[权利要求2]

所述CD3/TCR复合物刺激剂为CD3刺激剂(如抗CD3抗体),所述共刺激分子刺激剂为CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-刺激 1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226 或其任何组合的试剂,任选地刺激所述试剂或刺激 CD3/TCR 复合物的共刺激分子。试剂可以是抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变域抗体)、肽体、Fab 片段或 scFv)、小分子或配体(例如天然存在的、重组的或嵌合的配体)任选地,所述刺激 CD3/TCR 复合物的试剂或所述刺激 co 的试剂-刺激分子不包含珠子;任选地,所述刺激CD3/TCR复合物的试剂包括:所述包含抗-CD3抗体和刺激共刺激分子的试剂包括抗-CD28抗体和任选地所述刺激CD3的试剂/TCR 复合物是共价结合胶体聚合物纳米基质的抗 CD3。所述包含抗体和刺激共刺激分子的试剂包括共价结合胶体聚合物纳米基质的抗 CD28 抗体,任选地刺激所述试剂和刺激共刺激分子的共刺激分子2.如权利要求1所述的方法,其中所述试剂包括T Cell TransAct TM 。

[权利要求3]

步骤(i)增加来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的细胞的百分比,例*自步骤(iii)的所述细胞群更高(例如,至少10、20 , 30%, 40%, 50% 或 60%)百分比。

[权利要求4]

(a) 幼稚细胞的百分比,例如幼稚 T 细胞,例如 CD45RA + CD45RO-CCR7 + T 细胞,在来自步骤 (iii) 的所述细胞群中是幼稚细胞的百分比,例如与幼稚细胞的百分比相同T细胞,如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞,或相差不超过5%或10%;

(b)来自步骤(iii)的所述细胞群中的幼稚细胞(例如幼稚T细胞,例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞)的百分比例如是开始时所述细胞群中的幼稚细胞步骤 (i) 的百分比,例如至少 1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2 与幼稚 T 细胞的百分比相比,例如 CD45RA+CD45RO-CCR7+ 细胞增加了 0.8 倍或3;

(c)所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的幼稚T细胞的百分比,例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比是随时间的增加,例如在步骤(ii)开始后 18-24 小时内减少至少 30、35、40、45、50、55 或 60%;或

(d)来自步骤(iii)的所述细胞群中的幼稚细胞,例如幼稚T细胞,例如CD45RA + CD45RO-CCR7 + T细胞的百分比等于幼稚细胞的百分比,例如4。任何方法4. 权利要求1-3之一,其中幼稚T细胞如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比没有减少或减少不超过5%或10%。

[权利要求5]

(a) 所述来自步骤 (iii) 的细胞群在步骤 (iii) 开始后在步骤 (iii) 中处理超过 26 小时,例如 5、6、7、5、6、7、更高(例如至少高出 10%、20%、30% 或 40%)百分比;

(b)来自步骤(iii)的所述细胞群中的幼稚细胞,例如幼稚T细胞,例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比在步骤(iii)开始后大于26小时;幼稚细胞在通过类似方法制备的细胞中,除了它是在步骤 (i) 开始后超过 5、6、7、8、9、10、11 或 12 天进行的,例如更高百分比的幼稚 T 细胞,例如,高 2.8 或 3 倍);

(c)来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的幼稚T细胞的百分比,例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比是,步骤( iii)在步骤(i)开始后超过26小时发生,例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11或12天,包含所述第一或第二个核酸分子,例如更高的百分比(例如至少高 4、6、8、10 或 12 倍);

(d)来自步骤(iii)的所述细胞群在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前用所述细胞群(例如T细胞)在体外处理超过3天,例如5、6、7 ,更高(例如,至少高出 10%、20%、30% 或 40%)百分比;

(e) 幼稚细胞,例如幼稚 T 细胞,例如幼稚细胞,例如幼稚 T 细胞,在通过类似方法制备的细胞中的百分比,除了进一步包括在体外扩增细胞群超过 3 天的步骤,例如,5、6、7、8 或 9 天。,例如更高百分比的 CD45RA+CD45RO-CCR7+ T 细胞(例如,至少 1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8或高出三倍);或

(f)步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的幼稚T细胞的百分比,例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比是,在步骤(iii)之后(ii)和在步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如,T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天。高于幼稚T的百分比在通过类似方法(例如,至少 4、6、8、10 或 12 次更高)。

[权利要求6]

(a)来自步骤(iii)的所述细胞群中的中央记忆细胞,例如中央记忆T细胞,例如CD95+中央记忆T细胞的百分比等于中央记忆细胞在所述细胞群中的百分比步骤(i)的开始;与记忆细胞的百分比相同,例如中央记忆T细胞,例如CD95+中央记忆T细胞,或相差不超过5%或10%;

(b)来自步骤(iii)的所述细胞群中的中央记忆细胞,例如中央记忆T细胞,例如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比小于或等于所述细胞群中中央记忆细胞的百分比步骤(i)的开始;与例如中央记忆T细胞,例如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比减少至少20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%;

(c)包含所述第一或第二核酸分子的中央记忆T细胞的百分比,例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+细胞,在步骤(ii)期间降低,例如降低至少8、10、12 , 14, 16 或 20% 18-24 小时后开始 (ii); 或

(d)来自步骤(iii)的所述细胞群中的中央记忆细胞,例如中央记忆T细胞,例如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比小于或等于所述细胞群中中央记忆细胞的百分比步骤(i)的开始; 6.根据权利要求1至5中任一项的方法,其中与中央记忆T细胞例如CCR7+的百分比相比没有增加或增加5%或10%或更少CD45RO+ T 细胞。

[权利要求7]

(a) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群在步骤 (iii) 开始后在步骤 (iii) 中处理超过 26 小时,例如中央记忆的 5、6、7、5、6、7细胞,例如中央记忆T细胞,例如表现出较低(例如,至少低10%、20%、30%或40%)的百分比;

(b)中央记忆细胞的百分比,例如中央记忆T细胞,例如CCR7+CD45RO+T细胞,在来自步骤(iii)的所述细胞群中在步骤(i)开始后大于26小时;中央记忆在通过类似方法制备的细胞中,不同之处在于它是在步骤 (i) 开始后超过 5、6、7、8、9、10、11 或 12 天进行的,例如较短的(例如,至少 20 , 30%、40% 或 50% 低)细胞百分比,例如中央记忆 T 细胞,例如 CCR7+CD45RO+ T 细胞;

(c)来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的中央记忆T细胞的百分比,例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比是步骤(iii)在步骤(i)开始后超过 26 小时进行,例​​如在步骤(i)开始后超过 5、6、7、8、9、10、11 或 12 天比中央记忆 T 的百分比包含所述第一或第二核酸分子的细胞,例如,包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+T细胞,在通过类似方法产生的细胞中,除了低(例如至少低10、20、30或40%) );

(d)来自步骤(iii)的所述细胞群在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前用所述细胞群(例如T细胞)在体外处理超过3天,例如5、6、7 ,较低(例如,至少降低 10%、20%、30% 或 40%)百分比;

(e) 在体外超过 3 天,例如 5、6、7、8 或 9 天的中央记忆细胞(例​​如中央记忆 T 细胞,例如细胞)的百分比。较低的百分比(例如,至少 20, 30%、40% 或 50%)的 T 细胞,例如 CCR7+CD45RO+ T 细胞;或

(f)来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的中央记忆T细胞的百分比,例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+T细胞在步骤(ii)之后)并且在步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天小于包含所述中央记忆T细胞的百分比第一或第二核酸分子,例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+T细胞,在通过类似方法产生的细胞中(例如低10%、20%、30%或40%),权利要求中任一项的方法1-6。

[权利要求8]

(a)来自步骤(iii)的所述细胞群中干记忆T细胞的百分比,例如,与CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比增加;

(b)来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的干记忆T细胞,例如包含所述第一或第二核酸的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞酸分子细胞的百分比是包含所述第一或第二核酸分子的干记忆T细胞,例如CD45RA + CD95 + IL-包含所述第一或第二核酸分子,在步骤(i)开始时所述细胞群中相对于 2 受体 β + CCR7 + CD62L + T 细胞的百分比增加;

(c)来自步骤(iii)的所述细胞群中干记忆T细胞的百分比,例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞,其中步骤(iii)超过26小时后步骤 (i) 的启动;通过类似方法制造的细胞中的干记忆,除了它是在步骤 (i) 启动后超过 5、6、7、8、9、10、11 或 12 天执行的比 T 细胞的百分比,例如 CD45RA + CD95 + IL-2 受体 β + CCR7 + CD62L + T 细胞;或

(d)来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的干记忆T细胞,例如包含所述第一或第二核酸的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞酸分子步骤(iii)中的细胞百分比在步骤(i)开始后大于26小时,例如步骤(i)开始后5、6、7、8、9、10、11或12天)包含所述第一或第二核酸分子的干记忆T细胞,例如大于CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比;

(e) 干记忆 T 细胞的百分比,例如 CD45RA + CD95 + IL-2 受体 β + CCR7 + CD62L + T 细胞,在来自步骤(iii)的所述细胞群中在步骤(ii)之后和步骤( iii)所述细胞(例如T细胞)在体外超过3天,例如5、6、7、8或9天,大于-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比;或

(f)来自步骤(iii)的所述细胞群中包含所述第一或第二核酸分子的干记忆T细胞,例如包含所述第一或第二核酸的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞酸分子步骤 (ii) 之后和步骤 (iii) 之前的细胞百分比在体外扩增所述细胞群(例如 T 细胞)超过 3 天,例如 5、6、7、8 或 9 天。包含所述第一或第二核酸分子的记忆T细胞,例如根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高。

[权利要求9]

(a) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群的中值 GeneSetScore(上 TEM 与下 TSCM)是步骤(i)开始时所述细胞群的中值 GeneSetScore(上 TEM 与下 TSCM)) ,或相差(例如,增加)不超过约 25、50、75、100 或 125%;

(b) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群的中值 GeneSetScore(上 TEM 与下 TSCM)是

步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行,例​​如步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11或12天一个类似的方法,除了

在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天是通过类似方法产生的细胞

低于(例如,至少低约 100、150、200、250 或 300%)中值 GeneSetScore(上 TEM 对比下 TSCM)

(c)来自步骤(iii)的所述细胞群的GeneSetScore中值(Up Treg vs. Down Teff)等于步骤(i)开始时所述细胞群的GeneSetScore中值(Up Treg vs. Down Teff) )),或相差不超过约 25%、50%、100%、150% 或 200%(例如,增加较少);

(d) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群的中值 GeneSetScore(Up Treg vs. Down Teff)是

步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行,例​​如步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11或12天一个类似的方法,除了

在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天是通过类似方法产生的细胞

低于(例如,至少低约 50%、100%、125%、150% 或 175%)

(e)来自步骤(iii)的所述细胞群的中值GeneSetScore(向下干性)与步骤(i)开始时所述细胞群的中值GeneSetScore(向下干性)大致相同;或不同之处在于(例如,增加了)约25%、50%、100%、150%、200%或250%或更少;

(f) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群的中值 GeneSetScore(向下干性)是

步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行,例​​如步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11或12天一个类似的方法,除了

在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天是通过类似方法产生的细胞

低于(例如,至少低约 50%、100% 或 125%)

(g)来自步骤(iii)的所述细胞群的GeneSetScore(缺氧)中值与步骤(i)开始时所述细胞群的GeneSetScore(缺氧)中值大致相同;或相差约125, 150、175 或 200% 或更少(例如,增加的更少);

(h) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群的中值 GeneSetScore (Uphypoxia) 是

步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行,例​​如步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11或12天一个类似的方法,除了

在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天是通过类似方法产生的细胞

低于(例如,至少低约 40%、50%、60%、70% 或 80%)

(j)来自步骤(iii)的所述细胞群的中值GeneSetScore(向上自噬)与步骤(i)开始时所述细胞群的中值GeneSetScore(向上自噬)大致相同;或不同之处在于(例如,增加了约 180、190、200 或 210% 或更少;或

(k) 来自步骤 (iii) 的所述细胞群的中值 GeneSetScore(向上自噬)是

步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行,例​​如步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11或12天一个类似的方法,除了

在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前,在体外扩增所述细胞群(例如T细胞)超过3天,例如5、6、7、8或9天是通过类似方法产生的细胞

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,GeneSetScore的中值(Up autophagy)低于(例如,低至少约20、30或40%)。

[权利要求10]

将来自步骤(iii)的所述细胞群与所述CCAR或表达由CAR识别的抗原的细胞孵育,例如使用实施例8中关于图29C-29D所述的方法。如所评估的,步骤(iii)被延迟了在步骤(i)开始后超过 26 小时,例如在步骤(i)开始后 5、6、7、8、9、10、11 或 12 小时。细胞或所述细胞群(例如, T 细胞)在步骤(ii)之后和步骤(iii)之前在体外超过 3 天,更高(例如,至少 2、4、6、8、10、12 或 14 10。根据以下任一项的方法10. 权利要求1至9,其中该方法分泌双倍高水平的IL-2。

[权利要求11]

所述来自步骤(iii)的细胞群在体内施用,其中步骤(iii)在步骤(i)开始后施用超过26小时,例如在步骤(i)开始后5小时;与细胞相比与通过类似方法产生的细胞相比,通过类似方法制备但在超过 6、7、8、9、10、11 或 12 天后,或在步骤 (ii) 之后和步骤 (iii) 之前进行,除了进一步包含在体外扩增所述细胞群(例如 T 细胞)超过 3 天,例如 5、6、7、8 或 9 天的步骤 11. 权利要求 1-10 中任一项的方法,其持续时间更长或增殖至更高水平(例如,如使用关于图4C的实施例1中描述的方法评估的)。

[权利要求12]

所述来自步骤(iii)的细胞群在体内施用,其中步骤(iii)在步骤(i)开始后施用超过26小时,例如在步骤(i)开始后5小时;类似的方法,但在步骤 (ii) 之后和步骤 (iii) 之前的 6、7、8、9、10、11 或 12 天以上(例如,T 细胞)在体外进行超过 3 天,例如(例如低剂量,例如 0.15 x 10 ^６ , 0.2×10 ^６ , 0.25×10 ^６ 或 0.3×10 ^６ 12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其在含有1μg或更少剂量的所述第一或第二核酸分子的活细胞中表现出更强的抗肿瘤活性。

[权利要求13]

来自步骤(iii)的所述细胞群与在步骤(i)开始时的所述细胞群相比未扩增,例如通过活细胞数评估,或5、10、15、20,扩增不再超过 25%、30%、35% 或 40%,并且可选地,来自步骤(iii)的所述细胞群中的活细胞数是在步骤(i) 13 开始时所述细胞群中的活细胞数。 13. 权利要求1-12中任一项,其中细胞数量减少。

[权利要求14]

其中与步骤(i)开始时的所述细胞群相比,来自步骤(iii)的所述细胞群未扩增,或扩增少于2小时,例如少于1或1.5小时。第14项。根据第1至13项中任一项的方法。

[权利要求15]

步骤(i)和/或(ii)包括IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL -6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂或其组合,在细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。

[权利要求16]

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中步骤(i)和/或(ii)在含有血清替代物的无血清细胞培养基中进行。

[权利要求17]

17.根据权利要求16所述的方法,其中所述血清替代物是CTS TM 免疫细胞血清替代物(ICSR)。

[权利要求18]

在步骤(i)之前,

(iv)(任选地)新鲜白细胞单采产品(或新鲜全血产品、新鲜骨髓产品或新鲜肿瘤或器官活检或切除(例如,接受造血组织的替代来源),例如胸腺去除的新鲜产品);

(v) 新鲜白细胞单采产品(或造血组织的替代来源,如新鲜全血产品、新鲜骨髓产品或新鲜肿瘤或器官活检或切除(例*自胸腺切除术的新鲜产品));分离所述细胞群(例如 T细胞,例如 CD8+ 和/或 CD4+ T 细胞)在步骤 (i) 中接触来自

并且可选地,

步骤(iii)在步骤(v)开始后35小时内进行,例如在步骤(v)开始后27、28、29、30、31、32、33、34或35小时内进行,例如步骤( v) 在启动后 30 小时内执行,或

来自步骤(iii)的所述细胞群未扩增,如通过与步骤(v)结束时的所述细胞群相比的活细胞数量评估,或5、10、15、20、25、30、35或40%或更少,例如10%或更少。

[权利要求19]

在步骤 (i) 18 之前,从实验室、医院或医疗保健提供者等实体的白细胞单采术产品(或全血、骨髓或肿瘤或器官活检或切除术(例如胸腺切除术))中分离出来的冷冻保存。 18. 权利要求1-17,进一步包括接收从造血组织的替代来源分离的冷冻保存的T细胞,例如T细胞。

[权利要求20]

在步骤(i)之前,

(iv)(任选地)冷冻保存的白细胞去除术产品(或冷冻保存的全血产品、冷冻保存的骨髓产品或冷冻保存的肿瘤或器官活检或切除物(例如,接受替代来源的造血组织),例*自胸腺去除的冷冻保存产品);

(v) 冷冻保存的白细胞去除术产品(或造血组织的替代来源,例如冷冻保存的全血产品、冷冻保存的骨髓产品或冷冻保存的肿瘤或器官活检或切除物(例如,来自胸腺切除术的冷冻保存产品))。分离所述细胞群(例如 T 细胞,例如 CD8+ 和/或 CD4+ T 细胞)在步骤(i)中接触来自

并且可选地,

步骤(iii)在步骤(v)开始后35小时内进行,例如在步骤(v)开始后27、28、29、30、31、32、33、34或35小时内进行,例如步骤( v) 在启动后 30 小时内执行,或

来自步骤(iii)的所述细胞群未扩增,如通过与步骤(v)结束时的所述细胞群相比的活细胞数量评估,或5、10、15、20、25、30、35或40%或更少,例如10%或更少。

[权利要求21]

步骤(vi):来自步骤(iii)的所述细胞群的一部分至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5.6、6.5或7天,例如培养至少2天并且不超过7天,并且测量所述部分中的CAR(例如,CCAR)表达水平(例如,所述部分中活的CAR表达细胞(例如,CCAR表达细胞)的数量测量百分比)步骤

并且可选地,

步骤 (iii) 包括收获和冷冻细胞群(例如 T 细胞),并且步骤 (vi) 解冻来自步骤 (iii) 的一部分细胞群;培养该部分至少 2、2.5、3、 3.5、4、4.5、5.5、6、6.5或7天,例如至少2天且不超过7天,并测量所述部分中CAR(例如CCAR)的表达水平(例如测量活CAR的百分比) -在所述部分中表达细胞(例如 CCAR 表达细胞)。根据第 1 项的方法。

[权利要求23]

23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-2接触。

[权利要求24]

23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-7接触。

[权利要求25]

23.权利要求22的方法,其中步骤(1)包括使细胞群(例如T细胞)与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。

[权利要求26]

23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-21接触。

[权利要求27]

23.权利要求22的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。

[权利要求28]

23.权利要求22的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。

[权利要求29]

23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-7和IL-21接触。

[权利要求30]

23.权利要求22的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。

[权利要求31]

步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触;第23项的方法22.

[权利要求32]

步骤(1)包括用IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))划分细胞群(例如T细胞); 23.如权利要求22所述的方法,包括接触。

[权利要求33]

23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(1)包括使所述细胞群(例如T细胞)与IL-2和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。

[权利要求34]

将来自步骤(3)的细胞群与通过类似方法产生的细胞进行比较,除了来自步骤(3)的细胞群还包括使细胞群与例如抗-CD3抗体接触的步骤34.在包含权利要求22-33中任一项的核酸分子的细胞中更高百分比(例如高至少10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%)的幼稚细胞的方法。

[权利要求35]

来自步骤(3)的所述细胞群中的幼稚细胞(例如幼稚T细胞,例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞)的百分比是

(a) 与步骤开始时所述细胞群中幼稚细胞(如幼稚 T 细胞,如 CD45RA+CD45RO-CCR7+ 细胞)的百分比相同或相差不超过 5 或 10% (1), 或

(b)在步骤开始时与所述细胞群中的幼稚细胞(例如幼稚T细胞,例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比增加,例如增加至少10%或20% (1);根据权利要求22-34中任一项的方法。

[权利要求36]

来自步骤(3)的所述细胞群在步骤(1)开始后超过26小时,例如在步骤(1)开始后5、6、7、8、9个更高(例如,至少10 , 20%, 30% 或 40%)百分比。

[权利要求37]

在步骤 (2) 之后和步骤 (3) 之前,所述细胞群(例如 T 细胞)在体外超过 3 天,例如 5、6、7、8 或更高天数(例如至少 10、20、 30% 或 40%)百分比。

[权利要求38]

所述来自步骤(3)的细胞群在体内施用,其中步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行,例​​如在步骤(1)开始后5小时;持续更长时间或增殖至比通过类似方法制备但在超过 6、7、8、9、10、11 或 12 天后进行的细胞更高的水平(权利要求 22-37 中任一项的方法,例如使用实施例 1 中描述的方法评估关于图 4C)。

[权利要求39]

在体内施用来自步骤(3)的所述细胞群之后,在步骤(2)之后和步骤(3)之前,所述细胞群(例如,T细胞)在体外超过3天,例如5天。与通过类似方法制备的细胞相比,持续时间更长或增殖水平更高,但还包括生长 6、7、8 或 9 天的步骤(例如,关于图 4C,根据权利要求 22 中任一项的方法-38,如使用实施例1)中描述的方法评估的那样。

[权利要求40]

来自步骤(3)的所述细胞群与在步骤(1)开始时的所述细胞群相比未扩增,例如通过活细胞数评估,或5、10、15、20,扩增25, 30%、35%或40%或更少,例如10%或更少,任选地其中来自步骤(3)的所述细胞群中的活细胞数少于步骤(1)开始时的所述细胞数 40. 方法40. 权利要求22-39中任一项的方法,其中群体中活细胞的数量减少。

[权利要求41]

其中与步骤(1)开始时的所述细胞群相比,来自步骤(3)的所述细胞群未扩增,或扩增少于 2 小时,例如少于 1 或 1.5 小时。第 41 项。第 22-40 项中任一项的方法。

[权利要求42]

当所述细胞群未在体外接触或与刺激CD3/TCR复合物的试剂和/或刺激所述细胞表面上的共刺激分子的试剂接触时,所述接触步骤包括根据任何方法权利要求 22 至 41 之一,其小于 2 小时,例如 1 或 1.5 小时或更短。

[权利要求43]

所述CD3/TCR复合物刺激剂为CD3刺激剂(如抗CD3抗体),所述共刺激分子刺激剂为CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-刺激 1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226 或其任何组合的试剂,任选地刺激所述试剂或刺激 CD3/TCR 复合物的共刺激分子。试剂可以是抗体(例如单结构域43. 权利要求42的方法,选自:

[权利要求44]

步骤 (1) 和/或 (2) 是

5%、4%、3%、2%、1%或0%血清或更少,以及任选的步骤(1)和/或(2)在含有约2%血清的细胞培养基中进行。血清,或

LSD1 抑制剂或 MALT1 抑制剂

44. 如权利要求22-43中任一项所述的方法,其中该方法在包含以下的细胞培养基中进行

[权利要求45]

来自实验室、医院或医疗保健提供者等实体的冷冻保存的白细胞单采术产品(或冷冻保存的全血产品、冷冻保存的骨髓产品、或冷冻保存的肿瘤或器官活检或切除物(例如,来自胸腺切除的冷冻保存产品)。 45. 任何方法45. 权利要求 22-44 中的一项,还包括接收替代来源的造血组织,例如。

[权利要求46]

46. 权利要求 1 至 45 中任一项的方法,其中步骤 (i) 或步骤 (1) 开始时的细胞群富含 IL6R 表达细胞(例如 IL6Rα 和/或 IL6Rβ 阳性细胞)。节中描述。

[权利要求47]

1-其中步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群包含50%、60%或70%或更多的IL6R表达细胞(例如IL6Rα和/或IL6Rβ阳性细胞) 47. 方法第 46 条中的任何一项。

[权利要求48]

1-48. 47 中任一项的方法。

[权利要求49]

49.根据权利要求48所述的方法,其中IL-15增加所述细胞群在例如10、15、20或25天后增殖的能力。

[权利要求 50]

49.根据权利要求48所述的方法,其中IL-15增加所述细胞群中表达IL6Rβ的细胞的百分比。

[权利要求51]

51.如权利要求1-50中任一项所述的方法,其特征在于,所述CCAR或CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和/或细胞内信号结构域。

[权利要求52]

所述抗原结合结构域包括CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT , IL-13Ra2, Legman, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, Lewis Y, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, 叶酸受体α, ERBB (例如,ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、EphrinB2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体 β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、legumain、HPV E6 或 E7, ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos 相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白 17、β 人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globo H、RAGE1、MN -CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠道羧酸酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO -1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、 GFRα4 或呈递在 MHC 上的任何所述抗原的肽。

[权利要求53]

所述抗原结合结构域包含本文公开的 CDR、VH、VL 或 scFv 序列,任选地

(a) 所述抗原结合结构域结合 BCMA 并包含表 3-15 中公开的 CDR、VH、VL、scFv 或 CAR 序列或其至少 80%、85%、90%、95% 或 99% 包含具有以下序列的序列的身份

(b) 所述抗原结合结构域结合 CD19 并具有表 2 中公开的 CDR、VH、VL、scFv 或 CAR 序列或至少 80%、85%、90%、95% 或 99% 相同的序列包含具有性别;

(c) 所述抗原结合结构域结合 CD20 并包含本文公开的 CDR、VH、VL、scFv 或 CAR 序列或至少 80%、85%、90%、95% 或 99% 包含同一性序列;或

(d) 所述抗原结合结构域结合 CD22 并包含本文公开的 CDR、VH、VL、scFv 或 CAR 序列或至少 80%、85%、90%、95% 或 99% 53. 权利要求51的方法或52,包含具有同一性的序列。

[权利要求54]

54. 权利要求51-53中任一项,其中所述抗原结合结构域包含VH和VL,所述VH和VL通过接头连接,任选地所述接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。 1.

[权利要求55]

(a) 跨膜结构域是 T 细胞受体 α、β 或 ζ 链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、跨膜选自CD137和CD154的蛋白质结构域;

(b) 所述跨膜结构域包括 CD8 的跨膜结构域;

(c) 所述跨膜结构域包含 SEQ ID NO: 6 的氨基酸序列或与其具有至少约 85%、90%、95% 或 99% 序列同一性的氨基酸序列;或

(d) 所述第一或第二核酸分子包含编码所述跨膜结构域的核酸序列,所述核酸序列是SEQ ID NO: 17或至少约85%、90%、95%或55的核酸序列。 55.如权利要求51-54中任一项所述的方法,其包含具有99%序列同一性的核酸序列。

[权利要求56]

所述抗原结合结构域通过铰链区连接至所述跨膜结构域,任选地

(a) 所述铰链区包含 SEQ ID NO: 2、3 或 4 的氨基酸序列或与其具有至少约 85%、90%、95% 或 99% 序列同一性的氨基酸序列;或

(b) 所述第一或第二核酸分子包含编码所述铰链区的核酸序列,所述核酸序列是SEQ ID NO: 13、14或15或其至少约85%、90%的核酸序列; 56.如权利要求51-55中任一项所述的方法,包括具有95%或99%序列同一性的核酸序列。

[权利要求57]

所述细胞内信号域包含初级信号域,任选地所述初级信号域包含CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12 或 CD66d ,可选地包含来自

(a) 所述主要信号域包含源自 CD3ζ 的功能性信号域;

(b) 所述初级信号结构域包含 SEQ ID NO: 9 或 10 的氨基酸序列或与其具有至少约 85%、90%、95% 或 99% 序列同一性的氨基酸序列;或

(c) 所述第一或第二核酸分子包含编码所述初级信号域的核酸序列,所述核酸序列是SEQ ID NO: 20或21或其至少约85%、90%的核酸序列;57 57.如权利要求51-56中任一项所述的方法,其包含具有95%或99%序列同一性的核酸序列。

[权利要求58]

所述细胞内信号域包括共刺激信号域,可选地,所述共刺激信号域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传递淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体, BTLA, Toll 配体受体, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB (CD137), B7-H3, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIG​​HT, HVEM ( LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1 , CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB 或 CD83, 以及可选

(a) 所述共刺激信号域包含源自 4-1BB 的功能性信号域;

(b) 所述共刺激信号结构域包含 SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列或与其具有至少约 85%、90%、95% 或 99% 序列同一性的氨基酸序列;或

(c) 所述第一或第二核酸分子包含编码所述共刺激信号结构域的核酸序列,所述核酸序列是SEQ ID NO: 18或至少约85%、90%、95%的核酸序列58.如权利要求51-57中任一项所述的方法,其包含具有%或99%序列同一性的核酸序列。

[权利要求59]

所述细胞内信号结构域包含源自 4-1BB 的功能性信号结构域和源自 CD3ζ 的功能性信号结构域,任选地其中所述细胞内信号结构域包含氨基酸序列(或具有至少约 85%、90%、 95% 或 99% 序列同一性)和 SEQ ID NO: 9 或 10 的氨基酸序列(或至少约 85%、90%、95% 或具有 99% 序列同一性的氨基酸序列),和任选,所述细胞内信号结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。 59. 51-58中任一项的方法。

[权利要求60]

60.根据权利要求51-59中任一项所述的方法,其中所述CCAR或CAR还包含前导序列,所述前导序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

[权利要求61]

61.一种包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如包含所述第一或第二核酸分子的自体或同种异体的),其通过权利要求1-60中任一项的方法产生(T细胞或NK细胞群)。

[权利要求64]

64.如权利要求1-60中任一项所述的方法或如权利要求61-63中任一项所述的细胞群,其中所述细胞群包含所述编码CCAR的第一核酸分子。

[权利要求65]

65. 根据权利要求64的方法或根据权利要求64的细胞群,其中所述CCAR是融合多肽,其包含降解多肽(例如,本文公开的降解多肽)和CAR多肽(例如,本文公开的CAR多肽) 64.

[权利要求66]

(i) 降解多肽包含 SEQ ID NOS: 310-315、320-324、337-339、360-361、367-369 和 374 (或至少 85、87、90、95、97、98、99 或具有100%同一性的序列)任选地,所述降解多肽包含或由SEQ ID NO: 312的氨基酸序列组成;

(ii) 所述降解多肽包含 IKZF1 或 IKZF3 (或与其具有至少 85%、87%、90%、95%、97%、98%、99% 或 100% 同一性的序列)的β-转角;降解多肽包含β-发夹或IKZF1或IKZF3的β-链(或与其具有至少85%、87%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列);

(iii) 所述降解多肽包含 IKZF1 或 IKZF3 的α螺旋(或与其具有至少85%、87%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列);

(iv) 所述降解多肽从 N 端到 C 端包含第一个包含 β-链、β-发夹、第二个 β-链和第一个 α-螺旋;

(v) 所述降解多肽从 N-末端到 C-末端包含第一 β-链、β-发夹、第二 β-链、第一 α-螺旋和第二 α-螺旋,任选地,其中所述β-发夹和所述第二个α-螺旋是60、50、40或30或更少被氨基酸残基隔开的;

(vi) 降解性多肽包含 IKZF1 或 IKZF3(或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列)的约 10 至约 95 个氨基酸残基,约 15 至约90个氨基酸残基,约20至约85个氨基酸残基,约25至约80个氨基酸残基,约30至约75个氨基酸残基,约35至约70个氨基酸残基,约40至约65个氨基酸残基,约45至约65个氨基酸残基,约50至约65个氨基酸残基,或约55至约65个氨基酸残基;

(vii) 所述降解多肽为至少 10 个氨基酸、至少 15 个氨基酸、至少 20 个氨基酸、至少 25 个氨基酸、至少 30 个氨基酸、至少 35 个氨基酸、至少 40 个氨基酸、至少至少45个氨基酸,至少50个氨基酸,至少55个氨基酸,至少60个氨基酸,至少65个氨基酸,至少70个氨基酸,至少75个氨基酸,至少80个氨基酸,包括至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸或至少95个氨基酸;

(viii) 在不存在 COF1 或 COF2 的情况下,所述融合多肽与 cereblon (CRBN) 的结合,例如免疫调节酰亚胺药物 (IMiD),例*那度胺、泊马度胺或沙利度胺,不超过 0.01%、0.1%、1%,在来那度胺、泊马度胺或沙利度胺存在下,所述融合多肽与 CRBN 的结合为 5%、10%、15% 或 20%;

(ix) 所述融合多肽在不存在 COF1 或 COF2 的情况下泛素化,例如 0.01%、0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60% 或 70% 或更少的融合多肽的泛素化;

(x) 在不存在 COF1 或 COF2 的情况下所述融合多肽的降解,例如 0.01%、0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60% 或 70% 或更少多肽的降解;和/或

(xi) 所述融合多肽在 COF1 或 COF2 存在下的表达水平,例如 66. 权利要求 65 的方法或权利要求 65 的细胞群,其中所述融合多肽的表达水平通过例如,至少 40、50、60、70、80、90 或 99%。

[权利要求67]

(i) 所述降解多肽是选自由 SEQ ID NOS: 375-377 (或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列)组成的组的氨基酸序列;任选地,所述降解多肽包含或由 SEQ ID NO: 375 的氨基酸序列组成;

(ii) 所述降解多肽包含 IKZF2 的 β-转角(或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列);该肽包含 β-发夹或 β- IKZF2 链(或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列);

(iii) 所述降解多肽包含 IKZF2 的 α-螺旋(或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列);

(iv)所述降解的多肽从N-末端到C-末端包含IKZF2的第一β链(或与其具有至少85%、87%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列) ;, 一个 β-发夹, 第二个 β-链和第一个 α-螺旋;

(v) 所述降解的多肽从 N 端到 C 端包含 IKZF2 的第一 β 链(或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列) ;、β-发夹、第二β-链、第一α-螺旋和第二α-螺旋,任选地其中所述β-发夹和所述第二α-螺旋不超过60、50、40或30个氨基酸由残留物分隔;

(vi) 降解多肽包含 IKZF2 的约 10 至约 95 个氨基酸残基(或与其具有至少 85、87、90、95、97、98、99 或 100% 同一性的序列);约 90 个氨基酸残基,约20至约85个氨基酸残基,约25至约80个氨基酸残基,约30至约75个氨基酸残基,约35至约70个氨基酸残基,约40至约65个氨基酸残基,约45至约65个氨基酸残基,约50至约65个氨基酸残基,或约55至约65个氨基酸残基;

(vii)所述降解多肽是IKZF2的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸(或具有至少85%、87%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列)及其);至少25个氨基酸,至少30个氨基酸,至少35个氨基酸,至少40个氨基酸,至少45个氨基酸,至少50个氨基酸,至少55个氨基酸,至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸或至少95个氨基酸酸;

(viii)在不存在COF3(例如表29中公开的化合物I-112)的情况下,所述融合多肽与cereblon(CRBN)的缔合与COF3(例如表29中公开的化合物I-112)缔合;不超过0.01%, 0.1%、1%、5%、10%、15% 或 20% 的所述融合多肽与 CRBN 的结合存在;

(ix) 所述融合多肽在不存在 COF3 的情况下泛素化,例如表 29 中公开的化合物 I-112;例如 0.01%、0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60融合多肽泛素化的 % 或 70% 或更少;

(x)在不存在COF3(例如表29中公开的化合物I-112)的情况下所述融合多肽的降解在存在COF3(例如表29中公开的化合物I-112)的情况下降解所述融合;例如,0.01%, 0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%或更少的多肽降解;和/或

(viii)所述融合多肽在COF3存在下的表达水平,例如表29中公开的化合物I-112,等于所述融合多肽在COF3不存在下的表达水平,例如表29中公开的化合物I-112;66。 66.如权利要求65所述的方法或如权利要求65所述的细胞群,其中所述融合多肽的表达水平降低例如至少40、50、60、70、80、90或99%。

[权利要求68]

(i) 所述降解多肽与所述 CAR 多肽融合;

(ii) 降解多肽和CAR多肽是否通过肽键连接;

(ii