1.一种基于CRISPR/Cas9的甘蓝型油菜基因编辑材料的构建方法,其特征在于,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnTFL1基因6个拷贝即:BnTFL1-1, BnTFL1-2,BnTFL1-3,BnTFL1-4,BnTFL1-5,BnTFL1-6中的一个或一个以上,获得开花时间提前,主枝和所有侧枝产生终端花、花序结构由无限花序变为有限花序的甘蓝型油菜基因编辑材料;
所述甘蓝型油菜BnTFL1基因6个拷贝的全长编码区核酸序列如下所示:
BnTFL1-1
ATGGAGAATATGGGAACTAGAGTGATAGAGCCATTAATAGTGGGAAGAGTGGTCGGAGAT 60
GTTCTTGATAATTTCACTCCAACAATTAAAATGAACGTGAGTTACAACAAGAAGCAAGTC120
TCCAATGGCCATGAGCTTTTCCCTTTAGCTGTCTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATCCAT160
GATGGTGATCTCAGATCTTTCTTCACCCTGGTGATGACAGACCCTGATGTTCCAAATCCT240
AGTGACCCCTTTCTAAAAGAACGCCTGCATTGGCTCGTCATGAACATCCCCGGCACAACA300
GATGCTACATTTGGAAAAGAGGTGGTGAGCTATGAGCTGCCAAAGCCAAACATAGGGATA360
CACAGGTACGTGTTTGTTCTGTTCAGGCAGAAGCAAAGACGTGTTAAGTTCCCAAGCAAT420
ATTATTTCGAGGGATCAGTTCAACACTCGTGAATTTGCGATCGAGAATGATCTTGGTCTC480
CCTGTCGCGGCTGTCTTCTTCAACGCTCAGAGAGAAACCGCATCTCGCAGACGTTAG 537
BnTFL1-2
ATGGAGAATATGGGAACTAGAGTGATAGAGCCATTAATAGTGGGAAGAGTGGTCGGAGAT 60
GTTCTTGATAATTTCACTCCAACAATTAAAATGAACGTGAGTTACAACAAGAAGCAAGTC120
TCCAATGGCCATGAGTTTTTGCCTTTAGCTGTCTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATACAT180
GATGGTGATCTCAGATCTTTCTTCACCCTGGTGATGACAGACCCTGATGTTCCAAATCCT240
AGTGACCCCTTTCTAAAAGAACGCCTGCATTGGCTCGTCATGAACATCCCCGGCACAACA300
GATGCTACATTTGGAAAAGAGGTGGTGAGCTATGAGCTGCCAAAGCCAAACATAGGGATA360
CACAGGTACGTTTTTGTTCTGTTCAGGCAGAAGCAAAGACGTGTTAAGTTCCCAAGCAAT420
ATTATTTCGAGGGATCAGTTCAACACTCGCGAATTTGCGATCGAGAATGATCTTGGTCTC480
CCTGTCGCGGCTGTCTTCTTCAACGCTCAGAGAGAAACCGCATCTCGCAGACGTTAA 537
BnTFL1-3
ATGGAGAATATGGGAGTTAGAGTGATAGAGCCATTGATAATGGGAAGAGTGGTAGGAGAT 60
GTTCTTGATTTCTTCACTCCAACAATTAAAATGAATGTGAGCTACAACAAGAATCAAGTC120
TCCAACGGCCATGAGCTTTTGCCTTCCTCTGTCTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATCCAT180
GGTGGTGATCTCAGATCCTTCTTCACCTTGGTGATGATAGACCCTGATGTTCCAGGTCCT240
AGTGACCCCTTTCTAAAAGAGCACCTGCATTGGATAGTAACAAACATCCCCGGTACAACC300
GATGCTACATTTGGAAAAGAGGTGGTGAGCTATGAGTTGCCAAGGCCTAGCATAGGGATA360
CACAGGTTCGTGTTTGTTCTGTTCAAGCAGAAGCAAAGACGTGTTATCTTCCCAAACATT420
CCTTCGAGAGATAACTTCAACACTCGAAAATTTGCGATCGAGTATGATCTTGGTCTTCCT480
GTCGCTGCTGTCTTCTTTAACGCCCAGAGAGAAACTGCAGCTCGAAGACGTTAA 534
BnTFL1-4
ATGGAGAATATGGGAGTTAGAGTGATAGAGCCATTGATAATGGGAAGAGTGGTAGGAGAT 60
GTTCTTGATTTCTTCACTCCAACAATTAAAATGAATGTGAGCTACAACAAGAATCAAGTC120
TCCAACGGCCATGAGCTTTTGCCTTCCTCTGTCTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATCCAT180
GGTGGTGATCTCAGATCCTTCTTCACCTTGGTGATGATAGACCCTGATGTTCCAGGTCCT240
AGTGACCCCTTTCTAAAAGAGCACCTGCATTGGATAGTAACAAACATCCCCGGTACAACC300
GATGCTACATTTGGAAAAGAGGTGGTGAGCTATGAGTTGCCAAGGCCTAGCATAGGGATA360
CACAGGTTCGTGTTTGCTCTGTTCAAGCAGAAGCAAAGACGTGTTATCTTCCCAAACATT420
CCTTCGAGAGATAACTTCAACACTCGAAAATTTGCGATCGAGTATGATCTTGGTCTTCCT480
GTCGCTGCTGTCTTCTTTAACGCCCAGAGAGAAACTGCAGCTCGAAGACGTTAA 534
BnTFL1-5
ATGGAGAATATGGGAAGTAGAGTGATAGAGCCATTGATAGTGGGAAGAGTGGTAGGAGAG 60
GTTCTTGATTTTTTCACTCAAACAATTGAAATGAACGTGAGTTACAACAAGAAGCAAGTC120
TGCAATGGCCATGAGCTTTTCCCTTCCTTTGTCTCCTCAAAGCCTAGGGTTGAGATCCAT180
GGCGGTGATCTCAGATCTTTCTTCACCTTGGTGATGATAGACCCTGATGTTCCAGGTCCT240
AGCGACCCCTTTTTAAAAGAACACCTGCATTGGATTGTGACAAACATCCCCGGTACAACA300
GATGCAACATTTGGAAAAGAGGTGGTGAGCTATGAGTTCCCAAGGCCAAATATAGGGATA360
CACAGGTTCGTGTTTGTTCTCTTCAAGCAGAAGCAAAGACATGTTATCGATATCTCCCCA420
AACATTCCTTCGAGAGATAAGTTCAATACTCGCAAATTTGCGATCGAGCATGATCTTGGT480
CTCCCTGTCGCGGCTGTCTTCTTCAACGCACAGAGAGAAACCGCAGCTCGCAGACGTTAA540
BnTFL1-6
ATGGGAGAAAGAGTGATAGAGCCATTGATAATGGGAAGAGTGGTAGGAGATGTTCTCGAT 60
TTCTTCACTCCAACAATTAAAATGAATGTGAGCTACAACATGAAGCAAGTCTCCAACAGC120
CATGAGCTTTTTCCTTCCTCTGTCTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATCCATGGTGGTGAT180
CTCAGATCCTTCTTCACCTTGGTGATGATAGACCCTGATGTTCCAGGTCCTAGTGACCCC240
TTTCTAAAAGAGCACCTGCATTGGATAGTAACAAACATCCCCGGTACAACCGATGCTACA300
TTTGGAAAAGAGGTGGTGAGCTATGAGTTGCCAAGGCCTAGCATAGGGATACACAGGTTC360
GTGTTTGTTCTGTTCAAGCAGAAGCAAAGACGTGTTATCTTCCCAAACATTCCTTCGAGA420
GATAACTTCAACACTCGAAAATTTGCGATCGAGTATGATCTTGGTCTTCCTGTCGCTGCT480
GTCTTCTTTAACGCCCAGAGAGAAACTGCAGCTCGAAGACGTTAA 525
具体步骤如下:
步骤一,甘蓝型油菜BnTFL1基因CRISPR/Cas9表达载体的构建:
1)sgRNA靶位点的选择:
针对甘蓝型油菜自交系K407中BnTFL1基因6个不同拷贝的结构和同源关系,基于CRISPRdirect 网站设计两个sgRNA序列,第一个sgRNA序列位于BnTFL1基因第一个外显子,所选序列为5’-CCAAGCCTAGGGTTGAGATC-3’,命名为sgR-BnTFL1-Target1;第二个sgRNA序列位于BnTFL1基因第四个外显子,所选序列为5’-GAGCTGCCAAAGCCAAACAT-3’,命名为sgR-BnTFL1-Target2;
2)sgRNA上下游引物设计:
sgR-BnTFL1-Target1的上游引物BnTFL1-Target1-F:5’-ATTGGATCTCAACCCTAGGCTTGG-3’;
sgR-BnTFL1-Target1的下游引物BnTFL1-Target1-R:5’-AAACCCAAGCCTAGGGTTGAGATC-3’;
sgR-BnTFL1-Target2的上游引物BnTFL1-Target2-F:5’-ATTGGAGCTGCCAAAGCCAAACAT-3’;
sgR-BnTFL1-Target2的下游引物BnTFL1-Target2-R:5’-AAACATGTTTGGCTTTGGCAGCTC-3’;
3)CRISPR/Cas9表达载体的构建与农杆菌转化:
取上述步骤2)所述的sgR-BnTFL1-Target1和sgR-BnTFL1-Target2的上下游引物混合,经PCR仪退火得到双链DNA;利用T4连接酶将双链DNA与经过AarI酶切的CRISPR/Cas9质粒进行T4连接酶连接,将连接产物转化大肠杆菌并做菌落PCR鉴定以及测序验证,得到表达载体;将验证含有sgRNA的载体转化农杆菌,进行菌落PCR验证得到含有表达载体的农杆菌菌株;
步骤二,甘蓝型油菜BnTFL1基因CRISPR/Cas9基因编辑突变体的获得与鉴定:
1)基于农杆菌介导的方法遗传转化甘蓝型油菜自交系K407,通过潮霉素抗性筛选获得基因编辑突变体植株;
2)利用PCR检测基因编辑突变体植株中的CRISPR/Cas9表达载体,并克隆基因编辑突变体植株中BnTFL1基因6个不同拷贝的基因组序列,经测序后,检测每个CRISPR/Cas9基因编辑突变体植株中各BnTFL1拷贝的编辑状况;
步骤三,验证甘蓝型油菜BnTFL1基因对开花时间、花器官发育和花序结构的影响:
1)比较甘蓝型油菜自交系K407和不同CRISPR/Cas9基因编辑突变体在开花时间、花器官和花序结构的差异;
2)分析BnTFL1基因6个不同拷贝的功能。
2.权利要求1所述方法获得的甘蓝型油菜基因编辑材料在甘蓝型油菜育种中的应用。