发明领域
[0001] 本发明涉及基于重叠肽 (OLP) 的新型免疫原和源自其的肽。 它还涉及表达这些免疫原的分离的核酸以及包含此类核酸的载体和细胞。 本发明的化合物可用作疫苗,特别是用于预防和治疗AIDS和机会性疾病。
发明背景
[0002] HIV 感染诱导强烈和广泛定向的 HLA I 类限制性 T 细胞反应,其中特定表位和限制性 HLA 等位基因与相对
体内 控制。
看 Brander C, et al., Current Opinion Immunol. 2006年; 18:1-8。 虽然大部分抗病毒 CTL 反应似乎受 HLA-B 限制,但靶向病毒区域和限制性 HLA 分子对这些反应有效性的相对贡献仍然不清楚。
看 Kiepiela P, et al., Nature 2004; 432:769-775 和 Ngumbela K, et al., AIDS Res. 哼。 逆转录病毒 2008; 24:72-82。
[0003] 此外,HIV 序列多样性在
体内 病毒特异性 T 细胞免疫的相关性尚不清楚,因为逃逸变体的功能限制、单个蛋白质位置的密码子使用、T 细胞受体 (TCR) 可塑性和功能亲和力以及交叉反应潜力都可能有助于整体有效性 特异性 T 细胞反应。
看 Brockman M, et al., J. Virol. 2007年; 81: 12608-12618 和 Yerly D, et al., J. Virol. 2008; 82:3147-3153。 值得注意的是,T 细胞对 HIV Gag 的反应最一致地与 HIV 进化枝 B 和进化枝 C 感染队列中的病毒载量减少有关。
看 Zuñiga R, et al., J. Virol. 2006年; 80:3122-3125 和 Kiepiela P, et al., Nat. 医学。 2007年; 13:46-53。
[0004] 然而,这些分析都没有评估对目标蛋白较短区域的反应的作用,这些区域可能会引起特别有效的反应。 此外,尚不清楚 Gag 的相对益处是否归因于该蛋白质的任何其他特定特征,例如表达水平、氨基酸组成和固有的更高免疫原性。 因此,可以确定 Gag 外部和这些富含特定短表位区域的蛋白质亚基:i)诱导主要见于 HIV 控制者的反应,以及 ii)可在不同 HLA 类型的个体中检测到,不限于 表达先前与有效病毒控制相关的等位基因的个体。
[0005] 虽然一些早期的研究确实控制了在“好”HLA I 类等位基因上呈现的 Gag 衍生表位的潜在过度代表,但人们仍然担心纯粹基于 Gag 的 HIV 疫苗可能主要有益于那些具有有利 HLA 基因型的人 并且不会利用 Gag 之外的潜在有益目标。
看 基皮埃拉, 2007,
同上 和 Honeyborne I,等人,J. Virol。 2007年; 81:3667-3672。 此外,CTL 逃逸和病毒适应性研究在很大程度上仅限于在相对保护性 HLA 等位基因(如 HLA-B57 和 -B27)背景下呈现的 Gag 衍生表位。
看 Schneidewind A, et al., J. Virol. 2007年; 81:12382-12393 和 Leslie A, et al., Nat. 医学。 2004; 10:282-289。 因此,现有信息可能无法提供旨在保护遗传多样性的大多数人类宿主群体的免疫原序列的相关信息。
[0006] 此外,尽管最近对 HIV 和 SIV 感染的一些研究表明亚显性反应对
体内 病毒控制,其中目标位于 Gag 之外。
看Frahm N, et al., Nat. 免疫学。 2006年; 7:173-178 和 Friedrich T, et al., J. Virol. 2007年; 81:3465-3476。 因此,目前关于什么可能构成对 HIV 的保护性细胞免疫反应的观点很可能偏向于关注免疫显性反应和受频繁 HLA I 类等位基因和与优越疾病结果相关的 HLA 等位基因限制的反应。 因此,HIV 疫苗的开发部分受到缺乏能够诱导广泛免疫反应的免疫原的限制。 本发明致力于此类免疫原的设计。
发明内容
[0007] 在第一个方面,本发明涉及具有包含序列 SEQ ID NO: 1-16 或所述 SEQ ID NO: 1-16 的变体的氨基酸序列的免疫原性多肽,其中每个所述变体的长度至少为 8 氨基酸,条件是除了根据SEQ ID NOs 1-16的任何氨基酸序列或其变体之外,所述氨基酸序列不包含源自HIV基因组的长度为8个或更多个氨基酸的任何序列段 其中。
[0008] 在第二个方面,本发明涉及一种免疫原性多肽,其氨基酸序列包含至少一个选自 SEQ ID NOs 1-16 或其变体的序列,其中所述变体的长度至少为 8 个氨基酸 , 附带条件是:
i)除了根据SEQ ID NOs 1-16的任何氨基酸序列或其变体或片段之外,所述免疫原氨基酸序列不包含源自HIV基因组的长度为8个或更多个氨基酸的任何序列段 ,和ii)当免疫原仅包含选自由SEQ ID NOs 1-16组成的组的一个序列时,则该序列不选自由SEQ ID NOs:3、5、6和16组成的组。
[0009] 在进一步的方面,本发明涉及编码第一方面和第二方面的免疫原的核酸,以及包含所述核酸的表达盒、载体、病毒和细胞。
[0010] 在另一个方面,本发明涉及包含根据权利要求1至11中任一项的免疫原性多肽和一种或多种佐剂的疫苗。
[0011] 另一方面,本发明涉及第三方面的免疫原性多肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞,或用于药物的组合疫苗。
[0012] 另一方面,本发明涉及第三方面的免疫原性多肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞,或用于预防或治疗HIV感染的组合疫苗 或与 HIV 感染有关的疾病。
[0013] 另一方面,本发明涉及一种试剂盒,其包含第一和/或第二方面的免疫原、核酸、表达盒、表达载体、第三方面的病毒或细胞,或组合物 第四个方面。
微生物沉积
[0014] 质粒 298H GMCSF-HIVACAT DNA 于 2012 年 1 月 13 日以登录号 DSM 25555 保藏在 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany。
附图简要说明
[0015] 图1 . 表达质粒中包含的基因的示意图。 点标识起始和终止密码子。
图 2 . 通过流式细胞术分析汇集的脾细胞中的细胞免疫反应。 显示了 (a) 中组间总 Gag、Pol 和 Nef-Tat-Vif 特异性干扰素伽马反应的频率以及 (b) 中 CD4 和 CD8 反应的分布。
图 3 . 对 Gag、Pol、NTV 和 HIVACAT T 细胞免疫原序列的反应,通过干扰素伽马 ELISpot 测定在鼠脾细胞中测量。 用编码完整 Gag、Pol 和 Nef-Tat-Vif 多肽的质粒免疫个体小鼠。 显示了针对 HIVACAT T 细胞免疫原中包含的区域的反应对总干扰素 Gag-Pol-NTV 特异性反应的贡献。
图 4 .免疫小鼠中针对 HIVACAT T 细胞免疫原的干扰素γ反应的 (a) 广度和 (b) 幅度比较。 用编码完整蛋白质或最小 T 细胞序列的质粒处理受试者。
图 5 . 对于用 20 µg 编码完整 Gag、Pol 加 Nef-Tat-Vif 多肽和 HIVACAT T 细胞免疫原的质粒免疫的小鼠,干扰素伽马反应对 Gag、Pol、Vif 或 Nef 的平衡。 对于用全蛋白免疫的小鼠,图 (a) 中显示的 Gag 特异性反应占优势,而对于用 HIVACAT T 细胞免疫原免疫的小鼠,在图 (b) 中看到更平衡的反应。
图 6 . 通过蛋白质免疫印迹检测 p24、p37 和 p55 的结合抗体,方法是使用 HEK 293 细胞的细胞提取物,这些细胞转染了 1mg 的 gag 和 gag-pol 表达载体(显示 p55 gag,以及处理过的 p24、p37 和 p55 gag 亚基),分离时间为 12 % SDS-Page 并用 a) HIV 感染患者的人血清,b) 来自用高剂量免疫原免疫的小鼠的混合血清和 c) 来自用低剂量免疫原免疫的小鼠的混合血清(全部在 1:100 稀释)。
图 7.a) 来自治疗小鼠的 Gag-p24 特异性结合抗体的终点效价。 测定是通过 ELISA 从单个连续 4 倍稀释的混合血清样品中进行的。 b) 使用 HIV-1IIIB pr55 Gag 重组蛋白(目录号 3276,NIH 试剂计划,美国马里兰州贝塞斯达)内部开发的 gag p55 ELISA。 在 1:100 稀释的个体小鼠血清中进行测定。
图 8 . a) 小鼠免疫的示意图。 使用 6 只 C57BL/6 小鼠为一组比较不同异源组合的免疫原性(2xDNA prime 与 3xDNA prime 随后是 1xMVA 加强),使用 100µg pDNA-HIVACAT 或 10^6 pfu 的 MVA-HIVACAT 肌肉注射。 b) 比较个体免疫小鼠中针对 HIVACAT T 细胞免疫原的 IFNγ 反应的广度和强度。 c) Gag、Pol、Vif 和 Nef 特异性反应在个体免疫小鼠中的分布。 d) 显示了不同免疫组中 HIVACAT T 细胞免疫原(Gag p17、Gag p24、Gag p2p7p1p6、Pol-蛋白酶、Pol-RT、Pol-整合酶、Vif 和 Nef)中包含的 8 个蛋白质亚基的分布。
发明详述
[0016] 本发明公开了几种免疫原性化合物,可有效在广泛的受试者中诱导针对 HIV 的高免疫反应。 特别是,已经用这些化合物获得了针对关键 HIV 编码表位的 HIV 特异性 CD4 +< 和 CD8 +< T 细胞反应。
1. 通用术语的定义
[0017]如本文所用,术语“佐剂”是指一种免疫剂,其改变免疫原的作用,而当单独施用时几乎没有直接作用。 它通常包含在疫苗中以增强接受者对提供的抗原的免疫反应,同时将注射的异物保持在最低限度。 将佐剂添加到疫苗中以刺激免疫系统对目标抗原的反应,但佐剂本身并不赋予免疫力。 有用佐剂的非限制性实例包括矿物盐、多核苷酸、聚精氨酸、ISCOM、皂苷、单磷酰脂 A、咪喹莫特、CCR-5 抑制剂、毒素、聚磷腈、细胞因子、免疫调节蛋白、免疫刺激融合蛋白、共刺激分子和组合 其中。 矿物盐包括但不限于AIK(SO 4 ) 2 。 AlNa(SO 4 ) 2 、AlNH(SO 4 ) 2 、二氧化硅、明矾、Al(OH) 3 、Ca 3 (PO 4 ) 2 、高岭土或碳。 有用的免疫刺激性多核苷酸包括但不限于具有或不具有免疫刺激复合物(ISCOM)的CpG寡核苷酸、具有或不具有聚精氨酸、聚IC或聚AU酸的CpG寡核苷酸。 毒素包括霍乱毒素。 皂甙包括但不限于 QS21、QS17 或 QS7。 有用的免疫刺激性融合蛋白的一个例子是 IL-2 与免疫球蛋白 Fc 片段的融合蛋白。 有用的免疫调节分子包括但不限于 CD40L 和 CD1a 配体。 用作佐剂的细胞因子包括但不限于 IL-1、IL-2、IL-4、GMCSF、IL-12、IL-15、IGF-1、IFN-α、IFN-β 和干扰素 γ。 此外,实例是胞壁酰二肽、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰基-降胞氨酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687,也称为nor- MDP), N-acetylmuramyul-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1 '2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxphosphoryloxy)-ethylamine (CGP 19835A, 也称为 MTP-PE ), RIBI (MPL+TDM+CWS) 在 2% 角鲨烯/TWEEN®< 80 乳液中,脂多糖及其各种衍生物,包括脂质 A、弗氏完全佐剂 (FCA)、弗氏不完全佐剂、默克佐剂 65、多核苷酸(例如 聚 IC 和聚 AU 酸),蜡 D 来自
结核分枝杆菌, 发现的物质
小棒杆菌、百日咳博德特氏菌、 和布鲁氏菌属的成员、Titermax、Quil A、ALUN、Lipid A 衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP 衍生物、LPS 衍生物、合成肽基质或 GMDP、Montanide ISA-51 和 QS-21、CpG 寡核苷酸、poly I:C, 和 GMCSF。
看 Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1980, pp. 1324-1341),Hunter R, US 5,554,372 和 Jager E, Knuth A, WO1997028816。 也可以使用佐剂的组合。
[0018] 如本文所用,术语“AIDS”是指HIV感染的症状阶段,并且包括获得性免疫缺陷综合症(通常称为AIDS)和“ARC”或AIDS相关综合症。
看 阿德勒 M 等人,英国人。 医学。 J. 1987; 294:1145-1147。 AIDS的免疫学和临床表现是本领域众所周知的,包括例如机会性感染和由免疫缺陷引起的癌症。
[0019] 如本文所用,术语“氨基酸接头”是指除了出现在天然蛋白质中特定位置的氨基酸序列之外的氨基酸序列,并且通常被设计为柔性的或插入结构,例如α-螺旋, 两个蛋白质部分之间。 接头也称为间隔子。 接头通常是非抗原性的,并且基本上可以是任何长度(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20 或更多氨基酸)。 接头也可以是细胞抗原加工机器可以在不破坏有效T细胞表位的情况下启动免疫原性多肽降解的位置或序列。
[0020] 如本文所用,术语“抗逆转录病毒抗性突变位点”涉及当发生突变时赋予抗逆转录病毒剂抗性的位点。 可以通过挖掘已知数据库(例如斯坦福大学 HIV 耐药数据库)来识别此类站点,例如,可以检索具有特定突变的病毒的序列和治疗或具有选定突变的分离株的药物敏感性数据。 用于测试HIV耐药性的测定法是本领域已知的。
看Dong J, US 20040106136 和 Shafer R,抗逆转录病毒耐药性测定,HIV InSite 知识库章节(http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-02-03,2012 年 1 月)。 已知的 HIV 抗逆转录病毒耐药突变位点由世界卫生组织或美国国际抗病毒协会定期发布(例如 Johnson V, et al., ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4): 153- 164.
[0021] 如本文所用,表述“细胞免疫反应”描述了由T细胞及其分泌产物介导的针对外来抗原的免疫反应。
[0022] 如本文所用,术语“树中心序列”或“COT”指这样的序列,从该序列到相关变体序列的系统发育图的每个尖端的平均进化距离已被最小化。
看 Nickle D 等人,《科学》2003 年; 299、1515-1517。
[0023] 如本文所用,术语“密码子优化”涉及改变核酸分子中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用而不改变由DNA编码的多肽,以提高表达。 之前已经报道了大量用于密码子优化的方法和软件工具。
看 Narum D 等人,感染。 免疫。 2001年; 69(12):7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. 净化器。 2002年; 24(1):18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000 ; 39(50):15399-15409,和 Humphreys D, et al., Protein Expr. 净化器。 2000; 20(2):252-2。
[0024] 如本文所用,术语“包含”或“包含”根据普遍接受的专利实践还公开了“由......组成”。
[0025] 如本文所用,表述“与HIV感染相关的疾病”包括受试者已发展为AIDS的状态,但也包括感染HIV的受试者未表现出任何疾病体征或症状的状态。 因此,当将本发明的疫苗施用于没有感染的临床体征的受试者时可以具有预防活性,因为它们可以预防疾病的发作。 免疫原性组合物能够预防或减缓此类受试者中健康 CD4+ T 细胞的感染和破坏。 它还指预防和减缓获得性免疫缺陷病症状的发作,例如极低的 CD4+ T 细胞计数和机会性病原体的反复感染,例如
分枝杆菌属、卡氏肺囊虫、 和
肺孢子菌隐球菌。 有益或预期的临床结果包括但不限于绝对幼稚 CD4+ T 细胞计数增加(范围 10-3520),CD4+ T 细胞占循环免疫细胞总数的百分比增加(范围 1-50%) 和/或未感染受试者中 CD4+ T 细胞计数占正常 CD4+ T 细胞计数百分比的增加(范围 1-161%)。
[0026] 如本文所用,术语“变体”或“片段”是指通过在序列的N-末端或C-末端缺失一个或多个末端氨基酸而衍生自SEQ ID NOs 1-16中任一个的多肽。 单独的 SEQ ID NO. 变体或片段优选地具有至少8个氨基酸或最多10%、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最多60%、最多70%、最多 至 80%、至多 90% 或至多 99% 的其各自的 SEQ ID NO。
[0027] 如本文所用,术语“HIV基因组”是指被HIV衣壳包围并编码基因的约8749个核苷酸长的RNA序列
gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx, 并且可选地,
电视。 HIV基因组序列具有高度可变性,因此,本发明所指的HIV基因组不限于任何特定序列。 优选的序列是本文所述的HIV类型和亚型的序列。
[0028] 本文所用术语“人类免疫缺陷病毒”或“HIV”泛指人类免疫缺陷病毒,包括 1 型 HIV(“HIV-1”)、2 型 HIV(“HIV-2”)或其他 HIV 病毒,包括 例如,HIV-1、HIV-2、新出现的 HIV 和其他 HIV 亚型和 HIV 变体,例如广泛分布或地理上孤立的变体和猿猴免疫缺陷病毒(“SIV”)。 例如,可以确定祖先病毒基因序列
环境 和
插科打诨HIV-1 的基因,例如 HIV-1 亚型 A、B、C、D、E、F、G、H、J 和 K,以及亚型间重组体,例如 AG、AGI,以及 M、N、 O 或 HIV-2 病毒或 HIV-2 亚型 A 或 B。HIV-1、HIV-2 和 SIV 包括但不限于细胞外病毒颗粒和与其各自感染细胞相关的病毒形式。
[0029] 如本文所用,“体液免疫反应”描述由B细胞产生的抗体介导的针对外来抗原的免疫反应。
[0030] 如本文所用,术语“免疫原性组合物”是指引发免疫反应的组合物,该免疫反应产生针对特定免疫原的抗体或细胞介导的免疫反应。
[0031] 如本文所用,术语“免疫原性多肽”或“免疫原”是指如果单独注射或与佐剂一起注射,则能够诱导适应性免疫反应(即体液或细胞介导的免疫反应)的多肽抗原 .
[0032] 如本文所用,术语“套件”是指促进过程、方法或应用的物品的组合。 这些试剂盒提供了进行本发明所述应用所必需的材料。
[0033] 如本文所用,术语“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接至调节序列(例如,在体外转录/翻译中 系统或在宿主细胞中(当载体被引入宿主细胞时)。
看 Auer H,自然生物技术。 2006年; 24:41-43。
[0034] 如本文所用,术语“肽标签”或“标签”是指可用于分离或纯化所述免疫原的肽或氨基酸序列。 因此,所述标签能够以高亲和力结合一种或多种配体,例如亲和基质如层析载体或珠子的一种或多种配体。 可用于分离或纯化蛋白质的标签的说明性、非限制性实例包括 Arg-标签、FLAG-标签、His-标签或 Strep-标签; 能够被抗体识别的表位,例如c-myc-标签(由抗c-myc抗体识别)、SBP-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、谷胱甘肽 S-转移酶标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA 或 Avi-标签; 氨基酸序列,例如 AHGHRP (SEQ ID NO:53)、PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO:54)或 GMTCXXC (SEQ ID NO:55); 或β-半乳糖苷酶。
看 Terpe K 等人,Appl。 微生物学。 生物技术。 2003年; 60:523-525。
[0035] 本文可互换使用的术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的稀释剂”或“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料 或任何常规类型的配方助剂。 药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者基本上无毒,并且与制剂的其他成分相容。 例如,用于含有多肽的制剂的载体通常不包括氧化剂和已知对多肽有害的其他化合物。 合适的载体包括但不限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。 载体可以包含额外的试剂,例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂有效性的佐剂。
[0036] 如本文所用,术语“预防”、“预防”和“预防”是指抑制动物疾病的发生或减少疾病的发生。 预防可能是完全的(例如受试者体内完全没有病理细胞)。 预防也可以是部分的,使得例如受试者中病理细胞的出现少于没有本发明会出现的情况。 预防还指降低对临床状况的易感性。
[0037]术语“分泌信号肽”是指高度疏水的氨基酸序列(例如,优选 15 至 60 个氨基酸长)的蛋白质,必须穿过膜才能到达其功能性细胞位置。 通过与信号识别颗粒结合,这些序列将新生的蛋白质-核糖体复合物引导至翻译过程中蛋白质插入的膜。 信号肽通过各种膜(例如内质网、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体)指导蛋白质的翻译吸收。 非膜蛋白上的前导信号序列最终会被特定的肽酶去除。 使用的一些信号肽包括 MCP-3 趋化因子,用于促进抗原呈递细胞的分泌和吸引; 用于增加蛋白酶体降解的连环蛋白 (CATE) 衍生肽; 和溶酶体相关蛋白 LAMP1,用于靶向 MHC II 区室。
看 Rosati M, et al., Proc. 国家队。 学院。 科学。 美国 2009; 106:15831-15836。
[0038] 如本文所用,表述“顺序施用”是指施用不是同时的,而是进行第一次施用,然后进行一次或多次连续施用。
[0039] 如本文所用,表述“基本上保留了免疫原性多肽的免疫能力”是指变体表现出至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 免疫原性多肽诱导适应性免疫反应(即体液或细胞介导的免疫反应)的能力的 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95% 或 100%, 如果单独注射或与佐剂一起注射。
[0040] 如本文所用,术语“治疗”或“治疗”是指施用本发明的免疫原性组合物或包含它的药物以在临床症状出现之前或之后控制疾病的进展。 疾病进展的控制被理解为是指有益的或期望的临床结果,包括但不限于症状的减轻、疾病持续时间的减少、病理状态的稳定(特别是避免进一步恶化)、延迟 疾病的进展,改善病理状态和缓解(部分和全部)。 与不进行治疗的预期生存相比,疾病进展的控制还涉及生存的延长。
[0041] 如本文所用,术语“疫苗”是指通过诱导包括免疫记忆在内的适应性免疫应答来建立或提高对特定疾病的免疫力的物质或组合物。 疫苗通常包含类似于致病微生物或其部分(例如多肽)的试剂。 疫苗可以是预防性的或治疗性的。
[0042] 如本文所用,术语“变体”是指通过修饰或突变,包括取代,优选保守取代、插入或非末端缺失,从任何SEQ ID NOs 1-16衍生的所有那些氨基酸序列,影响一个 或更多个氨基酸并且基本上保留了免疫原性多肽的免疫原性能力。
[0043] 如本文所用,术语“载体”是指线性或环状的核酸分子,其包含根据感兴趣的核酸的区段,该区段可操作地连接至提供其在感兴趣的宿主细胞中的自主复制的额外区段或 根据感兴趣的表达盒。
2. 本发明的免疫原性多肽
[0044] 在第一个方面,本发明涉及具有包含序列 SEQ ID NO: 1-16 或所述 SEQ ID NO: 1-16 的变体的氨基酸序列的免疫原性多肽,其中每个所述变体的长度至少为 8 氨基酸,条件是除了根据SEQ ID NOs 1-16的任何氨基酸序列或其变体之外,所述氨基酸序列不包含源自HIV基因组的长度为8个或更多个氨基酸的任何序列段 其中。
[0045] 在特定实施方案中,第一方面的免疫原性多肽具有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
[0046]在第二方面,本发明涉及具有氨基酸序列的免疫原性多肽,所述氨基酸序列包含至少一个选自下组的序列:SEQ ID NOs 1-16或其变体或其片段,其中所述片段的长度为 至少 8 个氨基酸,条件是:
i)除了根据SEQ ID NOs 1-16中任一项的氨基酸序列或其变体或片段之外,所述氨基酸序列不包含源自HIV基因组的长度为8个或更多个氨基酸的任何序列段, ii)当免疫原仅包含一个选自 SEQ ID NOs 1-16 的序列时,则该序列不选自 SEQ ID NOs:3、5、6 和 16。
[0047] 优选地,根据第一和第二方面的变体与其相关序列等价并且源自不同的HIV毒株或者是人工HIV序列。 在这方面等同是指一个或多个氨基酸残基不同,但对应于相同的序列(例如,由基因组中的位置或序列相似性确定)。 换句话说,在一个优选的实施方案中,变体是“天然存在的变体”,它指的是从目前或以前传播的病毒的 HIV 基因组中提取的核酸序列,并且可以从现有数据库(例如 GenBank 和 Los Alamos 序列数据库)。 循环病毒的序列也可以通过分子生物学方法来确定。
看 Brown T,“基因克隆”(Chapman & Hall,英国伦敦,1995 年); Watson R 等人,“重组 DNA”,第 2 版。 (美国科学书籍,纽约,纽约,美国,1992 年); Sambrook J 等人,“分子克隆。实验室手册”(冷泉港实验室出版社,冷泉港,美国纽约州,1989 年)。 优选地,任何 SEQ ID NOs 1-16 的变体具有至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、至少 98% 或至少 99% 的氨基酸序列同一性 与其相应的(即 SEQ ID NOs 1-16)。 适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法。
看 Altschul S 等人,Nuc。 酸研究。 1977; 25:3389-3402 和 Altschul S, et al., J. Mol. 生物学。 1990; 215:403-410。 BLAST 和 BLAST 2.0 程序可用于确定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。 用于执行 BLAST 分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
看 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi,2012 年 1 月。
[0048] 变体还可以含有一个或多个修饰的氨基酸残基(例如通过连接取代基修饰的残基),或一个或多个非天然氨基酸如β氨基酸。
[0049] 确定细胞反应程度的方法是本领域已知的。 可以使用任何适用于评估 T 细胞响应 Ag 的刺激的方法。 下面描述的程序提供了一些合适方法的例子:
1) 酶联免疫斑点 (ELISpot):将预培养孔中的非贴壁细胞转移到涂有所需抗细胞因子捕获抗体(Abs;例如抗 IFN、-IL-10、 -IL-2、-IL-4)。 用生物素化二抗和标准比色或荧光检测方法(如链霉亲和素-碱性磷酸酶和 NBT-BCIP)以及计数的斑点进行揭示。 然后将 ELISpot 读数表示为斑点形成细胞 (SFC)/10 6< 输入细胞。 2) 上清液细胞因子测定:培养上清液中释放的细胞因子通过不同的技术测量,例如酶联免疫吸附测定(ELISA),BD细胞计数珠阵列,Biorad Bio-Plex测定等。 3) HLA I 类四聚体:通过此程序,使用市售试剂(例如 MHC I 类 Dexamers、Immudex、Copenhagen、DK)或内部生成的试剂(例如 Novak)检测识别特定肽表位的 Ag 反应性 T 细胞 E, et al., J. Clin. Invest. 1999; 104:R63-R67)。 4) HLA II 类四聚体:通过此程序,可以使用市售试剂(例如 MHC II 类 Ultimers™<、ProImmune Ltd、Oxford、GB)或内部生成的试剂检测识别特定肽表位的 Ag 反应性 T 细胞 (例如诺瓦克,1991 年,
同上 )
. 5) 激活标记物(例如 CD69、CD25、CD137)的上调:通过此过程,通过 Ag 识别后暴露在膜上的激活标记物的差异表达来检测 Ag 特异性 T 细胞反应。 6) 细胞因子捕获测定:该系统是 ELISpot 的有效替代品,可根据细胞因子反应可视化 Ag 特异性 T 细胞(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,DE)。 此外,它还允许直接分选和克隆感兴趣的 T 细胞。 7) CD154 测定:该程序仅限于检测 Ag 特异性 CD4+ T 细胞。
看 Chattopadhyay P, et al., Nat. 医学。 2005年; 11:1113-11117 和 Frentsch M, et al., Nat. 医学。 2005年; 11:1118-1124。 8) CD 107 测定:该程序允许可视化具有细胞毒性潜力的 Ag 特异性 CD8+ T 细胞。
看 Betts M, et al., J. Immunol. 方法 2003; 281:65-78。 9) CFSE 稀释法:该程序根据 Ag 识别后的增殖情况检测 Ag 特异性 T 细胞(CD4+ 和 CD8+)。
看 Mannering S, et al., J. Immunol. 方法 2003; 283:173-183。
[0050] 用于确定变体的体液反应程度的方法是本领域已知的。 可以使用任何适用于评估 T 细胞响应 Ag 的刺激的方法。 合适的方法的例子包括但不限于检测或定量抗体的相对量,该抗体特异性地识别已经用免疫原性多肽或变体治疗的受试者的血清中的抗原性或免疫原性剂相对于该量的相对量 未治疗受试者中的抗体。 抗体滴度可以使用标准测定法确定,例如酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、单一径向免疫扩散测定法 (SRID) 或酶免疫测定法 (ETA)。
[0051] 在优选的实施方案中,SEQ ID NOs 1-16中任一个的变体是所述序列的片段。
[0052] 在特定实施例中,祖先病毒序列被确定为
环境 HIV-1 亚型 B 或 C 的基因,或
插科打诨 B 或 C 亚型的基因。在其他实施方案中,确定其他 HIV 基因或多肽的祖先病毒序列,例如
波尔 或辅助基因或多肽。 在又一个实施例中,病毒序列通过共识或树中心技术确定。
[0053]在一个优选的实施方案中,HIV是M组HIV。 M 组是主要循环的 HIV-1 组。 它被分为亚型,用字母表示,和子亚型,用数字表示。 目前已识别亚型 A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F1、F2、G、H、J 和 K。 HIV-1 亚型,也称为进化枝,是系统发育相关的 HIV-1 毒株,彼此之间的遗传距离大致相同; 在某些情况下,亚型在地理上或流行病学上也有联系。 亚型内的遗传变异可以达到 15% 到 20% 或更多,而亚型之间或同一亚型的不同成员之间的变异通常为 25% 到 35%。 HIV 全基因组测序的进展导致了循环和独特重组形式(分别为 CRF 和 URF)的鉴定。 这些是双重感染者体内亚型之间重组的结果,重组形式随后会从该感染者传给其他人。 如果在没有直接流行病学联系的三个或更多人中鉴定出重组后代,则重组后代被归类为循环重组形式; 否则它们被描述为独特的重组形式。
[0054] 在一个实施方案中,所述免疫原具有包含至少一种选自SEQ ID NOs 1-16或其变体的序列的氨基酸序列,其中所述条件ii)是:当免疫原仅包含一种选自以下序列的序列时: 由 SEQ ID NOs 1-16 组成的组,则该序列不选自由 SEQ ID NOs 1-16 组成的组。
[0055] 在一个优选的实施方案中,所述免疫原包含至少两个、至少三个或至少四个选自由SEQ ID NOs 1-16或其变体组成的组的序列,其中所述条件ii)是:当免疫原仅包含 两个、三个或四个选自 SEQ ID NOs 1-16 的序列,那么并非所有这些序列都选自 SEQ ID NOs:3、5、6 和 16。 在另一个实施方案中,所述 免疫原具有包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个选自以下的序列的氨基酸序列: SEQ ID NOs 1-16或其变体,其中所述条件ii)是:当免疫原仅包含选自SEQ ID NOs的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个序列时 1-16,那么并非所有这些序列都选自 SEQ ID NOs 1-16。
[0056] 在优选的实施方案中,根据第一方面的免疫原包含根据SEQ ID NOs 1-16的序列或其1-16顺序的变体。
[0057] 在一个实施方案中,本发明涉及第一方面的免疫原,其中至少两个序列通过氨基酸接头连接。
[0058] 在另一个实施方案中,本发明涉及第二方面的免疫原,其中,如果所述免疫原包含至少两个选自 SEQ ID NOs 1-16 或其变体的序列,则所述序列由氨基酸邻接 链接器。
[0059] 在第一和第二方面的免疫原的优选实施方案中,接头具有氨基酸序列A、AA或AAA。 在另一个实施方案中,当相对于接头位于 N 端的序列的 C 端残基或位于 C 端的序列的 N 端残基是丙氨酸残基时,可以缩短接头,使得 AAA 序列在相邻序列之间的连接区形成。 因此,在优选的实施方案中,如果相对于接头位于N末端的序列的C末端残基是丙氨酸,或者如果相对于接头位于C末端的序列的N末端残基是丙氨酸, 链接器的序列为 AA。 在另一个实施例中,如果相对于接头位于N端的序列的C端残基和相对于接头位于C端的序列的N端残基均为丙氨酸,则接头作为序列 A。
[0060]在另一个实施方案中,所述免疫原进一步包含在N-末端的分泌信号肽,其中所述信号肽优选地增强免疫原从表达所述免疫原的细胞的分泌。 优选的分泌信号肽衍生自GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子),优选接着是缬氨酸以增加稳定性。 GMCSF信号肽的序列优选为:MWLQSLLLLGTVACISS(SEQ ID NO:46)或MWLQSLLLLGTVACSISV(SEQ ID NO:47)。
[0061] 在另一个实施方案中,所述免疫原还任选地包含肽标签。 肽标签可以位于信号肽和免疫原性多肽之间的N-末端,或者优选地,可以位于终止密码子之前的C-末端。
[0062] 优选地,所述标签是FLAG肽。 FLAG 系统使用一种短的亲水性 8 氨基酸肽,它与感兴趣的重组蛋白融合。 FLAG 肽包括几种高度特异性的 ANTI-FLAG 单克隆抗体(M1、M2、M5;Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)的结合位点,可用于评估目标蛋白在 来自转染细胞的材料。 由于 FLAG 肽标签的尺寸小,它一般不会屏蔽其他表位、结构域,或改变融合蛋白的功能、分泌或转运。 优选地,所述FLAG肽具有序列DYKDDDDKL(SEQ ID NO:48)。
[0063] 在一个优选的实施方案中,所述标签仅用于免疫原的表达分析和纯化,并且在使用它引发免疫反应之前将其去除。
[0064] 在另一个实施方案中,本发明涉及所述免疫原,其中所述氨基酸序列包含至少一个抗逆转录病毒抗性突变位点。
[0065] 突变可以发生在病毒基因组内的任何位点。 优选地,突变发生在编码整合酶、蛋白酶或逆转录酶基因的区域中。
[0066] 整合酶内赋予对整合酶抑制剂的抗性的突变体包括但不限于SEQ ID NO:1内的T66、E92、F121、E138、G140、Y143、S147、Q148、S153、N155、E157和R263及其组合。 在一个优选实施例中,所述突变选自整合酶蛋白中的突变E92Q、G 140S、G 140A和Y143R及其组合。
[0067] 与蛋白酶抑制剂 (PI) 抗性相关的蛋白酶突变体包括主要蛋白酶、辅助蛋白酶和蛋白酶切割位点突变。
看 Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2):67-84。 17个基本非多态性位点最具临床意义,包括L231、L241、D30N、V321、L33F、M461/L、147/V/A、G48V/M、150L/V、F53L、154V/T/A/ L/M、G73S/T、L76V、V82A/T/F/S、184V/A/C、N88D/S、L90M。 附属蛋白酶突变包括多态性突变 L101/V、113V、K20R/M/I、M36I、D60E、I62V、L63P、A71V/T、V77I 和 193L 以及非多态性突变 L10F/R、V111、E34Q、E35G , K43T, K45I, K55R, Q58E, A71I/L, T74P/A/S, V751, N83D, P79A/S, 185V, L89V, T91 S, Q92K 和 C95F。
[0068] 在另一个实施方案中,抗逆转录病毒抗性突变位点位于逆转录酶中,导致对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)或非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)的抗性。 NRTI 耐药突变包括 M184V、胸苷类似物突变 (TAM)、由缺乏胸苷类似物的方案选择的突变 (Non-TAM) 和多核苷耐药突变 (Multi-NRTI 突变) 和许多最近描述的非多态性辅助突变。 总之,M184V、非胸苷类似物相关突变(如 K65R 和 L74V)和多核苷抗性突变 Q151M 通过减少 NRTI 掺入起作用。 胸苷类似物突变、与多核苷抗性相关的 T69 插入以及许多辅助突变有助于引物解锁。
看 谢弗, 20008,
同上。M184V 是最常发生的 NRTI 抗性突变。 最常见的耐药氨基酸突变是 M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F 和 K219QE。 在接受含有 NRTI 骨架(非 TAM)的非胸苷类似物时发生病毒学失败的患者中最常见的突变包括单独的 M184V 或 M184V 与 K65R 或 L74V 的组合。 其他非 TAM 突变包括 K65N、K70E/G、L741、V75T/M、Y115F。 密码子 69 处的氨基酸插入通常发生在存在多个 TAM 的情况下,并且在这种情况下与对 3TC 和 FTC 的中等抗性以及对每个剩余 NRTI 的高水平抗性相关。 Q151 M 是一个 2-bp 突变 (CAG.fwdarw.ATG),通常伴有以下两种或多种突变:A62V、V751、F77L 和 F116Y。 Q151M 复合物引起对 ZDV、d4T、ddI 和 ABC 的高水平抗性,以及对 TDF、3TC 和 FTC 的中等抗性。
看 Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2):67-84
[0069] NNTRI 抗性突变包括但不限于初级 NNRTI 抗性突变(K103N/S、V106A/M、Y181C/I/V、Y188L/C/H 和 G190A/S/E)、NNRTI 抗性次级突变(L1001、 K101P、P225H、F227L、M230L 和 K238T)和速率突变(V179F、F227C 和 L2341)。
[0070] 次要非多态性突变——A98G、K101 E、V 1081 和 V 179D/E 是常见的 NNRTI 耐药突变,可将对奈韦拉平和依非韦伦的敏感性降低约 2 至 5 倍。
[0071] 杂项非核苷逆转录酶抑制剂耐药突变,如 K101Q、1135T/M、V1791 和 L2831,可将对奈韦拉平和依非韦伦的敏感性降低约两倍,并可能与主要 NNRTI 耐药突变协同作用。 其他突变如 L74V、H221Y、K223E/Q、L228H/R 和 N3481 主要由 NRTI 选择,但也会导致 NNRTI 易感性的细微降低。
[0072] 优选地,所述抗逆转录病毒抗性突变位点位于SEQ ID NOs 9-11中的任一个。 更优选地,所述抗逆转录病毒抗性突变位点为SEQ ID NO:9的氨基酸残基8,其中氨基酸Leu被氨基酸Met取代。
[0073] 在另一个实施方案中,变体或片段具有8至40个氨基酸的长度,更优选11至27个氨基酸的长度。 优选地,所述变体或片段不包含与任何SEQ ID NOs 1-16邻接的氨基酸接头。 此外,优选所述变体或片段的C端氨基酸既不是G、P、E、D、Q、N、T、S或C,因为这些残基不形成HLA的C端锚 I 类一般限制性 T 细胞表位。
[0074] 在一个最优选的实施方案中,所述变体或片段选自根据SEQ ID NOs 17-45的肽。
[0075] 此外,设想所述变体或片段与热休克蛋白组合或融合。 本发明还涉及包含所述变体或片段和热休克蛋白的融合蛋白。 优选的热休克蛋白是 Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96 或 Hsp100。
[0076] 在另一个实施方案中,变体或片段是根据第一和第二方面的变体或片段。 优选地,所述变体或片段不包含与任何SEQ ID NOs 1-16邻接的氨基酸接头。 此外,优选所述变体或片段的C端氨基酸既不是G、P、E、D、Q、N、T、S或C,因为这些残基不形成HLA的C端锚 I 类一般限制性 T 细胞表位。
[0077] 在一个最优选的实施方案中,所述变体或片段选自根据SEQ ID NOs 17-45的肽。
[0078] 此外,设想所述变体或片段与热休克蛋白组合或融合。 本发明还涉及包含所述变体或片段和热休克蛋白的融合蛋白。 优选的热休克蛋白是 Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96 或 Hsp100。
3.本发明的核酸、载体、病毒和细胞
[0079]在第三方面,本发明涉及编码第一方面的免疫原的核酸,以及包含所述核酸的表达盒、载体、病毒和细胞。
[0080] 优选地,所述核酸为多核苷酸,指核苷酸单体(核酸)的单链或双链聚合物,包括但不限于核苷酸间磷酸二酯连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA) 债券联系。 本发明的多核苷酸编码本发明的免疫原,基本上不包含HIV基因组的额外区域。
[0081] 在一个实施方案中,所述核酸是密码子优化的。 在一个优选的实施方案中,核酸针对在人类中的表达进行了密码子优化。 根据本发明使用的密码子优化的核酸可以通过用“人源化”密码子替换编码免疫原的核酸的密码子来制备(即密码子是那些在高度表达的人类基因中频繁出现的密码子)。
看 André S 等人,J. Virol。 1998; 72:1497-1503。 在一个优选的实施方案中,所述密码子优化的核酸具有根据 SEQ ID NO: 50 的序列。
[0082] 第三方面的核酸可能需要用限制酶切割以将其连接到载体中。 此过程可能需要去除各种末端核苷酸(例如 1、2 或 3)。 因此,在一个实施方案中,本发明涉及所述核酸,其中它的每一端都用限制酶切割。
[0083] 在另一个实施方案中,本发明涉及包含第三方面的核酸、启动子序列和3'-UTR以及任选的选择标记的表达盒。 优选地,启动子序列是人巨细胞病毒(CMV)启动子或早期-晚期p7.5启动子序列。 优选地,3'-UTR是牛生长激素(BGH) poly-A。 可选的选择标记优选是抗生素抗性基因(例如卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、大观霉素)。
[0084] 在又一个实施方案中,本发明涉及包含第三方面的核酸或表达盒的表达载体。
[0085] 在一个实施例中,该载体是一种表达载体。 因此,根据本发明的合适载体包括原核载体,例如pUC18、pUC19和Bluescript质粒及其衍生物,如mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1和RP4质粒; 噬菌体和穿梭载体,例如 pSA3 和 pAT28 载体; 酵母表达载体,如2微米质粒型载体; 整合质粒; 是的向量; 着丝粒质粒和类似物; 昆虫细胞表达载体,如pAC系列和pVL系列载体; 植物表达载体,如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列及其类似物的载体; 基于病毒载体(例如 MVA、腺病毒、与腺病毒相关的病毒、逆转录病毒和慢病毒)以及非病毒载体,例如 pSilencer 4.1-CMV(Ambion®<,Life Technologies Corp)的高级真核细胞和表达载体 ., Carslbad, CA, US), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL 和 pKSV-10、pBPV-1、pML2d 和 pTDT1 载体。
[0086] 在特定的实施方案中,表达载体是包含哺乳动物启动子和聚腺苷酸化位点的哺乳动物表达载体。 优选地,启动子是人巨细胞病毒(CMV)启动子。 优选地,聚腺苷酸化位点是牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点。 可以修饰哺乳动物表达载体以优化载体在细菌中的复制。 哺乳动物表达载体还可包含选择基因,例如编码赋予抗生素抗性的蛋白质的基因。 在一个特定的实施方案中,哺乳动物表达载体包含卡那霉素抗性基因
[0087] 在其他具体实施方案中,表达载体是病毒载体,优选改良疫苗安卡拉(MVA)病毒载体。
[0088]在另一个实施方案中,本发明涉及包含第三方面的核酸的病毒。 合适的病毒是安全的、低毒性的并且是遗传稳定的。 非限制性实例是逆转录病毒,特别是痘病毒如 MVA、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒 (AAV)。
[0089] 在另一个特别优选的实施方案中,本发明涉及重组修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA),其包含在编码本发明的免疫原性多肽的多核苷酸或基因构建体中。 改良型安卡拉痘苗病毒 (MVA) 与痘苗病毒有关,痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒属的成员。 MVA 是通过对安卡拉痘苗病毒株 (CVA) 的鸡胚成纤维细胞进行 516 次连续传代而产生的。
看 Mayr A, et al., Infection 1975; 3:6-14 和 Sutter G 等人,US 6,440,422 和 CH 568,392。 MVA 病毒是公开可用的(例如 ATCC 登录号 VR-1508)。 MVA 的特点是减毒(例如,在某些哺乳动物细胞中降低的毒力和复制感染性病毒粒子的能力有限),同时保持良好的免疫原性和在鸟类细胞中复制和产生感染性病毒粒子的全部能力。 合适的 MVA 菌株包括由于 i) 生殖复制能力而具有增强安全性的菌株
体外 在鸡胚成纤维细胞 (CEF) 中,但在人细胞系中没有生殖复制能力,如人角质形成细胞系 HaCaT、人胚肾细胞系 293、人骨骨肉瘤细胞系 143B 和人宫颈腺癌 细胞系 HeLa; ii) 无法在无法产生成熟 B 细胞和 T 细胞的小鼠模型中进行复制,因此免疫功能严重受损且对复制病毒高度敏感; iii)与DNA初免/痘苗病毒加强方案相比,在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导至少相同水平的特异性免疫反应。 菌株中合适的减毒MVA菌株称为MVA-BN。
看 卓别林 P,
等人, WO2002042480,ECACC 登录号 V00083008。
[0090] 在另一个实施方案中,本发明涉及包含第三方面的核酸、表达盒、表达载体或病毒的细胞。 要使用的细胞可以是任何细胞类型,包括真核细胞和原核细胞。 优选地,所述细胞包括原核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。 哺乳动物细胞的优选实例是 COS 细胞、HeLa 细胞、HEK 293T 细胞或从患者(例如 HIV 患者)分离的细胞。
4.发明组合物
[0091] 在第四方面,本发明涉及包含根据第一和第二方面的变体或片段以及热休克蛋白的组合物。 可以将免疫原性组合物制备成例如注射剂,例如液体溶液、悬浮液和乳液。 优选的热休克蛋白是 Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96 或 Hsp100。
[0092] 此外,本发明涉及药物组合物,其包含根据本发明的免疫原、核酸、表达盒、载体或细胞或根据第四方面的组合物和药学上可接受的载体。 在一个实施方案中,所述药物组合物和第四方面的组合物可用作疫苗,如下所述。
5.本发明的疫苗
[0093] 另一方面,本发明涉及包含第一和第二方面的免疫原、核酸、表达盒、表达载体、第三方面的病毒或细胞或第四方面的组合物的疫苗。
[0094] 在一个优选的实施方案中,所述疫苗能够产生细胞和体液反应。 更优选地,疫苗产生细胞毒性T细胞反应。 细胞毒性 T 细胞或细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 测定法可用于监测用针对同源和异源 HIV 毒株的病毒序列进行亚基因组免疫后的细胞免疫反应。
看Burke S, et al., J. Inf. 迪斯。 1994; 170:1110-1119 和 Tigges M, et al., J. Immunol, 1996; 156:3901-3910。 用于检测 T 细胞反应的常规测定包括,例如,增殖测定、淋巴因子分泌测定、直接细胞毒性测定和有限稀释测定。 例如,可以测定已与肽一起孵育的抗原呈递细胞在应答细胞群中诱导 CTL 应答的能力。 抗原呈递细胞可以是外周血单核细胞(PBMC)或树突细胞(DC)等细胞。 或者,在加载 MHC I 类分子和内部加工的肽的能力方面存在缺陷并且已用适当的人 MHC I 类基因转染的突变非人哺乳动物细胞系可用于测试肽的能力 兴趣诱导
体外 初级 CTL 反应。 PBMC 可用作 CTL 前体的应答细胞来源。 将适当的抗原呈递细胞与肽一起孵育,然后在优化的培养条件下将载有蛋白质的抗原呈递细胞与应答细胞群一起孵育。 阳性 CTL 激活可以通过分析培养物中是否存在杀死放射性标记靶细胞的 CTL 来确定,CTL 既包括特定的肽脉冲靶细胞,也包括表达内源加工形式的抗原(肽序列来源于该抗原)的靶细胞。 例如,可以用 51 Cr 对靶细胞进行放射性标记,并且可以根据靶细胞释放的放射性计算细胞毒活性。 另一种合适的方法允许通过用荧光素标记的 HLA 四聚体复合物染色来直接量化抗原特异性 T 细胞。
看 奥特曼 J 等人,Proc。 国家队。 学院。 科学。 美国 1993; 90:10330-10334 和 Altman J, et al., Science 1996; 274:94-96。 其他相对较新的技术发展包括细胞内淋巴因子染色和干扰素释放测定或 ELISpot 测定。
[0095] 在一个实施方案中,第四方面的疫苗还包含一种或多种佐剂或热休克蛋白。
[0096] 佐剂定义如上。 优选的热休克蛋白是 Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、gp96 或 Hsp100。
六、治疗方法
[0097] 在一个优选的实施方案中,根据本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞或根据 本发明可用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。
[0098] 因此,另一方面,本发明涉及根据本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞 或根据本发明的疫苗用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病。
[0099] 另一方面,本发明涉及本发明的免疫原性多肽、本发明的核酸、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞的用途。 发明或根据本发明的疫苗用于制造预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病的药物。
[0100] 在另一方面,本发明涉及一种用于预防或治疗有此需要的受试者的 HIV 感染或 HIV 相关疾病的方法,包括向所述受试者施用根据本发明的免疫原性多肽、核酸 本发明的成分、本发明的表达盒、本发明的表达载体、本发明的病毒、本发明的细胞或本发明的疫苗用于制备预防或治疗HIV的药物 感染或与 HIV 感染相关的疾病。
[0101]在一个具体实施方案中,根据本发明使用的免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗包括顺序施用:
i)权利要求1-11任一项的第一免疫原性肽、权利要求12-14任一项的核酸、权利要求15的表达盒、权利要求16的表达载体、权利要求17-18任一项的病毒、权利要求19的细胞,或 权利要求20的疫苗和ii)权利要求1-11任一项的第二免疫原性肽、权利要求12-14任一项的核酸、权利要求15的表达盒、权利要求16的表达载体、权利要求17-18任一项的病毒, 权利要求19的细胞或权利要求20的疫苗。
[0102] 在一个具体实施方案中,第一免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗不同于第二免疫原性肽、核酸、表达盒、表达载体、病毒、细胞或疫苗。 优选地,首先施用根据本发明的表达载体,然后施用根据本发明的修饰的安卡拉痘苗病毒。
[0103] 在一个具体实施方案中,根据本发明的第一表达载体施用至少两次,优选至少三次。
[0104] 疫苗对 HIV 感染或 AIDS 症状的有益预防或治疗作用包括,例如,预防或延缓暴露于 HIV 的个体的初始感染; 减少感染 HIV 的个体的病毒负荷; 延长 HIV 感染的无症状期; 通过抗逆转录病毒疗法 (ART) 降低病毒水平的 HIV 感染患者维持低病毒载量; 增加 CD4 T 细胞的水平或减少 CD4 T 细胞的减少,包括 HIV-1 特异性和非特异性,在未接受药物治疗的患者和接受 ART 治疗的患者中,增加 HIV 特异性 CTL 的广度、强度、亲和力和功能, 提高艾滋病患者的整体健康或生活质量; 延长艾滋病患者的预期寿命。 临床医生可以将免疫接种的效果与患者治疗前的状况进行比较,或与未接受治疗的患者的预期状况进行比较,以确定该治疗是否能有效抑制 AIDS。
[0105] 优选地,所述疾病是AIDS、ARC或HIV机会性疾病。 HIV 机会性疾病的非限制性实例是伯基特淋巴瘤、支气管、气管、肺或食道念珠菌病、宫颈癌、球孢子菌病(播散性或肺外)、隐球菌病(肺外)、隐孢子虫病(在肠道内持续 超过 1 个月)、巨细胞病毒感染(肝脏、脾脏或淋巴结外)、巨细胞病毒性视网膜炎(伴有视力丧失)、HIV 脑病、持续超过 1 个月的单纯疱疹病变、支气管、肺部的单纯疱疹, 或食道、组织胞浆菌病(播散性或肺外)、免疫母细胞淋巴瘤、浸润性宫颈癌(癌症)、持续超过一个月的肠道等孢子虫病、卡波西肉瘤、淋巴瘤(原发于脑),
鸟分枝杆菌 复杂(播散或肺外),
堪萨斯分枝杆菌 (播散或肺外),
结核分枝杆菌 (播散或肺外),
卡氏肺孢子虫 肺炎、肺炎(在 12 个月内复发)、进行性多灶性脑白质病 (PML)、沙门氏菌败血症(复发)、弓形虫病(在大脑中)、消耗综合症以及由 HIV 免疫系统受损引起的感染引起的任何其他疾病 ——被感染的病人。
[0106] 本发明的疫苗可用于治疗HIV-1感染。 虽然所有可能感染 HIV-1 或其等同物的动物(例如黑猩猩、猕猴、狒狒或人类)都可以这种方式进行治疗,但本发明的免疫原性组合物特别针对它们在人类中的治疗用途。 通常,可能需要多次给药才能达到预期的治疗效果; 可以通过标准临床程序确定确切的方案(剂量和频率)。
[0107]本发明进一步涉及预防或减轻与HIV感染有关的症状。 这些包括与 HIV 感染的轻微症状阶段相关的症状,包括例如带状疱疹、皮疹和指甲感染、口腔溃疡、复发性鼻子和喉咙感染以及体重减轻。 此外,与 HIV 感染的主要症状阶段相关的其他症状包括,例如,口腔和阴道鹅口疮(念珠菌病)、持续性腹泻、体重减轻、持续性咳嗽和复发性结核病或复发性疱疹感染,例如唇疱疹(单纯疱疹) ). 可以根据本发明治疗的全面性 AIDS 的其他症状包括,例如,腹泻、恶心和呕吐、鹅口疮和口腔溃疡、持续性复发性阴道感染和宫颈癌、持续性全身性淋巴结肿大 (PGL)、严重 皮肤感染、疣和癣、呼吸道感染、肺炎,尤其是
卡氏肺孢子虫 肺炎 (PCP)、带状疱疹(或带状疱疹)、神经系统问题(例如手脚疼痛、麻木或“针刺感”)、神经系统异常、卡波氏肉瘤、淋巴瘤、肺结核或其他类似的机会性感染。
[0108] 本发明的有益效果包括,例如,预防或延迟暴露于 HIV 的个体的初始感染,减少感染 HIV 的个体的病毒负荷,延长 HIV 感染的无症状阶段,维持 HIV 感染患者的低病毒载量。 通过抗逆转录病毒疗法 (ART) 降低了水平,增加了 CD4 T 细胞的水平或减少了 CD4 T 细胞的减少,包括 HIV-1 特异性和非特异性,在未接受药物治疗的患者和接受 ART 治疗的患者中,增加了广度 HIV 特异性 CTL 的强度、亲和力和功能,提高 AIDS 患者的整体健康或生活质量,并延长 AIDS 患者的预期寿命。 临床医生可以将免疫接种的效果与治疗前患者的状况进行比较,或与未接受治疗的患者的预期状况进行比较,或者在用疫苗治疗和未治疗的个体的临床试验中进行比较,以确定治疗是否有效抑制 AIDS。
[0109] 可以设计免疫原性组合物以将核酸或表达载体引入所需的作用位点并以适当和可控的速率释放它。 制备控释制剂的方法是本领域已知的。 例如,可以通过使用聚合物复合或吸收免疫原或免疫原性组合物来生产控释制剂。 可以使用已知可提供所需控释特性或释放曲线的适当大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)来制备控释制剂。 通过控释制剂控制作用持续时间的另一种可能方法是将活性成分掺入聚合材料颗粒中(例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乳酸、聚乙醇酸、这些酸的共聚物或乙烯醋酸乙烯酯 共聚物)。 或者,不是将这些活性成分掺入聚合物颗粒中,而是可以将这些材料包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊, 分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒、纳米胶囊)或粗乳液中。
看 载于 Voller A, et al., Eds., “New Trends and Developments in Vaccines (University Park Press, Baltimore, MD, US, 1978) and Gennaro A, Ed., “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 第 18 版. (Mack Publishing) Co.,美国宾夕法尼亚州伊斯顿,1990 年)。
[0110]本领域技术人员可以容易地确定本发明的免疫原性组合物中本发明的核酸和表达载体(统称为免疫原)的合适剂量。 例如,免疫原的剂量可以根据给药途径和受试者的大小而变化。 合适的剂量可由本领域技术人员确定,例如通过使用常规免疫学技术测量受试者如实验室动物的免疫反应,并适当调整剂量。 此类用于测量受试者免疫反应的技术包括但不限于铬释放测定、四聚体结合测定、IFN ELISPOT测定、IL-2 ELISPOT测定、细胞内细胞因子测定和其他免疫学检测测定。
看 Harlow E, Lane D,“抗体:实验室手册”(冷泉港实验室出版社,冷泉港,美国纽约州,1988 年)。
[0111] 可以使用任何合适的递送方法施用免疫原性组合物,包括但不限于肌肉内、静脉内、皮内、经皮、鼻内、粘膜(例如直肠内、阴道内、口服)和局部递送。 这样的技术在本领域中是众所周知的。 递送方法的更具体实例是肌内注射、皮内注射和皮下注射。 然而,递送不必限于注射方法。 此外,通过阳离子脂质体将裸露的DNA直接注射到动物肌肉组织中或使用“基因枪”或电穿孔技术皮内注射DNA,已经实现了将DNA递送到动物组织。
看 Watanabe M 等人,Mol。 复制。 开发。 1994; 38:268-274, Charnock-Jones D, et al., WO1996020013, Robinson H, et al., Vaccine 1993:11:957-960, Hoffman S, et al., Vaccine 1994 ; 12(16):1529-1533; Xiang Z, et al., 病毒学 1994; 199:132-140, Webster R, et al., Vaccine 1994; 12:1495-1498, Davis H, et al., Vaccine 1994; 12:1503-1509,戴维斯 H 等人,嗡嗡声。 摩尔。 创1993; 2:1847-1851,和 Johnston S, et al., Meth。 细胞生物学。 1994; 43:353-365。 递送也可以通过粘膜表面例如肛门、阴道或口腔粘膜完成。
7.发明套件
[0112] 另一方面,本发明涉及一种试剂盒,其包含第一方面的免疫原、第二方面的肽或其变体、第四方面的核酸、表达盒、表达载体、病毒或细胞, 或第四方面的疫苗。 这些试剂盒提供了进行本发明所述应用所必需的材料。 该套件也可以是贴片的形式。
[0113] 此外,试剂盒可以包括包装,其允许将试剂保持在确定的限度内。 用于制备此类包装的合适材料包括玻璃、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶子、小瓶、纸或小袋。 本发明的试剂盒可以另外包含使用其中包含的组分的说明,特别是那些构成本发明的止血贴片的组分。 所述说明可以以印刷材料的形式或以可以存储说明使得它们可以被受试者阅读的电子载体的形式找到,例如电子存储介质(例如磁盘、磁带)或光学介质( 例如 CD-ROM、DVD)。 媒体可以附加地或可选地包含提供所述说明的互联网网站。
一般程序
1. T细胞免疫原设计
[0114] 遵循以下方法来设计本发明的HIV OLP。
[0115] 使用共有进化枝 B 肽集对 232 名 HIV 感染的未治疗个体进行实验(干扰素 γ ELISpot)筛选,揭示了病毒蛋白质组的区域,这些区域主要由具有出色 HIV 控制的受试者作为目标。
看Frahm N, et al., J. Virol. 2004; 78:2187-2200; Mothe B, et al., J. Transl. 医学。 2011; 9(1):208。 整个测试肽集由跨越整个病毒蛋白质组的 410 个 18mer 重叠肽组成。 其中,确定了 26 个 OLP,其中 OLP 应答者组与 OLP 无应答者组(即在干扰素中对这些 OLP 没有反应的个体)相比,病毒载量显着降低(p < 0.05,多重比较未校正) 伽玛 ELISpot 测定)。 这些有益的 OLP 具有保护率(PR >1)并且位于 HIV Gag 蛋白(n=10)、Pol(n=12)和 Vif(n=3)和 Nef(n=1)蛋白中 病毒的。 在 26 个 OLP 中,有 15 个部分重叠。
看 表格1。
表格1 | OLP编号 | 蛋白质 | 蛋白质亚单位 | OLP 进化枝 B 共有序列 | OLP 应答者的中位病毒载量 | OLP 无反应者的中位病毒载量 | 保护率 (PR) ∗< | p值 |
| 3 | 插科打诨 | p17 | EKIRLRPGGKKKYKLKHI | 22947 | 39014 | 1.053 | 0.037 |
| 6 | 插科打诨 | p17 | ASRELERFAVNPGLL | 15380 | 43189 | 1.107 | 0.001 |
| 7 | 插科打诨 | p17 | ERFAVNPGLLETSEGCR | 25939 | 38974 | 1.040 | 0.049 |
| 10 | 插科打诨 | p17 | QLQPSLQTGSEELRSLY | 16285 | 37237 | 1.085 | 0.031 |
| 12 | 插科打诨 | p17 | SLYNTVATLYCVHQRIEV 回复 | 23855 | 37113 | 1.044 | 0.037 |
| 23 | 插科打诨 | p24 | AFSPVIPMFSALSEGA | 22947 | 37113 | 1.048 | 0.036 |
| 31 | 插科打诨 | p24 | IAPGQMREPRGSDIA | 3563 | 35483 | 1.281 | 0.028 |
| 34 | 插科打诨 | p24 | STLQEQIGWMTNNPPIPV | 6127 | 37360 | 1.207 | 0.002 |
| 48 | 插科打诨 | p24 | ACQGVGGPGHKARVLAEA | 12975 | 35755 | 1.107 | 0.041 |
| 60 | 插科打诨 | p15 | GKIWPSHKGRPGNFLQSR | 16266 | 36434 | 1.083 | 0.044 |
| 75 | 内夫 | | WLEAQEEEEVGFPVRPQV | 13407 | 37360 | 1,108 | 0.026 |
| 76 | 内夫 | | EVGFPVRPQVPLRPPMTYK | 59618 | 29855 | 0.937 | 0.001 |
| 84 | 内夫 | | NYTPGPGIRYPLTFGWCF | 55402 | 30538 | 0.945 | 0.006 |
| 85 | 内夫 | | RYPLTFGWCFKLVPV | 69890 | 29903 | 0.924 | 0.002 |
| 90 | 内夫 | - | SLHGMDDPEKEVLVWKF | 89687 | 32650 | 0.911 | 0.042 |
| 159 | 波尔 | 蛋白酶 | KMIGGIGGFIKVRQYDQI | 14736 | 36434 | 1.094 | 0.020 |
| 160 | 波尔 | 蛋白酶 | FIKVRQYDQILIEICGHK | 3682 | 35755 | 1.277 | 0.031 |
| 161 | 波尔 | 蛋白酶 | QILIEICGHKAIGTVL V | 9117 | 35483 | 1.149 | 0.050 |
| 163 | 波尔 | 蛋白酶 | LVGPTPVNIIGRNLLTQI | 25965 | 45637 | 1.055 | 0.007 |
| 171 | 波尔 | 转播 | LVEICTEMEKEGKISKI公司 | 1865 | 35483 | 1.391 | 0.014 |
| 181 | 波尔 | 转播 | LDVGDAYFSVPLDKDFRK | 65858 | 32871 | 0.937 | 0.041 |
| 195 | 波尔 | 转播 | LRWGFTTPDKKHQKEPPF | 5624 | 37113 | 1.219 | 0.006 |
| 196 | 波尔 | 转播 | DKKHQKEPPFLWMGYELH | 10103 | 35483 | 1.136 | 0.044 |
| 210 | 波尔 | 转播 | EIQKQGQGQWTYQIY | 18155 | 35483 | 1.068 | 0.045 |
| 222 | 波尔 | 转播 | PPLVKL WYQLEKEPIVGA | 412599 | 34640 | 0.808 | 0.030 |
| 230 | 波尔 | 转播 | IHLALQDSGLEVNIV | 85102 | 34117 | 0.919 | 0.030 |
| 237 | 波尔 | 转播 | VYLAWVPAHKGIGGNEQV | 85102 | 34117 | 0.919 | 0.029 |
| 240 | 波尔 | 转播 | SAGIRKVLFLDGIDKA公司 | 116902 | 32761 | 0.891 | 0.019 |
| 269 | 波尔 | 整合酶 | TKELQKQITKIQNFRVYY | 6629 | 35755 | 1.192 | 0.030 |
| 270 | 波尔 | 整合酶 | TKIQNFRVYYRDSRDPLW | 18171 | 37360 | 1.073 | 0.019 |
| 271 | 波尔 | 整合酶 | YYRDSRDPLWKGPAKLLW | 25939 | 35755 | 1.032 | 0.043 |
| 276 | 波尔 | 整合酶 | KIIRDYGKQMAGDDCVA | 6629 | 35755 | 1.192 | 0.021 |
| 279 | 压差 | - | GPQREPYNEWTLELLEEL 回复 | 60222 | 32650 | 0.944 | 0.042 |
| 307 | 环境 | GP120 | DLNNNTNTTSSSGEKMEK | 179419 | 34117 | 0.863 | 0.044 |
| 311 | 环境 | GP120 | IRDKVQKEYALFYKLDVV | 179419 | 32871 | 0.860 | 0.008 |
| 314 | 环境 | GP120 | YRLISCNTSVITQACPKV | 58206 | 31273 | 0.943 | 0.008 |
| 315 | 环境 | GP120 | SVITQACPKVSFEPIPIH | 61011 | 32871 | 0.944 | 0.034 |
| 320 | 环境 | GP120 | TNVSTVQCTHGIRPVV | 341587 | 34640 | 0.820 | 0.034 |
| 355 | 环境 | GP120 | VAPTKAKRRVVQREKRAV | 161602 | 34117 | 0.870 | 0.042 |
| 399 | 环境 | GP41 | VIEVVQRACRAILHIPRR | 388089 | 34640 | 0.812 | 0.026 |
| 405 | 维夫 | - | VKHHMYISGKAKGWFYRH | 16458 | 37237 | 1.084 | 0.021 |
| 406 | 维夫 | - | GKAKGWFYRHYESTPR | 16458 | 37237 | 1.084 | 0.022 |
| 424 | 维夫 | - | TKLTEDRWNKPQKTKGHR | 10319 | 36434 | 1.137 | 0.014 |
| ∗< 粗体 PR 值表示 PR > 1,即 OLP 反应在病毒载量减少的个体中更常见。 |
[0116] 为了构建连续的免疫原序列,将 26 个 OLP 对齐并组装成总共 16 个片段,长度范围为 11-78 个氨基酸。 这些片段的精确起始和结束位置基于分析已识别的 26 个 OLP 的上游和下游残留物,并基于应用于不同侧翼位点的许多考虑因素。 这些考虑包括:
1) OLP 免疫原性数据 2) 保守区域反应性数据 3) 用于包含/排除好的或坏的已知表位的扩展或切割片段 4) CD4 表位覆盖率 5) HLA 覆盖率 6) 序列变异性(2010 共识和 HBX2 定义的表位)7) 多变量 OLP 分析 8) 创建新表位/自身表位 9) 维持自然序列,但不包括有益的 OLP 10) 引入变化以避免表位识别和 11) 避免禁用残基(G、P、E、D、Q、N ,T,S 或 C)
[0117] 该方案导致设计 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:16 作为潜在的免疫原。
2.载体
[0118] 序列 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 16 与区段之间的单、双或三丙氨酸氨基酸连接,以确保最佳加工并避免过早的表位消化。
[0119] 然后,连接的片段被用作 HIV T 细胞免疫原序列以包含在 DNA 和 MVA 载体中。 为了仅使用可溶性肽或与热休克蛋白结合来递送免疫原,设计了跨越 16 个片段的较短重叠肽(中位长度为 23 个残基),不包括三重 AAA 接头。 这些 OLP 的生成方式有助于避免 C 末端的禁用残基(对于 HLA I 类分子的最佳表位呈递很重要。
看 SEQ ID NO:17 至 SEQ ID NO:45,2012 年 1 月)。 这些重叠肽的长度范围为 11-27 个氨基酸。
3. T细胞免疫原
[0120] T 细胞免疫原被设计为一种多肽,由 HIV-1 基因组的 16 个不同大小(11 至 78 个氨基酸)的片段组装而成,由三重丙氨酸接头统一。 地区说明包括:
| T细胞免疫原片段 | 长度 | HIV-1蛋白 | 位置 (HXB2) | 序列号: |
| 段 1 | 78 | p17 | 17-94 | 1 |
| 段 2 | 14 | p24 | 30-43 | 2 |
| 第 3 段 | 11 | p24 | 61-71 | 3 |
| 第 4 段 | 60 | p24 | 91-150 | 4 |
| 5段 | 14 | p24 | 164-177 | 5 |
| 6段 | 15 | p24 | 217-231 | 6 |
| 七段 | 27 | p2p7plp6 | 63-89 | 7 |
| 8段 | 55 | 蛋白酶 | 45-99 | 8 |
| 九段 | 17 | 转播 | 34-50 | 9 |
| 10 段 | 55 | 转播 | 210-264 | 10 |
| 11 段 | 34 | 转播 | 309-342 | 11 |
| 12 段 | 34 | 整合酶 | 210-243 | 12 |
| 13 段 | 17 | 整合酶 | 266-282 | 13 |
| 14段 | 23 | 维夫 | 25-50 | 14 |
| 15 段 | 19 | 维夫 | 166-184 | 15 |
| 16段 | 13 | 内夫 | 56-68 | 16 |
| 总长度:529(包括 A、AA 或 AAA 接头) |
4. 包含前导序列
[0121]信号肽通常是蛋白质的高度疏水性氨基酸序列(长 15 到 60 个氨基酸),必须穿过细胞膜才能到达其功能性细胞位置。 通过与信号识别颗粒结合,这些序列将新生的蛋白质-核糖体复合物引导至翻译过程中蛋白质插入的膜。 信号肽通过各种膜(例如内质网、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体)指导蛋白质的翻译吸收。 非膜蛋白上的前导信号序列最终会被特定的肽酶去除。
[0122] 使用的一些信号肽包括 MCP-3 趋化因子,用于促进抗原呈递细胞的分泌和吸引; 用于增加蛋白酶体降解的连环蛋白 (CATE) 衍生肽; 和溶酶体相关蛋白 LAMP1,用于靶向 MHC II 区室。
看 Rosati M, et al., Proc. 国家队。 学院。 科学。 美国 2009; 106:15831-15836。
[0123] 在本设计中,来自 GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的信号肽被引入免疫原的氨基末端以增强免疫原从表达细胞中的分泌,随后是缬氨酸以增加稳定性。 GMCSF信号肽序列为:
MWLQSLLLLGTVACIS(序列号:46)
5. 包含用于体外表达实验的标签
[0124] 为了评估转染细胞中的表达,免疫原序列首先包括 C 末端区域上的 FLAG 肽,在终止密码子之前,是:DYKDDDDKL(SEQ ID NO:48)
[0125] FLAG 系统使用一种短的亲水性 8 氨基酸肽,它与感兴趣的重组蛋白融合。 FLAG 肽包括几种高度特异性的 ANTI-FLAG 单克隆抗体(M1、M2、M5;Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)的结合位点,可用于评估目标蛋白在 来自转染细胞的材料。
[0126] 由于 FLAG 肽标签的尺寸小,它一般不会屏蔽其他表位、结构域,或改变融合蛋白的功能、分泌或转运。 该序列随后被去除用于小鼠免疫原性测定。 免疫前从最终免疫原 (298H) 中去除 FLAG 标签。
6. T细胞免疫原说明
[0127] T细胞免疫原具有以下序列(SEQ ID NO:49):
![]()
其中,GMCSF 信号肽下划线显示,信号序列后的缬氨酸突出显示,单、双或三 A (AAA) 接头以粗体显示,FLAG 表位(在体内研究的最终构建体中删除) ) 以斜体显示,不同的段显示在括号中,如下所示:
![]()
7.核苷酸序列密码子优化
[0128] T 细胞免疫原序列被翻译成 RNA/密码子优化的核苷酸序列以增强表达和分泌(Mr. Gene GmbH, Regensburg, DE)。 密码子优化基于引入多个核苷酸变化,以破坏先前确定的 mRNA 中的 RNA 加工、抑制和不稳定序列,而不影响编码的蛋白质。
看 Schwartz S, et al., J. Virol. 1992年; 66(12):7176-7182。 该过程还可以包括通过适当的密码子变化从编码序列中消除预测的剪接位点(分数 > 0.4),以最大限度地减少剪接的可能性。
[0129] 作为上述核苷酸变化的结果,T 细胞免疫原的最终 GC 含量为 63%。 免疫原的完整密码子优化核苷酸序列是(SEQ ID NO:50):
![]()
![]()
其中编码GMCSF信号肽的序列加下划线,编码信号序列下游的缬氨酸密码子加亮显示,编码免疫原性多肽的序列以标准字母显示,编码Flag标签的序列以斜体显示,并且 tga 和 taa 终止密码子以小写形式显示。
8. 克隆策略
[0130]密码子优化的 T 细胞免疫原被克隆到哺乳动物表达质粒 BV5 中,该质粒由经过优化的经过修饰的 CMV 基本质粒骨架组成,适合在含有人巨细胞病毒 (CMV) 启动子、牛生长激素 (BGH) 聚腺苷酸化位点和细菌中生长的细菌中生长 卡那霉素抗性基因——缺少 Xho 位点。 克隆步骤如下:
1) 在第一步中,从 Leu 到 Meth 的氨基酸变化被引入到合成的 T 细胞免疫原中——一个包括 RT 41 位置(第 9 段)的 FLAG 表位,以覆盖主要的抗逆转录病毒耐药性突变位点之一。 将 T 细胞免疫原基因(起始载体)克隆到带有 spectomicin 抗性的质粒中。 将 PCR 生成的覆盖 RT M41 变化的片段作为 SpeI/HindIII 插入到 T 细胞免疫原中。 感受态细胞 DH108B 用于转化并在 LB-spectomicin 培养基上生长。 所得质粒命名为 HIVACAT RT M41。 使用覆盖区段9序列的有义和反义引物通过PCR测序确认点突变的插入。 2) 在第二步中,通过连接载体和凝胶纯化的消化的 HIVACAT RT M41 片段,将 HIVACAT RT M41 基因插入 BV5 质粒中,该质粒在卡那霉素抗性基因中缺少 Xho 位点,如 SalI/EcoRI。 感受态细胞 DH108B 用于转化并在 LB-Kan 培养基中生长。 生成的质粒名称为 297H (GMCSF-HIVACAT-FLAG)。 通过限制性消化和使用正义(来自 CMV 启动子)和反义引物(来自 polyA BGH 区域)的 PCR 测序确认基因的插入。 3) 在第三步中,通过 BstEII-EcoRI 消化并插入退火引物 298H Plus 和 298H Minus:298HPlus,从 297H 质粒中去除 FLAG 标签的表位
![]()
298H 负号
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[0131] 所得质粒命名为 298H GMCSF-HIVACAT,登录号 DSM 25555)。
看 图。1 . 使用反义引物(来自 polyA BGH 区域)通过 PCR 测序确认 FLAG 标签的去除。
示例 1
体外表达研究
[0132] 进行了几次瞬时转染以评估 HIVACAT T 细胞免疫原的表达、定位和稳定性。
[0133] 简言之,将完全DMEM加10%胎牛血清(FBS)中的1×10 6 人293细胞接种到60mm组织培养皿上并使其粘附过夜。 HEK 293 细胞通过 CaPhosphate DNA 共沉淀转染,共沉淀 7 µg DNA(100 ng 或 250 ng 297H GMCSF-HIVACAT-FLAG 质粒 DNA,50 ng 表达 GFP 的质粒 pFRED143,加上 7 µg Bluescript DNA)。
[0134] 转染后 6 小时,将培养基替换为补充有 2% FCS 的 3 ml DMEM。 24 和 48 小时后,将细胞和上清液收集在 0.5X RIPA 中。
[0135] 通过蛋白质免疫印迹分析蛋白质表达。 加载细胞提取物和上清液总量的 1/250。 通过在 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Nu-Page Bis-Tris、NuPAGE、Invitrogen、Life Technologies Corp.、Carlsbad、CA、US)上电泳分离蛋白质,并转移到硝酸纤维素膜上。
[0136] 在用辣根过氧化物酶缀合的抗 FLAG 单克隆抗体(Sigma-Aldrich Corp.,Saint Louis,MO,US)以 1:3.000 的稀释度探测膜后,检测到 297H 质粒。
[0137] 使用 ECL 使条带可视化。 膜在 ChemiDoc XRS + 上成像。
[0138] 使用阳性对照,包括编码进化枝 B p55 Gag 的质粒 DNA,它也带有 FLAG 标签。
[0139] 使用 298H 质粒(编码没有 FLAG 标签的 HIVACAT T 细胞免疫原编码)瞬时转染的细胞提取物用来自 HIV-1 感染受试者的人血清以 1:3.000 稀释,然后用辣根过氧化物酶缀合的人抗 -IgG,稀释度 1:10.000。
[0140] 297H 和 298H 质粒稳定(在 24 小时和 48 小时的估计量相同)表达 HIVACAT T 细胞免疫原构建体,其在细胞提取物隔室中可见。 没有构建体分泌的证据。
示例 2
小鼠的细胞反应
[0141] 1ml (2mg/ml) 298H GMCSF-HIVACAT DNA 的原液是在 endofree 中生产的,用于
体内 小鼠研究。
[0142] 在 6-8 周大的雌性 C57BL/6 小鼠(Charles River Labs, Inc., Frederick, MD, US)中评估了 HIVACAT T 细胞免疫原的免疫原性。
[0143] 使用 Inovio 系统(Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA, US)通过电穿孔将 20 µg 和 5 µg DNA 输送到左右股四头肌(每剂量 20 µg/50 µl,每个位点 25 µl) 第 0 周和第 4 周。在最后一次免疫后 2 周处死小鼠。 收获小鼠脾细胞和血清用于免疫原性研究。 使用的对照 DNA 是:
1) 114H p55 gag clade B:表达全gag蛋白; 2) 132H NTV:表达nef、tat、vif的嵌合蛋白; 3) 133H pol:表示全pol蛋白; 和 4) BV4 CMV-kan-Basic:SHAM 对照,相似的 DNA 质粒骨架,没有任何表达的转基因。
[0144] 实验中使用了 35 只小鼠,每组混合 5 只小鼠。 每组免疫分布如下:
| 团体 | 接种数 | 送货 | 剂量 | DNA/位点(股四头肌) | n |
| 1 | 114 p55 堵嘴进化枝 B | I.M.伊诺维奥 | 20µg | 25mL/站点 | 5 |
| 2 | 114 p55 gag clade B + 132H NTV + 133 pol | I.M.伊诺维奥 | 每个 20µg | 25mL/站点 | 5 |
| 3 | 298H GMCSF-HIVACAT | I.M.伊诺维奥 | 20µg | 25mL/站点 | 5 |
| 4 | 114 p55 堵嘴进化枝 B | I.M.伊诺维奥 | 5µg | 25mL/站点 | 5 |
| 5 | 114 p55 gag clade B + 132H NTV + 133 pol | I.M.伊诺维奥 | 每个 5µg | 25mL/站点 | 5 |
| 6 | 298H GMCSF-HIVACAT | I.M.伊诺维奥 | 5µg | 25mL/站点 | 5 |
| 7(假) | BV4 CMVKan-基本 | I.M.伊诺维奥 | 20µg | 25mL/站点 | 5 |
[0145] 第一步使用细胞内细胞因子染色 (ICS) 对合并的脾细胞(来自属于该组的 5 只小鼠的细胞)和使用覆盖所有 gag、pol、nef、tat 和 vif 蛋白的重叠肽库表征细胞免疫反应。
[0146] 简而言之,在存在肽库(15 聚体,由 11aa 覆盖进化枝重叠)的情况下,以 2×10 6 < 细胞/ml 的密度,在 1 ml 共培养物中孵育来自每组小鼠的合并的分离的小鼠脾细胞过夜 B gag, consensus B pol and NL43 nef, tat and vif sequences, 1 µg/ml each peptide, total about 12 hours, 1 hour with Golgi stop to prevent cytokine secretion). 使用 CD3-别藻蓝蛋白-Cy7、CD4-PerCP、CD8-太平洋蓝(BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, US)进行表面免疫染色。 渗透后使用干扰素 γ-FITC 抗体(BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, US)进行细胞内细胞因子染色。
[0147] 从第一次免疫原性分析来看,C57BL/6 小鼠中的 20 µg 和 5 µg DNA 确实产生了可检测的干扰素伽马 -+ 对完全 gag、pol 和 nef-tat-vif 肽库的反应。
看 图 2a . 显示了 CD4+ 和 CD8+ 反应的分布。
看 图 2b .
[0148] 在个体小鼠水平上,使用用 8 个肽库刺激的冷冻脾细胞对反应进行去卷积,以覆盖干扰素伽玛 ELISpot 测定中免疫原中包含的蛋白质亚基。
[0149] ELISpot 测定通过使用小鼠干扰素 γ ELISpot 试剂盒 (ALP)(Mabtech AB,斯德哥尔摩,SE)按照制造商的说明进行微小修改。 对于所有测定,在 96 孔聚偏乙烯板(Millipore Corp., Bedford, MA, US) 单独使用或与 HIV-1 特异性肽库(每种肽的最终浓度为 14µg/ml)一起在 37°C 5% CO 2 中处理 16 小时。 根据 2001 年共识-B 序列,将八个肽库(每个包含 2 到 12 个 18 个氨基酸的肽)汇集到不同的蛋白质亚基(gag-p17、gag-p24、gag-p2p7plp6、pol-RT、pol- 蛋白酶、聚合酶整合酶、vif 和 nef)跨越 HIVACAT T 细胞免疫原中包含的片段。
看 http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus.html,2012 年 1 月。用表达完整 gag、pol、nef、tat 和 vif 的 DNA 免疫小鼠的 HIV 肽库 蛋白质,由 18-mers 肽组成,重叠 11 个残基,跨越完整的 gag(6 个池,11 个肽/每个),pol(8 个池,16 或 17 个肽/每个),nef(2 个池,13 o 14 个肽 /每个)、tat(1 个池、12 个肽)和 vif(2 个池、12 个肽/每个)蛋白质。
[0150]Concavalin A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US),5 mg/ml,用作阳性对照。 板用一步 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/Nitroblue Tetrazolium (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, US) 显影。 使用自动 ELISPOT 阅读器系统(CTL Analyzers LLC,克利夫兰,俄亥俄州,美国)使用 ImmunoSpot 软件对板上的斑点进行计数,反应的大小表示为每百万输入脾细胞的斑点形成细胞(SFC)。 阳性反应的阈值被定义为每孔至少 5 个斑点,并且反应超过“阴性对照孔中斑点的平均数加上阴性对照孔的 3 个标准差”和“阴性对照孔平均值的三倍”,以两者为准 更高。
1) 在用编码整个 gag、pol、nef、tat 和 vif 蛋白的质粒免疫的小鼠中产生的干扰素伽马反应的优势是朝向 HIVACAT T 细胞免疫原覆盖区段之外的区域(针对 HIVACAT 免疫原区域的反应的中值比率/总 gag +pol+nef+tat+vif 为 0.26(范围 0.17-0.42))并且在用高剂量(20μg)或低剂量(5μg)DNA 免疫的组之间没有差异。
看 图 3 2) 在用 20µg HIVACAT 免疫的小鼠中,对 HIVACAT T 细胞免疫原序列中包含的蛋白质亚基的反应宽度中值为 4(范围 2-5),而在用编码为 20µg 的质粒免疫的小鼠中为 2 个反应(范围 1-3) 整个蛋白质 (ns),反应幅度没有显着差异。 在用 HIVACAT T 细胞免疫原免疫的小鼠中,八个蛋白质亚基中的六个至少被靶向一次。
看 图4 .
| HIVACAT T 细胞免疫原片段 | HIV-1蛋白 | 池号 | 肽/池 | 做出反应的小鼠(组 Gag-Pol-NTV) | 做出反应的小鼠(HIVACAT 组) |
| 段 1 | 堵嘴-p17 | HTI-pool1 | 10 | 0/10 | 3/10 |
| 段 2 | 堵嘴-p24 | HTI-pool2 | 12 | 10/10 | 10/10 |
| 第 3 段 | 堵嘴-p24 |
| 第 4 段 | 堵嘴-p24 |
| 5段 | 堵嘴-p24 |
| 6段 | 堵嘴-p24 |
| 七段 | 堵嘴-p2p7plp6 | HTI-pool3 | 3 | 0/10 | 0/10 |
| 8段 | pol蛋白酶 | HTI-pool4 | 6 | 4/10 | 7/10 |
| 九段 | 逆转录酶 | HTI-pool5 | 11 | 5/10 | 9/10 |
| 10 段 | 逆转录酶 |
| 11 段 | 逆转录酶 |
| 12 段 | pol整合酶 | HTI-pool6 | 4 | 0/10 | 0/10 |
| 13 段 | pol整合酶 |
| 14段 | 维夫 | HTI-pool7 | 4 | 3/10 | 2/10 |
| 15 段 | 维夫 |
| 16段 | 内夫 | HTI-pool8 | 2 | 0/10 | 1/10 |
[0151] 4) 用编码 gag、pol、nef、tat 和 vif 的全蛋白的质粒免疫的小鼠中,89% 的反应主要被驱动到 gag,而在用高剂量 HIVACAT T 细胞免疫原免疫的小鼠中,所有反应都更加平衡 免疫原中包含的蛋白质成分(gag、pol、vif 和 nef)。
看 图 5 .
示例 3
小鼠的体液反应
[0152] 首先在汇集的小鼠血清中分析体液反应。 通过蛋白质免疫印迹检测与 p24、p37 和 p55 结合的抗体,方法是使用 HEK 293 细胞的细胞提取物,这些细胞转染了在 12% SDS-Page 上分离的 1mg gag 表达载体,并用混合的小鼠血清(1:100 比例)探测膜 稀释)。 gag p24 的抗体滴度通过 ELISA 测量。 评估汇集的血清样品的连续 4 倍稀释,并测定 450nm 处的吸光度(Advanced BioScience Lab, Inc., Kensington, MD, US)。 结合效价被报告为最高稀释度评分阳性,其值高于平均值加 3 个标准差,这些标准差是用 SHAM DNA 免疫的小鼠的对照血清获得的。
a) 从第一次体液免疫原性分析来看,HIVACAT T 细胞免疫原诱导了对 gag p55、p37 和 p24 的结合抗体反应,在用 20 µg 免疫的小鼠组中可通过蛋白质印迹检测到。
看 图 6 . b) 通过 ELISA 对 p24 的结合抗体进行定量。 接受所述质粒的小鼠的 gag-p24 特异性结合抗体的终点滴度通过 ELISA 从单个系列 4 倍稀释混合血清样品中测定。 在以 1:4,000 的滴度免疫 HIVACAT T 细胞免疫原的高剂量小鼠组中,该滴度低于在用全堵嘴构建体免疫的小鼠中检测到的滴度。 在低剂量组中未检测到与 p24 结合的抗体。
看 图 7a . 在个体小鼠水平上,内部开发的 gag p55 ELISA 使用 HIV-1IIIB pr55 gag 重组蛋白(目录号 3276,NIH 试剂计划,美国马里兰州贝塞斯达)对小鼠血清进行 1:100 稀释。 在用高剂量免疫原免疫的 3 只小鼠中,有 2 只可检测到低水平的抗体。
看 图 7b .
例 4
异源质数 /
提高小鼠体内免疫原性
材料与方法
pDNA-HIVACAT 和 MVA-HIVACAT 疫苗的制备
[0153]密码子优化的 T 细胞免疫原被克隆到哺乳动物表达质粒 BV5 中,该质粒由经过优化的经过修饰的 CMV 基本质粒骨架组成,适合在含有人巨细胞病毒 (CMV) 启动子、牛生长激素 (BGH) 聚腺苷酸化位点和细菌中生长的细菌中生长 卡那霉素抗性基因——缺少 Xho 位点。 使用 Endo-Free Megaprep (Qiagen) 制备用于小鼠免疫的质粒 DNA,并储存在 -80°C 直至使用。
[0154] 如前所述制备表达 HIVACAT 基因的重组 MVA {Letourneau,2007 #235; 恩科洛拉,2004 #321}。 简而言之,将在添加了 10% FBS、青霉素/链霉素和谷氨酰胺(DMEM 10)的 Dulbeco 改良 Eagle 培养基中生长的鸡胚成纤维细胞(CEF)用 MOI 1 的亲本 MVA 感染,并使用含有 3ug pDNA 的 Superfectin(Quiagen)进行转染。 携带β-半乳糖苷酶基因作为标记的HIVACAT。 两天后,收获总病毒并用于重新感染 CEF 细胞。 MVA 进行五轮噬菌斑纯化,之后培养主病毒原液,在 36% 蔗糖垫上纯化,滴定并储存在 -80°C 直至使用。
C57BL 的体内免疫原性/ 6只老鼠。
[0155] 对于小鼠的异源初免/加强体内免疫原性实验,使用了每组 5 只 6 至 8 周大的雌性 C57BL/6(Harlan Laboratories Ltd.,Barcelona,Spain)。 小鼠肌肉注射 100µg pDNA-HIVCAT(2 或 3 次疫苗接种),然后进行 10^6 pfu 的 MVA-HIVACAT 加强(组:分别为 2xDNA、3xDNA、2xDNA +1MVA 和 3xDNA + 1MVA)所有疫苗接种由三个分开 周。
[0156] 在每个实验中最后一次接种疫苗后两周处死所有小鼠。 收获小鼠脾细胞和血清用于免疫原性研究。 取出脾脏并使用 5 毫升注射器橡皮塞通过细胞过滤器 (Falcon) 单独挤压。 红细胞裂解后,将脾细胞洗涤并重悬于补充有 10% FCS、青霉素/链霉素 (R10) 的 RPMI 1640 中,并冷冻直至使用。
[0157] 所有动物程序和护理均由当地伦理委员会批准。
重叠肽和肽库的分布
[0158] 为了评估异源方案的免疫原性,pDNA 或 MVA 仅表达 HIVACAT T 细胞免疫原,并排除潜在连接表位的免疫原性,147 个长度为 15 个氨基酸的肽(重叠 11 个残基)跨越 整个 HIVACAT T 细胞免疫原(包括前导序列和接头区域)是使用 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 化学新合成的。 根据蛋白质亚基和免疫原片段,肽被分配到 18 个不同的池中(1 个池用于信号肽序列,n=4 个肽;7 个池用于 Gag,n=8-11 个肽/每个;7 个池用于 Pol, n=5-11 个肽/每个;2 个 Vif 池,n=6-8 个肽/每个和 1 个 Nef 池,n=2 个肽)结果按 8 个蛋白质亚基特异性的 IFNγ 反应分组(Gag p17, Gag p24、Gag p2p7plp6、Pol-蛋白酶、Pol-RT、Pol-整合酶、Vif 和 Nef)
小鼠 干扰素γ 酶联免疫斑点 化验
[0159]使用小鼠 IFNγ ELISpot 试剂盒 (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE) 按照制造商的说明进行 ELISpot 测定,稍作修改。 对于所有测定,冷冻的小鼠脾细胞在使用前首先解冻并在 R10 中在 37°C 下静置 5 小时。 将细胞以 4×10 5 个细胞/孔的输入细胞数添加到 96 孔聚偏乙烯板(Millipore Corp.,Bedford,MA,US)中的 140μl R10 中,单独或与 HIV-1 特异性肽库(14μg /ml 每种肽的最终浓度)在 37°C 的 5% CO 2 中处理 16 小时。 Concavalin A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US),5 mg/ml,用作阳性对照。 板用一步 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/Nitroblue Tetrazolium (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, US) 显影。 使用自动 ELISPOT 阅读器系统(CTL Analyzers LLC,克利夫兰,俄亥俄州,美国)使用 ImmunoSpot 软件对板上的斑点进行计数,反应的大小表示为每百万输入脾细胞的斑点形成细胞(SFC)。 阳性反应的阈值被定义为每孔至少 5 个斑点,并且反应超过“阴性对照孔中斑点的平均数加上阴性对照孔的 3 个标准差”和“阴性对照孔平均值的三倍”,以两者为准 更高。
结果
[0160] 在这些实验中,由于没有使用编码完整蛋白质的质粒免疫小鼠,因此合成了与确切免疫原序列匹配的第二组重叠肽,并用于免疫原性比较。 用 100µg pDNA-HIVACAT 进行的三次肌肉内 (i.m.) 免疫能够在所有小鼠中诱导 IFNγ 反应的频率,这与电穿孔 Inovio 系统免疫诱导的 IFNγ 反应频率相当。 然而,两个 pDNA i.m. 发现接种疫苗仅在三只动物 (60%) 中具有免疫原性,而 100% 的动物在三个 pDNA i.m. 后诱导反应。 免疫接种。 有趣的是,MVA-HIVACAT 疫苗能够在广度和强度上增强反应,(
图 8B ) 在所分析的两组中,但当小鼠先前已用三剂 pDNA-HIVACAT 引发时,确实显着增加了反应的幅度 (
图 8B 和
8C ). 正如在之前的 EP 实验中所见,在所有动物中都观察到对免疫原中包含的大多数蛋白质亚基的平衡和广泛的反应,但它们之间没有明显的优势模式。 在所研究的小鼠中未检测到 nef 或 gag-p15 特异性反应(
图 8D ).
[0161] 虽然为了清楚和理解的目的对本发明进行了一些详细的描述,但是本领域的技术人员通过阅读本公开内容将理解,在不脱离本发明的真实范围的情况下,可以在形式和细节上做出各种改变 和附加的权利要求。
[0162] 上文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文。
