技术领域 [0001]本发明属于植物组培养技术领域，尤其涉及一种构树防褐化组织培养方法。 背景技术 [0002]构树(学名Broussonetiapapyrifera)，桑科构属植物，为落叶乔木，高10-20m，树皮暗灰色，小枝密生柔毛；具有速生、适应性强、分布广、易繁殖、热量高、轮伐期短的特点；抗污染性强；在中国的温带、热带均有分布。 [0003]杂交构树是一种很好的饲料，蛋白质含量较高，含有多种氨基酸，还含有单宁、黄酮、萜类等多种化合物，因其单宁含量较高，在一定程度上可以起到防腐抗氧化，同时也减少了饲料中防腐剂的添加。杂交构树和野生构树均能吸附尘埃、二氧化硫、氟化氢等，大面积种植可防尘治霾。研究表明，构树对铅和锌有较高的富集能力，而且对于镉的吸收富集能力优于其他物种，是土壤和生态环境修复的先锋树种。杂交构树木质部的综纤维素含量高达80％，木质部具有色白、髓芯少、综纤维素含量高等有利于制浆的特点，其韧皮纤维色泽洁白柔软，原浆不经漂白其白度就可达到80％以上，品质优良。以上研究表明杂交构树各项指标符合当今时代对木材纤维原材料的要求，具有极大的发展潜力。另外，构树叶、皮、果实均可入药，树液可治皮肤病，叶片中的黄酮类、酚类等化合物，具有抗菌、抗血小板聚集、抑制芳香化酶、免疫调节、抗癌以及抗细胞毒性等作用，其中黄酮类和生物碱类是主要的药用成分，经济价值很高。 [0004]构树包括种子繁育、枝条扦插和组织扩繁等多种育苗方式。其中，种子种植实用性较低，因其种子较小(千粒重仅为2g)，种皮坚硬，田间发芽率不到4％，造成种子的大量浪费和造林中构树种苗的缺乏；而硬枝扦插会形成大量愈伤组织导致消耗过多养分，在愈伤组织表面形成木栓层则会影响插穗和吸收水分，生根困难，插穗下切口愈合组织需3-10d生长出新根，常因生根慢导致营养物质不足而死亡。组织培养技术是在植物生产中广泛应用一项生物技术，也是快速繁殖植物新品种的最重要的方法。然而，构树在组培过程中产生的污染、白化以及褐化问题不仅浪费外植体还会影响后续试验效果。 发明内容 [0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构树防褐化组织培养方法，有效解决构树组织培养过程中易发生的褐化、白化的问题，提升增殖率。 [0006]为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案： [0007]一种构树防褐化组织培养方法，包括：将构树外植体接种于诱导分化培养基，暗培养至出芽，继续在诱导分化培养基全光照培养或光照周期10-14h/d培养，进行芽增殖，形成丛生芽后进行生根培养。 [0008]优选的是，所述外植体为构树叶片。 [0009]优选的是，所述外植体进行消毒，包括：流水冲洗1-1.5h，75％酒精浸泡20-40s，无菌水冲洗2-3次，2.5-5％次氯酸钠浸泡6-10min，无菌水冲洗2-3次。 [0010]更优选的是，所述外植体进行消毒后，切成0.5-1.5cm²大小。 [0011]优选的是，所述诱导分化培养基配方为：MS+6-BA1.5-2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖28-30g/L+琼脂7-9g/L。 [0012]优选的是，所述生根培养基配方为：1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖28-30g/L+琼脂7-9g/L。 [0013]优选的是，所述生根培养时，光照周期12-16h/d。 [0014]优选的是，所述组织培养过程温度控制在25-28℃。 [0015]优选的是，还包括获得组织培养生根苗后，进行炼苗移栽。 [0016]优选的是，所述构树为杂交构树。 [0017]相对于现有技术，本发明具有如下有益效果： [0018]本发明提供了一种构树防褐化组织培养方法，通过愈伤组织诱导培养阶段暗培养，能够明显降低愈伤组织褐化现象发生，保持愈伤组织呈绿色状态；光暗交替增殖培养获得丛生芽，避免出芽部分白化现象发生。本发明通过调整构树愈伤组织诱导分化培养和增殖培养的光照条件，使得构树组培褐化率、白化率以及增殖率表现都优于其他组织培养方式。 附图说明 [0019]图1：不同组织培养方法对构树愈伤组织诱导的影响； [0020]图中，a、b为处理1培养；c、d为处理3培养； [0021]图2：不同组织培养方法对构树愈伤组织诱导的影响； [0022]图中，a为处理6培养；b为处理1培养；c、d为处理9培养。 具体实施方式 [0023]本发明提供了一种构树防褐化组织培养方法，包括：将构树外植体接种于诱导分化培养基，暗培养至出芽，继续在诱导分化培养基全光照培养或光照周期10-14h/d培养，进行芽增殖，形成丛生芽后进行生根培养。 [0024]本发明优选外植体为构树叶片，进一步优选外植体母株为长势良好、无病虫害的植株，更优选顶部幼嫩叶片。 [0025]本发明优选外植体进行消毒，包括：流水冲洗1-1.5h，进一步优选外植体置于烧杯中，加3％洗洁精，用纱布封口在流水下冲洗1-1.5h；75％酒精浸泡20-40s，进一步优选浸泡30s，无菌水冲洗2-3次；2.5-5％次氯酸钠浸泡6-10min，无菌水冲洗2-3次，进一步优选幼嫩叶片2.5％次氯酸钠消毒8min，成熟叶片5％次氯酸钠消毒8min。 [0026]本发明优选完成消毒后，将外植体切成0.5-1.5cm²大小，进一步优选1cm²。 [0027]将构树外植体接种于诱导分化培养基进行诱导培养，本发明通过在诱导分化阶段进行暗培养，能够减少组织褐化率，25-30d后可以观察到叶片伤口周围长出白中带绿的健康愈伤组织，并且从中有部分芽分化出。本发明优选诱导分化培养基配方为：MS+6-BA1.5-2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖28-30g/L+琼脂7-9g/L；进一步优选MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.5g/L。 [0028]等愈伤组织中分化出芽之后，转移至光下，继续在诱导分化培养基进行继代增殖培养，全光照培养或光照周期10-14h/d培养，优选光照周期12h/d，能够避免出芽部分白化情况的发生，15-20d之后可增殖形成丛生芽。作为一种可实施方式，本发明光照灯使用的是LED植物组培灯，红白灯1：7的比例排列，灯的功率为18W、色温为6500K、光通量为20501m。 [0029]将得到丛生芽在无菌条件下切取移至生根培养基中，进行生根培养。本发明优选生根培养基配方为：1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖28-30g/L+琼脂7-9g/L；进一步优选1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.5g/L。优选生根培养时，光照周期12-16h/d，进一步优选14h/d，7-10d可生根。 [0030]本发明优选组织培养过程中，温度控制在25-28℃，进一步优选26-27℃。 [0031]本发明优选还包括获得组织培养生根苗后，进行炼苗移栽；进一步优选生长良好的组培苗先开盖加水，在原组培瓶中生长3-5d，待其适应外界环境之后将瓶中的培养基再加0.1％多菌灵水中清洗，将洗净后移栽至栽培盆中，每盆移栽一棵，25-28℃，光照15h/d日常管理。 [0032]本发明优选构树为杂交构树。 [0033]下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0034]实施例1 [0035]一种构树防褐化组织培养方法，包括以下步骤： [0036]步骤一：配制培养基 [0037]诱导分化培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.5g/L； [0038]生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.5g/L； [0039]步骤二：外植体的采集及消毒 [0040]选择长势良好无病虫害的幼嫩构树叶片作为外殖体，置于烧杯中加清洗剂(3％的洗洁精)用纱布封口在流水下冲洗1.5h，然后于超净工作台中进行消毒灭菌，先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3遍，接着用次氯酸钠进行消毒灭菌，幼嫩叶片2.5％次氯酸钠消毒8min，成熟叶片5％次氯酸钠消毒8min，依然无菌水冲洗3遍； [0041]步骤三：愈伤组织诱导分化培养 [0042]在无菌条件下将叶片剪切成1cm²大小的形状，叶片正面朝上置于诱导分化培养基中，进行完全暗培养，温度保持在25-28℃，25-30d后可以观察到叶片伤口周围长出愈伤组织，并且从中有部分芽分化出； [0043]步骤四：继代增殖培养 [0044]等愈伤组织中分化出芽之后，转移至光照培养箱，按光照周期12-14h/d培养，温度25-28℃，15-20d之后增殖形成丛生芽； [0045]步骤五：生根培养 [0046]将步骤四得到的丛生芽在无菌条件下切取移至生根培养基中，光照周期14h/d培养，温度保持在25-28℃，7-10d生根； [0047]步骤六：移栽 [0048]生长良好的生根组培苗先开盖加水，在原组培瓶中生长3-5d，待其适应外界环境之后将瓶中的培养基再加0.1％多菌灵水中清洗，将洗净后的生根苗移栽至栽培盆中，每盆移栽一棵； [0049]步骤七：日常管理 [0050]构树在25-28℃，光照周期15h/d的条件下生长。 [0051]实施例2 [0052]一种构树防褐化组织培养方法，包括以下步骤： [0053]步骤一：配制培养基 [0054]诱导分化培养基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖28g/L+琼脂7g/L； [0055]生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖28g/L+琼脂7g/L； [0056]步骤二：外植体的采集及消毒 [0057]选择长势良好无病虫害的幼嫩构树叶片作为外殖体，置于烧杯中加清洗剂(3％的洗洁精)用纱布封口在流水下冲洗1h，然后于超净工作台中进行消毒灭菌，先用75％酒精消毒20s，无菌水冲洗2遍，接着用次氯酸钠进行消毒灭菌，幼嫩叶片2.5％次氯酸钠消毒6min，成熟叶片5％次氯酸钠消毒8分钟，依然无菌水冲洗2遍； [0058]步骤三：愈伤组织诱导分化培养 [0059]在无菌条件下将叶片剪切成0.5cm²大小的形状，叶片朝上置于诱导分化培养基中，进行完全暗培养，温度保持在25-28℃，25-30d后可以观察到叶片伤口周围长出愈伤组织，并且从中有部分芽分化出； [0060]步骤四：继代增殖培养 [0061]等愈伤组织中分化出芽之后，转移至光照培养箱，全光照培养，温度25-28℃，15-20d之后增殖形成丛生芽； [0062]步骤五：生根培养 [0063]将步骤四得到的丛生芽在无菌条件下切取移至生根培养基中，光照周期12h/d培养，温度保持在25-28℃，7-10d生根； [0064]步骤六：移栽 [0065]生长良好的生根组培苗先开盖加水，在原组培瓶中生长3-5d，待其适应外界环境之后将瓶中的培养基再加0.1％多菌灵水中清洗，将洗净后的生根苗移栽至栽培盆中，每盆移栽一棵； [0066]步骤七：日常管理 [0067]构树在25-28℃，光照周期15h/d的条件下生长。 [0068]实施例3 [0069]一种构树防褐化组织培养方法，包括以下步骤： [0070]步骤一：配制培养基 [0071]诱导分化培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L； [0072]生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L； [0073]步骤二：外植体的采集及消毒 [0074]选择长势良好无病虫害的幼嫩构树叶片作为外殖体，置于烧杯中加清洗剂(3％的洗洁精)用纱布封口在流水下冲洗1h，然后于超净工作台中进行消毒灭菌，先用75％酒精消毒40s，无菌水冲洗3遍，接着用次氯酸钠进行消毒灭菌，幼嫩叶片2.5％次氯酸钠消毒10min，成熟叶片5％次氯酸钠消毒10min，依然无菌水冲洗3遍； [0075]步骤三：愈伤组织诱导分化培养 [0076]在无菌条件下将叶片剪切成1.5cm²大小的形状，叶片朝上置于诱导分化培养基中，进行完全暗培养，温度保持在25-28℃，25-30d后可以观察到叶片伤口周围长出愈伤组织，并且从中有部分芽分化出； [0077]步骤四：继代增殖培养 [0078]等愈伤组织中分化出芽之后，转移至光照培养箱，按光照周期10-12h/d培养，温度25-28℃，15-20d之后增殖形成丛生芽； [0079]步骤五：生根培养 [0080]将步骤四得到的丛生芽在无菌条件下切取移至生根培养基中，光照周期16h/d培养，温度保持在25-28℃，7-10d生根； [0081]步骤六：移栽 [0082]生长良好的生根组培苗先开盖加水，在原组培瓶中生长3-5d，待其适应外界环境之后将瓶中的培养基再加0.1％多菌灵水中清洗，将洗净后的生根苗移栽至栽培盆中，每盆移栽一棵； [0083]步骤七：日常管理 [0084]构树在25-28℃，光照周期15h/d的条件下生长。 [0085]实施例4 [0086]不同组织培养方式对构树褐化率、白化率及增殖率的影响 [0087]以杂交构树为试验材料，分别进行以下处理，按实施例1方式进行组织培养，期间统计杂交构树组织培养的褐化率、白化率及增殖率； [0088]处理1：实施例1； [0089]处理2：与处理1区别在于：继代增殖阶段进行全光照培养； [0090]处理3：与处理1区别在于：继代增殖阶段进行暗培养； [0091]处理4：与处理1区别在于：诱导分化阶段12-14h光照培养，继代增殖阶段暗培养； [0092]处理5：与处理1区别在于：诱导分化阶段全光照培养，继代增殖阶段暗培养； [0093]处理6：与处理1区别在于：诱导分化阶段12-14h光照培养； [0094]处理7：与处理1区别在于：诱导分化阶段12-14h光照培养，继代增殖阶段全光照培养； [0095]处理8：与处理1区别在于：诱导分化阶段全光照培养； [0096]处理9：与处理1区别在于：诱导分化阶段全光照培养，继代增殖阶段全光照培养。 [0097]试验结果：见表1。 [0098]表1不同组织培养方式对构树褐化率、白化率及增殖率的影响 [0099] [0100]根据表1及图1-2可以看出，利用本发明的构树组织培养方法，通过愈伤组织诱导培养阶段暗培养，能够明显降低愈伤组织褐化现象发生，保持愈伤组织呈绿色状态；光暗交替增殖培养获得丛生芽，避免出芽部分白化现象发生。本发明通过调整构树愈伤组织培养和增殖培养的光照条件，使得构树苗褐化率、白化率以及增殖率表现都优于其他培养方式。 [0101]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。