CN112646754B
有效
一种伯克氏菌及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种菌株，具体涉及一种伯克氏菌株及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用。
背景技术
[0002]三七是云南文山地区主要的经济作物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境容易诱发多种土传病害。由于三七神奇的药用功效，全球对三七及其相关产品的需求日益增加，而可供种植三七的区域并不多，因此大多数地区采取三七连作的种植方式。随着三七种植年限的增加，土传病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，严重损害三七的产量和质量，其中最主要的病害为根腐病。
[0003]根腐病是由于土壤中微生物失调，大量病原性和真菌侵染三七植株根部导致的，土壤中微生物失调是导致三七连作障碍的一个重要因素，目前常用的治理方法主要是施用杀菌剂，但是效果越来越不理想，而采用高效熏蒸剂进行土壤灭生处理，然后再补充益生菌剂调整微生物区系使土壤活化和健化的方法则成本较高，效果也不理想。
[0004]伯克氏菌是一种假单胞菌，广泛分布于自然环境中，不同的菌株表型相同，但是基因型不同，有些类型的伯克氏菌在农业上可用作生物降解、生物控制及促进植物生长之根圈微生物，但还有一些是植物致病菌甚至是人体条件致病菌，而且由于伯克氏菌具有较强的抗生素抗药性及较高的运动性，因此，在农业上应用伯克氏菌具有一定的潜在风险，在菌株的选择上需得非常谨慎。中国专利201010290583.8公开了一种水稻根围伯克氏菌，这个菌株在防治水稻纹枯病方面有非常好的效果，但是用这个菌株的菌悬液接种烟叶时，会在24小时内导致典型的过敏反应，因此，如果要利用伯克氏菌解决不同作物的土传病害，如何分离纯化出最合适的伯克氏菌株就很重要。
发明内容
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种伯克氏菌株及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用方法。
[0006]本发明提供一种伯克氏菌菌株(Burkholderia spp.)B36，保藏编号为CGMCCNo.21179；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2020年11月16日。
[0007]本发明所提供的伯克氏菌菌株B36为从健康三七根际土壤中分离得到，对其形态进行鉴定，具体结果如下：该菌为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆状、菌落黄色、表面光滑隆起、边缘不规则。
[0008]本发明还提供了一种采用上述伯克氏菌菌株B36制备的菌悬液及其应用，更为具体地，所述应用为可用于抑制三七根腐病菌、降解三七主要的皂苷类毒性物质以及缓解土壤连作效应。
[0009]本发明的有益效果如下：
[0010]本发明提供的伯克氏菌B36在抗菌实验中能有效地拮抗三七根腐病主要病菌，如茄腐镰刀菌和锈腐病菌，并且对三七皂苷类自毒物质具有显著的降解作用，尤其对皂苷Rb1的降解活性最高，可达100％；此外，不同浓度的三七粗皂苷均未对菌株生长产生抑制，其中高浓度皂苷1.0g/L能明显促进菌株生长。说明伯克氏菌B36能耐受较高浓度的粗皂苷，并且三七粗皂苷能促进菌株进行营养生长，在三七根系中占据更有利的生态位。粗皂苷会促进伯克氏菌B36生物膜的形成，加强其在根部的定殖。伯克氏菌B36对林下土中三七出苗具有一定的促进作用，尤其当土壤中存在自毒物质和根腐病菌(茄腐镰刀菌和锈腐病菌)时，可以明显促进三七的出苗，促进率分别为15.79％、60.0％和42.86％。
附图说明
[0011]图1为本实施例提供的伯克氏菌(Burkholderia spp.)B36菌落图。
[0012]图2为本实施例提供的伯克氏菌(Burkholderia spp.)B36革兰氏染色图。
[0013]图3不同浓度三七粗皂苷对伯克氏菌B36生长的影响。
[0014]图4不同浓度三七粗皂苷对伯克氏菌B36生物膜形成的影响。
具体实施方式
[0015]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
[0016]实施例1伯克氏菌(Burkholderia)B36的分离
[0017]采用平板分离法从健康三七根际土壤中分离得到一种伯克氏菌(Burkholderiaspp.)B36，并对其形态进行鉴定，具体结果如下：该菌为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆状、菌落黄色、表面光滑隆起、边缘不规则。
[0018]该伯克氏菌(Burkholderia spp.)B36保藏信息如下：保藏编号为CGMCCNo.21179；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2020年11月16日。
[0019]实施例2伯克氏菌(Burkholderia)B36对三七根腐病主要病原菌锈腐病菌和茄腐镰刀菌的抑制作用
[0020]本实施例中供试茄腐镰刀菌(Fusarium solani)和锈腐病菌(Cylindrocarpondestructans)由云南农业大学植保学院植物病理实验室提供。
[0021]具体方法如下：
[0022]采用平板对峙培养法测定伯克氏菌B36对供试根腐病菌菌丝生长的抑制活性。在超净工作台上将在PDA培养基上长好的供试茄腐镰刀菌和锈腐病菌用直径为5mm的打孔器制成菌饼，然后将菌饼转至PDA培养基平板中央，再用无菌的牙签将分离纯化的伯克氏菌接种到距病原菌2.5cm处，设置4次重复，以只放病原菌菌饼的平板为对照，26℃恒温培养，待对照菌落长到培养基的2/3时，测量菌落直径，并按照以下供试计算抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]×100％。
[0023]其中，PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，水1000mL。
[0024]将伯克氏菌B36单菌落在1％粗皂苷培养基上直接划线，置于28～30℃恒温培养，能生长的为耐皂苷细菌。
[0025]其中，粗皂苷培养基配方为：3g NaNO3，1g KH2PO4，0.5g KCl，0.5g MgSO4·7H2O，0.01gFeSO4·7H2O，10g粗皂苷，17g琼脂，1000mL蒸馏水，溶解，混匀，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.0。
[0026]得到如表1所示结果，伯克氏菌B36具有明显的耐皂苷性，对供试三七根腐病菌抑制率达到42％以上。
[0027]表1伯克氏菌B36耐皂苷及抑菌能力测定
[0028]
[0029]实施例3检测伯克氏菌B36对皂苷类自毒物质的降解能力
[0030]具体步骤如下：
[0031](1)用接种环挑取纯化好的单一伯克氏菌B36菌株，接种到50mL的NA液体培养基中，放置在28℃、150r/min的摇床上培养过夜；然后，取100μL菌液加入到200mL以三七粗皂苷为唯一碳源的液体培养基中(三七粗皂苷1g/L)，以不加入菌液的处理作为空白对照，置于摇床上振荡培养(28℃、150r/min)，每一处理设置3次重复，培养48h、96h和144h分别取样测定。
[0032]其中NA培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，水1000mL。
[0033](2)从每瓶摇培液中取100mL液体(包括空白对照)加入等体积甲醇，摇匀，20℃超声20min，静置5min后取200mL混合液用0.22μm的微孔滤膜真空抽滤，将抽滤好的溶液用旋转蒸发仪40℃旋转蒸发直到将甲醇蒸发干；最后，取20mL溶液放入-20℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中干燥48h。待溶液干燥后，加入20ml、70％的色谱甲醇纯超声溶解，充分摇匀后取10ml溶液到15ml离心管中离心(4℃、9000r/min)5min，离心后取上面的澄清液1.5mL用0.22μm的尼龙滤膜过滤3次，将滤液置于4℃保存备用。
[0034](3)利用HPLC检测不同处理中主要皂苷物质的含量，并计算接菌处理中主要皂苷类自毒物质的降解率。
[0035]HPLC检测条件为：色谱柱(4.6mm×150mm，4μm，Agilent Poroshell 120EC-C18)；流动相A：乙腈；流动相B：水；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为203nm；进样体积为10μL。洗脱梯度：0～20min，82％B；20～40min，82～57％B；40～48min，57～45％B；48～54min，45％B；54～56min，45～5％B；56～71min，5％B；71～72min，5～82％B；72～74min，82％B。在此条件下，可实现5种主要皂苷达到基线分离。
[0036]降解率(％)＝(未接菌培养液的皂苷含量-接菌培养液皂苷含量)/未接菌培养液的皂苷含量×100％。
[0037]结果得到如表2所示结果，伯克氏菌B36对三七主要的皂苷类自毒物质(Rg1、Re和Rb1)均存在显著的降解作用，尤其对皂苷Rb1的降解活性最高，可达100％。
[0038]表2伯克氏菌B36接种不同时间对皂苷类自毒物质的降解作用
[0039]
[0040]
[0041]实施例4检测皂苷对伯克氏菌(Burkholderia)B36生长和生物膜形成的促进作用
[0042]具体步骤如下：
[0043](1)取100μL的菌株保存液到900μL LB培养基中，28℃过夜培养活化菌株。
[0044](2)用1/10LB液体培养基将菌液稀释到OD590值≈0.4。
[0045](3)取稀释好的菌液20μL，添加到96孔板180μL的不同浓度(0、0.001、0.005、0.01、0.1和1.0g/L)粗皂苷1/10LB溶液中，每组6个重复，28℃静置培养52h。
[0046](4)在培养期间测量细菌OD590值，绘制生长曲线；并在培养52h后，用结晶紫法测定菌株在不同浓度粗皂苷下生物膜的形成情况。
[0047]由图3中可以看出，随着培养时间延长，菌液OD值上升，不同浓度的三七粗皂苷未对菌株生长产生抑制，其中高浓度皂苷1.0g/L能明显促进菌株生长。说明伯克氏菌B36能耐受较高浓度的粗皂苷，并且三七粗皂苷能促进菌株进行营养生长，在三七根系中占据更有利的生态位。由图4中可以看出，在适宜的皂苷浓度下，粗皂苷会促进伯克氏菌B36生物膜的形成，加强其在根部的定殖。
[0048]实施例5检测伯克氏菌(Burkholderia)B36对连作土中三七出苗的促进作用
[0049]具体步骤如下：
[0050](1)土壤配制以林下土：珍珠岩：草炭＝8：1：1充分混匀，分装于200mL灭菌组培瓶中，每瓶50g备用。
[0051](2)三七种子消毒三七种子用1％NaClO溶液消毒3min，用灭菌水冲洗净，备用。
[0052](3)在装有土的组培瓶中分别加入1.0μg/mL皂苷Rg1和浓度为106个孢子/mL的茄腐镰刀菌和锈腐病菌的孢子悬浮液模拟三七连作土，以不加入皂苷Rg1和病原菌的作为空白对照。
[0053](4)在上述装有土的组培瓶中种入消毒过的三七种子，每瓶10棵，然后将伯克氏菌B36在平板上活化48h后，用灭菌水冲洗，将各菌液稀释至106CFU/mL接种于组培瓶中，每瓶20mL，以加入相同体积的无菌水作为对照，每个处理12瓶。放入培养室(26℃，8h光照16h黑暗)中培养，培养3个月后，测量记录植株的出苗率。
[0054]结果得到如表3所示结果，伯克氏菌B36对林下土中三七出苗具有一定的促进作用，尤其当土壤中存在自毒物质和根腐病菌(茄腐镰刀菌和锈腐病菌)时，可以明显促进三七的出苗，促进率分别为15.79％、60.0％和42.86％。
[0055]表3伯克氏菌B36对三七种子出苗的影响
[0056]
[0057]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0029]实施例3检测伯克氏菌B36对皂苷类自毒物质的降解能力
[0030]具体步骤如下：
[0031](1)用接种环挑取纯化好的单一伯克氏菌B36菌株，接种到50mL的NA液体培养基中，放置在28℃、150r/min的摇床上培养过夜；然后，取100μL菌液加入到200mL以三七粗皂苷为唯一碳源的液体培养基中(三七粗皂苷1g/L)，以不加入菌液的处理作为空白对照，置于摇床上振荡培养(28℃、150r/min)，每一处理设置3次重复，培养48h、96h和144h分别取样测定。
[0032]其中NA培养基配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，水1000mL。
[0033](2)从每瓶摇培液中取100mL液体(包括空白对照)加入等体积甲醇，摇匀，20℃超声20min，静置5min后取200mL混合液用0.22μm的微孔滤膜真空抽滤，将抽滤好的溶液用旋转蒸发仪40℃旋转蒸发直到将甲醇蒸发干；最后，取20mL溶液放入-20℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中干燥48h。待溶液干燥后，加入20ml、70％的色谱甲醇纯超声溶解，充分摇匀后取10ml溶液到15ml离心管中离心(4℃、9000r/min)5min，离心后取上面的澄清液1.5mL用0.22μm的尼龙滤膜过滤3次，将滤液置于4℃保存备用。
[0034](3)利用HPLC检测不同处理中主要皂苷物质的含量，并计算接菌处理中主要皂苷类自毒物质的降解率。
[0035]HPLC检测条件为：色谱柱(4.6mm×150mm，4μm，Agilent Poroshell 120EC-C18)；流动相A：乙腈；流动相B：水；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为203nm；进样体积为10μL。洗脱梯度：0～20min，82％B；20～40min，82～57％B；40～48min，57～45％B；48～54min，45％B；54～56min，45～5％B；56～71min，5％B；71～72min，5～82％B；72～74min，82％B。在此条件下，可实现5种主要皂苷达到基线分离。
[0036]降解率(％)＝(未接菌培养液的皂苷含量-接菌培养液皂苷含量)/未接菌培养液的皂苷含量×100％。
[0037]结果得到如表2所示结果，伯克氏菌B36对三七主要的皂苷类自毒物质(Rg1、Re和Rb1)均存在显著的降解作用，尤其对皂苷Rb1的降解活性最高，可达100％。
[0038]表2伯克氏菌B36接种不同时间对皂苷类自毒物质的降解作用
[0039]
[0040]
[0041]实施例4检测皂苷对伯克氏菌(Burkholderia)B36生长和生物膜形成的促进作用
[0042]具体步骤如下：
[0043](1)取100μL的菌株保存液到900μL LB培养基中，28℃过夜培养活化菌株。
[0044](2)用1/10LB液体培养基将菌液稀释到OD590值≈0.4。
[0045](3)取稀释好的菌液20μL，添加到96孔板180μL的不同浓度(0、0.001、0.005、0.01、0.1和1.0g/L)粗皂苷1/10LB溶液中，每组6个重复，28℃静置培养52h。
[0046](4)在培养期间测量细菌OD590值，绘制生长曲线；并在培养52h后，用结晶紫法测定菌株在不同浓度粗皂苷下生物膜的形成情况。
[0047]由图3中可以看出，随着培养时间延长，菌液OD值上升，不同浓度的三七粗皂苷未对菌株生长产生抑制，其中高浓度皂苷1.0g/L能明显促进菌株生长。说明伯克氏菌B36能耐受较高浓度的粗皂苷，并且三七粗皂苷能促进菌株进行营养生长，在三七根系中占据更有利的生态位。由图4中可以看出，在适宜的皂苷浓度下，粗皂苷会促进伯克氏菌B36生物膜的形成，加强其在根部的定殖。
[0048]实施例5检测伯克氏菌(Burkholderia)B36对连作土中三七出苗的促进作用
[0049]具体步骤如下：
[0050](1)土壤配制以林下土：珍珠岩：草炭＝8：1：1充分混匀，分装于200mL灭菌组培瓶中，每瓶50g备用。
[0051](2)三七种子消毒三七种子用1％NaClO溶液消毒3min，用灭菌水冲洗净，备用。
[0052](3)在装有土的组培瓶中分别加入1.0μg/mL皂苷Rg1和浓度为106个孢子/mL的茄腐镰刀菌和锈腐病菌的孢子悬浮液模拟三七连作土，以不加入皂苷Rg1和病原菌的作为空白对照。
[0053](4)在上述装有土的组培瓶中种入消毒过的三七种子，每瓶10棵，然后将伯克氏菌B36在平板上活化48h后，用灭菌水冲洗，将各菌液稀释至106CFU/mL接种于组培瓶中，每瓶20mL，以加入相同体积的无菌水作为对照，每个处理12瓶。放入培养室(26℃，8h光照16h黑暗)中培养，培养3个月后，测量记录植株的出苗率。
[0054]结果得到如表3所示结果，伯克氏菌B36对林下土中三七出苗具有一定的促进作用，尤其当土壤中存在自毒物质和根腐病菌(茄腐镰刀菌和锈腐病菌)时，可以明显促进三七的出苗，促进率分别为15.79％、60.0％和42.86％。
[0055]表3伯克氏菌B36对三七种子出苗的影响
[0056]
[0057]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
