【技术领域】 【0001】 本发明涉及糊粉层增稠的米粒。 还提供了一种包含至少一种基因突变的水稻,该基因突变降低了植物中至少一种 ROS1a 基因的活性。 本发明的谷物或来自其的糊粉层具有改善的营养特性,因此特别有益于人类和动物饲料产品。 【背景技术】 【0002】 在世界范围内,谷物如小麦、大米、玉米,以及较小程度上的大麦、燕麦、黑麦等,是人类从谷物中的淀粉含量中摄取热量的主要来源。 谷物在提供蛋白质、维生素、矿物质和膳食纤维等其他营养成分方面也很重要。 谷物的不同部分对这些营养素的贡献不同。 淀粉储存在谷物的含淀粉胚乳中,而其他营养成分更多地集中在胚芽和麸皮中(Buri 等人,2004 年)。 然而,麸皮通常在用于食物之前被去除,尤其是米饭,它被当作白米饭吃。 【0003】 谷物由雌性和雄性配子体之间的多次受精事件发育而来。 来自花粉管的两个精子细胞中的一个与卵细胞融合产生受精卵,受精卵发育成胚胎,另一个精子细胞形成雌性巨配子体的二倍体中央细胞。产生初级胚乳核,从其中遗传三倍体胚乳发育。 因此,含有糊粉层的胚乳是三倍体,具有两份雌性单倍体基因组拷贝和一份雄性单倍体基因组拷贝。 在双子叶植物种子中,胚乳被发育中的胚胎消耗,而在水稻等单子叶植物中,胚乳仍然构成成熟籽粒的大部分。 【0004】 谷物的成熟胚乳具有四种具有不同特性的细胞类型:淀粉颗粒和贮藏蛋白。表皮糊粉层、主要雌性脉管系统种子基部的运输细胞,以及在早期形成胚胎内壁的吊杆。谷物的发育,但后来将胚连接到含淀粉的胚乳。有一层胚周细胞 (Becraft et al., 2001a),它可能围绕着 . 胚胎是在淀粉质胚乳的空腔中形成的。 谷粒糊粉层组织因此包含谷粒中胚乳的最外层并包围淀粉质胚乳和部分胚。 【0005】 糊粉层细胞与淀粉质胚乳细胞的区别在于它们的形态、生化成分和基因表达谱(Becraft 和 Yi,2011)。 糊粉层细胞通常富含油和蛋白质,并分泌能够在种子萌发过程中转移胚乳储备的酶。 每个糊粉层细胞都包裹在比胚乳细胞壁厚的纤维细胞壁内,主要由不同比例的阿拉伯木聚糖和 β-葡聚糖组成,并且具有高度自发荧光。 糊粉层是谷物中唯一有时被花青素着色的层。 【0006】 谷物淀粉在小麦和野生型玉米中只有一层细胞层厚 (Buttrose 1963; Walbot, 1994),在胚乳的背侧区域有一层到三层细胞层,主要在水稻中 (Hoshikawa, 1993),三层野生型大麦的细胞层 (Jones, 1969)。 在正常胚乳中,糊粉层非常规则,细胞分裂模式高度组织化。 野生型成熟糊粉层细胞大致呈立方体,具有致密的细胞质,含有颗粒、囊泡和由蛋白质、脂质和植蛋白或蛋白质加碳水化合物组成的内含物。 在成熟的谷物中,糊粉层是唯一的活胚乳组织,尽管处于休眠干燥状态。 通过吸水膨胀,胚胎分解储存化合物,使胚胎过早发育成幼苗,产生赤霉素诱导淀粉酶的合成,形成糖和氨基酸,淀粉分解储存化合物。其他水解酶是由释放到胚乳中的糊粉层产生。 【0007】 Becraft 和 Yi (2011) 对谷物糊粉层发育的控制进行了综述。 多层次的基因调控控制着细胞的命运、分化和组织,许多基因都参与了这个过程,但只有少数基因被鉴定出来。 例如,玉米缺陷型 kernal1 (dek1) 功能丧失突变体没有糊粉层,表明需要野生型 Dek1 多肽才能将外部细胞层指定为糊粉层(Becraft 等人,2002)。 Dek1 多肽是一种大的完整膜蛋白,具有 21 个跨膜结构域和一个含有活性钙蛋白酶的细胞质结构域。 另一个玉米基因 CRINKLY4 (CR4) 编码一种受体激酶,作为糊粉层命运的正调节剂发挥作用,而 cr4 突变体会​​减少糊粉层(Becraft 等人,2001b)。 【0008】 文献中报道了谷物突变体中糊粉层增稠的一些例子,但尚未证明对多效性或农业生产和生产问题有用。 【0009】 Shen et al. (2003) 报道了玉米突变体在 supernumary aleurone layers1 (sal1) 基因中的鉴定,这些突变体具有 2-3 或多达 7 层的糊粉层细胞,而不是正常的单层。 SAL 多肽被鉴定为 E 类液泡定位蛋白。 纯合子 sal1-1 突变体谷物无法发芽,胚胎有缺陷,淀粉质胚乳大大减少。 sal1-2 等位基因的纯合缺陷突变体显示出两个细胞层糊粉层。 然而,突变植物只长出野生型的 30%,根系减少,结实率低(Shen et al. 2003)。 这些植物在农业上没有用处。 【0010】 Yi 等人 (2011) 报道了在玉米中鉴定出厚糊粉层 1 (thk1) 突变体。 突变的籽粒(kernals)表现出许多糊粉层。 然而,突变种籽粒缺乏完全成熟的胚,播种时不发芽。 野生型 Thk1 基因编码 Thk1 多肽,该多肽作用于玉米糊粉层发育所需的 Dek1 多肽下游(Becraft 等,2002)。 【0011】 玉米细胞外层 (Xcl) 基因突变体通过其对叶片形态的影响进行鉴定。 突变体产生双层糊粉层和多层叶表皮(Kessler 等,2002)。 Xcl 突变是一种半显性突变体,它破坏了玉米的细胞分裂和分化模式,并产生了厚而窄的叶子,具有异常闪亮的外观。 【0012】 disorgal1 和 disorgal2(dil1 和 dil2)基因中的玉米突变体显示出具有可变层数的糊粉层以及不规则形状和大小的细胞(Lid 等,2004)。 然而,纯合的dil1和dil2突变体的籽粒由于淀粉积累减少而萎缩,而成熟突变体的籽粒发芽率低并且没有提供有活力的植物。 【0013】 在大麦中,由于异常平行细胞分裂,elo2 突变体显示出类似的杂乱无章的细胞和不规则的糊粉层 (Lewis et al., 2009)。 植物的叶表皮细胞层也增加,表皮细胞肿胀和变形。 重要的是,纯合突变植株矮化,籽粒重量不到野生型的 60%,对粮食生产无用。 【0014】 在水稻中,控制种子贮藏蛋白表达的两个转录因子也会影响糊粉层细胞的命运(Kawakatsu 等人,2009 年)。 通过共抑制构建体,编码水稻谷醇溶蛋白盒结合因子 (RPBF) 多肽(一类 DOF 锌指转录因子)的基因表达减少,导致由大的不规则细胞组成的散发性多层糊粉层。 种子贮藏蛋白的表达和积累也显着减少,淀粉和脂质的积累水平大大降低。 玉米 Dek1、CR4 和 SAL1 基因的水稻同系物的表达也降低,表明 RPBF 和 RISBZ1 因子在与这些基因相同的调节途径中起作用。 【0015】 DNA去甲基化 在植物科学的一个完全不同的领域,现在正在组织 DNA 去甲基化。 植物将核 DNA 中嘧啶环第 5 位碳原子上的一些胞嘧啶核苷酸甲基化,形成 5-甲基胞嘧啶 (5-meC)。 甲基化胞嘧啶可发生在以下三种情况中的任何一种:CG、CHG(其中 H=A、C 或 T)和 CHH 甲基化,每种都由不同的甲基转移酶催化。 在大多数植物中,至少包括拟南芥和可能的水稻(Zemach 等人,2010 年),CG 甲基化由甲基转移酶 1 (Met1) 家族中的酶催化,而 CHG 甲基化由色素甲基化酶催化。由家族中的甲基化酶催化, 和 CHH 甲基化通过 RNA 介导的反应发生,该反应由结构域重排甲基化酶 (DRM) 使用小 RNA 作为指导序列催化。 胞嘧啶甲基化发生在所有胞嘧啶的一小部分中,经常发生在异染色质 DNA 和富含重复 DNA 和转座子的区域,从而抑制它们的活性。 它也出现在核 DNA 的转录区域,包括基因的启动子,从而参与许多基因表达的控制。 【0016】 DNA 的胞嘧啶甲基化通过去甲基化是可逆的,这可以通过 DNA 复制或通过去甲基化酶的活性而被动发生。 植物中 DNA 主动去甲基化的一种途径是通过使用 DNA 糖基化酶的碱基切除修复 (BER) 途径。 这些酶从双链 DNA 主链上去除 5-meC,然后通过连续的 β- 和 δ- 消除反应在脱碱基位点切割 DNA 主链(裂解酶活性)。 通过 DNA 聚合酶活性插入未甲基化的胞嘧啶核苷酸来完成修复。 【0017】 拟南芥基因组中有四种 5-meC DNA 糖基化酶/裂解酶,分别名为 Demeter (DME)、Demeter-like 2 (DML2)、Demeter-like 3 (DML3) 和 Repressor of Silencing (ROS1)。 遗传和生化分析表明,DME 具有作为 DNA 去甲基化酶的所有四种功能,主要在卵细胞和胚乳中发挥作用,在其他组织中也有差异(Gong 等人,Agius 等人,2006 年;Morales-Ruiz 等人, 2006). 其他植物也表达多种去甲基化酶(Zemach 等,2010)。 【0018】 需要具有来自植物的厚糊粉层的米粒,尤其是水稻,其在表型上是正常的并且在农业上是有用的。 【发明概要】 【0019】 一方面,本发明提供了水稻谷粒,该谷粒包含糊粉层、淀粉质胚乳、编码ROS1a多肽的ROS1a,并且(i)与相应的野生型水稻相比:(ii)与来自相应的野生型谷物是。 【0020】 在一个实施例中,ROS1a多肽具有DNA糖基化酶活性。 在一个实施方案中,ROS1a多肽是相应野生型ROS1a多肽和/或ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性水平的2%至约60%,该ROS1a多肽是具有SEQ ID NO:中所列序列的氨基酸。 2.具有一定水平的DNA糖基化酶活性。 【0021】 在其他实施方案中,ROS1a多肽是相应野生型ROS1a多肽的变体,其氨基酸序列不同。 在一个优选的实施方案中,水稻籽粒是具有如SEQ ID NO: 1所提供的氨基酸序列的ROS1a (Ta2)变体多肽,具有如SEQ ID NO: 2所提供的氨基酸序列的野生型ROS1a多肽。包括一个变种人。 【0022】 在一个实施方案中,与相应野生型谷物中的 ROS1a 多肽水平相比,谷物中存在的 ROS1a 多肽水平为 2% 至约 60%。 【0023】 在一个实施例中,增稠的糊粉层具有至少2层、至少3层、至少4层或至少5层细胞、约3层、约4层、约5层或约6层细胞,或 2 至 6 层细胞。包含 8、2-7、2-6 或 2-5 层细胞。 在一个实施例中,谷粒来源于稻米并且增稠的糊粉层包括5-8、5-7、5-6或2-5层。 在一个实施例中,糊粉层的厚度与野生型稻谷相比增加了约100%、或约150%、或约200%、或约250%。 【0024】 降低植物中至少一个 ROS1a 基因活性的基因突变,优选基因突变的引入,是降低或干扰水稻籽粒中 ROS1a 多肽的野生型水平生产的任何基因突变。 . 此类遗传变异的示例包括但不限于: (a) 编码突变体 ROS1a 多肽的 ROS1a 基因,其相对于野生型 ROS1a 多肽具有降低的 DNA 糖基化酶活性(SEQ ID NO:2); (b) 表达后导致野生型 ROS1a 多肽水平降低的 ROS1a 基因,例如,如 SEQ ID NO:8 所示的 cDNA 序列,其包含导致 ROS1a 表达水平降低的剪接位点突变基因;与野生型 ROS1a 基因相关,或 ROS1a 基因在其启动子中包含突变,导致 ROS1a 相对于野生型 ROS1a 的表达降低; (c) 编码减少水稻中 ROS1a 基因表达的多核苷酸的外源核酸构建体,优选地,核酸构建体在至少开花至开花后 7 天之间的时间点递送到发育中的水稻籽粒中;包含编码可操作地连接到待表达的启动子的多核苷酸的DNA区域;和 (d) 编码相对于野生型 ROS1a 多肽截短多肽的 ROS1a 基因,但在该基因的蛋白质编码区包含过早的翻译终止密码子,该密码子可能产生也可能不产生; 包括。 【0025】 在一个优选的实施方案中,水稻谷粒包含(i)糊粉层,(ii)淀粉质胚乳,和(iii)ROS1a基因,其包含与野生型ROS1a基因相比降低水稻ROS1a基因活性的基因突变。所述包含所述遗传变异的ROS1a基因编码相对于SEQ ID NO:2的突变ROS1a多肽,并且与来自相应野生型水稻籽粒的糊粉层相比,糊粉层增厚。 在一个实施例中,ROS1a基因的遗传变异是引入的遗传修饰。 在优选的实施方案中,与SEQ ID NO:2相比,变体ROS1a多肽的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:2提供的序列的差异在于至少一个或多个氨基酸插入或缺失,或氨基酸取代。 在甚至更优选的实施方案中,变体ROS1a多肽与SEQ ID NO:2相比具有一个或多个氨基酸插入或单个氨基酸取代,例如表3中列出的单个氨基酸取代。氨基酸不同来自作为 SEQ ID NO: 2 提供的序列的序列。 可以对米粒进行处理以使其不再发芽,例如,将其煮熟,或者可以不进行处理以使其发芽和生长,从而生产本发明的米。 在最优选的实施方案中,米粒的糊粉层用例如黑米(如本文定义的米粒)着色。 【0026】 在另一个优选的实施方案中,稻谷包含(i)糊粉层,(ii)淀粉质胚乳,(iii)与包含ROS1a基因的野生型ROS1a基因相比降低水稻中ROS1a基因活性的基因突变,其中包含所述基因突变的ROS1a基因编码与野生型ROS1a多肽具有相同氨基酸序列的ROS1a多肽,例如SEQ ID NO:2,其中所述ROS1a基因是野生型ROS1a在水稻中表达的与基因相比水平降低,其中糊粉层与来自相应野生型水稻谷粒的糊粉层相比变厚。 在一个实施例中,ROS1a基因中的基因突变是引入的基因修饰,使得ROS1a基因以降低的水平表达。 在一个实施方案中,遗传变异是(i)导致ROS1a基因相对于野生型ROS1a基因表达水平降低的剪接位点突变,野生型ROS1a基因是如SEQ ID NO:8提供的cDNA序列,(ii ) 导致 ROS1a 基因相对于野生型 ROS1a 基因表达减少的 ROS1a 基因启动子突变;一种外源性核酸分子。 可以对米粒进行处理以使其不再发芽,例如,将其煮熟,或者可以不进行处理以使其发芽和生长,从而生产本发明的米。 在最优选的实施方案中,米粒的糊粉层用例如黑米(如本文定义的米粒)着色。 【0027】 在一个实施方案中,水稻在其发育中的谷粒中具有的DNA糖基化酶活性水平是相应野生型发育中谷粒中DNA糖基化酶活性水平的2%至约60%。 在一个优选的实施方案中,水稻在相应的野生型发育谷粒中具有 2% 至 50%、或 2% 至 40%、或 2% 至 30% 的 DNA 糖基化酶活性水平。其发育中的谷物中 DNA 糖基化酶的活性在 2% 到 20% 之间。 【0028】 在一个实施方案中,水稻中至少一种 ROS1a 基因的活性与发育中谷粒的糊粉层、果皮、珠心突起、子房、种皮和淀粉质胚乳中的一种或多种或全部相关。 【0029】 在一个实施方案中,ROS1a 基因的活性至少在开花期间和开花后 7 天期间和/或在开花前的卵细胞中降低。 在一个实施例中,外源核酸分子可以可操作地连接至在至少开花时间和开花后 7 天之间的时间表达的启动子,在此期间编码的 RNA 多核苷酸用于降低 ROS1a 基因在水稻中的表达. 【0030】 在一个实施例中,水稻在雄蕊和雌蕊上结出种子。 【0031】 在一个实施例中,水稻表现出延迟的谷粒成熟。 在一个实施例中,与野生型水稻相比,谷粒成熟延迟了 2-10 天或 2-15 天。 【0032】 在一个实施例中,基于它们各自的重量,与相应的野生型谷物相比,谷物包含以下一种或多种或全部: i)较高的矿物质含量,优选矿物质含量为锌、铁、钾、镁、磷和硫中的一种或多种或全部, ii) 更高的抗氧化剂含量; iii) 较高的植酸含量, iv) 一种或多种或所有维生素 B3、B6 和 B9 含量较高; v) 更高的膳食纤维含量和/或不溶性纤维含量, vi)相对于相应野生型谷粒的淀粉含量按重量计介于约90%和约100%之间的淀粉含量; vii) 更高的蔗糖含量, viii) 更高的单糖含量,和 ix) 相对于相应野生型谷粒的脂质含量至少90%或至少100%的脂质含量。 在一个实施例中,该成分的含量相对于相应的野生型水稻籽粒含量增加10-50%,优选增加10-100%。 【0033】 在一个实施例中,谷粒包含胚。 【0034】 在一个实施例中,谷物是全谷物或碎谷物。 【0035】 在一个实施例中,谷物已经过处理,优选地通过热处理,使得它不能再发芽。 例如,将谷物在 100°C 的水中煮至少 5 分钟。 在一个实施例中,谷物是破碎的谷物或磨碎的谷物。 【0036】 在另一个实施例中,相对于相应谷粒的发芽率,该谷粒具有介于约70%和约100%之间的发芽率。 即,与野生型相比,至少 100 粒的聚集体具有 70-100% 的平均发芽率。 当谷物发芽和生长时产生本发明的稻米。 【0037】 在一个实施方案中,谷粒包含编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因,优选地在谷粒的糊粉层、种皮和淀粉质胚乳中的一个或多个中,其中DNA糖基化酶活性优选是突变的ROS1a多肽。 【0038】 在其他实施方案中,谷粒包含与相应的野生型 ROS1a 多肽相比在水稻中表达的 DNA 糖基化酶活性降低的突变体 ROS1a 多肽,优选突变体 ROS1a。多肽包含一个或多个降低 DNA 糖基化酶活性的氨基酸取代、缺失或插入与相应的 ROS1a 多肽相比。 突变的 ROS1a 多肽不需要具有具有 DNA 糖基化酶活性的颗粒,只要它包含另一个具有 DNA 糖基化酶活性的 ROS1a。 例如,ROS1a基因可以通过可变剪接编码两种ROS1a多肽,其中一种具有DNA糖基化酶活性,另一种则不具有。 在优选的实施方案中,与野生型ROS1a多肽相比,突变ROS1a多肽具有7个氨基酸的插入,例如,具有如SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列的突变ROS1a多肽具有。 【0039】 在另一个实施方案中,与相应的野生型谷粒相比,谷粒具有减少的 ROS1a 多肽总量,优选地在谷粒的糊粉层、种皮和淀粉质胚乳中的一个或多个中。编码具有 DNA 糖基化酶活性的 ROS1a 多肽的基因。 水稻花粉中 ROS1a 多肽的总量也可以减少。 【0040】 在另一个实施方案中,基因突变,优选引入的基因突变,降低水稻中 ROS1a 基因的表达,优选至少在开花时间和开花后 7 天之间。是编码多核苷酸的外源核酸构建体,其导致谷粒含有至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。 【0041】 在一个实施例中,谷粒在其外层上是有色的,例如谷粒是棕色或黑色的米粒,并且谷粒具有(i)至少2个细胞层,或2-7个(ii)包含的ROS1a多肽与相应的野生型水稻 ROS1a 多肽相比,具有降低的 DNA 糖基化酶活性的一个或多个氨基酸取代、插入或缺失;含有突变体 ROS1a 基因编码,至少在开花期之间的时间点在水稻中发生降低的 DNA 糖基化酶活性开花后约 7 天,但与野生型水稻相比,至少开花后约 7 天。前提是水稻在发育谷粒中的 DNA 糖基化酶活性水平为 2% 至约 60%天。 【0042】 在一个实施例中,谷粒在其外层上是有颜色的,例如谷粒是棕色或黑色的米粒,并且(i)具有至少2个细胞层,或2至7个细胞层的厚度。和( ii)编码减少水稻ROS1a基因表达的多核苷酸的外源核酸构建体,其中外源核酸构建体至少存在于开花时间和开花后7天之间。包含编码可操作地连接到启动子的多核苷酸的DNA区域在至少开花时间和开花后 7 天之间的时间点在发育中的水稻籽粒中表达;与野生型水稻相比,在发育中的籽粒中具有 2% 至约 60% 的 DNA 糖基化酶活性水平。 在优选的实施方案中,启动子是除组成型启动子之外的启动子,例如在发育种子的胚乳中表达的启动子。 在最优选的实施方案中,启动子是LTP启动子。 【0043】 在其他实施方案中,ROS1a多肽包含与SEQ ID NO:2在序列上至少95%相同的氨基酸,或者ROS1a多肽与SEQ ID NO:2在序列上至少95%相同,至少97.5%。 .包含相同或至少99%相同的氨基酸,并且其中序列不同于相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列。 【0044】 在一个实施方案中,ROS1a多肽包含一个或多个或所有以下基序;ELHYQMITFGKVFCTKSKPNCN(SEQ ID NO:48)和HFASAFASARLALP(SEQ ID NO:49)。 【0045】 本发明还提供了一个稻谷种群,每个稻谷种群具有与上述实施方案中所述相同的遗传变异、相同的ROS1a基因、相同的ROS1a多肽和/或相同的特性。 也就是说,群体在遗传和/或表型上是同质的。 这样的稻谷种群可以从单一祖先稻米或谷粒中获得或衍生,例如,它可以从至少四代后代中衍生。 【0046】 发明人已经鉴定出具有降低的DNA糖基化酶活性的突变体ROS1a多肽。 因此,在另一方面,本发明优选地提供了一种DNA糖基化酶活性,其氨基酸序列不同于相应的野生型ROS1a多肽,并且与相应的野生型ROS1a多肽相比具有降低的DNA糖基化酶活性。提供了游离的、纯化的和/或重组的ROS1a多肽。 【0047】 在一个实施方案中,纯化的和/或重组的ROS1a多肽包含具有与SEQ ID NO:2至少95%相同、至少97.5%相同或至少99%相同的序列的氨基酸。 【0048】 另一方面,本发明提供了编码本发明的ROS1a多肽的分离的和/或外源的多核苷酸。 【0049】 另一方面,本发明提供了一种分离的和/或外源多核苷酸,当其存在于水稻中时,它会降低 ROS1a 基因的表达。 【0050】 本领域技术人员熟悉可用于降低靶基因表达的不同类型的多核苷酸,以及如何设计这些多核苷酸。 实例包括但不限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、双链RNA(dsRNA)分子或其工程化的RNA产物。 【0051】 在一个实施方案中,该多核苷酸与 SEQ ID NO: 7 或 8 (其中胸腺嘧啶 (T) 是尿嘧啶 (U)) 的互补序列或作为 SEQ ID NO: 1 或 2 dsRNA 提供的氨基酸序列至少 95% 相同包含至少 19 个连续核苷酸的分子或其加工的 RNA 产物,这些核苷酸与编码 ROS1a 多肽的 mRNA 互补序列至少有 95% 相同。 【0052】 在其他实施方案中,dsRNA分子是微RNA(miRNA)前体和/或其中加工的RNA产物是miRNA。 【0053】 在一个实施例中,多核苷酸用于在至少开花时间和开花后7天之间的时间点减少发育中的水稻籽粒中ROS1a基因的表达。 【0054】 在进一步的方面,本发明提供了编码本发明的多核苷酸的核酸构建体和/或载体,其中核酸构建体或载体在至少开花时间和开花后 7 天之间的时间在水稻中生长。可操作地连接到启动子的多核苷酸,该启动子在发育中的谷粒中表达 【0055】 在另一方面,本发明提供了包含本发明的外源多核苷酸或本发明的核酸构建体和/或载体的重组细胞。 【0056】 在一个实施例中,细胞是例如稻谷细胞,优选稻米细胞,例如稻米淀粉。 【0057】 在一个实施方案中,外源多核苷酸、核酸构建体或载体被整合到细胞基因组中,优选整合到核基因组中。 【0058】 还提供了水稻细胞,其包含编码 ROS1a 多肽的 ROS1a 基因和基因突变,优选引入的基因突变,其与相应的野生型细胞相比降低细胞中至少一种 ROS1a 基因的活性。 【0059】 在一个实施方案中,细胞是糊粉层、果皮、核、子房、种皮或淀粉质胚乳。 【0060】 在另一方面,本发明提供一种水稻植物,其产生本发明的谷粒、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体和/或载体和/或包含本发明的细胞。 ,或提供水稻种群。 在一个实施例中,每一种都是大米。 【0061】 还提供了至少 100 株或至少 1,000 株本发明水稻植物的大田种植群体。 在一个优选的实施方案中,大田稻是本发明的大部分(>50%),优选全部稻米。 在最优选的实施方案中,至少100株、至少1,000株水稻植株在遗传和/或表型上是相同的,例如,包含相同的遗传变异。 【0062】 在另一个方面,本发明是一种用于产生本发明的细胞的方法,所述方法包括将本发明的外源多核苷酸或本发明的核酸构建体和/或载体转移到细胞,优选水稻中提供了一种方法,包括引入细胞的步骤。 【0063】 另一方面,本发明提供了一种生产本发明的水稻或由其产生的转基因谷粒的方法,所述方法包括以下步骤: i)将本发明的外源多核苷酸或本发明的核酸构建体和/或载体引入水稻细胞; ii)从获自步骤i)的细胞获得转基因水稻植物,该植物对外源多核苷酸、核酸构建体或载体或其部分是转基因的,和 iii)任选地从步骤ii)的植物中收获谷粒,其中谷粒对于外源多核苷酸、核酸构建体或载体是转基因的; iv)任选地从转基因谷粒产生一代或多代转基因后代植物,其中后代植物是外源多核苷酸、核酸构建体或载体; 从而产生水稻或转基因谷物。 【0064】 另一方面,本发明提供了一种生产本发明的稻米或其谷物的方法,所述方法包括以下步骤; i) 向水稻细胞中引入内源性 ROS1a 基因的突变,例如编码本发明的 ROS1a 多肽或不编码 ROS1a 多肽的突变 ROS1a 基因,和 ii) 从步骤 i) 获得的细胞中获得含有内源性 ROS1a 基因突变的水稻植株,以及 iii)任选地从步骤ii)的植物收获谷粒,其中谷粒在内源ROS1a基因中包含突变;和 iv)任选产生一代或多代谷类衍生的后代植物,其中后代植物在内源ROS1a基因中含有突变; 从而生产大米或谷物。 【0065】 在一个实施例中,水稻或谷物包含至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。 【0066】 另一方面,本发明提供了一种选择本发明的稻米或稻谷的方法,所述方法包括以下步骤: i)从祖先水稻细胞、谷粒或植物诱变处理获得的水稻或谷粒用于生产本发明的谷粒或用于ROS1a基因突变的存在或用于本发明水稻谷粒的存在分别筛选粮食人口;和 ii)从步骤(i)的群体中选择产生本发明的谷粒或含有突变的ROS1a基因的水稻,或步骤(i)的水稻谷粒为本发明的水稻谷粒; 从而选择大米或谷物。 【0067】 该方法可包括从所选水稻或至少两代的后代植物收获一种或多种后代植物或谷粒,和/或从后代植物收获谷粒。 优选地,子代植物对于遗传变异是纯合的。 【0068】 另一方面,本发明提供了一种选择本发明水稻的方法,所述方法包括以下步骤: i) 稻谷来源于两个亲本稻谷的杂交,并从稻谷产生一个或多个子代植物; ii) 筛选步骤 i) 的一种或多种后代植物用于生产本发明的谷物,以及 iii) 选择产生谷物的后代植物, 从而选择大米。 在一个优选实施例中,所述米粒为黑米粒。 【0069】 在一个实施例中,筛选步骤i)或步骤ii)包括以下步骤中的一个或多个或全部; i) 分析包含来自后代植物的 DNA 的样本的遗传变异; ii) 分析从后代植物获得的谷粒的糊粉层厚度; iii) 分析谷物或其部分的营养成分; 【0070】 优选地,基因突变是引入的基因突变。 【0071】 在一个实施例中,步骤iii)包括以下步骤中的一个或多个或全部; i)选择基因突变纯合的后代植物,其中与相应的野生型水稻相比,基因突变降低了水稻中的DNA糖基化酶活性; ii) 选择其籽粒与相应的野生型籽粒相比糊粉层厚度增加的后代植物; iii)选择后代植物,其中谷粒或其部分与相应的野生型谷粒或其部分相比具有改变的养分含量。 【0072】 在进一步的实施例中,该方法还包括: i) 杂交两个亲本水稻植物,优选其中一个亲本水稻植物产生本发明的谷粒; ii)来自步骤i)的一个或多个后代植物和与本发明的非产谷第一亲本具有相同基因型的植物,具有第一亲本水稻植物的大部分基因型被回交足够次数生产能生产本发明谷物的植物,以及 iii) 选择产生本发明谷物的后代植物。 【0073】 还提供了使用本发明的方法生产的大米和米粒及其产品。 【0074】 进一步提供了本发明的外源多核苷酸或本发明的核酸构建体和/或载体在产生重组细胞、转基因水稻或转基因谷物中的用途。 【0075】 在一个实施例中,该用途是生产本发明的稻谷。 【0076】 另一方面,本发明提供了一种鉴定本发明水稻产粮的方法,所述方法包括以下步骤: i) 从大米中获取核酸样本,以及 ii) 与相应的野生型水稻相比,筛选样本是否存在降低水稻 ROS1a 基因活性的基因突变。 【0077】 在一个实施例中,遗传变异包括以下之一或两者: a)核酸构建体或编码的多核苷酸从而表达当ROS1a基因存在于水稻中时降低其表达的多核苷酸,和 b)基因或由其编码的mRNA,表达具有降低的ROS1a多肽活性的突变体ROS1a多肽。 【0078】 在一个实施例中,遗传变异的存在表明与没有遗传变异的相应植物相比,该植物的籽粒具有增厚的糊粉层。 【0079】 在另一方面,本发明提供了一种鉴定产生本发明谷粒的水稻植物的方法,所述方法包括以下步骤: i) 从大米中获取谷物,以及 ii) 筛选一种或多种谷物或其部分: a) 加厚的糊粉层, b) 谷物中 ROS1a 多肽的量和/或活性,以及 c) 谷物中由 ROS1a 基因编码的 mRNA 的数量。 【0080】 在一个实施例中,该方法鉴定了本发明的稻米。 【0081】 另一方面,本发明提供了一种生产稻米部分,优选谷粒的方法,所述方法包括: a) 种植本发明的水稻或在田间种植至少 100 粒水稻,和 b) 从水稻中收获水稻部分或水稻。 【0082】 在另一方面,本发明提供了一种从获得的谷物生产米粉、麸皮、全麦、麦芽、淀粉或油的方法,所述方法包括: a) 获得本发明的谷物,以及 b) 加工谷物以生产面粉、麸皮、全麦、麦芽、淀粉或油。 【0083】 另一方面,本发明提供本发明的谷粒或本发明的水稻植物,或从所述谷粒或水稻植物的一部分产生的产品。 【0084】 在一个实施方案中,该产品包含一种或多种或所有的ROS1a基因、基因突变(优选引入的基因突变)、外源核酸构建体和增稠的糊粉层。 【0085】 在一个实施例中,该部分是米糠。 【0086】 在一个实施例中,产品是食品成分、饮料成分、食品或饮料产品。 示例包括但不限于: i) 食品或饮料成分选自全谷物、粉末、麸皮、淀粉、麦芽和油; ii) 食品选自发酵或未发酵面包、意大利面、面条、牲畜饲料、早餐麦片、休闲食品、蛋糕、糕点和粉状酱汁;或 iii) 饮料产品是包装饮料或含乙醇的饮料。 【0087】 在另一方面,本发明是一种制备本发明的食品或饮料产品的方法,所述方法包括: 提供一种方法,包括加工粉末、全谷物、麦芽、淀粉或油。 【0088】 另一方面,本发明是一种制备本发明的食品或饮料产品的方法,所述方法包括制备本发明的谷物,或源自谷物、面粉、全麦、麦芽、淀粉或油的麸皮。与其他食品或饮料配料一起使用。 优选地,该方法中使用的麸皮、面粉、全谷物、麦芽、淀粉或油的重量至少为食品重量的10%。 【0089】 本发明的谷粒或其部分,或本发明的稻米或其部分作为动物饲料或食品,或用于生产供动物食用的饲料或供人类食用的食品的用途。还提供了。 【0090】 在进一步的方面,本发明提供一种或多种本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体和/或载体、或本发明的细胞,以及一种或多种允许的载体。 【0091】 除非另有说明,否则本说明书中的任何实施例均应比照适用于任何其他实施例。 【0092】 本发明的范围不受本文描述的仅用于说明的具体实施例的限制。 如本文所述,功能等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。 【0093】 在本发明的整个说明书中,除非另有说明或上下文另有要求,对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被解释为包括一个或多个(即,过程、物质组成、步骤组或物质组成的一个或多个)。 [现有技术文件] 【非专利文献】 【0094】 [非专利文献1] Agius 等人 (2006) Proc. 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(2007) Current Biology 17:54-59。 【0095】 现在将参照以下非限制性实施例和附图描述本发明。 【图纸简要说明】 【0096】 【图1】 基于图谱的 ta2 基因克隆示意图。 每条线下方的数字表示作图群体中显示标记与 ta2 基因之间重组的重组体的数量。 第三行的实线表示编码区在水稻染色体上的范围。 第4行中的实线表示基因中的蛋白质编码区,中间的线表示内含子(内含子1位于5'UTR,此处未显示)。 星号表示内含子 14 中 ta2 突变相对于水稻基因组的位置 Chr1:6451738。 【图2】 对应于从野生型 (WT) 基因型和 ta2 基因型发育谷物中获得的 mRNA 的 cDNA 的核苷酸序列。 WT 中的两个破折号和 ta2 序列表示不存在核苷酸。 大多数 ta2 mRNA 有 21 个核苷酸插入。 野生型序列是SEQ ID NO:10,突变序列是SEQ ID NO:11。 [图3] 从对应于从发育的野生型谷粒(上部氨基酸序列,SEQ ID NO:12)和ta2(下部氨基酸序列,SEQ ID NO:13)获得的mRNA的cDNA预测的氨基酸序列。 WT 序列中的破折号表示氨基酸缺失,而不是 ta2 多肽中的 7 个氨基酸插入(CSNVMRQ;SEQ ID NO:14)。 序列下方的星号表示相同的氨基酸存在于野生型和突变型多肽中的那些位置。 [图 4-1] 拟南芥 DME (NM001085058.1)、拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号代表所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图 4-2] 拟南芥 DME (NM001085058.1)、拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号代表所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图 4-3] 拟南芥 DME (NM001085058.1)、拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号代表所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图4-4] 拟南芥 DME (NM001085058.1)、拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号代表所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图5-1] 拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号表示所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图5-2] 拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号表示所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图5-3] 拟南芥 ROS1a (NM129207.4) 和水稻 ROS1a 同系物的氨基酸序列比对。 比对下的星号表示所有三种多肽中保守的氨基酸位置。 分号代表完全保守的氨基酸变化,而单点代表部分保守的氨基酸变化。 [图6] 实时 RT-PCR 结果显示 TA2 基因在多个组织中的相对表达。 [实施发明的方式] 【0097】 序列表要点 SEQ ID NO:1-水稻ROS1a突变体(Ta2)多肽。 SEQ ID NO:2-野生型水稻ROS1a多肽。 SEQ ID NO:3-野生型水稻ROS1b多肽。 SEQ ID NO:4-野生型水稻ROS1c多肽。 SEQ ID NO:5-野生型水稻ROS1d多肽。 SEQ ID NO:6-拟南芥DEMETER多肽。 SEQ ID NO:7-编码水稻ROS1a突变体(Ta2)多肽的全长cDNA。 开放阅读框跨越核苷酸 341-6220。 SEQ ID NO:8-编码水稻ROS1a多肽的全长cDNA。 开放阅读框跨越核苷酸 341-6199。 SEQ ID NO:9-水稻 ROS1a 基因。 启动子和5'UTR:核苷酸1-4726,翻译起始密码子ATG 4727-4729;翻译终止密码子TAG 15867-15869;3'-UTR 15870-16484,基因下游16485-16885。 2, 7816-7909; 3, 9426-9571; 4, 9652-10452; 5, 10538-10628; 6, 10721-10795; 8, 10989-11069; 9, 11153-11834; 10, 12282-12,385; 11, 12423-12508;12、12567-12650;13、12791-13017;14708-15732.-11006。 该序列在 3' 端包含 401 个不构成基因一部分的核苷酸。 SEQ ID NO:10-野生型水稻ROS1a cDNA序列的一部分如图1所示。 SEQ ID NO:11-突变体(Ta2)水稻ROS1a cDNA序列的一部分如图1所示。 SEQ ID NO:12——野生型水稻ROS1a蛋白序列的一部分如图1所示。 SEQ ID NO:13-突变体(Ta2)水稻ROS1a蛋白序列的一部分如图1所示。 SEQ ID NO:14-与野生型(SEQ ID NO:2)相比,ROS1a 突变体(Ta2)多肽中的额外氨基酸。 SEQ ID NO:15-43-寡核苷酸引物。 SEQ ID NOS:44-49-野生型水稻ROS1a多肽的糖基化酶结构域内高度保守的氨基酸基序。 SEQ ID NO:50-拟南芥 ROS1a 多核苷酸。 【0098】 一般技术和定义 除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语均应解释为与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(例如,细胞培养、分子遗传学、植物分子生物学、蛋白质化学和生物化学) . 【0099】 除非另有说明,否则本发明中使用的重组蛋白、培养细胞和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。 此类技术在例如 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984);J. Sambrook 等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 中有所描述;T.A. Brown(编),基本分子生物学:实用方法,第 1 卷和第 2 卷,IRL 出版社(1991 年);D.M. Glover 和 B.D. Hames(编),DNA 克隆:实用方法,第 1-4 卷,IRL Press(1995 年和 1996 年)和 F.M. Ausubel 等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates 和 Wiley-Interscience(1988 年,包括迄今为止的所有更新),Ed Harlow 和 David Lane(编辑。 ) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (eds.) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(包括迄今为止的所有更新),进行了解释。 【0100】 术语“和/或”,例如“X和/或Y”被理解为是指“X和Y”或“X或Y”,以明确支持这两种含义或任一含义。 【0101】 如本文所用,除非有相反说明,否则术语“约”是+/-10%,更优选+/-5%,更优选+/-2.5%,甚至更优选,参考特定值+/- 1%。 【0102】 在整个本说明书中,术语“包含”或诸如“包含”或“包含”的变体是指所述的元素、整数或步骤,或元素、整数或步骤的组。并且不排除任何元素、整数或步骤,或一组元素、整数或步骤(复数)。 【0103】 选定的定义 术语“糊粉层”和“糊粉层”在本文中可互换使用。 糊粉层与淀粉质胚乳不同,是米粒胚乳的最外层,包围着淀粉质胚乳和部分胚。 因此,构成糊粉层的细胞是胚乳最外层的细胞,是谷粒的淀粉质成分。 虽然它在技术上是胚乳的一部分,有时也被称为外周胚乳,但糊粉层与麸皮的果皮和种皮一起被去除,因此从实用的角度来看也被认为是麸皮的一部分。 与淀粉质胚乳的细胞不同,糊粉层细胞在籽粒灌浆过程中保持活跃。 糊粉层是米粒营养价值的重要组成部分,包括矿物质、维生素如维生素A和B族维生素、植物化学物质和纤维。 【0104】 本发明的实施方案是有用的,因为在本发明的颗粒的任何一个横截面点,在横截面内或横截面之间的任何单个点观察到的细胞层可能在某种程度上变化,至少在某种程度上,与“细胞层”的数量范围有关。 更具体地,具有例如七层细胞的糊粉层不能具有围绕整个内部淀粉质胚乳的七层,但是具有围绕至少一半内部淀粉质胚乳的七层。 【0105】 当涉及本发明谷粒的糊粉层时,术语“增稠”是在比较本发明谷粒的相应野生型谷粒时使用的相对术语。 与相应的野生型谷物糊粉层相比,本发明的谷物糊粉层具有增加的细胞数和/或增加的细胞层。 因此,以 μm 测量时,糊粉层会增加厚度。 在一个实施例中,厚度增加至少50%,优选地增加至少100%,并且可以增加多达500%或600%,每个百分比代表相应野生型谷粒的糊粉层。据了解,它与厚度有关,每个百分比都是谷粒腹侧的平均增加量,最好是整个谷粒的增加量。 在一个实施例中,糊粉层厚度在谷粒的横截面上确定。 在一个实施例中,糊粉层厚度通过至少分析谷粒的腹侧来确定。 在一个实施例中,本发明谷物的加厚糊粉层与相应的野生型谷物相比具有不同的大小和不规则性,其中糊粉层通常具有规则定向的短细胞。包含定向细胞。 【0106】 多肽 如本文所用,术语“ROS1多肽”指与SEQ ID NOs:1-5的氨基酸序列相关的DNA糖基化酶相关分子的蛋白质家族成员,其在SEQ ID NOs:1-5中列出。 5. 表示与一个或多个氨基酸序列至少95%相同。 ROS1多肽包括野生型水稻ROS1a、ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽(包括其天然存在的变体和突变体)。 ROS1多肽是例如在野生型水稻中发现的那些多肽,及其任何突变体,例如在任何籼稻和粳稻中发现的那些,人工产生或天然存在。并且具有DNA糖基化酶活性但水平降低与具有或不具有 DNA 糖基化酶活性的相应野生型 ROS1 多肽相比。 野生型水稻 ROS1 多肽的例子是那些具有 SEQ ID NOs:2-5 之一所示的氨基酸序列,以及 SEQ ID NOs:2-5 所示的一个或多个氨基酸序列,并且至少 95%包括具有至少97%或至少99%同一性的氨基酸序列的变体多肽和天然存在的ROS1多肽。 如本文所用,ROS1多肽不包括在SEQ ID NOS:1-5的氨基酸序列中少于95%的DNA糖基化酶相关家族得墨忒耳(DME)多肽。 【0107】 如本文所用,术语“ROS1a多肽”是指氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少95%相同,优选与SEQ ID NO:2至少97%或更优选至少99%相同。 DNA 糖基化酶相关分子。 ROS1a 多肽可以人工或天然产生,条件是它们与 SEQ ID NO:2 和具有或不具有 DNA 糖基化酶活性的野生型水稻及其变体具有必需水平的氨基酸序列同一性。 例如,其序列如SEQ ID NO:1提供的ROS1a多肽将不具有DNA糖基化酶活性,其是如本文定义的ROS1a多肽。 在优选的实施方案中,ROS1a多肽具有一些DNA糖基化酶活性,但与氨基酸序列如SEQ ID NO:2提供的野生型ROS1a多肽相比处于降低的水平。 例如,表 3 列出了据信具有降低的 DNA 糖基化酶活性的 ROS1a 突变多肽。 【0108】 本领域技术人员将能够使用例如计算机系统发育分析或蛋白质比对来区分 ROS1a 多肽与其他 ROS1 多肽,特别是其他结构相关的蛋白质,例如 ROS1b、ROS1c 和 ROS1d 多肽。区分 . 因此,ROS1a多肽可以仅根据结构特征鉴定为ROS1a多肽。 参见例如本文的图4和5。 与野生型 ROS1a 多肽(例如具有 SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列的多肽)相比,本发明的 ROS1a 多肽具有或不具有 DNA 糖基化酶活性,或具有降低的 DNA 糖基化酶活性。 【0109】 如本文所用,术语“序列不同于相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列”或类似的短语是指本发明的ROS1a多肽的氨基酸序列不同于其所来源的氨基酸序列。衍生的和/或是一个比较术语,不同于自然界中最密切相关的蛋白质的氨基酸序列。 在一个实施例中,ROS1a多肽的氨基酸序列相对于相应的氨基酸序列具有一个或多个插入、缺失或氨基酸取代(或其组合)。 与相应的野生型 ROS1a 多肽相比,ROS1a 多肽可以具有 2、3、4、5 或 6-10 个氨基酸取代。 在优选的实施方案中,与相应的野生型多肽相比,ROS1a多肽仅具有单一插入、单一缺失或单一氨基酸取代。 在本文中,“单次插入”和“单次缺失”分别包括多个(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)连续氨基酸被插入或缺失,并且“相应的野生型多肽”是指衍生变体的野生型多肽和/或与变体最密切相关的天然多肽。 ROS1a多肽可以是,例如,不完整的多肽,例如ROS1a基因,其相对于其衍生自的野生型ROS1a基因在蛋白质开放阅读框中含有不成熟的翻译终止密码子,或ROS1a多肽A肽可以具有全量,即与相应的野生型ROS1a多肽相同数量的氨基酸残基。 天然存在的(野生型)ROS1a多肽的例子是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的那些,以及仅具有单一插入、缺失或氨基酸取代的突变ROS1a多肽。例子如SEQ ID NO: :1 和表 3。 【0110】 如本文所用,术语“DNA糖基化酶活性”是指参与碱基断裂修复的酶(分类为EC编号EC 3.2.2)。 酶通常还具有 DNA 裂解酶活性,其中 DNA 碱基被切除并且主链 DNA 链被切割。 在一个实施方案中,本文所用的“DNA糖基化酶活性”涉及活性去甲基化,其中5-甲基胞嘧啶残基被截短并被未甲基化的胞嘧啶取代。 在优选的实施方案中,具有DNA糖基化酶活性的本发明的ROS1a多肽具有至少五个可识别的基序。 一种是螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序(例如,SEQ ID NO:2的氨基酸1491-1515或同源氨基酸序列)。 另一个是富含甘氨酸/脯氨酸的基序,其后是保守的天冬氨酸 (GPD) 和四个保守的半胱氨酸残基(SEQ ID NO:2 的氨基酸),用于固定 [4Fe-4S] 簇。1582- 1598 区)。 还存在富含赖氨酸的结构域(例如,SEQ ID NO:2的氨基酸87-139或同源氨基酸序列)。 与 HhH DNA 糖基化酶超家族成员的其他成员不同,ROS1a 多肽家族成员包含两个位于中央糖基化酶结构域侧翼的额外保守结构域(结构域 A 和 B)。 在水稻ROS1a多肽(SEQ ID NO:2)中,结构域A出现在氨基酸859-965,糖基化酶结构域出现在氨基酸1403-1616,结构域B出现在氨基酸1659-1933。 域 A 在氨基酸 882-892 处包含一个重复的混合电荷簇。 可以使用本领域已知的标准技术测量DNA糖基化酶活性,例如实施例8中描述的那些。 【0111】 野生型水稻 ROS1a 多肽的糖基化酶结构域内高度保守的氨基酸基序是 DHGSIDLEWLR(SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:2 中的氨基酸 1467-1477)、GGLLKSVECVRLLTLHH(SEQ ID NO:45,氨基酸 1493)在 SEQ ID NO:2).-1509), AFPVDTNVGRI (SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:2 中的氨基酸 1511-1521), VRLGWVPLQPLPESLQLHLLE (SEQ ID NO:47, SEQ ID NO: 47 中的氨基酸 1523-1543) :2)、ELHYQMITFGKVFCTKSKPNCN(SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:2 中的氨基酸 1569-1590)和 HFASAFASARLALP(SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:2 中的氨基酸 1600-1613)。 这些基序中可能存在也可能不存在一个或两个氨基酸取代。 通过将野生型水稻 ROS1a (SEQ ID NO:2) 的氨基酸序列与来自拟南芥的 DME 多肽 (SEQ ID NO:6) 和/或拟南芥 ROS1a 多肽进行比对,可以很容易地鉴定出其他保守氨基酸。确定(见图 4 和 5)。 可从 Kapazoglou 等人 (2012) 获得有关识别保守氨基酸的进一步指导。 【0112】 如本文所用,术语“与相应的野生型 ROS1a 多肽相比降低了 DNA 糖基化酶活性”、“与相应的野生型 ROS1a 多肽相比降低了 DNA 糖基化酶活性”,不优选的,或类似的短语意指变体/突变体 ROS1a 多肽的 DNA 糖基化酶活性假设低于天然存在的和/或最密切相关的蛋白质。术语。 例如,本领域技术人员可以理解,与相应的野生型 ROS1a 多肽(SEQ ID NO:2)相比,本文所述的水稻 Ta2 突变体(SEQ ID NO:1)表现出降低的 DNA 糖基化酶活性。 .减少。 具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的其他实例包括在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号156的氨基酸位置处的丝氨酸替换为另一种氨基酸例如苯丙氨酸,SEQ ID NO:2的氨基酸编号214。将苯丙氨酸对应的氨基酸位置的丝氨酸替换为另一种氨基酸如苯丙氨酸,将SEQ ID NO: 2的第1413位氨基酸对应的氨基酸位置的丝氨酸替换为另一种氨基酸如天冬酰胺,氨基酸SEQ ID NO: 2 对应于编号 441 的氨基酸位置上的丙氨酸被另一个氨基酸如缬氨酸取代 在对应于 SEQ ID NO: 2 的氨基酸编号 1357 的氨基酸位置上的丝氨酸被另一个氨基酸取代,例如作为苯丙氨酸,SEQ ID NO:2将SEQ ID NO:2的氨基酸编号501对应的氨基酸位置的赖氨酸替换为另一种氨基酸如丝氨酸,以及将SEQ ID NO:2的氨基酸编号482对应的氨基酸位置的精氨酸替换为苯丙氨酸。 SEQ ID NO:2与另一种氨基酸例如赖氨酸;包括对应于表3中所列氨基酸的突变/突变,其赋予增厚的糊粉层,例如。 在一个特别优选的实施方案中,谷粒具有至少一些DNA糖基化酶活性,优选一些ROS1a,因为有证据表明卵细胞中缺乏DNA糖基化酶活性和早期种子发育对水稻植物是致命的。具有DNA糖基化酶活性。 在一个实施例中,颗粒大约在 30% 和 98% 之间,或者在大约 40% 和 98% 之间,或者在大约 40% 和 90% 之间,或者在大约 40% 和 85% 之间,或者在大约 40% 和 80% 之间。较少 具有 DNA 糖基化酶活性。 【0113】 “基本上纯化的多肽”或“纯化的多肽”是指通常与脂质、核酸、其他肽和与其天然相关的其他污染物分子分离的多肽。 优选地,基本上纯化的多肽至少90%不含与其天然相关的其他成分。 在一个实施方案中,本发明的多肽具有不同于天然存在的ROS1a多肽的氨基酸序列,即如上所定义的氨基酸序列变体。 【0114】 本发明的谷物、植物和宿主细胞可含有编码本发明多肽的外源多核苷酸。 在这些情况下,谷物、植物和细胞会产生重组多肽。 术语“重组”,就多肽而言,包括由细胞产生时,通过重组DNA或RNA技术,例如转化,引入细胞或祖细胞的外源多肽。它是指由核苷酸编码的多肽. 通常,细胞包含产生改变量的多肽的非内源性基因。 在一个实施方案中,“重组多肽”是通过在植物细胞中表达外源(重组)多核苷酸产生的多肽。 【0115】 术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换使用。 【0116】 多肽的同一性百分比通过 GAP(Needleman 和 Wunsch,1970)分析(GCG 程序)确定,空位纯化罚分 = 5,空位延伸罚分 = 3。 查询序列的长度至少为 1,​​000 个氨基酸,GAP 分析在至少 1,000 个氨基酸的跨度内比对两个序列。 更优选地,查询序列的长度至少为 1,​​250 个氨基酸,GAP 分析在至少 1,250 个氨基酸的跨度内比对两个序列。 更优选地,查询序列的长度至少为 1,​​500 个氨基酸,并且 GAP 分析在至少 1,500 个氨基酸的跨度内比对两个序列。 甚至更优选地,GAP分析在其整个长度上比对两个序列,对于ROS1a多肽,其为约1,800-2,100个氨基酸残基。 【0117】 关于定义的多肽,应当理解比上面提供的那些更高的同一性百分比包括优选的实施方案。 因此,在适用的情况下,多肽将是至少 95%,更优选至少 96%,更优选至少 97%,更优选至少 97%,更优选至少 96%,更优选至少 97%,相对于指定的 SEQ ID NO 的最小同一性百分比,如果适用,优选至少 98%,更优选至少 99%,更优选至少 99.1%,更优选至少 99.2%,更优选至少 99.3 %,更优选至少99.4%,更优选至少99.5%,更优选至少99.6%,更优选至少99.7%,更优选至少99.8%,甚至更优选至少99.9%的氨基酸序列% 完全相同的。 【0118】 如本文所用,短语“在对应于氨基酸编号的位置”或其变体是指氨基酸与周围氨基酸相比的相对位置。 因此,在一些实施方案中,本发明的多肽可具有改变氨基酸相对位置的缺失或取代突变,例如当与SEQ ID NO:2比对时。 确定两个密切相关的蛋白质之间的相应氨基酸位置完全在本领域技术人员的能力范围内。 【0119】 本发明的多肽的氨基酸序列突变体可以通过将适当的核苷酸变化引入本发明的核酸中,或通过体外合成所需的多肽来制备。 此类突变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。 可以结合删除、插入和替换来获得最终的构建体,前提是最终的肽产物具有所需的特性。 与参考野生型多肽相比,优选的氨基酸序列突变体具有不超过1、2、3、4或10个氨基酸变化。 与相应的野生型天然 ROS1a 多肽(例如,包含具有如 SEQ ID NO:2 所示序列的氨基酸的多肽)相比,本发明的突变多肽具有降低的“ROS1a 多肽活性”。 【0120】 使用本领域已知的任何技术制备突变(改变的)多肽,例如定向进化或合理设计策略(见下文)。 当与包含具有如 SEQ ID NO:2 提供的序列的氨基酸的一种或多种或所有 ROS1a 多肽相比时,使用本文描述的技术衍生自突变/改变的 DNA 的产物可以容易地筛选以确定它是否具有ROS1a 多肽活性降低,例如 DNA 糖基化酶活性降低。 例如,该方法产生表达突变/修饰的 DNA 的转基因植物,i) 突变/修饰的 DNA 对糊粉层厚度的影响和 ii) ROS1a 基因是否突变/修饰。 【0121】 在设计氨基酸序列突变体时,突变位点的位置和突变的性质取决于待修饰的性质。 突变的位点,例如,(1)被非保守氨基酸选择取代,(2)删除目标残基,或(3)该位点侧翼的其他残基,可以单独或通过插入连续修饰。 【0122】 氨基酸序列缺失的范围通常为约1-15个残基,更优选约1-10个残基,通常约1-5个连续残基。 【0123】 取代突变体至少去除了多肽分子中的一个氨基酸残基,并在其位置插入了一个不同的残基。 在不希望维持给定活性或降低给定活性的情况下,优选进行非保守取代,特别是在相关蛋白质家族中高度保守的氨基酸位置。 非保守替换是表 1 中未显示的替换,因为保守替换的示例显示在表 1 中。 【0124】 在一个实施方案中,突变体/变体多肽与天然存在的多肽相比具有1或2或3或4个氨基酸变化。 在优选的实施方案中,变异是一种或多种基序,其在本文提供的不同ROS1a多肽中高度保守,特别是在已知的保守结构域中。 正如本领域技术人员所理解的那样,可以合理地预期此类变化会改变多肽在细胞内表达时的活性。 【0125】 基于与密切相关的酶,特别是DNA糖基化酶的比较,本发明多肽的一级氨基酸序列可用于设计其变体/突变体。 正如本领域技术人员将理解的那样,在密切相关的蛋白质中高度保守的残基特别容易发生非保守取代的改变,并且可能比非保守残基活性低(见上文)。 【0126】 表 1. 保守替代 【表格1】 【0127】 还包括在本发明的范围内的是本发明的多肽,其在合成后通过细胞中的翻译后修饰进行差异修饰,例如通过磷酸化,这可以调节它们的活性。 【0128】 多核苷酸和基因 本发明涉及各种多核苷酸。 如本文所用,“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸的聚合物,其可以是DNA或RNA,并且包括基因组DNA、mRNA、cRNA、dsRNA和cDNA。 它可以是细胞、基因组或合成来源的 DNA 或 RNA,例如在自动合成仪上制备,并且可以与碳水化合物、脂质、蛋白质或其他来源、荧光的或自然界中未发现的一种或多种来源结合,可以标记与其他基团或可以连接到固体支持物以执行如本文所定义的特定活性,并且是修饰核苷酸领域的技术人员所熟知的。 聚合物可以是单链的、基本上双链的或部分双链的。 如本文所用,碱基配对是指核苷酸之间的标准碱基配对,包括G:U碱基对。 “互补”是指两个多核苷酸能够沿其部分长度或沿一个或两个的整个长度进行碱基配对(杂交)。 “杂交的多核苷酸”是指该多核苷酸实际上与其互补序列碱基配对。 术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”互换使用。 本发明优选的多核苷酸编码本发明的多肽。 【0129】 “分离的多核苷酸”是指通常与与其在自然状态下相关联或连接的多核苷酸序列分离的多核苷酸,如果它存在于自然界中的话。 优选地,分离的多核苷酸至少90%不含当它在自然界中发现时与其天然相关的其他组分。 优选地,多核苷酸在自然界中不存在,例如,通过以自然界中未发现的方式共价连接两个较短的多核苷酸序列(嵌合多核苷酸)。 【0130】 本发明包括构建和使用降低的基因活性和嵌合基因。 如本文所用,术语“基因”包括含有蛋白质编码区或不翻译但在细胞内转录的任何脱氧核糖核苷酸序列,以及相关的非编码和调节区。 此类相关区域通常位于 5' 和 3' 端的编码或转录区域的两侧,两侧距离约为 2 kb。 在这样做时,该基因可能包含控制信号,例如天然连接到给定基因的启动子、增强子、终止和/或聚腺苷酸化信号,或异源控制信号,在这种情况下该基因被称为“嵌合基因” .叫。 位于编码区 5' 并存在于 mRNA 上的序列称为 5' 非翻译序列。 位于编码区 3' 或下游并存在于 mRNA 上的序列称为 3' 非翻译序列。 术语“基因”包括该基因的cDNA和基因组形式。 【0131】 “等位基因”是指细胞、个体植物或种群中基因序列(例如基因)的一种特定形式,一种与同一基因的其他形式至少在一个序列上不同的特定形式,以及一种或多种指基因序列中的变异位点,频率为 . 不同等位基因之间不同的这些变异位点的序列称为“差异”或“多态性”。 如本文所用,“多态性”是指等位基因之间、不同植物物种、栽培品种、品系或个体之间在本发明基因座处的核苷酸序列变异。 “多态性位置”是基因序列内发生序列分歧的预选核苷酸位置。 在一些情况下,遗传多态性导致由该基因编码的多肽内的氨基酸序列发生变化,因此多态性位置是指多态性在多肽序列中给定位置的氨基酸序列中的位置。带来 在其他情况下,多态性区域可能位于基因的非多肽编码区域,例如启动子区域,从而影响基因的表达水平。 典型的多态性是缺失、插入或替换。 这些可能包含单核苷酸(单核苷酸多态性或 SNP)或两个或多个核苷酸。 【0132】 如本文所用,“突变”是导致植物或其部分表型变化的多态性。 如本领域已知的,一些多态性是沉默的,例如,蛋白质编码区中的单一多态性不会由于遗传密码的复制而改变所编码多肽的氨基酸序列。 二倍体植物通常具有单个基因的一个或两个不同等位基因,但当基因的两个拷贝相同时只有一个,即植物具有纯合性。 多倍体植物通常具有任何给定基因的两个或多个同系物。 例如,六倍体小麦有三个亚基因组(通常称为“基因组”),称为 A、B 和 D 基因组,因此 A、B 和 D 基因组各有一个基因。它主要有三个同源物。 【0133】 如本文所用,术语“编码ROS1a多肽的ROS1a基因”或“ROS1a基因”是指编码如本文定义的ROS1a多肽的核苷酸序列。 ROS1a基因可以是内源性、天然存在的基因,或者可以包含如本文定义的基因的突变(优选引入的基因突变)。 在本发明的谷物中编码ROS1a多肽的ROS1a基因可以有也可以没有内含子。 在一个实施例中,本发明的谷粒源自水稻,并且与来自野生型水稻的相应 ROS1a 多肽相比,ROS1a 基因的至少一个等位基因具有降低的 DNA 糖基化酶活性。编码多肽(例如,包括氨基酸如 SEQ ID NO:2 中提供的序列)。 这种具有降低的 DNA 糖基化酶活性的 ROS1a 多肽的一个例子是水稻 Ta2 突变体(SEQ ID NO:1)。 【0134】 如本文所用,短语“或使ROS1a基因失活”或“降低ROS1a基因的表达”或其突变降低编码功能性ROS1a多肽的基因的表达(部分)或完全干扰任何遗传变异。 这种遗传改变减少了转录基因的转录,例如,基因编辑以删除或替换 ROS1a 基因启动子的核苷酸,或内含子剪接以改变剪接的数量或位置以形成 mRNA。包括启动子区域的突变通过使用突变的基因。 【0135】 包含转录区的基因的基因组形式或克隆可以被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断,这些非编码序列相对于“外显子”可以是同源的或异源的基因。它可以是任何一个。 如本文所用,“内含子”是作为初级RNA转录本的一部分转录的基因片段,但不存在于成熟mRNA分子中。 内含子从核或初级转录本中移除或“剪接”;因此信使 RNA (mRNA) 中不存在内含子。 如本文所用,“外显子”是指当RNA分子未被翻译时对应于存在于成熟mRNA或RNA分子中的RNA序列的DNA区域。 mRNA 在翻译过程中发挥作用,以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。 术语“基因”包括合成的或融合的分子,其编码本文所述的发明蛋白质的全部或部分以及与上述任一者互补的核苷酸序列。 可以将该基因引入合适的载体中用于细胞内或优选染色体外维持以整合到宿主基因组中。 【0136】 如本文所用,“嵌合基因”是指包含在自然界中未发现的共价连接序列的任何基因。 通常,嵌合基因包含在自然界中不存在的调节和转录或蛋白质编码序列。 因此,嵌合基因可以包含源自不同来源的调控和编码序列,或源自相同来源但以不同于自然界中发现的方式排列的调控和编码序列。 在一个实施方案中,ROS1a基因的蛋白质编码区可操作地连接到与ROS1a基因异源的启动子或聚腺苷酸化/终止子区,从而形成嵌合基因。 在另一个实施方案中,编码下调谷粒中ROS1a多肽的产生和/或活性的多核苷酸的基因是当存在于水稻谷粒中时与该多核苷酸异源的启动子或基因。它可操作地连接到聚腺苷酸化/终止子区域,从而形成嵌合基因。 【0137】 如本文所用,术语“内源”用于指在与受试植物相同发育阶段的未修饰植物中正常存在或产生的物质。 “内源基因”是指在生物体基因组中处于其自然位置的天然基因。 如本文所用,“重组核酸分子”、“重组多核苷酸”或其变体是指通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。 术语“外来多核苷酸”或“外源多核苷酸”或“异源多核苷酸”等是指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸。 【0138】 外来或外源基因可以是插入非天然生物体的基因、引入天然宿主内新位置的天然基因或嵌合基因。 “转基因”是通过转化程序引入基因组的基因。 术语“遗传修饰”包括通过转化或转导将基因引入细胞、细胞中基因的突变,以及在发生这些作用的细胞或生物体或其后代中控制基因.包括改变或调制。 【0139】 此外,就多核苷酸(核酸)而言,术语“外源”是指当存在于细胞中时天然不含有该多核苷酸的多核苷酸。 细胞含有导致编码多肽产生改变的非内源性多核苷酸,例如增加内源性多肽表达或产生天然状态多肽的外源性多核苷酸。 本发明多肽产量的增加在本文中也称为“过表达”。 本发明的外源多核苷酸是尚未从转基因(重组)细胞或不含其所在细胞的表达系统的其他组分中分离出来的多核苷酸,并且未从至少其他组分中纯化,包括在此类中产生的多核苷酸细胞或细胞系统。 外源多核苷酸(核酸)可以是自然界或不同来源(天然存在的和/或合成的核苷酸)连接形成单个多核苷酸的一段连续核苷酸。)包含两个或更多个连续的核苷酸片段,来自 通常,此类嵌合多核苷酸将具有编码本发明多肽的开放阅读框,该开放阅读框可操作地连接至适合驱动目标细胞中开放阅读框转录的启动子。 【0140】 多核苷酸同一性百分比通过 GAP(Needleman 和 Wunsch,1970)分析(GCG 程序)确定,空位纯化罚分 = 5,空位延伸罚分 = 3。 查询序列的长度至少为 3,000 个核苷酸,GAP 分析在至少 3,000 个核苷酸的跨度内比对两个序列。 甚至更优选地,查询序列的长度至少为 3,750 个核苷酸,并且 GAP 分析在至少 3,750 个核苷酸的跨度内比对两个序列。 甚至更优选地,查询序列的长度至少为 4,500 个核苷酸,并且 GAP 分析在至少 4,500 个核苷酸的跨度内比对两个序列。 甚至更优选地,GAP分析在其整个长度上比对两个序列。 【0141】 关于定义的多核苷酸,应当理解,高于以上提供的那些的同一性百分比包括优选的实施方案。 因此,在适用的情况下,相对于指定的 SEQ ID NO,多核苷酸至少 95%,更优选至少 96%,更优选至少 97%,更优选至少 97%,更优选至少 96%,给定最小同一性数百分比。优选至少 98%,更优选至少 99%,更优选至少 99.1%,更优选至少 99.2%,更优选至少 99.3%,更优选至少 99.4%,更优选至少99.5%,更优选包含至少99.6%,更优选至少99.7%,更优选至少99.8%,甚至更优选至少99.9%相同的核苷酸序列。 【0142】 本发明还涉及寡核苷酸的用途,例如,在筛选本发明的多核苷酸或编码本发明的多肽的方法中。 如本文所用,“寡核苷酸”是长度最多为50个核苷酸的多核苷酸。 此类寡核苷酸的最小大小是寡核苷酸与本发明核酸分子上的互补序列之间稳定杂交形成所需的大小。 它们可以是 RNA、DNA 或其组合或衍生物。 寡核苷酸是相对较短的单链分子,一般为10-30个核苷酸,一般长度为15-25个核苷酸。 当在扩增反应中用作探针或引物时,此类寡核苷酸的最小大小是寡核苷酸与靶核酸分子上的互补序列之间稳定杂交形成所需的大小。 优选地,寡核苷酸的长度为至少15个核苷酸,更优选至少18个核苷酸,更优选至少19个核苷酸,更优选至少20个核苷酸,甚至更优选至少25个核苷酸。 用作探针的本发明的寡核苷酸通常与标记例如放射性同位素、酶、生物素、荧光或化学发光分子缀合。 【0143】 本发明包括可用作例如鉴定核酸分子的探针或用作产生核酸分子的引物的寡核苷酸。 可以使用探针和/或引物从其他物种克隆本发明的多核苷酸的同系物。 此外,本领域已知的杂交技术可用于筛选基因组或cDNA文库以寻找此类同系物。 【0144】 本发明的多核苷酸和寡核苷酸包括在严格条件下与如 SEQ ID NO: 1 或 2 提供的一个或多个序列杂交的那些。 如本文所用,严格条件定义为 (1) 低离子强度和高温洗涤,例如 0.015 M NaCl/0.0015 M 柠檬酸钠/0.1% NaDodSO ₄ (2) 杂交时的甲酰胺,例如,50% (vol/vol) 甲酰胺含有 0.1% 牛血清白蛋白、0.1% 聚蔗糖、0.1% 聚乙烯吡咯烷酮、750 mM NaCl。使用 50 mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.5、75 mM 柠檬酸钠( 42°C);或 (3) 50% 甲酰胺、5×SSC(0.75 M NaCl、0.075 M 柠檬酸钠)、50 mM 磷酸钠。(pH 6.8)、0.1% 焦磷酸钠、5× Denhardt 溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、10%硫酸葡聚糖(42℃、0.2×SSC、0.1%SDS)是使用变性剂等的条件。 【0145】 与天然存在的分子相比,本发明的多核苷酸可具有一个或多个突变,即核苷酸残基的缺失、插入或取代。 突变体可以是天然存在的(即,从天然来源分离)或合成的(例如,通过对核酸进行定点诱变)。 本发明的多核苷酸或寡核苷酸的变体是如本文定义的参考多核苷酸或寡核苷酸分子,优选水稻基因组大小和/或接近内源ROS1a基因的可杂交分子,包括。 例如,变体可以包含额外的核苷酸(例如,1、2、3、4或更多)或更少的核苷酸,只要它仍然与目标区域杂交即可。 此外,可以进行一些核苷酸取代而不影响寡核苷酸与靶区域杂交的能力。 此外,可以容易地设计突变体,其在植物基因组的区域附近杂交,本文定义的特定寡核苷酸与其杂交,例如在50个核苷酸内。 具体而言,这包括编码相同多肽或氨基酸序列但由于遗传密码重复而核苷酸序列不同的多核苷酸。 术语“多核苷酸变体”和“突变体”还包括天然存在的等位基因变体。 【0146】 基因突变 如本文所用,术语“遗传变异”是指谷粒的一种或多种细胞,优选糊粉层、果皮、软体动物、子房中的至少一种或多种或全部,是指发育中谷粒的种皮和淀粉质胚乳中的细胞,或具有可由人类引入的遗传修饰的本发明植物或其部分的细胞,或水稻中可能天然存在的细胞(例如,杂交以产生本发明的植物)。 【0147】 如本文所用,术语“一种或多种引入的遗传变异”是指谷粒的一种或多种细胞,优选至少一种或多种或所有糊粉层、果皮、耳屏中的细胞、子房、种皮和发育中谷物的淀粉质胚乳,或本发明的植物细胞或其具有可由人类引入的遗传修饰的部分。 在一个优选的实施方案中,谷粒或植物或其部分中的所有细胞都含有引入的基因突变。 如本领域技术人员将理解的,编码但不限于其中ROS1a基因(例如,dsRNA分子或微RNA)的表达降低的外源多核苷酸的核酸构建体不同于相应野生型的氨基酸序列-型 ROS1a 多肽。以及编码 ROS1a 多肽的外源多核苷酸,该多肽具有与相应的野生型 ROS1a 多肽相比具有降低(优选一些,但可能没有)DNA 糖基化酶活性的氨基酸序列。核酸构建体编码,基因组工程化通过基因编辑降低内源性 ROS1a 基因的活性,并使用 TILLING 对生产 ROS1a 多肽 DNA 糖基化酶活性降低的谷粒的植物进行突变。可以进行许多不同类型的遗传修饰,例如引入和选择。 【0148】 如本文所用,与“一个或多个基因突变”或“一个或多个引入的基因突变”相关的术语“至少一个 ROS1a 基因的活性降低”是指导致 ROS1a 基因的量或活性降低的基因突变。与相应的野生型水稻相比,该基因表达的 ROS1a 多肽。 在一个实施例中,谷物包含具有至少一些DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。 【0149】 在一个实施方案中,基因突变不下调非ROS1a多肽的DNA乙二醇酶活性。 例如,遗传变异不使本发明的水稻ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽中的每一种的DNA糖基化酶活性降低超过10%或30%。 或者,基因突变使 ROS1b、ROS1c 和 ROS1d 多肽中至少一种的 DNA 糖基化酶活性降低至少 30%。 【0150】 RNA干扰 RNA 干扰 (RNAi) 对于特异性降低基因的表达特别有用,因此如果基因编码蛋白质,则该特定蛋白质的产量就会减少。 不希望受理论束缚,Waterhouse 等人(1998)提供了一个机制模型,通过该模型可以使用 dsRNA(双链 RNA)来减少蛋白质生产。 该技术依赖于 dsRNA 分子的存在,其包含与感兴趣基因或其部分的 mRNA 基本相同的序列。 方便地,dsRNA可以从重组载体或宿主细胞中的单个启动子产生,其中有义和反义序列杂交形成环。 . 合适的 dsRNA 分子的设计和生产尤其考虑 Waterhouse 等人(1998)、Smith 等人(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029 和 WO 01/34815。本领域技术人员的能力。 【0151】 在一个实施方案中,引入指导与ROS1a基因同源的至少部分双链RNA产物的合成的DNA。 因此,DNA 包括有义和反义序列,当转录成 RNA 时,它们可以杂交形成双链 RNA 区域。 在本发明的一个实施例中,有义和反义序列由包含内含子的间隔区分开,内含子在转录成 RNA 时被剪接掉。 这种安排已被证明可以提高基因沉默的效率(Smith 等人,2000)。 双链区域可包含从一个或两个DNA区域转录的一个或两个RNA分子。 双链分子的存在被认为会引发内源性系统反应,破坏双链 RNA 和来自靶基因的同源 RNA 转录物,从而有效降低或消除靶基因活性。 【0152】 杂交的有义和反义序列的长度各为至少19个连续核苷酸,优选至少30或至少50个连续核苷酸,更优选至少100或至少200个连续核苷酸。 通常,使用对应于靶基因mRNA区域的100-1000个核苷酸的序列。 可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。 有义序列与靶转录物的同一性程度(以及反义序列与靶转录物的互补序列的同一性)应至少为 85%、至少 90% 或 95-100%,优选地。与目标序列相同。 自然地,RNA 分子可能包含不相关的序列,这些序列可能起到稳定分子的作用。 RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的控制下表达。 后者的例子包括 tRNA 或 snRNA 启动子。 【0153】 优选的小干扰RNA(“siRNA”)分子含有与靶mRNA的约19-25个连续核苷酸相同的核苷酸序列。 优选地,siRNA序列以二核苷酸AA开始,包含约30-70% (优选30-60%,更优选40-60%,更优选约45-55%)的GC含量并且被引入。与待测生物基因组中除靶序列外的任何核苷酸序列具有高百分比同一性,例如,通过标准BLAST搜索确定。 【0154】 可使用常规程序容易地产生用于本发明的dsRNA。 【0155】 微小核糖核酸 microRNAs(简称miRNAs)是一种非编码RNA分子,一般长度为19-25个核苷酸(在植物中一般约为20-24个核苷酸),来源于形成不完美茎环结构的较大前体。 miRNA 通常与表达将被降低的目标 mRNA 区域完全互补,但不需要完全互补。 【0156】 miRNA 与目标信使 RNA 转录物 (mRNA) 上的互补序列结合,通常会导致翻译抑制或靶向降解和基因沉默。 如本领域所熟知的,可以基于天然miRNA设计人工miRNA(amiRNA)以降低任何目的基因的表达。 【0157】 在植物细胞中,miRNA 前体分子被认为主要在细胞核中加工。 pri-miRNAs(包含一个或多个局部双链或“发夹”区域以及 mRNA 的正常 5'“帽”和聚腺苷酸化尾巴)是较短的 miRNA 前体,也包含茎环或折叠结构。它们被加工成称为“pre-miRNA”的分子。 在植物中,pre-miRNA 被不同的 DICER 样 (DCL) 酶切割以产生 miRNA:miRNA* 双链体。 这些双链体在从细胞核输出之前被甲基化。 【0158】 在细胞质中,来自 miRNA:miRNA 双链体的 miRNA 链被选择性地掺入活性 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC) 中用于目标识别。 RISC 复合体包含 Argonaute 蛋白的特定子集,可发挥序列特异性基因沉默作用(例如 Millar 和 Waterhouse,2005;Pasquinelli 等,2005;Almeida 和 Allshire,2005)。 【0159】 可使用常规程序容易地产生用于本发明的微小RNA。 例如,ROS1a amiRNA(人工 microRNA)构建体的设计可以基于 Fahim 等人(2012)描述的一般方法。 WMD3 软件 (www.wmd3.weigelworld.org/) 可用于识别 ROS1a 基因中合适的 amiRNA 靶标。 根据以下四个标准选择 amiRNA 目标:1) 相对 5' 不稳定性,使用 5' 端富含 AT 且 3' 端富含 GC 的序列;以及切割位点的 A(位置 10 之间)和 11);在位置 1-9 和 13-21 分别有最多 1 个和 4 个错配,如果 amiRNA 与目标 RNA 杂交,则预期的自由度。能量 (ΔG) 为 -30kcal mol ^-1 小于(Ossowski 等人,2008 年)。 对于基因特异性表达减少,候选 amiRNA 序列在显示与 OsROS1a 所有同源物比对的最低同源性的区域中选择,因此 ROS1 同源物和同源物的脱靶减少表达的可能性降低。 水稻 miR395 的前体(Guddeti 等人,2005 年;Jones-Rhoades 和 Bartel,2004 年;Kawashima 等人,2009 年)可选择作为 amiRNA 主链,用于插入 amiRNA 序列。 为了设计和生成构建体,将 miR395 中的五个内源性 miRNA 靶标替换为五个用于 TA2 敲低的 amiRNA 靶标。 【0160】 共抑制 基因可以抑制基因组中已经存在的相关内源基因和/或转基因的表达,这种现象称为同源依赖性基因沉默。 大多数同源依赖性基因沉默的例子分为两类,一类在转基因的转录水平发挥作用,另一类在转录后发挥作用。 【0161】 转录后同源依赖性基因沉默(即共抑制)描述了转基因植物中转基因和相关内源或病毒基因表达的丧失。 共抑制在转基因转录物中很丰富,通常被认为是在 mRNA 加工、定位和/或降解水平上被诱导的。 存在几种模型来解释共抑制的工作原理(参见 Taylor,1997)。 【0162】 共抑制涉及将基因或其片段的额外拷贝以相对于其表达的启动子的有义方向引入植物中。 有义片段的大小、其与目标基因区域的对应关系、以及其与目标基因的序列同一性程度可由本领域技术人员确定。 在某些情况下,基因序列的额外拷贝会干扰目标植物基因的表达。 有关如何实施共抑制方法的信息,请参见 WO 97/20936 和 EP 0465572。 【0163】 反义多核苷酸 术语“反义多核苷酸”是指与编码内源性多肽的特定mRNA分子的至少一部分互补并且能够干扰转录后事件如mRNA翻译的DNA或RNA分子。 反义方法的使用是本领域众所周知的(参见,例如,G. Hartmann 和 S. Endres,Manual of Antisense Methodology,Kluwer (1999))。 Bourque (1995) 和 Senior (1998) 对反义技术在植物中的应用进行了综述。 Bourque (1995) 举了很多例子说明反义序列如何在植物系统中用作基因失活的方法。 Bourque 还指出,可能没有必要实现 100% 的酶活性抑制,因为部分抑制可能会导致系统发生可测量的变化。 Senior (1998) 指出,反义技术是一种非常完善的基因表达操纵技术。 【0164】 在一个实施例中,反义多核苷酸在生理条件下杂交,即反义多核苷酸(其是完全或部分单链的)在细胞内的正常条件下是内源性ROS1a。至少双链多核苷酸可以与mRNA形成编码多肽。 【0165】 反义分子可包含对应于结构基因或控制基因表达或剪接事件的序列的序列。 例如,反义序列可对应于内源基因的靶编码区,或5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR或其组合。 它可以与转录期间或转录后可剪接的内含子序列部分互补,最好仅与目标基因的外显子序列互补。 鉴于 UTR 的差异通常更大,靶向这些区域可提供更大的基因抑制特异性。 【0166】 优选地,反义序列的长度为至少19个连续核苷酸,优选至少30或至少50个核苷酸,更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。 可以使用与所有基因转录物互补的全长序列。 其长度最优选为100-2000个核苷酸。 反义序列与靶转录物的同一性程度优选为至少90%,更优选95-100%,通常为100%同一性。 当然,反义 RNA 分子可以包含不相关的序列,这些序列可以起到稳定分子的作用。 【0167】 使用位点特异性核酸酶进行基因组编辑 基因组编辑使用由融合到非特异性 DNA 切割模块的序列特异性 DNA 结合域组成的修饰核酸酶。 这些嵌合核酸酶通过刺激细胞的内源性细胞 DNA 修复机制诱导靶向 DNA 双链断裂来修复诱导的断裂,从而实现高效和精确的基因修饰。 这样的机制包括,例如,容易出错的非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。 【0168】 在存在具有扩展同源臂的供体质粒的情况下,HDR 可以指导引入单个或多个转基因以纠正或替换现有基因。 在没有供体质粒的情况下,NHEJ 介导的修复会产生导致基因破坏的靶向小插入或缺失突变。 【0169】 用于本发明方法的修饰核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样(TAL)效应核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9型位点特异性核酸酶。 【0170】 通常,核酸酶编码的基因通过质粒 DNA、病毒载体或体外转录的 mRNA 传递到细胞。 使用荧光替代报告载体还可以富集 ZFN、TALEN 或 CRISPR 修饰的细胞。 【0171】 复杂的基因组通常包含多个序列副本,这些序列与目标 DNA 靶标相同或高度同源,可能导致脱靶活性和细胞毒性。 为了解决这个问题,结构(Miller 等人,2007 年;Szczepek 等人,2007 年)旨在生成改进的 ZFN 和 TALEN 异二聚体,具有最佳的切割特异性和降低的毒性,并且基于选择(Doyon 等人,2011 年;Guo等人,2010)的方法可以使用。 【0172】 根据本发明的优选实施方案,必须在宿主DNA中鉴定出两个9bp锌指DNA识别序列,以便通过ZFN靶向基因重组或突变。 这些识别位点彼此相对,并由大约 6 bp 的 DNA 分开。 然后,通过设计和生产可将 DNA 特异性结合到目标位点的锌指组合,然后将锌指连接到 DNA 切割域,从而生成 ZFN。 【0173】 转录激活因子样 (TAL) 效应核酸酶 (TALEN) 包含一个 TAL 效应 DNA 结合结构域和一个核酸内切酶结构域。 【0174】 TAL 效应子是由病原体注入植物细胞的植物致病细菌蛋白,在那里它们易位到细胞核并作为激活特定植物基因的转录因子发挥作用。 TAL 效应子的一级氨基酸序列需要其结合的核苷酸序列。 因此,可以预测 TAL 效应子的靶位点,并且可以将 TAL 效应子设计为与特定核苷酸序列结合。 【0175】 与编码 TAL 效应子的核酸序列融合的是编码核酸酶或部分核酸酶的序列,通常源自 II 型限制性核酸内切酶,例如 FokI(Kim 等人,1996)。非特异性切割域。 其他有用的核酸内切酶可以包括,例如,HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI 和 AlwI。 某些核酸内切酶(例如 FokI)仅作为二聚体发挥作用这一事实可用于提高 TAL 效应子的靶标特异性。 例如,在某些情况下,每个 FokI 单体可以与识别不同 DNA 靶序列的 TAL 效应子序列融合,只有当两个识别位点非常接近时,无活性的单体才会聚集在一起,以产生功能性酶。 通过要求 DNA 结合来激活核酸酶,可以制备高度位点特异性的限制酶。 【0176】 序列特异性 TALEN 可以识别细胞中存在的预选靶核苷酸序列中的特定序列。 因此,在一些实施方案中,可以针对核酸酶识别位点扫描靶核苷酸序列并且可以基于靶序列选择特定的核酸酶。 在其他情况下,可以将 TALEN 设计为靶向特定的细胞序列。 【0177】 核酸构建体 本发明包括包含本发明的多核苷酸或可用于本发明的多核苷酸的核酸构建体,以及载体和宿主细胞,包括它们的制备和使用方法及其用途。 【0178】 本发明涉及可操作地连接或耦合的元件。 “可操作地连接”或“可操作地连接”等是指功能关系中的多核苷酸元件的连接。 通常,可操作连接的核酸序列连续地和任选地连续地并且在阅读框中连接以连接两个蛋白质编码区。 当 RNA 聚合酶将两个编码序列转录成单个 RNA 时,编码序列“可操作地连接”到另一个编码序列,当翻译时,将来自两个编码序列的氨基酸翻译成单个多肽。 编码序列不需要彼此连续,只要表达的序列最终被加工以产生所需的蛋白质即可。 【0179】 如本文所用,术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”或“顺式调节区”或“调节区”或类似术语意指任何核苷酸序列。连接到可表达的基因序列,可以至少部分调节基因序列的表达。 本领域技术人员知道顺式调节区在转录或转录后激活、沉默、增强、抑制或以其他方式调节基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。水平。你会认识到你可以改变。 在本发明的优选实施方案中,顺式作用序列是增强或刺激可表达基因序列表达的激活序列。 【0180】 “将启动子或增强子元件可操作地连接”到可转录多核苷酸是指将可转录多核苷酸(例如,编码蛋白质或其他转录物的多核苷酸)置于启动子的调节控制之下。并且启动子的调节控制控制其多核苷酸的转录. 在构建异源启动子/结构基因组合时,通常优选将启动子或其变体放置在远离可转录多核苷酸的转录起始位点的位置,其在其自然环境中受到控制。与启动子和蛋白质大致相同-它起源的编码区;即启动子所源自的基因。 如本领域中已知的,可以在不损失功能的情况下适应该距离的一些变化。 类似地,调控序列元件(例如,操纵子、增强子等)相对于置于其控制下的可转录多核苷酸的优选放置由该元件在其自然环境中的定位决定;它是一种基因, 【0181】 如本文所用,“启动子”或“启动子序列”是指通常在RNA编码区上游(5')的遗传区域,其控制感兴趣细胞中转录的起始和水平。 “启动子”包括经典基因组基因的转录控制序列,例如 TATA 盒和 CCAAT 盒序列,以及响应发育和/或环境刺激或组织或细胞特异性方式而改变基因表达的额外控制。包括元素(即上游激活序列、增强子和消音器)。 启动子通常但不一定(例如 PolIII 启动子)位于结构基因的上游以控制其表达。 此外,包括启动子在内的调节元件通常位于基因转录起始位点的 2 kb 以内。 启动子可以具有位于起始位点远端的额外特异性调节以进一步增强细胞中的表达和/或改变与其有效连接的结构基因的表达的时间或诱导能力。可以包含元件。 【0182】 “组成型启动子”是指指导可操作连接的转录序列在生物体如植物的许多或所有组织中表达的启动子。 如本文所用,术语“组成型”不一定表示基因在所有细胞类型中以相同水平表达,尽管通常可检测到一些水平差异。然而,该基因在广泛的细胞类型中表达。 如本文所用,“选择性表达”几乎专门指在特定植物器官例如胚乳、胚、叶、果实、块茎或根中的表达。 在一个优选的实施方案中,该启动子选择性地或优先地在植物谷粒中表达,优选水稻。 因此,选择性表达可以与组成型表达形成对比,组成型表达是指在植物所经历的大多数或所有条件下在植物的许多或所有组织中的表达。 【0183】 选择性表达还可导致特定植物组织、器官或发育阶段的基因表达产物区室化。 质体、细胞质、液泡或质外体等特定亚细胞位置的区室化为运输到所需的细胞区室提供了适当的信号,例如,这可以通过包含或在半自主细胞器(质体和线粒体)的情况下实现, 通过将适当的调控序列与转基因直接整合到细胞器基因组中。 【0184】 “组织特异性启动子”或“器官特异性启动子”是指许多其他组织或器官,优选所有,如果不是大部分,例如植物的其他组织或器官。或优先表达的启动子在器官中。 通常,启动子在某些组织或器官中的表达水平是其他组织或器官中的 10 倍。 【0185】 本发明优选的种子特异性启动子包括油菜籽 napine 基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆 USP 启动子(Baumlein 等人,1991)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)、phaseolus bulgari phaseolin( Phaseolus vulgaris phaseolin)启动子(US 5,504,200)、Brassica Bce4启动子(WO 91/13980)或legmin B4启动子(Baumlein等,1992),以及在水稻​​中诱导种子特异性表达的启动子等。 值得注意的合适启动子是大麦 LPT2 或 LPT1 基因启动子(WO 95/15389 和 WO 95/23230)或 WO 99/16890 中描述的启动子(来自大麦大麦醇溶蛋白基因的启动子)。 其他启动子包括 Broun 等人 (1998)、Potenza 等人 (2004)、US20070192902 和 US20030159173 描述的那些。 在一个实施方案中,种子特异性启动子优先在种子的有限部分表达,例如胚乳,优选在发育中的糊粉层中表达。 在另一个实施方案中,种子特异性启动子在种子发芽后不表达,或仅以低水平表达。 【0186】 在一个实施例中,它至少在开花时间和开花后 7 天之间是活跃的,或者在此期间是完全活跃的。 这种启动子的一个例子是 ROS1a 基因启动子。 【0187】 在一个实施方案中,可操作地连接到减少ROS1a基因表达的外源多核苷酸的启动子不是高MW麦谷蛋白启动子。 【0188】 本发明考虑的启动子对于待转化的宿主植物而言可以是天然的,或者可以源自替代来源,其中其区域在宿主植物中是有功能的。 其他来源是农杆菌 T-DNA,例如胭脂碱、八角碱、甘露碱或其他冠冕碱生物合成基因的启动子、组织特异性启动子(参见例如 US 5,459,252 和 WO 91/13992)基因;包括来自病毒的启动子(包括宿主特异性病毒),或部分或全部合成的启动子。 许多在单子叶和双子叶植物中有功能的启动子是本领域众所周知的,包括从植物和病毒分离的各种启动子,例如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S,19S)。(参见,例如,Greve,1983;Salomon 等人)等人,1984 年;加芬克尔等人,1983 年;巴克等人,1983 年)。 Medberry 等人(1992 和 1993)、Sambrook 等人(1989,同上)和 US 5,164,316 公开了评估启动子活性的非限制性方法。 【0189】 或者或另外,启动子可以是诱导型启动子或发育调节的启动子,其能够驱动引入的多核苷酸的表达,例如,在植物发育的适当阶段。 增强子区域是本领域技术人员所熟知的并且可以包括ATG翻译起始密码子和相邻序列。 如果包括在内,起始密码子应与与外源或外源多核苷酸相关的编码序列的阅读框同步,以确保在翻译时翻译整个序列。 翻译起始区可由转录起始区来源或外源或外源多核苷酸提供。 该序列也可以源自选择用于促进转录的启动子来源,并且可以被特异性修饰以增加mRNA的翻译。 【0190】 本发明的核酸构建体可包括约50至1,000个核苷酸碱基对的3'非翻译序列,其可包括转录终止序列。 3'非翻译序列可包括转录终止信号,其可包括或不包括聚腺苷酸化信号和能够影响任何mRNA加工的其他调节信号。 聚腺苷酸化信号的作用是将聚腺苷酸束添加到前体 mRNA 的 3' 端。 Polyadenylation 信号通常通过与规范 5'AATAAA-3' 的同源性来识别,尽管突变并不少见。 不含聚腺苷酸化信号的转录终止序列包括含有 4 个或更多胸苷片段的 PolI 或 PolIII RNA 聚合酶的终止子。 合适的 3' 非翻译序列的例子是来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶 (ocs) 基因或胭脂碱合酶 (nos) 基因的聚腺苷酸化信号(Bevan 等人,1983)。3' 转录的非翻译区包含 合适的 3' 非翻译序列是 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 (ssRUBISCO),尽管也可以使用本领域技术人员已知的其他 3' 元件。)基因。 【0191】 插入转录起始位点和编码序列起始位置之间的 DNA 序列,即未翻译的 5' 前导序列 (5'UTR),在转录和翻译时都会影响基因表达。,也可以使用特定的前导序列顺序。 合适的前导序列包括那些包含被选择以指导外源或内源DNA序列的最佳表达的序列。 例如,这样的前导序列包括优选的共有序列,其可以增加或维持mRNA稳定性并防止不适当的翻译起始,例如,如Joshi(1987)中所述。 【0192】 本发明包括使用载体来操作或转移遗传构建体。 “嵌合载体”是指核酸分子,优选衍生自质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子,其中可以插入或克隆核酸序列。 载体优选为双链DNA,包含一个或多个特征性限制性位点,并且能够在指定的宿主细胞中自主复制,包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织。或者克隆的序列可以可重复地整合到指定的宿主中基因组。 因此,载体可以是自主复制的载体,即其复制作为独立于染色体复制的染色体外实体存在的载体,例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。 载体可以包含确保自我复制的任何手段。 或者,载体可以是这样的载体,当其被引入细胞时,整合到受体细胞的基因组中并与它整合到其中的染色体一起复制。 载体系统可包含单个载体或质粒、两个或更多个载体或质粒,它们一起包含要引入宿主细胞基因组中的完整DNA或转座子。 载体的选择通常取决于载体与其引入的细胞的相容性。 载体还可以包含选择标记,例如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因或可用于选择合适的转化体的其他基因。 此类基因的实例是本领域技术人员众所周知的。 【0193】 可以将本发明的核酸构建体导入质粒等载体中。 质粒载体通常含有额外的核酸序列,便于在原核和真核细胞中选择、扩增和转化表达盒,例如 pUC 衍生的,包括一个或多个 T-DNA 区域载体、pSK 衍生的载体、pGEM - 衍生载体、pSP 衍生载体、pBS 衍生载体或二元载体。 额外的核酸序列可以包括复制起点以提供载体的自主复制,优选编码抗生素或除草剂抗性的选择标记基因,核酸构建体中编码的核酸序列或用于基因插入的多个位点,以及增强原核和真核(特别是植物)细胞转化的序列。 【0194】 “标记基因”是指赋予表达标记基因的细胞不同表型的基因,从而允许如此转化的细胞与不具有标记的细胞区分开来。 选择标记基因赋予可基于对选择剂(例如,除草剂、抗生素、辐射、热或其他损害未转化细胞的处理)的抗性而被“选择”的性状。 可筛选标记基因(或报告基因)赋予可通过观察或测试(即“筛选”)鉴定的性状(例如,β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、GFP 或非转化细胞中不存在的其他基因)。活动)。 不需要连接标记基因和感兴趣的核苷酸序列。 【0195】 为了促进转化体的鉴定,核酸构建体理想地包括可选择的或可筛选的标记基因作为或除了外源或外源多核苷酸之外。 标记的实际选择并不重要,只要它与选定的植物细胞结合是有功能的(即选择性的)。 未连接基因的共转化也是植物转化中的有效过程,例如,如美国专利 . 【0196】 细菌选择标记的实例是赋予抗生素抗性的标记,例如氨苄青霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性,优选卡那霉素抗性。 用于选择植物转化的合适标记的实例包括但不限于编码潮霉素 B 抗性的 hyg 基因;赋予卡那霉素、巴龙霉素、G418 抗性的新霉素磷酸转移酶 (nptII) 基因;谷胱甘肽-S-转移酶赋予对来自大鼠肝脏的诱导谷胱甘肽的除草剂的抗性的基因,如所述;谷氨酰胺合成酶抑制剂,例如草胺膦,当过表达时,例如,如 WO 87/05327 中所述,赋予对谷氨酰胺合酶的抗性的谷氨酰胺合成酶基因,例如编码 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) 赋予对 N-phosphonomethylglycine 的抗性,如 WO91/02071 中所述,如 et al. (1988) 所述,例如 WO91/02071中;腈水解酶基因,例*自 Klebsiella ozaenae 的 bxn,它赋予对溴苯腈的抗性(Stalker 等人,1988);和二氢叶酸还原酶(DHFR),它赋予对甲氨蝶呤的抗性。)基因(Tillet 等人,1988);突变体乙酰乳酸合酶基因 (ALS) 赋予对咪唑啉酮类、磺酰脲类或其他 ALS 抑制化学品的抗性 (EP 154,204);对 5-甲基色氨酸或 dalapon 脱卤素酶基因的抗性赋予对除草剂的抗性。 【0197】 优选的可筛选标记包括但不限于编码具有已知显色底物的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)酶的uidA基因、编码具有已知显色底物的酶的β-半乳糖苷酶基因、钙水母蛋白基因,其可用于用于灵敏的生物发光检测的基因(Prasher et al., 1985);绿色荧光蛋白基因(Niedz et al., 1995)或其衍生物荧光素酶(luc),它允许生物发光检测基因(Ow et al., 1986),以及本领域已知的其他人。 如本文所用,“报道分子”是指凭借其化学性质提供分析上可识别的信号的分子,该信号有助于通过参照蛋白质产物来确定启动子活性。 【0198】 优选地,核酸构建体例如稳定地整合到本发明的植物或细胞的基因组中。 因此,核酸包含允许分子整合到基因组中的合适元件,或者将构建体置于合适的载体中以允许其整合到植物细胞的染色体中。 【0199】 本发明的一个实施方案包括重组载体,其包含至少一种本发明的多核苷酸分子,其插入到能够将核酸分子递送至宿主细胞的任何载体中。 此类载体含有异源核酸序列,即未天然发现与本发明的核酸分子相邻的异源核酸序列,并且优选衍生自不同于衍生核酸分子的物种的物种。 载体可以是原核生物或真核生物,也可以是 RNA 或 DNA,通常是病毒或质粒。 【0200】 许多适用于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的载体是可用的,例如,Pouwels 等人,Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987;Academic Press, 1989;和 Gelvin 等人,植物分子生物学手册,Kluwer Academic Publishers,1990。 通常,植物表达载体含有一种或多种在例如5'和3'调控序列和显性选择标记的转录控制下的克隆植物基因。 此类植物表达载体还可以包括启动子调节区(例如控制诱导或组成型、环境或发育、或细胞或组织特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点,和/或聚腺苷酸化信号。 【0201】 ROS1s 多肽的水平通过降低水稻蛋白质编码基因的表达水平来增加糊粉层厚度来调节。 基因的表达水平通过改变每个细胞的拷贝数来调节,例如通过引入包含编码序列和与其可操作地连接并在细胞内起作用的转录控制元件的合成基因构建体。 可以选择多个转化体并筛选那些由于转基因整合位点附近的内源序列的影响而具有有利的转基因表达水平和/或特异性的转化体。 优选的转基因表达水平和模式是那些导致糊粉层增加的水平和模式。 或者,可以针对糊粉层厚度增加的单个品系筛选诱变种子群或来自育种计划的植物群。 【0202】 重组细胞 本发明的其他实施方案包括重组细胞,包括用一种或多种本发明的重组分子或其后代转化的宿主细胞。 可以通过能够将核酸分子插入细胞中的任何方法将核酸分子转化到细胞中。 转化技术包括但不限于转染、电穿孔显微注射、脂转染、吸收和质外体融合。 重组细胞可以保持单细胞或可以长成组织、器官或多细胞生物。 本发明的转化的核酸分子可以以保留表达能力的方式整合到转化的(即,重组的)细胞的染色体内的一个或多个位点。 优选的宿主细胞是植物细胞,更优选水稻细胞。 【0203】 具有遗传变异的植物 术语“植物”在本文中作为名词使用时,指的是整株植物并表示植物界的任何成员,但当用作形容词时,例如植物器官(例如叶、茎、根、花),单细胞(例如花粉)、种子、植物细胞等。 幼苗和发芽的具有新根和芽的种子也包括在“植物”的含义内。 如本文所用,术语“植物部分”是指从植物获得并含有植物基因组DNA的一种或多种植物组织或器官。 植物部分包括营养结构(例如叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、子叶和种皮)、植物组织(例如维管组织、地面组织等)细胞及其后代。 如本文所用,术语“植物细胞”是指植物或源自植物的细胞、原生质体或源自植物的其他细胞、配子产生细胞和再生的完整植物。 植物细胞可以是培养物中的细胞。 “植物组织”是指植物中的分化组织或来源于肿瘤组织的未分化组织,如未成熟或成熟的胚、种子、根、芽、果实、块茎、花粉、冠瘿(“外植体”),以及各种形式的植物培养物中的细胞聚集,如愈伤组织。 种子中或来自种子的示例性植物组织是子叶、胚和胚轴。 因此,本发明包括植物和植物部分以及含有它们的产品。 【0204】 术语“谷物”和“种子”在本文中可互换使用。 “谷粒”是指植物的成熟谷粒、植物的发育谷粒、收获的谷粒或加工后的谷粒,例如研磨或磨碎,其中,根据上下文,大多数谷粒在收获后是完整的或保留的或发芽。 成熟谷物的水分含量通常低于约 18-20%。 在一个实施例中,本发明的发育谷粒在授粉后至少约 10 天 (DAP)。 在一个实施例中,本发明的发育谷粒包含至少在开花时间和开花后 7 天之间的谷粒。 【0205】 如本文所用,“转基因植物”是一种或多种如本文所定义的遗传转基因植物,其包含在相同物种、变种或栽培品种的野生型植物中未发现的核酸构建体。指具有突变的植物。 因此,转基因植物(转化植物)包含转化前不包含的遗传物质(转基因)。 转基因可以包括从植物细胞获得的遗传序列,或从植物细胞衍生的,或另一种植物细胞,或非植物来源,或合成序列。 通常,已经通过人为操作将转基因引入植物,例如转化,尽管可以使用本领域技术人员所理解的任何方法。 遗传物质优选稳定地整合到植物的基因组中。 引入的遗传物质可以包括相同物种的序列,例如反义序列,但是以重排的顺序或以不同的元件排列天然存在。 包含此类序列的植物在本文中被称为“转基因植物”。 【0206】 “非转基因植物”是未通过重组DNA技术引入遗传物质进行遗传修饰的植物。 【0207】 如本文所用,“野生型”是指未根据本发明进行修饰的细胞、组织、谷物或植物。 野生型细胞、组织或植物用作对照以比较外源核酸表达水平或由如本文所述修饰的细胞、组织、谷粒或植物引起的性状修饰的程度和性质。 【0208】 如本文所用,术语“相应的野生型”水稻或谷粒或类似短语是指至少 50%、更优选至少 75%、更优选至少 75% 的水稻或谷粒的基因型。优选地是指稻米或谷物包含至少 95%,更优选至少 97%,更优选至少 99%,甚至更优选至少 99.5%,但植物或谷物和/或增稠的糊粉层不含一种或多个基因突变(例如,引入的基因突变),每个突变都会降低 ROS1a 基因的活性 在一个实施例中,除了一种或多种遗传变异(例如引入的遗传变异)之外,本发明的稻谷粒或植物与野生型稻谷粒或植物相同。 优选地,相应的野生型植物或谷粒属于/衍生自与本发明的植物/谷粒的祖先相同的栽培品种或品种,或缺少一种或多种遗传修饰和/或许多情况下,它是没有称为“隔离器”的厚糊粉层的同胞植物品系。 在一个实施例中,本发明的水稻或谷粒具有与水稻栽培品种中华 11 (ZH11) 的基因型具有小于 50% 同一性的基因型。 ZH11 于 1986 年上市销售。 【0209】 如本发明上下文中所定义的转基因植物包括使用重组技术进行遗传修饰的水稻后代,其中该后代包含感兴趣的转基因。 这样的后代可以通过初级转基因植物的自花授粉或通过将这样的植物与另一种水稻植物杂交来获得。 通常,这是为了调节所需植物或植物器官中至少一种本文定义的蛋白质的产生。 转基因植物的部分包括含有转基因的所述植物的所有部分和细胞,例如培养物、愈伤组织和原生质体。 【0210】 如本文所用,术语“稻”指稻属的任何物种,包括其祖先以及通过与其他物种杂交产生的后代。 优选地,植物是水稻的商业栽培种,例如水稻的品系或栽培品种或品种,或适合商业生产的谷粒。 【0211】 如本文所用,“糙米”是指完整的米粒,包括麸皮层和胚芽(胚芽),但通常没有在收获期间去除的外壳。 也就是说,糙米没有经过精磨去除糊粉层和胚芽。 “棕色”是指麸皮层中存在棕色或棕褐色色素。 糙米被认为是全谷物。 如本文所用,“精米”(polished rice)是指去除了麸皮和胚芽的米粒,即基本上是整个米粒的淀粉质胚乳。 这两类稻谷都可以以短粒、中粒或长粒的形式出现。 与白米相比,糙米的蛋白质、矿物质和维生素含量高,而且其蛋白质中的赖氨酸含量也很高。 【0212】 如本文所用,“色素米”包括黑米和红米,它们中的每一种都在糊粉层中含有色素如原花青素(单宁)。 色素大米的核黄素含量高于非色素大米,但胸腺嘧啶含量相似。 “黑米”由于花青素而具有黑色或接近黑色的麸皮层,煮熟后可能会变成深紫色。 “紫米”(也称为“紫色黑米”)是黑米的一种短粒品种并且包括在如本文所定义的黑米中。 生时呈紫色,煮熟后呈深紫色。 “红米”含有多种花青素,使米糠呈红色/栗色,包括花青素 3-葡糖苷(菊花碱)和芍药苷 3-葡糖苷(oxycoccicy-anin)。 【0213】 可以对这些类型的米粒进行处理,例如,通过蒸煮(煮沸)或干热来防止发芽。 白米通常煮 12-18 分钟,而糙米和彩色米通常煮 20-40 分钟,具体取决于所需的质地。 通过使这些蛋白质变性,烹饪或加热会降低米粒中抗营养因子(但不是植酸含量)的水平,例如胰蛋白酶抑制剂、oryzacystatin 和血凝素(凝集素)。 如本领域已知的,米粒可以在烹饪之前浸泡在水中或慢煮一段延长的时间。 米粒也可以被磨碎、漂白或热稳定。 米糠可以例如在100℃下蒸约6分钟以稳定。 【0214】 在一个实施例中,与相应的野生型谷粒相比,本发明的谷粒具有延迟的谷粒成熟度。 延迟成熟可以通过使用结实率 (%) 来确定,这涉及计算在成熟谷物阶段被种子满足的植物小花的百分比。 【0215】 在一个实施例中,与相应的野生型谷物相比,本发明的谷物具有降低的发芽能力。 例如,当在 28°C、无湿度控制且在 12 小时光照/12 小时黑暗循环的生长室中培养时,谷物是约 70% 至约 80%,或约 75%,优选 70%。具有相应野生型籽粒的%~100%的发芽能力。 如本文所用,术语“发芽”定义为当胚根通过种皮变得可见时。 【0216】 在一个实施例中,本发明的植物具有正常株高、生育力(雄性和雌性),具有籽粒大小和千粒重中的一种或多种或全部。 在一个实施例中,本发明的谷粒是相对于野生型亲本栽培品种具有正常株高、生育力(雄性和雌性)、谷粒大小和千粒重中的一项或多项或全部的水稻植物。 . 如本文所用,术语“正常”可通过测量在与本发明植物相同条件下生长的野生型亲本栽培品种的相同性状来确定。 在一个实施例中,与野生型亲本品种相比,本发明的植物的常态是限定特征的+/-10%,更优选+/-5%,更优选+/-5%。-2.5% ,甚至更优选 +/-1% 水平/值等。 【0217】 如本发明上下文中所定义的,转基因植物是已经使用重组技术进行遗传修饰以导致在期望的植物或植物器官(以及植物部分和细胞)中产生至少一种本发明的多肽的植物,并且他们的后代。 转基因植物是本领域已知的,例如,A. Slater 等人,Plant Biotechnology - Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press (2003),以及 P. Christou 和 H. Klee,Handbook of Plant Biotechnology.,John Wiley 和儿子 (2004) 等。 【0218】 在一个优选的实施方案中,转基因植物对于每个引入的基因或核酸构建体(转基因)是纯合的,因此其后代不会分离出所需的表型。 转基因植物对于导入的转基因也可以是杂合的(例如,从*种子繁殖的F1后代)。 此类植物可提供优势,例如本领域众所周知的*优势。 【0219】 在一个实施例中,本发明的选择水稻的方法进一步包括分析来自植物的至少一种“其他遗传标记”的DNA样品。 如本文所用,“其他遗传标记”可以是与植物的所需性状相关的任何分子。 此类标记为本领域技术人员所熟知并且可用于抗病性、产量、植物形态、谷粒品质、休眠性状、谷粒颜色、种子中的赤霉酸含量、植物高度、粉末颜色等。包含分子决定性状的基因标记。 这种基因的一个例子是 Rht 基因,它决定了半矮化植物的生长习性和抗倒伏性。 【0220】 已经描述了四种将基因直接递送至细胞的一般方法:(1) 化学方法(Graham 等人,1973);(2)物理方法,例如显微注射(Capecchi,1973);1980);电穿孔(参见例如 WO 87 /06614、US 5,472,869、5,384,253、WO 92/09696 和 WO 93/21335);和基因枪(参见例如 US 4,945,050 和 US 5,141,131);(Clapp,1993;Lu 等,1993;Eglitis 等,1988 );和 (4) 受体介导的机制(Curiel 等人,1992 年;Wagner 等人,1992 年)。 【0221】 可以使用的增强方法包括例如微粒轰击等。 将转化核酸分子递送至植物细胞的方法的一个例子是微粒轰击。 Yang 等人在 Particle Bombardment Techniques for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994) 中对这种方法进行了综述。 非生物颗粒(微粒)可以涂有核酸并通过推进力输送到细胞。 示例性颗粒包括钨、金、铂等。 除了作为可重复转化单子叶植物的有效手段之外,微粒轰击的一个特殊优点是既不需要原生质体分离也不需要对农杆菌的敏感性。 适用于本发明的粒子输送系统是可从 Bio-Rad Laboratories 获得的氦加速 PDS-1000/He 枪。 对于轰击,可将未成熟胚胎或诱导的靶细胞*自未成熟胚胎的盾片或愈伤组织置于固体培养基上。 【0222】 在另一个可供选择的实施方案中,质体可以被稳定地转化。 公开的用于在高等植物中进行质体转化的方法包括粒子枪递送含有选择标记的 DNA 和通过同源重组将 DNA 靶向质体基因组(US 5,451,513、US 5,545,818、US 5,877,402、US 5,932479 和 WO 99/05265)。 【0223】 农杆菌介导的转移在将基因导入植物细胞方面具有广泛的应用,因为它可以将 DNA 导入整个植物的组织中,避免了从原生质体再生完整植物的需要。这是一个可能的系统。 使用农杆菌介导的植物整合载体将 DNA 引入植物细胞是本领域众所周知的(参见,例如,US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。 此外,T-DNA 整合是一个相对精确的过程,基本上不存在重排。 要转移的 DNA 区域由边界序列定义,插入的 DNA 通常插入植物基因组中。 【0224】 使用农杆菌转化方法形成的转基因植物通常在一条染色体上包含单个遗传基因座。 此类转基因植物可称为添加基因的半合子植物。 更优选的是转基因植物,其中添加的结构基因,即在一对染色体的每条染色体上的相同基因座处的一个基因,对于包含两个添加基因的转基因植物来说是纯合的。 纯合转基因植物是通过与含有一个附加基因的独立分离的转基因植物进行有性杂交(自花授粉),使所产生的种子的一部分发芽,并获得感兴趣的基因而获得的。它可以通过分析植物来获得。 【0225】 也可以使用其他细胞转化方法,包括但不限于将 DNA 直接转移到花粉中,将 DNA 直接注射到植物的生殖器官中,或注射到未成熟胚胎的细胞中。它涉及引入通过直接 DNA 注射将 DNA 注入植物,然后对干燥的胚胎进行再水化。 【0226】 从单一植物原生质体转化体或各种转化的外植体再生、发育和培养植物是本领域众所周知的(Weissbach 等人,Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, (1988))。 这种再生和生长过程通常涉及转化细胞的选择,通过胚胎发育的正常阶段到生根的小植株阶段培养个体化细胞。 转基因胚胎和种子同样再生。 然后将所得转基因根茎种植在合适的植物生长介质如土壤中。 【0227】 含有外源、外源基因的植物的发育或再生是本领域众所周知的。 优选地,再生植物是自花授粉的以提供纯合转基因植物。 或者,将从再生植物获得的花粉与农业重要菌株的种子生长植物杂交。 相反,来自这些重要谱系的植物的花粉用于为再生植物授粉。 使用本领域技术人员熟知的方法培养含有所需外源核酸的本发明的转基因植物。 【0228】 为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在,可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。 根据产品的性质,可以通过多种方式中的任何一种来检测转基因表达产物,包括蛋白质印迹和酶促测定。 一种特别有用的量化蛋白质表达和检测不同植物组织中复制的方法是使用报告基因,例如 GUS。 一旦获得转基因植物,就可以种植它们以产生具有所需表型的植物组织或部分。 可收获植物组织或植物部分和/或可收获种子。 种子可以用作培育具有所需特性的组织或部分的额外植物的来源。 【0229】 标记辅助选择 标记辅助选择是一种众所周知的方法,用于选择在经典育种程序中回交亲本时所需的杂合植物。 每个回交世代的植物种群对于感兴趣的基因可能是杂合的,其通常以 1:1 的比例存在于回交种群中,分子标记可区分该基因的两个等位基因。 例如,通过从幼叶中提取 DNA 并用特定标记检测渗入的所需性状,进行植物的早期选择以进行进一步回交,以更少的能源和资源。集中在植物上。 为了进一步加快回交计划,可以提取未成熟种子(开花后 25 天)的胚胎,并在无菌条件下在营养培养基上生长,而不是让种子完全成熟。我可以。 这一过程被称为“胚胎拯救”,已与三个叶期的 DNA 提取结合使用,并用于分析至少一种改变 ROS1a 活性以赋予植物糊粉层厚度的基因突变。可以快速选择性状,可以在温室或田间培育至成熟,然后回交进一步回交亲本。 【0230】 本领域已知的任何分子生物学技术均可用于本发明的方法。 此类方法包括但不限于核酸扩增、核酸测序、与适当标记的探针的核酸杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE),包括使用主链分析(HET)、化学切割分析 (CCM)、催化核裂解或其组合(参见,例如,Lemieux,2000;Langridge 等人,2001)。 本发明还包括使用分子标记技术来检测与 ROS1a 基因的等位基因相关的多态性,这些等位基因改变 ROS1a 活性并增加植物中的糊粉层厚度(例如)。 此类方法包括检测或分析限制性片段长度多态性 (RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性 (AFLP) 和微卫星(简单序列重复,SSR)多态性。 密切相关的标记可以容易地通过本领域熟知的方法获得,例如Langridge等人(2001)综述的Bulked Seregant分析。 【0231】 在一个实施方案中,用于标记辅助选择的相关基因座距编码本发明多肽的基因至少1cM、或0.5cM、或0.1cM、或0.01cM以内。 【0232】 “聚合酶链式反应”(“PCR”)是指“引物对”或“引物组”,其由“上游”和“下游”引物以及用于聚合的催化剂(例如DNA聚合酶)和通常为热组成。使用稳定的聚合酶从目标多核苷酸制备双份拷贝的反应。 用于 PCR 的方法是本领域已知的并且例如在“PCR”(M.J.McPherson 和 S.G.Moller(编辑),BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford,(2000))中有所教导。 可以对通过逆转录从表达增加植物糊粉层厚度的 ROS1a 基因或等位基因的植物细胞分离的 mRNA 获得的 cDNA 进行 PCR。 然而,对从植物中分离的基因组 DNA 进行 PCR 通常更容易。 【0233】 引物是一种寡核苷酸序列,它可以序列特异性地与目标序列杂交,并且可以在 PCR 过程中延伸。 扩增子或PCR产物或PCR片段或​​扩增产物是包含新合成的引物拷贝和靶序列的延伸产物。 多重 PCR 系统包含多个引物组,可同时产生一个或多个扩增子。 引物可能与目标序列完全匹配,或者可能包含内部错配碱基,这可能导致将限制酶或催化核酸识别/切割位点引入特定目标序列。 引物还可以包含额外的序列和/或可以包含修饰的或标记的核苷酸以促进扩增子的捕获或检测。 DNA 热变性、引物与其互补序列退火以及聚合酶对退火引物的延伸的重复循环导致目标序列的指数扩增。 术语目标或目标序列或模板是指待扩增的核酸序列。 【0234】 用于核苷酸序列直接测序的方法是本领域技术人员众所周知的并且可以在例如Ausubel等人,同上和Sambrook等人,同上中找到。 可以通过任何合适的方法进行测序,例如双脱氧测序、化学测序或其变体。 直接测序的优点是可以确定特定序列的任何碱基对中的突变。 【0235】 耕种 本发明的植物可以使用称为TILLING(基因组靶向诱导的局部损伤)的过程来生产。 第一步,用化学诱变剂处理种子(或花粉),然后将植物更新到稳定遗传突变的世代,从而在植物种群中产生新的单碱基对。变化被诱发。 从种群的所有成员中提取 DNA 并储存种子,从而创建一种可以随时间重复访问的资源。 【0236】 对于 TILLING 分析,PCR 引物设计用于特异性扩增感兴趣的单个基因靶标。 当目标是基因家族的成员或多倍体基因组的一部分时,特异性尤为重要。 然后可以使用染料标记的引物从多个个体的混合 DNA 中扩增 PCR 产物。 这些 PCR 产物变性并重新退火以形成错配碱基对。 错配或异源双链体发生在自然发生的单核苷酸多态性 (SNP)(即,一个种群中的几种植物可能具有相同的多态性)和诱导的 SNP(即,只有罕见的个体植物可能表现出突变)之间。 使用内切核酸酶,如 CelI,在异源双链体形成后识别和切割错配的 DNA,是在 TILLING 群体中发现新 SNP 的关键。 【0237】 使用这种方法,可以筛选数千种植物,以识别在任何基因或基因组特定区域中具有单碱基变化和小插入或缺失 (1-30 bp) 的个体。 分析的基因组片段大小范围为 0.3 至 1.6 kb。 具有 8 倍池、1.4 kb 片段(在 SNP 检测由于噪声而有问题的地方截断片段的末端)和每次分析 96 条泳道,这种组合使 TILLING 成为一种高通量技术。允许筛选一百万个碱基对的基因组 DNA . 【0238】 Slade 和 Knauf (2005) 以及 Henikoff 等人 (2004) 进一步描述了 TILLING。 【0239】 除了允许高效检测突变外,高通量 TILLING 技术还是检测自然多态性的理想选择。 因此,通过对已知序列进行异源双链检测未知同源 DNA 可以揭示多态性位点的数量和位置。 鉴定了核苷酸变化和小的插入和缺失,包括至少一些重复数多态性。 这称为生态耕作(Comai 等,2004)。 【0240】 每个 SNP 都记录在几个核苷酸内的大致位置。 因此,每个单倍型都可以根据其移动性进行存档。 使用与错配切割分析相同的扩增 DNA 等分试样,可以通过相对较少的增量工作获得序列数据。 选择用于单个反应的左或右测序引物,因为它们与多态性的接近程度。 测序仪软件在每种情况下验证凝胶条带,执行多重比对,并检测碱基变化。 【0241】 与目前用于大多数 SNP 发现的完整测序方法相比,生态耕作的成本更低。 可以筛选包含阵列生态型 DNA 的板而不是来自诱变植物的 DNA 库。 由于检测是在具有接近碱基对分辨率的凝胶上进行的,并且泳道上的背景图案是均匀的,因此可以匹配相同大小的条带,从而一步完成 SNP 发现和基因分型。 这样,由于用于筛选的相同 PCR 产物的等分试样可以进行 DNA 测序,因此 SNP 的最终测序更简单、更有效。 【0242】 粮食加工 由于糊粉层增稠,本发明的米粒以及由其制成的面粉和麸皮具有改善的营养成分。 分离的糊粉层组织应含有低水平的淀粉和果皮,代表了谷物对人类营养生理有用的物质的主要部分。 例如,当与相应的野生型谷物和/或由其制成的粉末相比时,本发明的谷物和/或由其制成的粉末分别具有以下一项或多项或全部,以重量计:包括: ; i)更高的矿物质含量,例如高至少20%或至少25%,优选矿物质含量是锌(例如至少高约10%或至少约15%)、铁(例如至少约10%或钾(例如高至少约20%或至少约25%)、镁(例如高至少约18%或至少约22%)、磷(例如高至少约17%或至少约22%)高至少约21%)和硫(例如,高至少约5%或至少约8%),和 ii)更高的抗氧化剂含量,例如多至少约25%或至少约35%的酚类化合物,和/或多至少约60%或至少约70%的亲水性抗氧化剂;, iii)更高的植酸含量,例如高至少约10%或至少约15%; iv) 维生素 B3、B6 和 B9 中一种或多种或全部含量较高; v) 更高的膳食纤维含量和/或不溶性纤维含量(例如,高至少约150%,或高至少约180%的总纤维); vi)相对于相应野生型谷粒的淀粉含量按重量计约90%至约100%的淀粉含量; vii) 高蔗糖含量, viii)更高的单糖含量(例如,阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖含量),例如高至少约1.5倍或至少约2倍; ix) 更高的脂肪含量,例如至少约 20%、至少约 30%、或至少约 50%、或约高约 50%,和 x) 相似的氮水平。 【0243】 谷物的这些营养成分中的每一种都可以使用常规技术来确定,例如实施例 1 和 5 中概述的技术。 【0244】 在一个实施例中,本发明的米粒和/或由其制成的米粉包含以下的一种或多种或所有,每种基于重量; i)与相应的野生型谷物/面粉相比,脂肪至少增加约 20%、至少约 30%、或至少约 50%、或约 50%; ii) 至少约 11 mg/g 或至少约 12 mg/g 总植酸盐; iii)与来自相应野生型谷物的粉末相比,从该谷物获得的面粉中的矿物质含量高至少约20%或至少约25%; iv) 至少约 14 mg/kg 或至少约 15 mg/kg 总锌; v)至少约13mg/kg或至少约13.5mg/kg总铁; vi) 与相应的野生型谷物/面粉相比,总纤维至少增加约 150%,或增加至少约 180%; vii)相对于相应野生型谷物/面粉的淀粉含量,按重量计约90%至约100%的淀粉含量; viii)与相应的野生型谷物/面粉相比,单糖含量(例如,阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖含量)高至少约 1.5 倍或至少约 2 倍,并且 ix) 与相应的野生型谷物/面粉相比,至少约 25%,或至少约 35% 的酚类化合物和/或至少约 60%,或至少约 70% 的亲水性抗氧化剂。 【0245】 在一个实施例中,与相应的野生型谷物相比,该谷物具有增加百分比的直链淀粉在总淀粉含量中。 生产此类谷物的方法描述于例如 WO 2002/037955、WO 2003/094600、WO 2005/040381、WO 2005/001098、WO 2011/011833 和 WO 2012/103594 中。 【0246】 在一个实施例中,与相应的野生型谷物相比,本发明的谷物在其总脂肪含量中包含增加比例的油酸和/或减少比例的棕榈酸。 用于生产此类谷物的方法描述于例如WO 2008/006171和WO 2013/159149中。 【0247】 本发明的谷粒/种子或本发明的其他植物部分可使用本领域已知的任何技术加工以生产食物成分、食物或非食物。 【0248】 如本文所用,术语“其他食物或饮料成分”是指当作为食物或饮料的一部分提供时适合动物食用,优选人食用的任何物质。它指代任何物质。 示例包括但不限于来自其他植物物种的谷物、糖等,但不包括水。 【0249】 在一个实施例中,产品是全谷物面粉,例如超细磨碎的全谷物面粉或由约 100% 的谷物制成的面粉。 全麦面粉包含精制面粉成分(精制面粉或精制面粉)和粗粒部分(微粉化粗粒部分)。 【0250】 精粉例如可以是将洗净的谷物粉碎、抽薹制成的粉末。 精制粉末的粒度被描述为通过织物的粉末的 98% 或更多,其开口不大于指定为“212 微米(美国电线 70)”的编织金属丝布的开口。 粗粒部分含有麸皮和胚芽中的至少一种。 例如,胚芽是谷粒内的植物胚胎。 胚芽含有脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素(如类黄酮)。 麸皮含有多个细胞层,并含有大量的植物营养素,例如脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和类黄酮。 此外,粗馏分可包含糊粉层,糊粉层还含有植物营养素,例如脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和类黄酮。 虽然糊粉层在技术上被认为是胚乳的一部分,但它表现出许多与麸皮相同的特性,因此通常在研磨过程中与麸皮和胚芽一起被去除。 糊粉层含有蛋白质、维生素和阿魏酸等植物营养素。 【0251】 此外,粗馏分可以与精制粉末混合。 粗粒部分可以与精制面粉混合以形成全谷物面粉,从而与精制面粉相比具有改进的营养价值、纤维含量和抗氧化能力的全谷物提供粉末。 例如,粗粉或全麦面粉可以以不同的量使用,以替代烘焙、零食和食品中的精制或全麦面粉。 本发明的全麦面粉(即微粉化全麦面粉)可以直接出售给消费者用于他们自制的烘焙食品。 在示例性实施例中,全谷物面粉的造粒特征使得全谷物面粉的98重量%的颗粒小于212微米。 【0252】 在另一个实施例中,在全谷物面粉和/或粗粒部分的麸皮和胚芽中发现的酶被灭活以稳定全谷物面粉和/或粗粒部分。 稳定化是使用蒸汽、热、辐射或其他处理方法使麸皮和胚层中的酶失活的过程。 稳定的粉末保留其烹饪特性并具有较长的保质期。 【0253】 在进一步的实施例中,全谷物面粉、粗粒部分或精制面粉可以是食品的成分(成分)并且可以用于生产食品。 例如,食品包括百吉饼、饼干、面包、圆面包、羊角面包、饺子、英式松饼、松饼、皮塔面包、速食面包、冷冻/冷冻面团产品、面团、烤豆、卷饼、辣椒、炸玉米饼、玉米粉蒸肉、玉米饼。 , 馅饼, 即食麦片, 即食餐, 馅料, 微波炉食品, 核仁巧克力饼, 蛋糕, 芝士蛋糕, 咖啡蛋糕, 饼干, 甜点, 糕点, 甜面包, 糖果棒, 馅饼皮, 馅饼馅婴儿食品, 烘焙混合物、黄油、面包屑、肉汁混合物、肉类增量剂、肉类替代品、调味料、汤混合物、肉汁、面糊、沙拉酱、汤、酸奶油、面条、意大利面、拉面、炒美面条、长叶莴苣面条、冰淇淋内含物、冰淇淋棒、冰淇淋甜筒、冰淇淋三明治、薄脆饼干、油煎面包块、甜甜圈、蛋卷、挤压零食、水果和谷物棒、微波零食产品、营养棒、煎饼、半烘焙烘焙产品、椒盐卷饼、布丁、格兰诺拉麦片食品、零食薯片、休闲食品、混合零食、华夫饼、比萨饼皮、动物食品或宠物食品都可以作​​为食品。 【0254】 在另一个实施例中,全麦面粉、精制面粉或粗糙部分可以是膳食补充剂的成分。 例如,营养食品可以是添加到食物中的产品,含有一种或多种额外成分,通常是维生素、矿物质、草药、氨基酸、酶、抗氧化剂、草药、香料、益生菌、提取物、益生元和纤维。 本发明的全麦面粉、精制面粉或粗粉含有维生素、矿物质、氨基酸、酶和纤维。 例如,粗馏分含有高水平的膳食纤维以及健康饮食所必需的必需营养素,例如 B 族维生素、硒、铬、锰、镁、抗氧化剂等。 例如,22g本发明的粗馏分提供了个人每日推荐纤维消耗量的33%。 膳食补充剂可能含有已知有助于个体整体健康的营养成分,示例包括但不限于维生素、矿物质、其他纤维成分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、肽、蛋白质、叶黄素、核糖、omega-3 脂肪酸和/或其他营养成分。 营养补充剂可以但不限于以下形式提供:速溶混合饮料、即饮饮料、营养棒、威化饼、饼干、薄脆饼干、凝胶丸、胶囊、咀嚼片、咀嚼片和药丸。 一个实施例提供了调味奶昔或麦芽型饮料形式的纤维补充剂,这作为儿童纤维补充剂可能特别有吸引力。 【0255】 在进一步的实施例中,研磨过程可用于产生多晶粒粉末或多晶粒粗级分。 例如,可以将来自一种谷物的麸皮和胚芽磨碎并与另一种谷物的磨碎胚乳或全谷物面粉混合。 或者,可以将一种谷物的麸皮和胚芽磨碎并与另一种谷物的磨碎胚乳或全谷物面粉混合。 本发明旨在包括混合一种或多种麸皮、胚芽、胚乳和一种或多种谷物的全谷粉的任何组合。 这种多种谷物的方法创造了一种定制的粉末,并且可以利用多种谷物的品质和营养成分来制造一种粉末。 【0256】 据信,本发明的全谷物面粉、粗粒部分和/或谷物产品可以通过本领域已知的任何粉碎方法生产。 示例性实施例包括在单一流中研磨谷物而不将谷物的胚乳、麸皮和胚芽分离成单独的流。 将清洗和调质的谷物输送到第一道研磨机,例如锤磨机、辊磨机、针磨机、冲击磨机、盘磨机、空气研磨机、间隙磨机等。 破碎后的谷物被排出并输送到筛分机。 此外,本发明的全谷物面粉、粗粒级分和/或谷物产品可以通过许多其他过程进行改性,例如发酵、即食化、挤压、封装、烘烤、烘烤等,或者可以被增强。 【例子】 【0257】 示例 1. 一般材料和方法 【0258】 苏丹红染色观察糊粉层 通过将 1 g 苏丹红 IV 添加到 50 ml 聚乙二醇溶液(平均分子量 400,Sigma,货号 202398)中,在 90°C 下孵育 1 小时并与等体积的90% 甘油。底部。 去除每粒谷粒的果皮(内花和外花)后,将成熟的稻谷在蒸馏水中孵育 5 小时,然后使用刀片进行横向或纵向切割。 切片在室温下用苏丹红溶液染色 24-72 小时。 然后在室温下用 Lugol 染色液 (Sigma, 32922) 对切片进行复染 20 分钟,并在解剖显微镜下观察 (Sreenivasulu, 2010)。 【0259】 用伊文思蓝染色糊粉 通过将 0.1 g 伊文思蓝(Sigma,E2129)溶解在 100 ml 蒸馏水中来制备伊文思蓝染色溶液。 去除每粒谷粒的果皮(内花和外花)后,用刀片将成熟的稻谷横切。 切片在蒸馏水中室温孵育 30 分钟,加入染色剂,室温静置 2 分钟。 弃去染色液,用蒸馏水洗涤切片两次,在解剖显微镜下观察。 【0260】 水稻胚乳的光学显微镜观察 将米粒固定在福尔马林-乙酸-酒精 (FAA) 溶液(60% 乙醇、5% 冰醋酸和 2% 甲醛)中,脱气 1 小时,70%、80%、95% 和 100% 乙醇。在一系列含有 的酒精溶液中脱水,用 LR 白色树脂(Electron Microscopy Sciences,14380)浸润并在 60°C 下聚合 24 小时。 使用 Leica UC7 切片机进行切片机切片。 切片在室温下用 0.1% 甲苯胺蓝溶液(Sigma,T3260)染色 2 分钟,然后用蒸馏水洗涤两次并通过光学显微镜检查。 或者,将切片在 0.01% Calcofluor 白色溶液(Sigma,18909)中在室温下染色 2 分钟,并通过光学显微镜检查。 【0261】 PAS 和考马斯蓝染色 载玻片上的固定切片在预热的 0.4% 高碘酸(Sigma,375810)中在 57°C 下孵育 30 分钟,然后用蒸馏水冲洗 3 次。 应用席夫氏试剂(Sigma,3952016)并将载玻片在室温下孵育15分钟,然后用蒸馏水冲洗3次。 然后将切片在 1% 考马斯蓝(R-250,ThermoScientific,20278)中在室温下孵育 2 分钟,并用蒸馏水冲洗 3 次。 使用一系列含 30%、50%、60%、75%、85%、95%-100% 乙醇的酒精溶液,然后是 50% 二甲苯和 100% 二甲苯溶液(Sigma,534056)完成切片脱水,每张幻灯片清理 2 分钟。 然后用 Eukitt® 快速硬化封固剂(Fluka,03989)封固盖玻片,并在光学显微镜下观察切片。 【0262】 DNA 提取和 PCR 条件 从 Huang (2009) 修改而来的两种方法用于从植物叶片样品中提取 DNA:一种提供纯度较低的 DNA 样品的快速 DNA 提取方法和一种适用于高纯度 DNA 的更广泛的 DNA 提取方法。稻田。 在第一种方法中,加入 4 个直径为 2 mm 的玻璃珠(Sigma,273627)、1-2 mg 水稻叶组织和 150 μl 提取缓冲液(10 mM Tris、pH 9.5、0.5 mM EDTA、100 mM KCl)到孔 PCR 板的每个孔。 密封板并使用 Mini-Beadbeater-96 混合器 (GlenMills, 1001) 将混合物均化 1 分钟。 以3000rpm离心5分钟后,将含有提取的DNA的上清液用于PCR反应。 【0263】 在第二种方法中,将两个直径为 2 mm 的玻璃珠和 0.2 g 叶子置于 1.5 ml Eppendorf 管中,并在液氮中冷却 10 分钟。 然后将样品在 Mini-Beadbeater-96 中均化 1 分钟,然后将 600 μl DNA 提取缓冲液(2% SDS、0.4 M NaCl、2 mM EDTA、10 mM Tris-HCl,pH 8.0)添加到每个试管中。混合物在65°C孵育1小时。 冷却混合物后,加入 450 μl 6M NaCl,混合并以 12000 rpm 离心 20 分钟。 将每个上清液转移到新管中,并在 -20°C 下用等体积的 2-丙醇沉淀 DNA 1 小时。 通过以 2400 rpm、4°C 离心 20 分钟收集 DNA,并用 75% 乙醇洗涤沉淀两次。 沉淀在室温下风干,再悬浮于 600 μl 蒸馏水中,每份含有 10 ng/μl RNAse(ThermoScientific,EN0201)并用于 PCR 反应。 【0264】 PCR 反应使用 5 μl 2×PCR 缓冲液,其中含有 Taq 聚合酶(ThermoScientific,K0171)、5' 和 3' 寡核苷酸引物和 1 μl DNA 样品,总体积为 10 μl。 使用 94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 30 秒的 35 个循环进行扩增。 使用 3% 琼脂糖凝胶通过凝胶电泳分析扩增产物。 对照 PCR 反应使用来自纯合子中华 11 (ZH11)(野生型粳稻)、纯合子 NJ6(野生型籼稻)以及 ZH11 和 NJ6 的混合物的 DNA 制备物。 【0265】 对于 ta2 等位基因的遗传作图,遗传标记的 PCR 扩增使用了以下引物对(5'-3' 序列):INDEL 127(1 号染色体上的位置 6,343,260),正向引物 TGAGTAGTTGCGTTGTTCT(SEQ ID NO:15),反向引物引物 TCTTAGTGAGCCGTTTCT(SEQ ID NO:16);INDEL 129(1 号染色体上的位置 6,560,681),正向引物 CCTTCTGTGCTATGGGTT(SEQ ID NO:17),反向引物 CATGCCAAGACACCATT(SEQ ID NO:18);INDEL 128(1 号染色体上的位置 6,470,027) )、正向引物 TGGCTTTGGAAACGGTAG(SEQ ID NO:19)、反向引物 TTTAGAGGGATGTGCGTCA(SEQ ID NO:20);INDEL 149(1 号染色体上的位置 6,427,144)、正向引物 AAACAACGATCCAGCAAA(SEQ ID NO:21)、反向引物 TTGGCACCGTATTACTTTTC (序列号:22)。 【0266】 TILLING分析 TILLING 分析中使用的引物具有以下核苷酸序列: TA2-1F:ACGCATTCTTCATTGACTGTATGT(序列号:23) TA2-1R:GCCCTTTCAATACAATGACTAGGT(序列号:24) TA2-2F:GAACATTTGAATCATGTTCCTCAC(序列号:25) TA2-2R:ACTATCCTTTGATGCAAGTTCTCC(序列号:26) TA2-3F:GTTGGAAGAGCAGTTAAAGCAAAT(序列号:27) TA2-3R:CTTCGGCAGTGAAATTTAGTAACA(序列号:28) TA2-4F:TACAGAACTTCTACGAATGCAGGA(序列号:29) TA2-4R:GCAACATGAATTGCTAAAGATGAG(SEQ ID NO:30)。 【0267】 使用 ExTaq 的 PCR 扩增在以下反应条件下进行:95°C 2 分钟;8 个循环,72°C 60 秒,0.5°C,然后 94°C 20 秒,60°C 30 秒,和每 1 kb 扩增子长度 72°C 60 秒 35 个循环,最终延伸 72°C 5 分钟。 混合来自野生型和测试样品的 PCR 产物,并在以下条件下进行完全变性-缓慢退火程序以形成异源双链体:99°C 变性 10 分钟,然后 70°C 变性 20 分钟。70 个递减循环每个循环 0.3°C,以秒为单位,然后保持在 15°C,使变性的 PCR 产物重新退火,形成异源双链体。 在 CelI 缓冲液(10 mM HEPES、pH 7.5、10 mM KCl、10 mM MgSO4、0.002% Triton X-100 和 0.2 μg/mL 牛血清白蛋白 (BSA)、4 μL PCR 产物和 1 单位 CelI(10 单位/μL,如果 PCR 产物通过 Ex Taq 聚合,或 20 单位 CelI,如果 PCR 产物通过 KOD 聚合)在 45°C 下持续 15 分钟,1 分钟后,3 μL添加 0.5 M EDTA (pH 8.0) 以终止反应。 或者,用 4 μL PCR 产物和 2 单位锰在 MBN 缓冲液(20 mM Bis-Tris,pH 6.5、10 mM MgSO4、0.2 mM ZnSO4、0.002% Triton X-100 和 0.2 μg/mL BSA)中进行消化). 豆核酸酶(MBN,10 单位/μL,目录号 M0250S;New England Biolabs,美国)在 15 μL 反应混合物中,在 60°C 下反应 30 分钟,然后加入 2 μL 的 0.2% SDS 溶液。停了。 【0268】 将 96 孔 PCR 板中 CelI 消化的 PCR 产物用去离子水稀释至 100 μL,并在 9 kV、预运行 30 秒、1 ng/μL 下进行 15 秒分子量标记 75 和 15 kb 或 50 的毛细管电泳和 3 kb. dsDNA(Fermentas,加拿大),在 AdvanCE™ FS96 仪器(Advanced Analytical Technologies,美国)上进行注射、45 秒样品注射和 40 分钟样品分离。 使用 PROSize 软件(Advanced Analytical Technologies,美国)收集凝胶图像并进行毛细管电泳分析。 【0269】 DNA 糖基化酶 (DME) 酶促分析 Demeter (DME) 是一种双功能 DNA 糖基化酶/裂解酶,对 5-甲基胞嘧啶底物具有活性。 植物在三个序列环境中具有 5-甲基胞嘧啶:CpG、CpNpG 和 CpNpN,并且 DME 在这些序列环境中的每一个中都对 5-甲基胞嘧啶具有活性。 在体外进行的酶分析检测到甲基化胞嘧啶的磷酸二酯键 5' 的裂解,导致 delta 切除产物。 在凝胶电泳前用强碱 (NaOH) 处理 DNA 反应产物,证实了预测位置的 delta 去除过程。 【0270】 在酶促测定中用作底物的合成寡核苷酸合成如下,括号中指示核苷酸修饰,如下所示: MEA-1.6F, 5'-CTATACCTCCCTCAACTCCGGTCACCGTCTCCGGCG (SEQ ID NO: 31) MEA-1.6F18meC,5'-CTATACCTCTCAACTC(5-meC)GGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:32) MEA-1.6F17meC,5'-CTATACCTCCTCAACT(5-meC)CGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:33) MEA-1.6F22meC,5'-CTATACCTCCCTCAACTCCGGT(5-meC)ACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:34) MEA-1.6F18AP,5'-CTATACCTCCCTCAACTC(脱碱基)GGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:35) MEA-1.6F17AP,5'-CTATACCTCCCTCAACT(脱碱基)CGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:36) MEA-1.6F15AP,5'-CTATACCTCCTCAA(脱碱基)TCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:37) MEA-1;6F12AP,5'-CTATACCTCCT(脱碱基)AACTCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:38) MEA-1.6F18T, 5'-CTATACCTCCCTCAACTCTGGTCACCGTCTCCGGCG (SEQ ID NO: 39) MEA-1.6R,5'-CGCCGGAGACGGTGACCGGAGTTGAGGAGGTATAG(序列号:40) MEA-1.6R17meC,5'-CGCCGGAGACGGTGAC(5-meC)GGAGTTGAGGAGGTATAG(SEQ ID NO:41)。 【0271】 在存在 30 μCi (γ-32P)-ATP(6000 Ci/mmol,Perkin Elmer Life Sciences)的情况下,在 50 μL 反应中使用 20 个单位的 T4 多核苷酸激酶在 50 μL 反应中加入 20 pmol 每种寡核苷酸 37°C 反应 1 分钟。 , 结束标记。 根据制造商的说明,使用 Qiaquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen) 纯化每个标记的寡核苷酸。 标记的寡核苷酸在 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA 和 0.1 M NaCl 中与适当的互补寡核苷酸退火。 每种混合物在 100°C 下加热 10 分钟,然后缓慢冷却至室温过夜。 MspI 或 HpaII 限制性核酸内切酶消化后进行凝胶电泳,用于确定退火效率。 在糖基化酶活性测定中仅使用了 >90% 的双链底物。 【0272】 将 5'-标记的寡核苷酸底物 (13.3 nM) 添加到 15 ml 的 40 mM HEPES-KOH (pH 8.0)、0.1 M KCl、0.1 mM EDTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和 200 mg/ml KCl 中。与 DME 蛋白(250 nM)和200mg/ml BSA在反应溶液中在37℃下反应1小时。 用 15 ml 95% 甲酰胺、20 mM EDTA、0.05% 溴酚蓝、0.05% 二甲苯氰 FF 终止反应并煮沸 5 分钟。 为诱导去除,添加 NaOH 至终浓度为 0.1M,并将反应煮沸 7 分钟。 在含有 7.5M 尿素和 1xTBE 的 15% 聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。 使用 Hoefer SQ3 凝胶装置在 1000 V 下进行电泳 4 小时。 凝胶在 -80°C 下暴露于 Kodak BioMax MR 胶片。 【0273】 分析方法 谷物、食品成分和食品样品中的近似值和其他主要成分是使用如下所述的标准方法测定的。 【0274】 根据(特许分析化学家协会)AOAC 方法 925.10 测量谷物水分含量。 简言之,将谷物样品(~2g)在130℃的烘箱中干燥约1小时至恒重。 【0275】 灰分含量根据 AOAC 方法 923.03 测量。 用于水分测定的样品在马弗炉中在 520°C 下焚烧 15 小时。 【0276】 谷物、食品成分和食品样品的蛋白质含量 蛋白质含量根据 AOAC 方法 992.23 测定。 简而言之,使用自动氮分析仪(Elementar Rapid N cube,Elementar Analysensysteme GmbH,Hanau,Germany)通过杜马斯燃烧法分析总氮。 通过将氮含量乘以 6.25 来估算谷物或食品样品的蛋白质含量 (g/100g)。 【0277】 糖、淀粉和其他多糖 总淀粉含量根据 AOAC 方法 996.11 使用 McCleary 等人 (1997) 的酶法测定。 【0278】 根据 AOAC 方法 982.14 测量糖的量。 简而言之,使用乙醇水溶液(80% 乙醇)提取单糖,并使用乙腈:水 (75:25 v/v) 作为流动相和蒸发光散射检测器分析多胺。使用偶联聚合物凝胶柱通过 HPLC 进行定量. 【0279】 总中性非淀粉多糖 (NNSP) 的测定采用 Theander 等人 (1995) 的气相色谱法,对用 1M 硫酸水解 2 小时,然后离心进行轻微修改。 【0280】 按照 AOAC 方法 999.03 对果聚糖(低聚果糖)进行了详细分析。 简而言之,将低聚果糖提取到水中,然后用蔗糖酶/麦芽糖酶/转化酶混合物进行消化。 然后用硼氢化钠还原产生的游离糖,并用果聚糖消化成果糖/葡萄糖。 使用对羟基苯甲酸肼 (PAHBAH) 测量释放的果糖/葡萄糖。 【0281】 纤维含量 根据 AOAC 方法 985.29 测量总膳食纤维 (TDF),根据 AOAC 方法 991.43 测量可溶性和不溶性膳食纤维 (SIF)。 简而言之,TDF 是通过 Prosky 等人的重量分析法测定的,以重量分析法测定。 【0282】 总脂肪 将 5 g 粉末样品与 1% Clarase 40000(Southern Biological,MC23.31)在 45°C 下孵育 1 小时。 通过从样品中多次提取,将脂质提取到氯仿/甲醇中。 离心分离相后,除去氯仿/甲醇级分并在101℃下干燥30分钟以回收脂质。 大部分残留物代表样品中的总脂质(AOAC 方法 983.23)。 【0283】 脂质的脂肪酸谱 根据 AOAC 方法 983.23,将脂质从研磨粉末中提取到氯仿中。 在加入等份的十七烷酸作为内标后,一部分含脂质的氯仿级分在氮气流下蒸发。 将残余物悬浮于无水甲醇、1%硫酸中并将混合物在50℃加热16小时。 混合物用水稀释并用己烷萃取两次。 将合并的己烷溶液装入小的弗罗里硅土柱中,用己烷洗涤该柱,然后用己烷中的 10% 乙醚洗脱脂肪酸甲酯。 将洗脱液蒸发至干,将残余物溶解在异辛烷中并注入 GC。 脂肪酸甲酯是根据标准脂肪酸的混合物进行定量的。 GC条件:色谱柱SGE BPX70 30m×0.32mm×0.25um;进样量0.5μL;进样口250℃;15:1分流;流速1.723ml/min恒流;1.5℃/min~220℃,30℃/ min~260°C(总运行时间 33 分钟);检测器 FID 280°C。 【0284】 抗氧化活性 (ORAC-H) 亲水抗氧化活性 (ORAC-H) 是根据 Huang(2002a 和 2002b)的方法以及 Wolbang 等人(2010)中描述的修改来确定的。 提取亲脂性抗氧化剂然后提取亲水性抗氧化剂的样品如下:将 100 mg 样品一式三份称重到 2 mL 微量离心管中。 然后,加入1mL己烷:二氯甲烷(50:50),剧烈混合2分钟,并在10℃以13,000rpm离心2分钟。 将上清液转移到玻璃瓶中,并用额外的 2 mL 己烷:二氯甲烷混合物重新提取沉淀物。 然后重复混合和离心步骤,并将上清液转移到同一个玻璃瓶中。 在温和的氮气流下蒸发沉淀中的残留溶剂。 加入 1 mL 丙酮:水:乙酸混合物 (70:29.5:0.5) 并剧烈混合 2 分钟。 然后如前所述将混合物离心,并将上清液用于 ORAC-H 板分析。 根据需要用磷酸盐缓冲液稀释样品。 计算曲线下面积 (AUC) 并将其与 Trolox 标准 AUC 值进行比较。 ORAC 值报告为 uMTrolox 当量/g 样品。 【0285】 酚类 根据 Li 等人(2008 年)描述的略微修改的方法提取和测量总酚含量以及游离酚、共轭酚和结合酚含量。 简而言之,在玻璃瓶(8 mL 体积)中超声处理 10 分钟并提取到 2 mL 80% 甲醇中后,测量 100 mg 样品中的游离酚。 将上清液转移到第二个玻璃瓶中,重复进行残留物提取。 将合并的上清液在氮气下蒸发至干。 添加 2 mL 乙酸 (2%) 以将 pH 值调节至约 2,然后添加 3 mL 乙酸乙酯以在振荡下提取酚类 2 分钟。 将小瓶在 10°C 下以 2000 x g 离心 5 分钟。 将上清液转移到干净的玻璃瓶中,再重复提取两次。 合并的上清液在氮气下于 37°C 蒸发。 将残余物溶解在 2 mL 80% 的甲醇中并冷藏。 【0286】 对于第一个 80% 的甲醇提取,共轭酚样品的处理与游离酚分析类似。 此时,将 2.5 mL (2M) 氢氧化钠和磁棒添加到玻璃瓶中蒸发的上清液中,然后用氮气填充并盖紧。 将小瓶混合并在110℃下搅拌加热1小时。 样品在冰上冷却后,用 3 ml 乙酸乙酯萃取并振摇 2 分钟。 小瓶在 10°C 下以 2000 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液并使用 12M HCl 将 pH 值调节至约 2。 如针对游离酚类所述,使用 3×3 mL 等分试样的乙酸乙酯提取酚类。 合并上清液并在氮气下于 37°C 蒸发至干,将残余物溶解在 2 mL 的 80% 甲醇中并冷藏。 【0287】 游离酚的甲醇提取后,从残留物中测定结合酚。 向残留物中加入 2.5 mL (2M) 氢氧化钠和磁棒,将小瓶用氮气回填并密封。 将小瓶混合并在110℃下搅拌加热1小时。 样品在冰上冷却并用 3 mL 乙酸乙酯萃取,然后摇动 2 分钟。 小瓶在 10°C 下以 2000 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液并使用 12M HCl 将 pH 值调节至约 2。 如游离苯酚所述,用 3×3 mL 乙酸乙酯等分试样提取苯酚。 合并上清液并在氮气下于 37°C 蒸发至干,将残余物溶解在 2 mL 的 80% 甲醇中并冷藏。 【0288】 通过在水解前添加 200 μL 80% 甲醇润湿样品,使用 100 mg 样品测量总酚类物质。 加入 2.5 mL (2M) 氢氧化钠和磁棒,将小瓶充满氮气并盖紧。 将小瓶混合并在110℃下搅拌加热1小时。 样品在冰上冷却并用 3 mL 乙酸乙酯萃取,然后摇动 2 分钟。 小瓶在 10°C 下以 2000 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液并使用 12M HCl 将 pH 值调节至约 2。 如游离苯酚所述,用 3×3 mL 乙酸乙酯等分试样提取苯酚。 合并上清液并在氮气下于 37°C 蒸发至干,将残余物溶解在 4 mL 的 80% 甲醇中并冷藏。 【0289】 对于酚类物质的测定,使用 Folin Ciocalteu 的分析来确定处理/提取样品中酚类物质的量。 使用 0、1.56、3.13、6.25、12.5 和 25 μg/mL 没食子酸盐标准构建标准曲线。 将 1 mL 标准溶液加入到 4 mL 玻璃管中。 对于测试样品,将 100 μL 充分混合的样品等分试样加入 4 mL 玻璃管中的 900 μL 水中。 然后将 100 mL Folin Ciocalteu 试剂添加到每个试管中,立即涡旋。 2 分钟后加入 700 μL 碳酸氢钠溶液 (1M),然后涡旋混合。 每种溶液在室温下避光孵育 1 小时,然后在 765 nm 处读取吸光度。 结果以 μg 没食子酸盐当量/g 样品表示。 【0290】 植酸 粉末样品中植酸含量的测定基于 Harland 和 Oberleas 的方法,如 AOAC 官方分析方法 (1990) 中所述。 简而言之,称取 0.5 g 粉末样品,并在室温下使用旋转轮 (30 rpm) 用 2.4% HCl 萃取 1 小时。 然后将混合物以 2000 x g 离心 10 分钟,提取上清液并用 milli-Q 水稀释 20 倍。 将阴离子交换柱 (500 mg Agilent Technologies) 置于真空歧管上并根据制造商的说明进行调节。 然后将稀释的上清液装入柱中并用 0.05M HCl 洗涤以去除非植酸盐物质。 然后用 2M HCl 洗脱植酸。 使用加热块消化收集的洗脱液。 冷却样品并用 milli-Q 水将体积补足至 10 mL。 使用在 640 nm 处读取吸光度的钼酸盐、磺酸染色法,通过分光光度法测量磷水平。 使用以下公式计算植酸: 【0291】 植酸(mg/g) = P conc*V1*V2/(1000*样品量*0.282) (在公式, P conc 为分光光度法测得的磷浓度(μg/mL),V1为最终溶液的体积,V2为提取植酸溶液的体积,0.282为磷和植酸的浓度。为转化率. ) 【0292】 总矿物质含量测定 使用 AOAC 方法 923.03 和 930.22 通过灰分分析确定样品的总矿物质含量。 将约2g的粉末在540℃下加热15小时,然后称量灰分的质量。 将 0.5 g 总粉末样品在 140°C 下使用管块消解和 8 M 硝酸消解 8 小时。 根据 Zarcinas(1983a 和 1983b)描述的方法,使用电感耦合等离子体原子发射光谱 (ICP-AES) 分析锌、铁、钾、镁、磷和硫的含量。 【0293】 在 CSIRO、Urbrae、阿德莱德、南澳大利亚、Waite Analytical Service(阿德莱德大学,Waite,南澳大利亚)和 Dairy Technical Services(DTS,North Melbourne,Victoria)对矿物质进行了分析。 组分先用硝酸溶液 (CSIRO) 消解,然后进行电感耦合等离子体发射光谱 (ICP-OES) 或稀硝酸和过氧化氢 (DTS) 消解,或者用硝酸/高氯酸溶液消解后进行电感耦合。通过等离子体原子发射光谱 (ICP-AES) 测量。 【0294】 维生素 维生素 B1(烟酸)、B3(吡哆醇)和总叶酸分析由 DTS 和国家测量研究所 (NMI) 进行。 根据 Lahey 等人 (1999),通过 AOAC 方法第 13 版 (1980) 43.045 测量烟酸。 吡哆醇根据 Mann 等人 (2001) 进行测量。 该方法结合了磷酸化和游离维生素 B6 形式向吡哆醇(吡哆醇)的柱前转化。 酸性磷酸酶水解,去磷酸化,然后是 Fe ²⁺ 用于在存在下用乙醛酸将吡哆胺转化为吡哆醛。 然后用硼氢化钠将吡哆醛还原为吡哆醇。 【0295】 根据制造商的说明或根据 AOAC 方法 2004.05,使用 VitaFast 叶酸试剂盒测量叶酸。 【0296】 实施例 2. 增稠糊粉层 (ta) 突变体的分离和表征 【0297】 水稻突变群体的建立与培育 在标准条件下,通过用 60 mM 甲磺酸乙酯 (EMS) 处理来自野生型水稻品种中华 11 (ZH11) 的大约 8000 粒谷粒(称为 M0 谷粒)进行诱变。 将诱变的谷粒播种在田间,种植所得植物以生产 M1 谷粒。 收获 M1 谷粒并在田间播种以生产 M1 植物。 从 1327 个固体的 M1 植物收获了 8925 个固体的穗。 从这些植物中筛选出 36,420 个 M2 粒,每个圆锥花序至少获得 4 个粒。 【0298】 半粒染色突变筛选 M2 稻谷的果皮(内花和外花)被去除。 36,420 个谷粒中的每一个都被横向平分。 含胚胎的两半保存在 96 孔板中用于随后的发芽,每个无胚的一半的谷粒用伊文思蓝染色并在解剖显微镜下观察以显示相对于野生型增厚的糊粉层。我们检测到突变谷粒 这种染色遵循伊文思蓝只能穿透和染色非活细胞的原理,例如淀粉质胚乳的细胞,并且在活的糊粉层中没有观察到颜色变化。 根据最初的伊文思蓝染色和组织学分析,观察到单个籽粒的糊粉层厚度显着增加,而籽粒在种子腹侧的糊粉层中表现出显着增厚。 其他谷物显示糊粉层厚度增加,但程度较小。 专门检查每个种子腹侧的未染色区域的糊粉层厚度。 还观察到谷粒背面糊粉层厚度增加的突变体。 仅选择在整个横截面上糊粉层厚度显着增加的突变体进行进一步分析。 【0299】 与野生型的一半相比,选择了具有更厚的伊文思蓝未染色区域的一半。 在测试的 36,420 粒谷粒中,鉴定并选择了糊粉层厚度存在差异的 219 粒 (0.60%)。 这些是从 140 个单独的 M1 植物的 162 个穗中获得的,其中大部分是独立的突变体。 特别是一种突变谷物,具有名为 thick-aleurone 2 (ta2) 的突变,被鉴定并进一步表征如下所述。 相应的野生型基因因此被指定为 Ta2;该名称在本文中使用。 【0300】 为了维持假定的突变系,将每个相应的含胚半粒接种在含有半强度 MS 盐培养基(Murashige 和 Skoog,1962)的 1% Bacto 琼脂(Bacto,214030)上。种子在固化培养基上发芽并在在1500至2000Lux的光强度和16小时光照/8小时黑暗的循环下25°C。 在 2-3 个小叶阶段将小植物转移到土壤中,使所得植物生长至成熟。 在相应的发芽半谷粒的发芽和栽培中,栽培了115粒种子(52.5%的存活率),产生成熟和播种能力的植物。 【0301】 与野生型亲本品种相比,一般农艺性状显示出很少或没有缺陷,例如正常的株高、坐果(雄蕊和雌蕊坐果)、籽粒大小和千粒重,以及增厚的糊粉层。候选突变体植物表现出稳定对性状的遗传进行了鉴定、选择和进一步分析。 其中,选择并详细分析了一个名为ta2的突变体,该突变体显示出6-7个细胞层的更极端的多重糊粉层表型。 正如预期的那样,野生型谷物显示出一层糊粉层。 【0302】 ta2突变体籽粒的组织学分析 研究了野生型 ZH11 和 ta2 突变体植物的籽粒发育,并比较了授粉后 1 至 30 天 (DAP) 的形态变化。 米粒的灌浆期可以说分为乳粒期、面粒期和成熟粒期三个阶段。 在成熟期,野生型穗粒开始由绿色转为黄色,连接茎和水生植物的水泡组织逐渐被破坏。 ta2 圆锥花序中的籽粒颜色变化延迟。 稻谷横截面的显微镜检查也显示 ta2 突变谷粒的垩白度(不透明度)增加。 然后使用扫描电子显微镜 (SEM) 研究淀粉质胚乳中部的淀粉颗粒组织结构。 在野生型谷物中,淀粉颗粒紧密堆积,表面光滑且形状规则,而在 ta2 谷物中,观察到形状不规则的淀粉颗粒松散堆积。 总之,在具有 ta2 突变的植物和谷物中观察到至少三个变化:延迟的谷物成熟、增加的谷物不透明度和淀粉颗粒结构。 【0303】 在 6、7、8、9、10、12、15、18、21、24、27 和 30 DAP 发育的突变体和野生型谷粒用伊文思蓝染色,并通过光学显微镜检查糊粉层。 观察到高达 10 DAP 的野生型和 ta2 突变体之间正在发育的糊粉层厚度没有显着差异。 10 DAP后,ta2突变体的糊粉层比野生型籽粒厚,差异在20 DAP左右达到最大值。 这些结果与苏丹红染色一致。 【0304】 通过切片 (1 μm)、染色和光学显微镜进一步检查野生型和 ta2 突变体籽粒 (30 DAP) 的组织学差异。 在用 0.1% 甲苯胺蓝染色后,在野生型谷物中观察到单层大的、规则取向的矩形细胞,甲苯胺蓝将核酸染成蓝色,将多糖染成紫色。 相比之下,ta2 突变籽粒的切片具有 6-8 个细胞层的糊粉层,并且细胞也具有不同的大小和不规则的方向。 这些观察表明 ta2 籽粒中糊粉层增厚主要是由细胞数量增加而不是单个糊粉细胞引起的。 【0305】 用 0.01% Calcoflour White(一种荧光细胞壁染色剂)进一步染色,显示野生型和 ta2 突变型籽粒之间的细胞壁厚度没有差异。 对于野生型和 ta2 籽粒而言,糊粉层细胞的细胞壁比淀粉质胚乳的细胞壁厚。 【0306】 ta2突变株及籽粒农艺性状分析 在田间回交野生型 (ZH11) 植物 3 代以获得 BC3F3 代,从而消除可能由诱变处理产生的额外的无关突变后,对 ta2 突变植物的几种农艺性状进行了分析。 Ta2突变体和籽粒与野生型植株和籽粒相比,在株高、千粒重、籽粒大小(长、宽、厚)和核胚形态等方面无显着差异(表2)。 相比之下,野生型植物的结实率为 98.9%,而 ta2 突变体植物的结实率降低了 73.4%。 结实率计算为成熟谷粒阶段充满种子的植物小花的百分比。 此外,当在 28°C、12 小时光照/12 小时黑暗循环且无湿度控制的生长室中培养时,野生型谷物的发芽能力为 97.3%,而 ta2 突变谷物的发芽能力降低了75.1%。 发芽被定义为当胚根通过种皮变得可见时。 【0307】 实施例 3. ta2 突变体的遗传分析 【0308】 进行了两个遗传实验以确定厚糊粉层表型是否由母系根据生长植物的糊粉层和胚乳组织材料的来源决定。 最初,在母本 ta2(突变体)植物和父本野生型植物之间进行试验杂交以获得 F2 子代籽粒。 在 F2 谷粒中,49.4% (n = 634) 的糊粉层表型增厚,显着偏离 F2 种群显性基因孟德尔遗传预测的 3:1(野生型:突变型)比率表明。 其次,在 ta2 和野生型植物之间进行杂交。 所有 F1 种子(100%;n = 589)都表现出增厚的糊粉层表型,而在野生型母本杂交中,所有 F1 种子(n = 197)都表现出野生型表型。 这些杂交表明糊粉层表型由母本植物基因型决定。 【0309】 表 2. 野生型 (ZH11) 和 ta2 突变植物的农艺性状比较。 [表2] 【0310】 从纯合子 Ta2/Ta2 和纯合子 ta2/ta2 植物之间的杂交获得的杂合性,以确定母体效应是否由配子体或孢子体基因型 F1 植物决定,这些植物是性别 Ta2/ta2,用于与 ta2 纯合子(ta2/ta2)或野生杂交型植物。 在母本杂合子和父本野生型之间的相互杂交中,47.3% (n = 188) 的 F1 谷物表现出 ta2 突变表型,而母本 ta2 植物和父本杂合共轭互惠交叉显示 99.3% (n = 425) F1 个体具有 ta2突变表型。 从这些结果可以得出结论,TA2 基因通过配子体母系遗传模式赋予表型。 【0311】 上述遗传分析使我们能够根据配子体母系遗传方式提出ta2遗传模型。 如果母本配子体基因型是 ta2,则胚乳表型是突变体 ta2(增厚的糊粉层),与父本基因型无关。 因此,厚糊粉层表型完全由三倍体淀粉质胚乳和糊粉层的母体配子体的发育基因型决定,而母本杂合性与父本基因型无关。,产生了 50% 具有厚糊粉层表型的后代,而母本ta2/ta2 纯合子产生 100% 的具有厚糊粉层表型的后代。 为了检验TA2对母体的配子效应是由于三倍体胚乳中存在额外的母体基因拷贝,还是母体配子的基因印记抑制父体TA2基因表达的影响。因此,进一步的实验是需要的。 【0312】 实施例4.通过遗传作图和序列分析鉴定Ta2基因 【0313】 鉴定和使用 SSR 和 INDEL 标记进行遗传作图 对于遗传作图,F2 植物种群是由 ZH11(粳稻品种)遗传背景中含有 ta2 突变的植物与籼稻品种 NJ6 植物之间的遗传杂交产生的。 为了鉴定在 ZH11 和 NJ6 之间具有多态性并可用于遗传作图的遗传标记,分析了一系列叶 DNA 样品和来自纯合 ZH11 植物、纯合 NJ6 植物的 DNA 的 1:1 混合物。进行了 PCR 实验。 通过凝胶电泳分析 PCR 产物允许比较来自 ZH11、NJ6 和混合物的产物以鉴定多态性标记。 只有当用单独的 ZH11 和 NJ6 DNA 扩增显示出不同的扩增产物并且混合 DNA 显示出两种产物的组合时,才选择引物对进行基因作图。 共筛选出124对引物,其中插入缺失多态性(INDEL)54对,短序列重复(SSR)多态性70对。 这些遗传标记沿着水稻基因组以大约 3-4 Mbp 的间隔分布,并为遗传图谱提供了良好的覆盖范围。 【0314】 对于 ta2 等位基因的遗传作图,对来自 F2 群体的 143 株植物进行了 124 种多态性标记评分。 糊粉层表型作图群体中单个F2 植物的纯合性通过从每个F2 植物获得的F3 后代籽粒的表型仔细评估。 如实施例 1 所述提取叶 DNA。 如实施例1所述进行PCR扩增,并通过在3%琼脂糖上的凝胶电泳分离产物。 从结果可以得出结论,ta2 位点位于水稻基因组序列中 1 号染色体上的 INDEL 127 和 INDEL 129 标记之间,对应的物理距离约为 217 kb(图 1,最大上线)。 【0315】 用这对标记筛选了另外 5000 株 F2 植物。 鉴定并选择了显示 INDEL 127 和 INDEL 129 之间重组的 362 个个体。 当对这些重组植物进行表型分析时,ta2 基因座被定位到 INDEL149 和 INDEL128 标记之间的 42.8 kb 区域(图 1,第 2 行)。 【0316】 为获得ta2突变植物中该区域的核苷酸序列,并与野生型进行比较,从而鉴定出对应于ta2的突变,设计了基因组区域侧翼的引物,并对DNA序列进行了判定。 基因组 DNA 序列的比较在两个基因的测序区域内确定了两个单核苷酸多态性 (SNP),注释为 LOC_01g11900。 第一个是单个核苷酸位置Chr1:6451738,位于1号染色体LOC_01g11900基因的14和15外显子之间的内含子14(图1中的星号),参考粳稻基因组序列。有一个核苷酸G(野生type) 到 A (ta2) 多态性。 第二个多态性是从G(野生型)到A(ta2)在核苷酸位置Chr1:6452308,位于1号染色体上基因LOC_01g11900的外显子15和16之间的内含子区域(内含子15)。多态性为 【0317】 在对 ta2 等位基因对应的 cDNA 进行 RNA 提取、逆转录和测序后,Chr1:6451738 处的第一个 G 到 A 多态性对应于预测氨基酸序列中 7 个氨基酸的框内插入。观察到与外显子 14 和 15 之间插入 21 bp(图 2)相关(图 3)。 相比之下,外显子 15 和 16 之间突变的 cDNA 序列没有变化,对应于 Chr1:6452308 位点的第二个多态性。 从这些数据可以得出结论,内含子 14 中的第一个多态性是由于变化,即谷粒中的 ta2 突变。 这个结论在下面的例子中得到证实。 我们得出结论,与野生型 Ta2 基因相比,该突变还导致 ta2 基因的 RNA 转录本的剪接模式发生变化,从而导致 ta2 表型。 根据具有 21 个核苷酸插入的 cDNA 数量与缺少插入的 cDNA 数量的比率,估计大约 80% 来自 ta2(突变)基因的 RNA 转录物在新创建的剪接位点剪接. . 通过假设具有 7 个氨基酸插入的突变多肽是无活性的,我们得出结论,突变 ta2 基因相对于野生型保留了大约 20% 的活性。 【0318】 水稻基因组 1 号染色体上位置 LOC_01g11900 的基因被注释为水稻 ROS1a 基因 (OsROS1a),它是编码双功能 DNA 糖基化酶/裂解酶的拟南芥 Demeter 基因 (AtDME) 的同源物。 拟南芥 DME 酶充当 DNA 去甲基化酶并减少 DNA 中 C 残基的甲基化。 因此,Ta2 基因与 OsROS1a 基因和拟南芥 DME 基因的同源物同义。 【0319】 水稻 ROS1a 基因的核苷酸序列包含一个启动子和 4726 个核苷酸的 5-UTR(非翻译区),一个来自 4727-15869 核苷酸的蛋白质编码区,包括 16 个内含子,以及一个 615 个核苷酸的 3'UTR,SEQ ID NO:9 . 显示在 16个内含子的核苷酸位置在SEQ ID NO:9的图例中给出。 SEQ ID NO:9 还在其 3' 末端包含一个 401 个核苷酸的下游区域,据信该区域不是 OsROS1 基因的一部分。 对应于野生型OsROS1基因的cDNA的核苷酸序列提供为SEQ ID NO:8,由1952个氨基酸编码的多肽提供为SEQ ID NO:2。 【0320】 水稻有四个编码多肽的 ROS1 基因,分别命名为 OsROS1a、OsROS1b (LOC_Os02g29230)、OsROS1c (LOC_Os05g3735) 和 OsROS1d (LOC_Os05g37410)。 Rice 还有另外两个被认为编码 DNA 糖基化酶的 Demeter 同系物,Demeter-like-2 (DML2) 和 Demeter-like-3 (DML3)。 【0321】 野生型水稻TA2多肽结构特征描述 在发现水稻 TA2 基因与 OsROS1a 相同后,检查了 OsTA2 (OsROS1) 多肽的氨基酸序列。 已经确定了几种典型的 DNA 糖基化酶结构特征。 ROS1 蛋白的糖基化酶结构域具有至少三个已确定的基序,这些基序足够保守以可识别:螺旋-发夹-螺旋 (HhH) 基序(例如,OsTA2 中的氨基酸 1491-1515)、甘氨酸/脯氨酸-丰富的基序后跟一个保守的天冬氨酸 (GPD),和四个保守的半胱氨酸残基(例如,1582-1598 区域的氨基酸)。 还存在富含赖氨酸的结构域(例如,由 OsTA2 中的氨基酸 87-139 表示)。 与 HhH DNA 糖基化酶超家族的其他成员不同,ROS1 家族的成员包含两个位于中央糖基化酶结构域侧翼的额外保守结构域(结构域 A 和 B)(Mok 等人,2010)。 在水稻TA2多肽(SEQ ID NO:2)中,结构域A存在于氨基酸859-965,糖基化酶结构域存在于氨基酸1403-1616,结构域B存在于氨基酸1659-1933。 域 A 在氨基酸 882-892 处包含一个重复的混合电荷簇。 如诱变分析所示(Mok 等人,2010),AtDME 的保守 DNA 糖基化酶结构域和相邻结构域 A 和 B 似乎是 DNA 糖基化酶/裂解酶活性的必要和充分条件。据报道。 【0322】 实施例5. ta2突变籽粒营养成分分析 【0323】 ZH11 和 ta2 植株在相同时间段和相同条件下在田间种植,以确定突变谷物的成分,特别是那些具有营养重要性的成分。 全麦面粉样品是从植物收获的谷物中制备的,用于成分分析。 表 3 显示了粉末的近似分析结果(双测定法)。 【0324】 表 3. 稻谷的成分分析(g 粒/100g) [表3] 【0325】 近似分析表明 ta2 突变体粉末中的总脂质含量增加了大约 50%。 总氮分析显示 ta2 突变体和野生型谷粒之间的蛋白质水平没有显着差异。 一项测量燃烧除湿粉末样品后剩余材料量的灰分测试表明,与野生型相比,ta2 籽粒增加了 26%。 ta2 谷物中的总纤维水平增加了大约 200%。 与野生型相比,ta2 籽粒中的淀粉含量减少了 8.6%。 这些数据表明,在 ta2 突变体中增加糊粉层厚度会增加富含糊粉层的营养物质(例如脂质、矿物质和纤维)的水平,而不会改变种子大小。 为了更好地理解这些和其他变化,我们进行了如下更广泛的分析。 【0326】 矿物 ICP-AES 结合了电感耦合等离子体 (ICP) 和原子发射光谱 (AES) 技术,用于测量矿物质含量。 它是确定矿物质含量的标准方法,可在单次分析中对多种元素进行灵敏、高通量的定量。 分析数据显示,突变谷物的锌和铁含量比野生型谷物增加了约 15%(按重量计)。 锌水平从 13.9 mg/kg 增加到 16.0 mg/kg,铁从 12.4 mg/kg 增加到 14.2 mg/kg。 【0327】 还观察到钾、镁、磷和硫的增加,分别增加了约 28%、23%、22% 和 9%。 这些结果与 ta2 谷物中灰分含量增加一致,这主要衡量矿物质。 【0328】 抗氧化剂 抗氧化剂是生物分子,可以抵消参与动物组织的负面影响,以防止氧化应激相关疾病,如炎症、心血管疾病、癌症和走廊相关疾病(Huang,2005)。 【0329】 如实施例 1 所述,通过氧自由基吸收能力 (ORAC) 分析测量得自 ta 突变体和野生型稻谷的粉末的抗氧化能力。 在 ORAC 分析中,测量了 AAPH(2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐)产生的合成自由基对内源性自由基清除生物分子和可氧化分子荧光的抗氧化能力。由探针之间的拮抗动力学表示荧光素。 通过比较代表谷物中分子探针荧光素荧光降解动力学的动力学曲线下面积 (AUC) 与 Trolox 标准生成的 AUC(Prior,2005)计算效力。 另一种量化抗氧化能力的方法是使用 Folin-Ciocalteau 试剂 (FCR);它通过测量食品样品中总酚类化合物的还原能力来测量抗氧化能力。 FCR 分析相对简单、方便且可重现。 然而,更耗时的 ORAC 测定测量更多的生物学相关活动。 由于抗氧化剂包括范围广泛的多酚、还原剂和亲核试剂,FCR 和 ORAC 的测量提供了更好的覆盖范围和更全面的总抗氧化能力。 正如 Prior (2005) 所报告的那样,FCR 分析和 ORAC 测量的结果大体上是一致的。 【0330】 FCR 和 ORAC 分析表明,相对于野生型 ZH11 全谷物,来自 ta2 突变体全谷物的粉末的抗氧化能力有所提高。 FCR 显示 ta2 突变体中总酚类化合物增加了大约 35%。 ta2 突变体粉末中亲水性抗氧化剂的含量也增加了 83%。 【0331】 植酸 当在适当的含磷条件下培养时,米粒中总磷含量的大约 70% 会转化为植酸或植酸(肌醇-肌醇-1,2,3,4,5,6-六磷酸盐)。 食品中的植酸作为一种强大的抗氧化剂,对健康有益(Schlemmer,2009 年)。 总植酸分析表明,与野生型相比,ta2 的植酸含量增加了约 19%,增加了约 10.8 mg/g 至约 12.7 mg/g。 【0332】 B族维生素 ta2 粉末中维生素 B3、B6 和 B9 的含量分别比野生型粉末高约 19%、63% 和 58%。 当重复分析 4 次时,平均增长分别约为 20%、33% 和 38%。 已知糊粉层比胚乳富含维生素 B3、B6 和 B9 (Calhoun, 1960),因此 ta 突变体糊粉层厚度的增加推断与 B9 含量的增加有关。 【0333】 膳食纤维 如实施例 1 中所述,观察到测量的总膳食纤维增加了大约 70%。 不溶性纤维增加了约 55%。 【0334】 碳水化合物 ta2 谷物的淀粉含量按重量计降低了 9%。 相比之下,与野生型相比,突变型籽粒中的蔗糖水平增加了 2.5 倍,单糖(阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖)从 31% 增加到 118%。 【0335】 结论 营养成分分析表明,由田间种植的 ta2 谷物制成的全谷物粉含有大量营养素,如脂质和纤维,微量营养素,如矿物质(铁、锌、钾、镁、磷、硫)、B3、大多数富含糊粉层的营养素,包括 B与野生稻田相比,B6 和 B9 等维生素、抗氧化剂和糊粉相关生物分子(如酚类化合物和植酸)显着增加。 游离蔗糖和单糖也显着增加。 在增加这些营养素和微量营养素的同时,ta2 突变体中的淀粉含量也有适度的相对降低。 【0336】 实施例 6. 筛选 Ta2 基因中的其他突变等位基因 【0337】 如实施例1所述通过TILLING分析筛选具有ZH11遗传背景的诱变水稻群体(实施例2)以鉴定Ta2基因中的额外多态性和增厚的糊粉层。可以测试表型。 该方法使用标记的野生型和候选突变体 RNA 的异源双链以及核酸内切酶 CelI 的消化,基本上如 Jiang 等人 (2013) 所述。 虽然首先选择 TA2 基因的 5' 区域进行筛选,但可以选择该基因的任何区域。 【0338】 通过 TILLING 分析,在 Ta2 基因的 5' 区域发现了许多单核苷酸多态性。 与原始 ta2 突变体一样,对来自具有多态性的植物的谷物进行了加厚的糊粉层和其他谷物表型的检查。 一些谷物显示出增厚的糊粉层。 选择显示突变表型的谷物,并从中衍生出后代植物。 确定每个 Ta2 基因的核苷酸序列以确认突变的存在。 鉴定了每个突变体中 Ta2 基因的改变核苷酸。 其他三种厚糊粉层突变体也已测序。 其他含有多态性但未表现出糊粉层增稠的谷物也被鉴定并保留用于比较。 已鉴定的突变体和其他多态性品系及其糊粉层表型总结在表 4 中。 具有增厚的糊粉层的突变体表示为++大大增厚的糊粉层;+弱增厚的糊粉层;-未改变的糊粉层表型。 很明显,获得了各种突变和由此产生的表型。 【0339】 野生型ZH11籽粒的糊粉层厚度为一层。 相比之下,在某些突变体中,含有 V441A 突变的突变体的糊粉层在含有约 5-6 个细胞层的背侧增厚。 突变体S1357F籽粒的糊粉层厚约4-5个细胞层,籽粒收缩,而突变体R482K籽粒的糊粉层厚2-3个细胞层。是的,籽粒没有收缩。 与突变体S156F和S1413N的籽粒相似,突变体S214F籽粒中的糊粉层含有2-4个细胞层并且籽粒缩小。 相比之下,K501S籽粒的糊粉层有2-3个细胞层,籽粒没有收缩。 因此,很容易在 Ta2 基因中获得各种突变体和表型。 【0340】 表 4. 水稻 Ta2 基因中鉴定的突变。 [表4] 【0341】 在 60 个新鉴定的 TA2 基因多态性菌株中,19 个菌株在预测的多肽产物中发生了氨基酸变化(取代)。 其中,至少有 7 个品系表现出增厚的糊粉层表型。 S1413N 和 D1425N 突变位于糖基化酶结构域内。 其他确定的突变位于糖苷酶结构域之外。 除了最初的剪接位点变异外,所有已识别的突变都是氨基酸置换。 没有缺失或终止密码子,发明人得出结论,OsROS1 中的无效突变可能是致命的。 在拟南芥中,据报道母体 dme 突变会破坏种子发育(Choi 等人,2002 年和 2004 年)。 在水稻中,无论父本基因型如何,母本无效等位基因的存在都会导致胚乳早期衰竭(Ono 等人,2012 年)。 【0342】 恢复了 TA2 (OsROS1a) 基因的 10 个新的独立突变等位基因,每个基因在谷物中都有一个增厚的糊粉层,证实了该基因的突变导致了清晰显示的厚糊粉层表型。 此外,所有这些新突变都位于基因相对于第一个 ta2 突变的不同区域,并且可以在全长基因的不同位置改变该基因以实现厚糊粉层表型。 【0343】 克隆了来自表现出厚糊粉层的突变体的几个 ta2 基因,表达了编码的多肽并测试了 DNA 糖基化酶/裂解酶活性。 这证实与野生型多肽相比,该多肽具有降低的DNA糖基化酶/裂解酶活性。 【0344】 实施例 7. ta2 突变体的互补分析 【0345】 为了加强 Ta2 (OsROS1a) 基因突变导致糊粉层增厚和相关表型的结论,进行了互补实验,通过转化将野生型基因的拷贝引入突变株系。它是由 为了构建用于互补实验的转化质粒,从野生型水稻基因组中分离出含有Ta2基因的16,882个碱基对的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)。 该片段依次包含 4726 bp 的上游序列(据信包含该基因的启动子)、包括所有内含子的整个 OsTA2 蛋白编码区、615 个核苷酸的 3'-UTR 和 401 bp 的下游区。 使用一系列寡核苷酸引物从 ZH11 基因组 DNA 中扩增,组装,然后用 KpnI 和 SalI 消化并连接到双元载体 pCAMBIA1300 中。 该载体还含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因。 将转化用质粒和对照质粒(空载体)分别导入根癌农杆菌菌株EHA105中,按照Nishimura等(2006)描述的方法转化到水稻受体细胞中进行转化。 用野生型 Ta2 基因转化再生了总共 32 株 T0 转基因植物。 这些植物被转移到土壤中并在生长室中生长至成熟。 当使用PCR检测潮霉素抗性基因的存在时,鉴定并选择了20个携带潮霉素基因的转化株系。 这些植物生长至成熟,并从每株植物中收获谷粒(T1 种子)。 如 PCR 分析所示,这些植物中的每一种都含有含有野生型 Ta2 基因的载体衍生 T-DNA。 【0346】 通过用伊文思蓝染色检查从这些植物收获的谷物的糊粉层表型。 至少三个转化植物品系产生了与野生型一样的正常糊粉层,表明转基因的阳性表达并因此补充了ta2突变。 这最终证明了 Ta2 基因的突变导致了突变表型。 【0347】 Ta2 基因在下文中称为 ROS1a,这些术语可以互换。 【0348】 实施例 8. 重组表达的 TA2 和 ta2 蛋白的体外酶活性分析 【0349】 如以上实施例 4 所述,水稻 Ta2 基因与 OsROS1a 基因相同,后者与名为 Demeter 的拟南芥 DNA 脱甲基酶/糖基化酶(DME;Gehring 等人,2006)同源。 DME 将半甲基化 DNA 底物中的磷酸二酯键 3' 切割成 5-甲基胞嘧啶残基。 【0350】 因此,如 Gehring 等人(2006 年)所述,通过测量它们对标记的半甲基化 DNA 底物的活性来测试重组表达的水稻 Ta2 和 ta2 蛋白的酶活性。首先,生成末端标记的 DNA,该 DNA 在变性聚丙烯酰胺凝胶上迁移β-消除产物的预测位置。 【0351】 为了重组表达和纯化 Ta2 和 ta2 多肽,将来自野生型和突变型 ta2 植物的全长 ROS1a cDNA 添加到分别具有 XbaI 和 SalI 限制性酶切位点的扩增 DNA 片段的末端。用寡核苷酸 JH021(5'-TTAATCTAGAATGCAGAGCATTATGGACTCG-3';SEQ ID NO:42)和 JH017(5'-CGGTCGACTTAGGTTTTGTTGTTCTTCAATTTGC-3';SEQ ID NO:43)进行 PCR 反应。 PCR 产物用 XbaI 和 SalI 消化并克隆到 pMAL-c2x 载体 (NEB) 中以创建 c2x-ROS1a 基因构建体。 基因构建体被转化到大肠杆菌 Rosetta 细胞(Novagen)中。 为产生多肽,转化细胞在补充有 0.2% 葡萄糖、100 μg/mL 氨苄青霉素和 50 μg/mL 氯霉素的 LB 中在 28°C 下生长,直到 OD600 达到 0.4。 ROS1a-Mal 融合蛋白的表达在 18°C 下用 10 μM IPTG 诱导 1 小时。 将培养物在 4°C 下以 6,500 rpm 离心 15 分钟,并将沉淀重悬于 30 mL 的 4°C 柱缓冲液(20 mM Tris-HCl,pH 7.4,200 mM NaCl,1 mM EDTA)中。 使用输出功率为 4 的 Branson Sonifier 250,将细胞在冰上超声处理 2 分钟。 将裂解物在4℃以9,000rpm离心25分钟,收集上清液并进行重力柱纯化。 根据制造商的方案 (New England Biolabs),通过直链淀粉树脂纯化 ROS1a-Mal 融合蛋白。 洗脱的蛋白质在 4°C 下在 Slide-A-Lyzer 透析盒(10,000 MWCO;Pierce)中针对 50% 甘油透析过夜。 使用蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)通过Bradford方法测定蛋白质浓度,并将蛋白质储存在-20℃直至进一步使用。 【0352】 如实施例 1 中所述,分析 ROS1a-Mal 融合蛋白对半甲基化双链 DNA 底物的 DNA 糖基化酶活性(Gehring 等人,2006)。 【0353】 作为对照,当 ROS1a 与未甲基化的 DNA 寡核苷酸一起孵育时,或者当半甲基化的 DNA 底物在没有酶的情况下孵育时,未检测到裂合酶活性或共价捕获。 【0354】 实施例 9. 水稻 ROS1a 基因的同系物 【0355】 编码介导 DNA 去甲基化的 DNA 糖基化酶的植物基因主要在拟南芥中得到表征(Chan 等人,2005 年;Law 和 Jacobsen,2010 年;Zhu,2009 年)。 它们是 Demeter(DME,Choi 等人,2002 年;Gehring 等人,2006 年)、ROS1(Gong 等人,2002 年;Agius 等人,2006 年)、Demeter-like 2 (DML2) 和 Demeter-like Includes 3 个基因(DML3,Choi 等人,2002 年;Ortega-Galisteo 等人,2008 年)。 这些基因中最大的(和编码的多肽)DME 在雌性配子体的同源二倍体中央细胞中表达最强烈,其中母体等位基因特异性促进隐含基因(包括胚乳)的整体低甲基化和表达。 相反,ROS1、DML2 和 DML3 在营养组织中表达(Gong 等人,2002 年;Penterman 等人,2007 年)。 与 ROS1 相比,DML2 和 DML3 基因的表达水平较低(Mathieu 等人,2007)。 此外,ros1、dml2 和 dml3 中的纯合突变不会导致明显的形态表型,而母体 dme 突变会导致种子(即胚胎)死亡并且不会传递给后代(Choi 等人,2002 年和 2004 年) . 尽管它们的表达水平较低,但 ROS1、DML2 和 DML3 多肽仍然起到 DNA 糖基化酶/裂解酶的作用(Gong 等人,2002 年;Morales-Ruiz 等人,2006 年;Penterman 等人,2007 年)。 根据这些数据,我们预计 ROS1 突变不会导致糊粉层表型增厚。 【0356】 系统发育分析表明,水稻基因组包含四个胞嘧啶去甲基化基因,它们似乎是 ROS1 直向同源物(OsROS1a、OsROS1b、OsROS1c、OsROS1d)和两个不同的 DML3 直向同源物(Zemach 等人,2010)。已显示可编码六种假定的 DNA 糖基化酶为了 尽管鉴定了 OsROS1a 中的无效突变,可能是因为 ROS1a 野生型 DNA 糖基化酶对于雄性和雌性配子体的发育都是必不可少的 (Ono et al., 2012),含有突变的雄性或雌性植物不会传递给后代。 我们不知道任何已发表的 OsROS1a 部分突变的报告。 【0357】 三个已识别的 DNA 糖苷酶结构域:一个螺旋-发夹-螺旋 (HhH) 基序、一个富含甘氨酸/脯氨酸的基序后跟一个保守的天冬氨酸 (GPD) 和四个保守的半胱氨酸残基(实施例 4)。该基序存在在得墨忒尔家族的每个成员中。 在人类 8-氧鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 (hOGG1)、大肠杆菌腺嘌呤 DNA 糖基化酶 (MutY) 和核酸内切酶 III (Endo III) 中也发现了糖基化酶结构域结构(Bruner 等人 2000 年;Guan 等人 1998 年)。 Mok 等人,2010 年)。 与 HhH DNA 糖苷酶超家族的其他成员不同,DME 家族成员在中央糖苷酶结构域的两侧包含两个额外的保守结构域(结构域 A 和结构域 B)(Mok 等人,2010)。 【0358】 同源基因的蛋白质编码区的核苷酸序列通过 ClustalW (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) 比对。 表5显示了水稻ROS1a蛋白编码区与其他物种同源基因相应区域的序列一致性程度。 【0359】 从这些分析中,发明人得出结论,水稻具有多个 ROS1 基因同系物但没有 DME 基因。 在水稻中,就拟南芥而言,ROS1 在序列同一性程度上与其同源同源物 DML2 和 DML3 明显不同。 【0360】 表 5. 水稻 OsROS1a 或 TaROS1a-5B 编码区的核苷酸序列同一性。 [表5] 【0361】 实施例10.ROS1a基因在水稻中的表达 【0362】 进行了实验以分析TA2基因在不同水稻组织中的表达,包括部分发育中的籽粒。 在最初的实验中,如 Brewer 等人 (2006) 所述,通过原位杂交在水稻组织切片中检测到 TA2 mRNA。 简言之,各种水稻组织在真空浸润后在 4°C 下用 FAA 固定剂固定 8 小时,依次使用分级乙醇系列、二甲苯系列和 Paraplast Plus (Sigma-Aldrich) 脱水。 切片机切片 (8 μm) 安装在 Probe-On Plus 显微镜载玻片 (Fisher) 上。 【0363】 从杂交信号得出的结论是,TA2 在果皮、种皮和糊粉层组织以及淀粉质胚乳中表达,但在维管束中不表达。 【0364】 实时逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 用于分析不同植物组织中的相对表达水平。 令人惊讶的是,结果显示花粉中的相对表达最高,其次是花药、幼穗和糊粉层组织(图 6)。 OsROS1a 在花药中的特异性表达被认为与雄性配子体中转座子的抑制有关。 在拟南芥的三细胞花粉中,活性 DNA 去甲基化产生 siRNA,以增强雄性配子(两个精子细胞)中转座子的 RNA 依赖性 DNA 甲基化 (RdDM)。这对于维持转座子在营养细胞核中的基础表达很重要 (Zhu, 2009) ;朱等人,2007 年)。 【0365】 在发育中的种子中,ROS1a 表达在开花后 10 天增加,此后减少。 在淀粉质胚乳和糊粉层组织中均观察到强表达。 种子发育早期的表达模式与种子发育胚乳细胞化之前增厚的糊粉层形成一致。 发明人得出结论,从开花到开花后 7 天(授粉)(0-7DAP) 期间 ROS1a 表达的减少对于厚糊粉层的形成是重要的。 【0366】 示例 11. 水稻中的基因甲基化模式 【0367】 为了确定水稻基因的甲基化模式,从胚乳和胚胎中分离出 DNA,并且与野生型 TA2 植物相比,亚硫酸氢盐在 ta2 突变植物中与未甲基化的胞嘧啶共同反应,然后进行 Illumina 测序。 胚乳是在 10 DAP 从正在发育的 ta2 和野生型 (ZH11) 植物的水稻籽粒中分离出来的,胚是在籽粒发育的同一阶段从野生型植物中分离出来的。 对于亚硫酸氢盐处理后的测序,合成了定制的 Illumina 衔接子,其中胞嘧啶被 5-甲基胞嘧啶取代,使衔接子在亚硫酸氢盐转化后存活下来。 合成了双端 (PE) 接头,允许每个分子从两端进行测序,从而促进随后与基因组支架序列的比对。 大约 0.5-1 μg 的基因组 DNA 分别从野生型和 ta2 植物和野生型胚的解剖胚乳中分离出来。 通过超声处理将分离的 DNA 制备物剪切成 100-500 bp 的片段。 根据 Illumina 协议将适配器连接到剪切片段。 然后用 Qiagen EpiTect 试剂盒和 PfuTurboCx(一种允许模板链中存在尿苷的校对酶)将 DNA 用亚硫酸氢钠处理两次,将未甲基化的胞嘧啶 (C) 转化为尿苷 (U)。通过 18 个循环的 PCR 进行扩增使用 DNA 聚合酶 (Stratagene)。 由于这种 PCR 扩增产生了一个两端具有不同接头的 DNA 片段库,因此“正向”Illumina 测序引物选自“原始”基因组 DNA 衍生链(其中 C 对应于甲基化的 C,其中 T 对应于未甲基化C,其中C存在于基因组序列中),“反向”Illumina测序引物用于获得互补链的核苷酸序列(其中G在相反链上)。对应于甲基化的C和A对应于未甲基化的 C,其中 C 存在于基因组序列中)。 【0368】 从 ta2 胚乳获得的 DNA 中的 CG 和 CHG 甲基化程度大于从对照 ZH11 胚乳获得的 DNA。 这表明 TA2 (OsROS1a) 的突变减少了水稻胚乳中的去甲基化过程。 另一方面,ta2 胚乳中的 CHH 甲基化程度与野生型 ZH11 胚乳中的甲基化程度没有显着差异。 【0369】 实施例12. ta2突变谷物营养成分的进一步分析 【0370】 进行进一步分析以确定突变谷物与在相同条件下同一时间在田间种植的相应野生型谷物 (ZH11) 相比的营养成分。 使用从植物收获的谷物制备全谷物面粉样品并用于如实施例5中所述的成分分析。 表 6 显示了对澳大利亚种植的谷物面粉进行近似分析的结果。 中国种植的谷物结果如表 7 所示。 【0371】 邻近分析显示 ta2 突变粉末的总脂质含量增加了大约 50%。 总氮分析表明,中国的 ta2 突变体和野生型谷物的蛋白质水平发生了显着变化,而澳大利亚则没有,这可能是由于不同的氮肥制度。 ta2 谷物中的总纤维水平增加了约 66% 或 91%。 与野生型相比,ta2 籽粒的淀粉含量降低了 9%。 这些数据表明,在不改变种子大小的情况下,增加 ta2 突变体中的糊粉层厚度可显着提高富含糊粉层的营养物质(如脂质、矿物质和纤维)的水平。 ta2 晶粒的相对增加相当一致,尽管两种生长环境中的绝对数量不同。 【0372】 表 6. ros1a 突变稻谷(澳大利亚)与野生型相比的组成。 [表6] 【0373】 表 7. ros1a 突变体水稻籽粒(中国)与野生型相比的组成。 [表7] 【0374】 本领域的技术人员将理解,在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下,可以对本发明进行多种变化和/或修改,如其具体实施例所示。 因此,这个实施例在所有方面都应该被认为是说明性的而不是限制性的。 【0375】 本申请要求 2015 年 11 月 18 日提交的 AU 2015904754 的优先权,其全部内容通过引用并入本文。 【0376】 本文讨论和/或引用的所有出版物均以其整体并入本文。 【0377】 此处包含的文件、行为、材料、装置、文章等的讨论仅仅是为了提供本发明的背景。 任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分,或者是本申请中每项权利要求的优先权日之前存在的与本发明相关领域的公知常识。