本申请提供一种四氢嘧啶的提取方法、四氢嘧啶及其应用，涉及发酵液提取技术领域。该提取方法采用壳聚糖絮凝菌体和蛋白核酸等大分子物质得到絮凝液，絮凝液过滤得到滤出液，滤出液先使用强酸性阳离子交换树脂进行吸附和洗脱，洗脱液上强碱性阴离子交换树脂，收集流穿液，对流穿液进行浓缩结晶，得到四氢嘧啶。通过壳聚糖絮凝菌体和大分子物质，便于后续过滤得到滤出液。滤出液先使用强酸性阳离子交换层析后再经过强碱性阴离子交换层析，纯度可以达到99％，且损失量很小，相较于只使用一种离子交换树脂的方案，或者先阴离子交换层析再阳离子交换层析的方案，本申请方案得到的四氢嘧啶的纯度都有很大提高。