的酶水平高于用 1928z CAR T 细胞处理的小鼠。低于 【0325】 1×10 ⁶ 测量人和小鼠细胞因子水平。 图 20 显示了在第 10 天和第 27/28 天(剂量水平 = 1 x 10 ⁶ CAR T,每组 n=10)。 从严重细胞因子释放综合征小鼠模型中收集的血清用作阳性对照 (n=2)(Giavridis 等人,Nature Medicine (2018);24 (6):731-738)。 第 10 天和第 27/28 天的 IL2、IL3、GM-CSF、颗粒酶 B 和 TNFalpha 水平在两个 CAR T 细胞组之间具有可比性。 在第 27/28 天,19(T2)28z1XX CAR T 治疗组的 IFN-γ 水平高于接受 1928z CAR T 细胞的小鼠。 【0326】 图 21 显示第 10 天和第 27/28 天(剂量水平=1×10 ⁶ 显示了来自用任一 CAR T 处理的小鼠血清的小鼠细胞因子水平的定量结果,每组 n = 10)。 从严重细胞因子释放综合征小鼠模型中收集的血清用作阳性对照 (n=2)(Giavridis 等人,Nature Medicine (2018);24 (6):731-738)。 在第 10 天,用 #2 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠的 MCP 水平略高于注射了 1928z CAR T 细胞的小鼠。-1 和 G-CSF,而 IL6 水平两个 CAR T 细胞组之间具有可比性。 在第 27/28 天,用 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠显示出与 1928z CAR T 组相似的 MCP-1、IL-6 和 G 水平-脑脊液。 这些发现表明,两组中都没有细胞因子释放综合征 (CRS) 的证据。 【0327】 #2 在注射用 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)和 1928z CAR T 细胞处理的小鼠后 27/28 天测量血细胞计数。 两个不同的 CAR T 治疗组(剂量水平 = 1 × 10 ⁶ CAR T(每组 n = 10)第 27/28 天的必需血细胞定量如图 1 所示。 显示了中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数与网织红细胞计数的比较。 如图 22 所示,中性粒细胞和单核细胞被分为两个 CAR T 组(1 x 10 ⁶ 个体剂量水平)。 19(T2)28z1XX CAR T 细胞治疗组小鼠的淋巴细胞和网织红细胞计数高于 1928z CAR T 细胞组。 【0328】 此外,在用#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠和用 1928z CAR T 细胞处理的小鼠的尸检中测量了体重和器官重量。底部。 第 27/28 天来自两个不同 CAR T 治疗组的体重和基本器官重量的比较(剂量水平 = 1 x 10 ⁶ 车 T)。 结果显示在图 1 中。 如图 23 所示,体重、脾脏重量和肾脏重量在两个治疗组 1 和 2 中相当。 19(T2)28z1XX CAR T 治疗组(标记为“SFG-19(T2)28z-1XX”)小鼠的肝脏重量高于 1928z CAR T 组(标记为“SFG-1928z”)。也很轻。 心脏重量的差异归因于不平等的技术处理。 【0329】 #2 用 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠和用 1928z CAR T 细胞处理的小鼠的肝脏、骨髓和脾脏中的 CD3 ⁺ 和CD19 ⁺ 进行了免疫组织化学测量。 在 CAR T 治疗后 27/28 天评估小鼠肝脏、脾脏和骨髓中的淋巴细胞和肿瘤浸润水平(剂量水平 = 1 x 10 ⁶CAR T,n=6)示于图1中。 如图 24 所示,19(T2)28z1XX CAR T 治疗组(表示为“SFG-19(T2)28z-1XX”)小鼠在评估的所有器官中都有 1928z CAR T 细胞。CD3+ 细胞水平高于治疗组动物(标记为“SFG-1928z”)。 在 1928z CAR T 组的所有测试器官中均观察到肿瘤浸润,而在 19(T2)28z1XX CAR T 组中未观察到肿瘤浸润。 结论 【0330】 每个接受者 1 x 10 高剂量 ⁶ 将 1928z CAR T 细胞中#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的毒性特征与 1928z CAR T 细胞的毒性特征进行比较。 没有观察到整体体重或存活率的差异。 第10天测量的血清细胞因子水平在两组之间具有可比性,#2 CAR T细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T细胞”)诱导的细胞因子释放综合征(CRS)表明被感染的可能性是与 1928z CAR T 细胞相比并不高。 在第 10 天和第 17 天,两组的肝酶均升高,而#2 CAR T 细胞(指定为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)接受 1928z CAR T 细胞的受体少于该组。 外周血细胞计数显示#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)接受者的淋巴细胞计数较高,这与 FAC 分析(第 17 天)和组织 IHC(27/28 天)一致), 与 #2 CAR T 细胞的持久性一致。 观察到没有贫血、红细胞增多症或红细胞增生的孤立性网织红细胞增多症,因此不被认为是不良事件。 【0331】 除肝脏外,两组器官重量相似。 由于显着的肿瘤进展(BLI 和 IHC),用 1928z CAR T 细胞治疗的小鼠的肝脏更重。 相比之下,用 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠在这些相同的小鼠中通过 IHC 和 BLI 显示没有肿瘤。结果得到证实。 在#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)受体小鼠中观察到多器官淋巴细胞浸润,与异源 GVHD 一致。 后者通过这些组织中上皮坏死的发现得到证实。 在注射#2 CAR T 细胞(称为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)的小鼠中也观察到轻度至中度肝细胞坏死。 这种微观发现通常与 GVHD 无关,因此代表可能的不良事件。 鉴于肝酶适度升高(仅 AST,而非 ALT)和正常胆红素水平,这一发现对肝功能的影响有限。 其他病理学发现是次要的,并且在两个治疗组之间具有相同的代表性,因此不被认为代表重要的发现。 两个治疗组之间的 T 细胞流式细胞术概况相似,表明 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)显示 CAR T 细胞持久性与治疗增加的预期发现一致由于体积大而具有功效。 【0332】 #2 CAR T 细胞(命名为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)临床测试的 1928z CAR T 细胞(Park 等人,N. Engl. J. Med. (2018);378 (5):449-459 ) 在用 #2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)处理的小鼠中表现出轻度至中度毒性。揭示了严重的 GVHD 和轻度至中度肝细胞坏死。 【0333】 从本实施例和实施例 6 中提供的数据来看,#2 CAR T 细胞(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”)比 1928z CAR T 细胞更持久。可以得出结论,虽然它很强大,但由于它不会造成更大风险的事实。 #2 由于 CAR T 细胞的效力相对增加(表示为“19(T2)28z1XX CAR T 细胞”),因此剂量低于大多数 CD19 靶向 CAR T 细胞研究25 × 10 ⁶ 支持从 1 个 CAR T 细胞剂量开始的人体临床试验设计。 (例 8) 药理试验 抗CD19抗体的细胞结合 【0334】 公开的 scFv 的 V _H 和V _L 通过流式细胞术对 Raji 细胞和表达内源性 CD19 的 NALM-6 细胞系评估抗 CD19 抗体的细胞结合。 每种抗体都在 CD19 阳性亲本菌株和相应的 CD19 敲除 Raji 和 NALM-6 菌株上进行了测试,以确认细胞上的靶标特异性结合。 图 25 中所示的流式细胞术色谱图表明 CD19 阳性细胞系相对于相应的敲除细胞系中的背景结合有 1-2 对数的偏移。 【0335】 图 26A-26C 中所示连续稀释的流式细胞术结果表明与 NALM-6 细胞的饱和结合。 从曲线计算的 EC50 值列于表 4。 示例性抗 CD19 抗体以至少 0.2 nM 的高亲和力结合 CD19 阳性 NALM-6 细胞。 所观察到的对 CD19 阳性细胞的亲和力高于对可溶性蛋白的亲和力,这表明这些抗体与细胞上比 CD19-HSA 融合蛋白结合的表位更自然地结合。 表 4 中显示的所有抗 CD19 抗体都包含 SEQ ID NO: 10 中列出的氨基酸序列。 _H 包括。 [表4] 【0336】 (例 9) CD19 靶向 19(T2)28z1XX CAR T 细胞在复发或难治性 B 细胞恶性肿瘤成年患者中的 I 期研究 【0337】 此示例描述了针对患有复发性或难治性 B 细胞恶性肿瘤的成年患者进行的 CD19 靶向 19(T2)28z1XX CAR T 细胞的 I 期试验。 “19(T2)28z1XX”和“19(T2)28z1XX”在本文中可互换使用。 针对 B 细胞特异性表面抗原 CD19 的自体 CAR T 细胞疗法已证明对复发或难治性 (R/R) B 细胞淋巴瘤 (BCL) 具有良好的临床反应。 然而,尽管最初的完全缓解(CR)率为40-60%,但只有少数患者处于长期缓解、预防复发和达到更深层次的临床缓解(CR)。需要进一步提高CAR的疗效治疗方法 【0338】 研究设计和方法:本研究是 19(T2)28z1XX 在 R/R B 细胞恶性肿瘤患者中的单中心 I 期临床试验。 重要的疾病资格标准包括 R/R 弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL)、高级别 BCL、原发性纵隔 BCL、惰性 BCL 和慢性淋巴细胞白血病 (CLL)。 只要 CD19 表达得到确认,先前接受过 CD19 CAR 治疗的患者就有资格参加。 关键排除标准包括正在进行的免疫抑制,例如全身性 GvHD 治疗和活动性 CNS 疾病。 【0339】 本研究将使用 3+3 剂量递增设计来确定 BCL 的最大耐受剂量。 计划 5 个固定剂量水平:25 x 10 ⁶ 个,50×10 ⁶ 个,100×10 ⁶ 个,150×10 ⁶ 个,200×10 ⁶ CAR T 细胞。 患者接受由氟达拉滨和环磷酰胺组成的预处理化疗 3 天,然后单次输注 19(T2)28z1XX CAR T 细胞。 DLBCL、高级别 BCL 和原发性纵隔 BCL 患者有资格参加剂量递增阶段。 一旦确定了 2 期推荐剂量 (RP2D),该研究将开始两个队列的剂量扩展阶段。 队列 1 包括 DLBCL、高级别 BCL 和原发性纵隔 BCL(即,与剂量递增阶段相同的资格标准)。 队列 2 包括惰性 BCL、CLL 和里氏转化的患者。 该研究的剂量扩展部分旨在进一步表征 19(T2)28z1XX CAR 对多种适应症的安全性、有效性和药代动力学。 最多招募 60 名患者。 【0340】 本研究的主要目的是评估 19(T2)28z1XX 的安全性和耐受性,并确定推荐的 2 期剂量。 重要的次要目标包括评估 19(T2)28z1XX 的疗效和药代动力学。 探索性目标包括 B 细胞发育不全和可测量残留病 (MRD) 的评估、输注前后 19(T2)28z1XX CAR T 细胞表型的表征以及血清细胞因子分析。 【0341】 尽管已经详细描述了本公开的主题和某些优点,但是应当理解,在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替换和更改。 此外,本申请的范围不限于本文所述的过程、机器、制造和组合物以及方法的特定实施例。 执行与本文所述的相应的现在存在的或以后开发的实施例基本相同的功能或基本相同,正如本领域技术人员从当前公开的主题的公开内容中容易理解的那样;任何过程、机器、制造、组合物可以根据本公开的主题使用物质的本质或实现结果的方法。 因此,所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、组合物或方法包括在它们的范围内。 【0342】 在整个本申请中引用了各种专利、专利申请、出版物、产品描述、协议和序列登录号,出于所有目的,其全部公开内容通过引用并入本文。