技术领域 [0001]本发明属于兽医疫苗领域，具体涉及针对猪瘟病毒的具有免疫原性的E2重组蛋白及其用途。 背景技术 [0002]猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由经典猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的动物疫病名录。中国是养猪大国，CSF一直是严重威胁养猪产业的重要传染病。 [0003]CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约12.3kb，编码一个由3,898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在翻译过程中和翻译后，在病毒编码的蛋白酶和宿主细胞蛋白酶的作用下，加工水解成4种结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)和8种非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。E1、E2和E^rns是重要的毒力因子和主要的保护性抗原。E2是CSFV的囊膜蛋白，是病毒最重要的结构糖蛋白，可诱导较强的中和抗体来抵抗致死CSFV强毒株的攻击，是猪瘟基因工程疫苗研发的重要靶蛋白。 [0004]实施预防性疫苗接种与扑杀策略的组合是控制猪瘟暴发的主要手段，提供一种对目前广泛流行的猪瘟病毒能产生良好的免疫保护效果的疫苗具有重要意义。尽管目前已有大肠杆菌和杆状病毒等表达的猪瘟E2抗原亚单位疫苗，但具有完善的翻译后修饰功能的哺乳动物细胞仍然是大多数生物药蛋白表达宿主的首选。 发明内容 [0005]为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种经典猪瘟病毒的重组E2蛋白，其通过缺失跨膜结构域以及特定位点处的突变，能够有效提高蛋白表达量，且不会影响E2蛋白的免疫原性。 [0006]根据一个方面，提供了一种经典猪瘟病毒的重组E2蛋白，其相对于野生型E2蛋白缺失了N端和/或C端的跨膜结构域。在一些实施方式中，野生型E2蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。 [0007]在一些实施方式中，所述重组E2蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列一致性的氨基酸序列。 [0008]在一些实施方式中，基于如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述重组E2蛋白在第48、63、77、81、86、95、103和129位氨基酸中的一个或多个位点处具有突变。 [0009]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第48位半胱氨酸(C48)可以突变为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和脯氨酸(P)中的任意一种。 [0010]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第63位精氨酸(R63)可以突变为丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)中的任意一种。 [0011]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第77位丝氨酸(S77)可以突变为丙氨酸(A)、苏氨酸(T)和甘氨酸(G)中的任意一种。 [0012]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第81位谷氨酸(E81)可以突变为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。 [0013]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第86位甘氨酸(G86)可以突变为丙氨酸(A)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)中的任意一种。 [0014]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第95位甘氨酸(G95)可以突变为丙氨酸(A)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)中的任意一种。 [0015]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第103位半胱氨酸(C103)可以突变为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和脯氨酸(P)中的任意一种。 [0016]在一些具体的实施方式中，所述重组E2蛋白的第129位半胱氨酸(C129)可以突变为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和脯氨酸(P)中的任意一种。 [0017]在一些实施方式中，所述重组E蛋白可以包括：C48S、C48A、C48G、C48T和C48P中的任意一种；R63A、R63Q和R63E中的任意一种；S77A、S77T和S77G中的任意一种；E81R或E81K；G86A、G86R和G86Q中的任意一种；G95A、G95R和G95Q中的任意一种；C103S、C103A、C103G、C103T和C103P中的任意一种；和/或，C129S、C129A、C129G、C129T和C129P中的任意一种。在一些实施方式中，所述重组E蛋白可以包括上述突变的任意组合。 [0018]在一些实施方式中，所述重组E2蛋白可以包括以下突变中的一种或多种：C48P、R63E、S77A、G86A、G95R、G95Q、C103S、C103A、R63A/S77A、R63E/S77A、R63Q/S77T、R63E/S77T、E81K/G86R和E81K/G86Q。 [0019]在一些实施方式中，所述重组E2蛋白可以具有如SEQ ID NO:5～48中任一项所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列一致性的氨基酸序列。 [0020]本公开所提及的突变位点的编号均是以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为基础。 [0021]在一些实施方式中，所述重组E2蛋白的N-末端或C-末端可以具有选自His、c-myc、FLAG、Strep-tag中的一种或多种标签。 [0022]在一些实施方式中，所述重组E2蛋白的N-末端可以具有信号肽。在优选的实施方式，所述信号肽可以具有如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。 [0023]根据另一方面，提供了一种核酸分子，其编码本公开的重组E2蛋白。 [0024]根据又一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本公开的重组E2蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以选自大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞。在具体的实施方式中，所述宿主细胞可以选自哺乳动物细胞。在优选的实施方式中，所述宿主细胞可以包括，但不限于，人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。在优选的实施方式中，所述宿主细胞可以为括CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHOZN GS、CHOK1SV GS-KO细胞。 [0025]根据又一方面，提供了一种免疫原性组合物，其包括上述重组E2蛋白以及药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述载剂可以包括，例如铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾)、油佐剂(例如MF59)、核酸类佐剂(例如CpG)、蛋白类佐剂、脂质体。 [0026]在一些实施方式中，所述免疫原性组合物可用于使猪科动物(例如猪)免疫，以对抗至少一种猪瘟病毒相关的疾病。 [0027]在一些实施方式中，所述免疫原性组合物可以用于通过注射、气雾剂递送、鼻内施用、口服、局部施用或其组合的方式来施用。 [0028]根据又一方面，提供了本公开的免疫原性组合物在治疗或预防与经典猪瘟病毒(CSFV)相关疾病中的应用。 [0029]根据又一方面，提供了本公开的免疫原性组合物在制备治疗或预防与经典猪瘟病毒(CSFV)相关疾病的药物中的应用。 [0030]本公开通过缺失经典猪瘟病毒E2蛋白的N端和C端的跨膜结构域，提高了E2蛋白的表达量，相对于市售猪瘟疫苗具有更好的免疫效果。通过对截短的E2蛋白的一些特定位点进行突变，可以进一步提高E2蛋白的表达量，且对E2蛋白的免疫原性没有影响。 附图说明 [0031]图1示出了根据本公开的实施方式的Truncated_E2蛋白的SDS-Page检测结果。 [0032]图2示出了根据本公开的实施方式的Truncated_E2蛋白免疫后的抗体效价的检测结果。 [0033]图3示出了根据本公开的实施方式的Truncated_E2蛋白突变体的SDS-Page检测结果。 [0034]图4示出了根据本公开的实施方式的Truncated_E2蛋白突变体的免疫后的抗体效价的检测结果。 具体实施方式 [0035]为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。 [0036]除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。 [0037]除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。 [0038]本文所用的术语“约”表示其后的数值的±文所用的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±范围。的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±范围的范围。 [0039]相对于参照氨基酸序列具有“百分比(％)序列同一性”指在比对序列和(根据需要)引入缺口以获得最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，但不考虑任何保守取代为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以以本领域范围内的各种方式进行比对，例如使用BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列全长上实现最大比对所需的任何算法。 [0040]本文所用的术语“经典猪瘟病毒”或“CSFV”指属于黄病毒科中瘟病毒属的经典猪瘟病毒(CSFV)种的所有病毒。猪瘟病毒的E2蛋白是CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒的主要抗原蛋白。E2蛋白能够诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。 [0041]为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下实施例中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。 [0042]下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。 [0043]实施例 [0044]实施例1.CHO-K1细胞表达E2蛋白及Truncated_E2蛋白 [0045]1)重组质粒的构建 [0046]野生型E2(WT-E2)蛋白(SEQ ID NO:3)及Truncated_E2蛋白(SEQ ID NO:4)的编码核酸序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，WT-E2和Truncated_E2蛋白的N-末端均含有信号肽序列(MDWTWRVFCLLAVAPGVHS)。通过常规手段合成基因，将WT-E2和Truncated_E2的编码核酸序列分别克隆至载体pUC-GW-Kan(金唯智生物科技有限公司)中，分别制备得到重组质粒pUC-GW-Kan-WT-E2和pUC-GW-Kan-Truncated_E2。随后构建目的蛋白的表达质粒。简单来讲，将表达载体pCDNA3.1(+)(Invitrogen)，重组质粒pUC-GW-Kan-WT-E2和pUC-GW-Kan-Truncated_E2分别通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切，将回收的目的片段WT-E2和Truncated_E2分别与线性化的表达载体pCDNA3.1(+)进行连接，得到E2蛋白及Truncated_E2蛋白的表达质粒pCDNA3.1(+)-E2和pCDNA3.1(+)-Truncated_E2，测序正确。为便于纯化，在重组蛋白C末端添加了His标签。 [0047]2)CHO-K1细胞表达蛋白 [0048]将中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(Merck)作为野生型E2(WT-E2)蛋白及Truncated_E2蛋白表达的宿主细胞。将构建的表达质粒pCDNA3.1(+)-E2和pCDNA3.1(+)-Truncated_E2分别转染进CHO细胞。转染48小时后加入含有600μg/mL G418的完全培养基(+4mM L-Glutamine)进行培养，每3到6天更换一次含有G418的完全培养基，直到活率恢复到90％以上，撤去筛选压力，获得稳定细胞池，细胞池可稳定表达E2蛋白。 [0049]3)纯化、检测 [0050](1)细胞培养上清液以5000rpm转速离心20min处理后，经0.22μm滤膜(密理博)过滤。 [0051](2)采用Ni Sephorase Excel(Cytiva)填料纯化培养上清，通过Ni2+与His-tag的特异性结合对E2蛋白进行特定捕获，再以含250mM咪唑的缓冲液对E2蛋白进行洗脱。 [0052](3)用孔径规格30KD的超滤管(密理博)置换为pH8.0的PBS缓冲液，以等体积加入PBS溶液稀释后浓缩一倍，如此重复5次。使用分光光度计检测A280值，检测结果如下表1所示。 [0053]表1. [0054] [0055]根据表1示出的表达结果可以看到，WT-E2的表达量很低，但Truncated_E2通过去除了N端和C端跨膜区而获得了较高的表达量，细胞池阶段的表达量可达到3.2g/L。 [0056](4)将样品与5X的蛋白上样缓冲液(碧云天)以4:1比例制成上样体系，在100℃孵育10min使Truncated_E2蛋白变性并与SDS结合。点样至4～20％SurePAGE的孔道，以电压140V跑胶60min，再用考马斯亮蓝进行染色和醋酸进行脱色。SDS-Page检测结果如图1所示。 [0057]4)亚单位疫苗的制备及效果检测 [0058]将Truncated_E2蛋白用PBS稀释后，使用佐剂Gel 02(SEPPIC公司)，按照佐剂说明书配制疫苗。将15头断奶仔猪随机分为3组，每组5只，其中1组注射Truncated_E2蛋白疫苗50μg/头份，2组注射市售猪瘟疫苗，3组注射PBS，一免后21日进行二次免疫。猪只免疫后，每日监测记录猪的体温，并观察饮食、精神状态。一免后7、14、21日，采血检测ELISA抗体，二免后7日、14日、21日采血检测ELISA抗体。 [0059]采用猪瘟病毒抗体检测试剂盒(IDEXX)，按照说明书检测抗体的阻断率。免疫结果如下表2所示： [0060] [0061]图2中给出了免疫后，各组的抗体效价结果。 [0062]从表2和图2的结果可以看出，Truncated_E2亚单位疫苗免疫后转阳率100％，试验期间猪只健康，在一免后14天、一免后21天阻断率均高于市售疫苗组。Truncated_E2亚单位疫苗在一免后21天、二免后7天时抗体阻断率均大于70％，二免后21天时抗体阻断率均大于80％，表明其足以保护猪群免受猪瘟病毒的感染，可用于防控国内猪瘟流行。 [0063]实施例2.Truncated_E2蛋白突变体的构建及表达量的检测 [0064]1)重组质粒的构建 [0065]Truncated_E2蛋白突变体(N-端具有信号肽序列MDWTWRVFCLLAVAPGVHS)的编码核酸序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，通过常规合成，将基因克隆至载体pUC-GW-Kan中，制备得到Truncated_E2蛋白突变体重组质粒。随后构建目的蛋白表达质粒，将表达载体pCDNA3.1(+)和蛋白突变体重组质粒DNA通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切，将回收的各Truncated_E2蛋白突变体片段分别与线性化的表达载体pCDNA3.1(+)进行连接，得到各Truncated_E2蛋白突变体蛋白的表达质粒，测序正确后用于CHO-K1(Merck)细胞转染。为便于纯化，在重组蛋白C末端添加有His标签。Truncated_E2蛋白突变体的突变位点及序列如下表3所示。 [0066]表3.各Truncated E2蛋白突变体的突变位点。 [0067] [0068] [0069]2)CHO-K1细胞表达蛋白 [0070]将中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(Merck)作为Truncated_E2蛋白突变体表达的宿主细胞。将各Truncated_E2蛋白突变体蛋白的表达质粒分别转染进CHO细胞。转染48小时后加入含有600μg/mL G418的完全培养基(+4mM L-谷氨酰胺)进行培养，每3到6天更换一次含有G418的完全培养基，直到活率恢复到90％以上，撤去筛选压力，获得稳定细胞池，细胞池可稳定表达E2蛋白。 [0071]3)纯化、检测 [0072](1)培养上清以5000rpm转速离心20min处理后经0.22μm滤膜(密理博)过滤。 [0073](2)采用Ni Sephorase Excel填料(Cytiva)纯化培养上清，通过Ni2+与His-tag的特异性结合对E2蛋白进行特定捕获，再以含250mM咪唑的缓冲液对E2蛋白进行洗脱。 [0074](3)用孔径规格30KD的超滤管(密理博)置换为pH8.0的PBS缓冲液，以等体积加入PBS溶液稀释后浓缩一倍如此重复5次。使用分光光度计检测A280值，检测结果如下表4所示。 [0075]表4.各Truncated E2蛋白突变体的A280处的检测值。 [0076] [0077] [0078]根据表4示出的检测结果，选取表达明显较高的Truncated_E2_M05、Truncated_E2_M08、Truncated_E2_M09、Truncated_E2_M14、Truncated_E2_M18、Truncated_E2_M19、Truncated_E2_M20、Truncated_E2_M21、Truncated_E2_M30、Truncated_E2_M32、Truncated_E2_M34、Truncated_E2_M35、Truncated_E2_M42、Truncated_E2_M44进行SDS-Page检测。 [0079](4)将样品稀释3倍后，与5X的蛋白上样缓冲液以4:1比例制成上样体系，体系在100℃孵育10min以致蛋白变性与SDS结合。点样至4～20％SurePAGE的孔道，以电压140V跑胶60min，再用考马斯亮蓝进行染色和醋酸进行脱色。SDS-Page检测结果如图3所示。 [0080]4)亚单位疫苗的制备及效果检测 [0081]将Truncated_E2蛋白突变体Truncated_E2_M14、Truncated_E2_M32、Truncated_E2_M44用PBS稀释后，使用佐剂Gel 02(SEPPIC公司)，按照佐剂说明书配制疫苗。将20头断奶仔猪随机分为4组，每组5只，其中1、2、3组分别注射Truncated_E2蛋白突变体50μg/头份，4组注射PBS，一免后21日进行二次免疫。猪只免疫后，每日监测记录猪体温及观察饮食、精神状态。一免后7、14、21日，采血检测ELISA抗体，二免后7日、14日、21日采血检测ELISA抗体。 [0082]采用猪瘟病毒抗体检测试剂盒(IDEXX)，按照说明书检测抗体的阻断率。免疫结果如图4所示，图4给出了上述三种Truncated_E2蛋白突变体免疫后的抗体效价的检测结果。从图4可以看出，Truncated_E2蛋白突变体对E2蛋白的免疫原性没有显著影响。 [0083]本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。