CN115944033A
审中
5-HMF在黄条鰤促生长和提高免疫力饲料添加剂及饲料中应用
技术领域
[0001]本发明属于饲料添加剂领域，具体的涉及5-HMF在黄条鰤促生长和提高免疫力饲料添加剂及饲料中应用。
背景技术
[0002]黄条鰤(Seriola lalandi)隶属于鲈形目(Perciformes)、鯵科(Carangidae)、鰤属(Seriola)，是一种全球性分布的海洋中上层暖温性的具有长距离洄游特性的大洋性经济鱼类，因其具有生长速度快、个体大、营养丰富、口感佳等特点，世界范围内消费需求不断增加，成为我国发展深远海养殖的优良鱼种。近年来，由于水产养殖集约化和水质污染等原因，导致水产病害频发，水产行业遭受了经济损失。水产养殖常使用抗生素来防止病害，但是药物残留以及不正当使用等原因，抗生素易导致水产品品质受损，环境被污染，甚至危害人类健康。许多科研人员致力于寻求代替抗生素的物质，推广绿色添加剂已经成为养殖业发展的必然趋势。另外，当前市场上尚无黄条鰤养殖专用配合饲料，亟需研制专用高效配合饲料及绿色添加剂，推动养殖产业发展。
[0003]5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一种具有呋喃环结构的糠醛化合物，是焦糖化反应和美拉德反应的典型产物之一，广泛存在于食品、植物、中药中。近年来，关于5-HMF的生物学功能逐渐被发掘，主要包括抗氧化活性、改善血液流变学、影响甘草酸代谢等。随着现代科学技术在中药研究领域的广泛应用，对5-HMF有了深入的研究和认识。
发明内容
[0004]本发明要解决的技术问题在于提供一种5-HMF在黄条鰤促生长和提高免疫力饲料添加剂及饲料中应用，5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)对黄条鰤摄食、生长和免疫功能具有促进作用。
[0005]本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0006]5-HMF在黄条鰤促生长和提高免疫力饲料添加剂中的应用，所述饲料添加剂中含有5-HMF。
[0007]本发明还提供一种黄条鰤功能饲料，所述饲料中含有5-HMF，其添加5-HMF的质量为饲料重量的0.25-1％。
[0008]进一步，所述添加5-HMF的质量为饲料重量的0.5％。
[0009]本发明与现有技术相比的有益效果：
[0010]本发明在饲料中添加5-HMF能够改善肠道组织形态和菌群结构，提高消化道有益菌的比重，从而显著促进黄条鰤的摄食与生长(增重率、特定生长率和肥满度)；同时能够提高条鰤肝脏抗氧化能力和免疫力。
附图说明
[0011]图1饲料中添加不同浓度5-HMF对黄条鰤肠道形态的影响(HE染色)。
具体实施方式
[0012]下面结合附图和实例对本发明做进一步详细说明。
[0013]实施例1不同浓度5-HMF对Caco-2细胞的增殖影响
[0014]1.细胞活性实验设计与方法
[0015]为确定合适的饲料添加剂浓度，先探究不同5-HMF浓度对细胞的毒损作用，本实验选取不同浓度的5-HMF(0mMol、1.6mMol、3.2mMol、6.3mMol)干预Caco-2细胞24h，MTT法检测细胞活力情况。以1mlDEME细胞培养液中加入0.01mg待测样品配置待测母液，母液中5-HMF有效浓度为6.3mmol/L，各实验组待测液配制及成分浓度如下：
[0016]表1不同实验组待测液配制及成分浓度
[0017]
[0018]注：本实验中M1、M2、M3组的浓度对应添加剂投喂实验中设置的M1、M2、M3组浓度。
[0019]2.实验细胞培养与传代
[0020]Caco-2细胞(人结直肠腺癌细胞)培养在含有5mL的完全DMEM培养基(内含10％的胎牛血清和1％的青霉素、链霉素抗体)的T25细胞瓶中，培养在37℃、含5％CO2的培养恒温培养箱，每2天更换一次培养基。
[0021]待细胞生长至T25细胞瓶的90％左右时传代，传代时吸出培养瓶内原有培养基，用2mL无菌PBS(1×)轻轻冲洗，吸出PBS后用胰酶(内含0.25％EDTA)在37℃处理3min，处理后加入2mL完全α-MEM培养基中和以终止反应，1000g离心5min后弃上清，后用1mL完全α-MEM培养基重悬细胞，轻轻吹匀后，取0.5mL加入到新的含有4.5mL的完全α-MEM培养基T25细胞培养瓶中，置于培养箱中继续培养。
[0022]3.采用MTT法检测5-HMF对Caco-2细胞活性的影响
[0023]选取5-20代内的Caco-2细胞，以每孔1×104个的接种量接种至96孔板内培养24h后，吸出孔内原有培养基后加入100uL的含不同浓度待测物(5-HMF)培养基(待测物溶解在不含有胎牛血清培养基中)，具体浓度为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，在培养箱中培养20h后，每孔加入10μL、5mg/mL的MTT，37℃下孵育4h，孵育后，吸出孔内培养基，加入150μLDMSO，摇板15min后于490nm处测定其吸光度，细胞增殖活性按照如下公式技算：
[0024]细胞增殖活性＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％。
[0025]式中A空白是样品浓度为0μg/mL下的吸光度
[0026]培养基血清等均来自BiologicalIndustries(IsraelBeitHaemekCo.，Ltd)；MTT来自Sigma；Caco-2细胞来自中科院生物化学与细胞生物学研究所(上海)。
[0027]3.结果
[0028]如表2显示：5-HMF给药组与对照组相比，均出现显著性差异(P＜0.05)，但最高浓度A3组细胞增殖率仍大于80％，说明对细胞无明显毒损作用，适宜作为饲料添加浓度使用。
[0029]表2不同浓度5-HMF对Caco-2细胞的增殖影响
[0030]
[0031]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0032]注：本实验中M1、M2、M3组的浓度对应添加剂投喂实验中设置的M1、M2、M3组浓度。
[0033]实施例2
[0034]实验于2021年9月至10月在大连富谷食品有限公司的工厂化养殖车间完成，试验周期为42d。实验用黄条鰤来自于该公司海上网箱基地养殖的均一规格、体质健康的1龄鱼，平均体长(17.35±0.51)cm，平均体质量(82.33±2.75)g。
[0035]工厂化车间养殖使用容积为3m3圆形玻璃缸水槽，投喂饵料为配合颗粒饲料(林兼产业株式会社，日本)，实验开始前，暂养7d，期间投喂基础饲料，也即所述的配合颗粒饲料(林兼产业株式会社，日本)，日投喂2次，分别在8:00和16:00按体重的2％进行基础饲料投喂，实验开始前禁食24h。将实验鱼随机分4组(M0组、M1组、M2组、M3组)，每组3个重复，每个重复30尾。实验组饲料拟采用将添加不同浓度的5-HMF，通过喷雾的方式均匀覆盖在饲料表面，进行低温烘干，将5-HMF附着在基础饲料上。M1组、M2组、M3组分别投喂添加5-HMF占基础饲料的质量比为0.25％、0.5％、1％的实验饲料。投喂量为体重2-3％，流水养殖，日换水率200-300％。整个养殖过程中水环境条件:水温为13-24℃，盐度为31-32，溶解氧>7mg/L。
[0036]实验结束后，将对照组和实验组每个平行中各取样黄条鰤6尾，每个实验组取样18尾，用MS-222进行麻醉后用75％酒精棉擦拭体表，测量并记录鱼体质量、体长等，使用2ml注射器从尾静脉采集血液样本，血液于4℃静置，4000r/min离心10min，取上清液，储存于-80℃，用于血清生化指标测定。解剖后取肝脏和消化道(胃、幽门盲囊、肠道)样品，排出消化道内残余内容物，采用预冷的灭菌生理盐水冲洗后分装保存于液氮中。
[0037]1.生长性能测定
[0038]生长参数的计算按照下述公式进行：
[0039]增重率(Weightgainratio，WGR，％)＝[(Wt–W0)/W0]×100；
[0040]特定生长率(Specificgrowthratio，SGR，％/d)＝[(lnWt-lnW0)/t]×100；
[0041]肥满度(Conditionfactor，CF，g/cm3)＝Wt/L3。
[0042]上述式中:W0、Wt分别为试验初始和结束平均鱼体质量(湿重，g)；t为试验天数(d)；L为体长(cm)。
[0043]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的生长性能的影响见表。由表3看出，经过42天的饲养，M2和M3组的增重率和特定生长率显著高于M0组(P＜0.05)；M2组肥满度显著高于M0组(P＜0.05)。
[0044]表3不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼生长指标的影响
[0045]
[0046]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)
[0047]2肝脏抗氧化能力测定
[0048]实验所用抗氧化酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，参照说明书测定肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，并测定丙二醛(MAD)浓度。
[0049]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼肝脏抗氧化功能见表4。饲料中添加5-HMF可以显著提高条鰤幼鱼肝脏抗氧化能力。与对照组相比，实验组GSH显著升高(P<0.05)；M0组的MAD水平显著高于M2、M3组(P<0.05)。M2、M3组SOD和CAT活性显著高于M0组(P<0.05)。
[0050]表4不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼肝脏抗氧化能力的影响
[0051]
[0052]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0053]3血清学指标测定
[0054]免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)及酸性磷酸酶(ACP)活性使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行检测，检测方法依照试剂盒说明书进行操作。
[0055]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼血清免疫指标的影响见表5。与M0组相比，摄食不同浓度5-HMF饲料在不同程度上提高了实验鱼的免疫能力。免疫指标结果显示，M2和M3组黄条鰤幼鱼中IgM和AKP显著高于M0组(P<0.05)；M2组LZM和ACP活性显著高于M0组(P<0.05)；M0组GPT显著低于实验组(P<0.05)M1和M3组GOT活性显著高于M0组(P<0.05)。
[0056]表5不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼血清免疫指标的影响
[0057]
[0058]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0059]4肠道组织形态学分析
[0060]取Bouin氏液固定的肠道样品，经过75％，80％，95％，100％梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋与切片(厚度为5微米)、苏木精-伊红(HE)染色后中性树胶封片，置于OLYMPUS显微镜下观察，并拍照记录样本。使用Image J软件测量肠道肌层厚度、绒毛高度和杯状细胞个数。
[0061]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的肠道组织形态学指标见表6，染色结果如图1所示。M2组肌层厚度和绒毛高度显著高于M0组(P<0.05)；5-HMF组和对照组之间杯状细胞的个数没有显著差异。
[0062]表6不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼肠道组织形态学指标的影响
[0063]
[0064]
[0065]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0066]5微生物总DNA的提取与高通量测序
[0067]将采集的样品采用DNA抽提试剂盒(MagPure Soil DNAKF Kit)对样本的基因组DNA进行提取，之后利用Nano Drop 2000和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度并分离。以基因组DNA为模板，使用带barcode的特异引物，Tks Gflex DNA Polymerase(Takara)进行PCR，采用引物343F(5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’)和798R(5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)扩增16S V3-V4区。扩增的序列经琼脂糖凝胶电泳检测合格后交由青岛欧易生物科技有限公司通过Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序。
[0068]对添加不同浓度5-HMF的黄条鰤幼鱼消化道微生物进行多样性指数分析，结果如表7所示。Coverage指数表示样品的测序深度，也表明样品的覆盖率，12个处理组中的Coverage指数均在0.99以上，表明样品中未被检测到的可能性较低。Shannon指数以及Simpson指数反映群落的多样性(species diversity)，相同物种丰富度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性。M2组幽门盲囊中的shannon指数显著高于其他组(P<0.05)，而simpson指数指数显著低于其他组(P<0.05)。Chao指数反映样品中群落的丰富度(species richness)，即简单指群落中物种的数量，而不考虑群落中每个物种的丰度情况。M2组肠道的chao1指数显著高于其他组(P<0.05)。
[0069]表7不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道alpha多样性指数
[0070]
[0071]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0072]注：分组M0S、M0P、M0G为对照组的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M1S、M1P、M1G为添加量为0.25％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M2S、M2P、M2G为添加量为0.5％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M3S、M3P、M3G为添加量为1％的胃部、幽门盲囊、肠道样品。
[0073]在门水平上对微生物门类和相对丰度进行统计，结果表明：在饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的消化道样品间菌群数量无显著差异。其消化道样品中菌群丰度前5位的为Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Desulfobacterota(脱硫菌门)。各组中拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的相对丰度均达到90％以上，但是在各组所占比例有所不同。
[0074]在属水平上对微生物门类和相对丰度进行统计，结果表明：饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道的菌群组成相似，主要是由拟杆菌属(Bacteroides)、Muribaculaceae、Lachnoclostridium、乳杆菌属(Lactobacillus)、副杆菌属(Parabacteroides)、回肠杆菌属(Ileibacterium)、毛螺旋菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普拉梭菌属(Faecalibaculum)等组成。各组中相对丰度较高并且共有的菌属有拟杆菌属、Muribaculaceae、Lachnoclostridium和乳杆菌属。各菌属所占的百分比见表8。
[0075]表8黄条鰤幼鱼消化道的菌群组成百分比注：分组M0S、M0P、M0G为对照组的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M1S、M1P、M1G为添加量为0.25％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M2S、M2P、M2G为添加量为0.5％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M3S、M3P、M3G为添加量为1％的胃部、幽门盲囊、肠道样品。
[0076]
[0077]6数据统计与分析
[0078]高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为FASTQ格式的原始测序序列，经过一系列剪切、去杂、拼接、质控和去除嵌合体后得到有效序列。根据序列的相似性，将序列归为多个可分类操作单元(OTU)，序列相似度≥97％被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包选取每个OTU中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列，并将所有代表序列与Silva(version123)数据库进行比对注释，物种比对注释使用RDP classifier软件，保留置信区间大于0.7的注释结果。采用tax4fun(0.3.1)对微生物群基因参与的KEGG通路进行比对分析。
[0079]数据处理使用Excel2016，并用SPSS26.0软件进行统计分析，同类样品在不同浓度下指标采用配对T检验分析差异性，同一浓度下不同类型样品采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，并对组间差异作Duncan多重比较，显著差异水平P＜0.05时认为差异显著。数值均采用“平均值±标准差”(Mean±S.D.)表示。
[0080]对饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道菌群的OTUs在KEGG数据库进行功能预测分析，根据Kruskal-Wallis算法在Level 3水平上筛选具有显著性组间差异的功能通路(P＜0.05)。消化道各组织中菌群基因参与的主要信号通路相同，但在基因丰度方面存在一定差异，根据消化道菌群OTUs注释的数量发现，差异通路主要集中在碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(Amino Acid Metabolism)和能量代谢(Energy Metabolism)等。
[0081]综上所述，饲料中添加0.5％的5-HMF实验饲料可以改善黄条鰤肠道形态和生长性能，提高血清免疫指标和肝脏抗氧化能力，从黄条鰤幼鱼肠道微生物变化来看，厚壁菌门与拟杆菌门在各组幼鱼肠道菌群中均占绝对优势，而且各组的幼鱼肠道菌群具有相同的优势菌属，此外，各组的黄条鰤幼鱼消化道菌群基因参与的主要功能相近。
[0018]注：本实验中M1、M2、M3组的浓度对应添加剂投喂实验中设置的M1、M2、M3组浓度。
[0019]2.实验细胞培养与传代
[0020]Caco-2细胞(人结直肠腺癌细胞)培养在含有5mL的完全DMEM培养基(内含10％的胎牛血清和1％的青霉素、链霉素抗体)的T25细胞瓶中，培养在37℃、含5％CO2的培养恒温培养箱，每2天更换一次培养基。
[0021]待细胞生长至T25细胞瓶的90％左右时传代，传代时吸出培养瓶内原有培养基，用2mL无菌PBS(1×)轻轻冲洗，吸出PBS后用胰酶(内含0.25％EDTA)在37℃处理3min，处理后加入2mL完全α-MEM培养基中和以终止反应，1000g离心5min后弃上清，后用1mL完全α-MEM培养基重悬细胞，轻轻吹匀后，取0.5mL加入到新的含有4.5mL的完全α-MEM培养基T25细胞培养瓶中，置于培养箱中继续培养。
[0022]3.采用MTT法检测5-HMF对Caco-2细胞活性的影响
[0023]选取5-20代内的Caco-2细胞，以每孔1×104个的接种量接种至96孔板内培养24h后，吸出孔内原有培养基后加入100uL的含不同浓度待测物(5-HMF)培养基(待测物溶解在不含有胎牛血清培养基中)，具体浓度为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，在培养箱中培养20h后，每孔加入10μL、5mg/mL的MTT，37℃下孵育4h，孵育后，吸出孔内培养基，加入150μLDMSO，摇板15min后于490nm处测定其吸光度，细胞增殖活性按照如下公式技算：
[0024]细胞增殖活性＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％。
[0025]式中A空白是样品浓度为0μg/mL下的吸光度
[0026]培养基血清等均来自BiologicalIndustries(IsraelBeitHaemekCo.，Ltd)；MTT来自Sigma；Caco-2细胞来自中科院生物化学与细胞生物学研究所(上海)。
[0027]3.结果
[0028]如表2显示：5-HMF给药组与对照组相比，均出现显著性差异(P＜0.05)，但最高浓度A3组细胞增殖率仍大于80％，说明对细胞无明显毒损作用，适宜作为饲料添加浓度使用。
[0029]表2不同浓度5-HMF对Caco-2细胞的增殖影响
[0030]
[0031]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0032]注：本实验中M1、M2、M3组的浓度对应添加剂投喂实验中设置的M1、M2、M3组浓度。
[0033]实施例2
[0034]实验于2021年9月至10月在大连富谷食品有限公司的工厂化养殖车间完成，试验周期为42d。实验用黄条鰤来自于该公司海上网箱基地养殖的均一规格、体质健康的1龄鱼，平均体长(17.35±0.51)cm，平均体质量(82.33±2.75)g。
[0035]工厂化车间养殖使用容积为3m3圆形玻璃缸水槽，投喂饵料为配合颗粒饲料(林兼产业株式会社，日本)，实验开始前，暂养7d，期间投喂基础饲料，也即所述的配合颗粒饲料(林兼产业株式会社，日本)，日投喂2次，分别在8:00和16:00按体重的2％进行基础饲料投喂，实验开始前禁食24h。将实验鱼随机分4组(M0组、M1组、M2组、M3组)，每组3个重复，每个重复30尾。实验组饲料拟采用将添加不同浓度的5-HMF，通过喷雾的方式均匀覆盖在饲料表面，进行低温烘干，将5-HMF附着在基础饲料上。M1组、M2组、M3组分别投喂添加5-HMF占基础饲料的质量比为0.25％、0.5％、1％的实验饲料。投喂量为体重2-3％，流水养殖，日换水率200-300％。整个养殖过程中水环境条件:水温为13-24℃，盐度为31-32，溶解氧>7mg/L。
[0036]实验结束后，将对照组和实验组每个平行中各取样黄条鰤6尾，每个实验组取样18尾，用MS-222进行麻醉后用75％酒精棉擦拭体表，测量并记录鱼体质量、体长等，使用2ml注射器从尾静脉采集血液样本，血液于4℃静置，4000r/min离心10min，取上清液，储存于-80℃，用于血清生化指标测定。解剖后取肝脏和消化道(胃、幽门盲囊、肠道)样品，排出消化道内残余内容物，采用预冷的灭菌生理盐水冲洗后分装保存于液氮中。
[0037]1.生长性能测定
[0038]生长参数的计算按照下述公式进行：
[0039]增重率(Weightgainratio，WGR，％)＝[(Wt–W0)/W0]×100；
[0040]特定生长率(Specificgrowthratio，SGR，％/d)＝[(lnWt-lnW0)/t]×100；
[0041]肥满度(Conditionfactor，CF，g/cm3)＝Wt/L3。
[0042]上述式中:W0、Wt分别为试验初始和结束平均鱼体质量(湿重，g)；t为试验天数(d)；L为体长(cm)。
[0043]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的生长性能的影响见表。由表3看出，经过42天的饲养，M2和M3组的增重率和特定生长率显著高于M0组(P＜0.05)；M2组肥满度显著高于M0组(P＜0.05)。
[0044]表3不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼生长指标的影响
[0045]
[0046]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)
[0047]2肝脏抗氧化能力测定
[0048]实验所用抗氧化酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，参照说明书测定肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，并测定丙二醛(MAD)浓度。
[0049]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼肝脏抗氧化功能见表4。饲料中添加5-HMF可以显著提高条鰤幼鱼肝脏抗氧化能力。与对照组相比，实验组GSH显著升高(P<0.05)；M0组的MAD水平显著高于M2、M3组(P<0.05)。M2、M3组SOD和CAT活性显著高于M0组(P<0.05)。
[0050]表4不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼肝脏抗氧化能力的影响
[0051]
[0052]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0053]3血清学指标测定
[0054]免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)及酸性磷酸酶(ACP)活性使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行检测，检测方法依照试剂盒说明书进行操作。
[0055]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼血清免疫指标的影响见表5。与M0组相比，摄食不同浓度5-HMF饲料在不同程度上提高了实验鱼的免疫能力。免疫指标结果显示，M2和M3组黄条鰤幼鱼中IgM和AKP显著高于M0组(P<0.05)；M2组LZM和ACP活性显著高于M0组(P<0.05)；M0组GPT显著低于实验组(P<0.05)M1和M3组GOT活性显著高于M0组(P<0.05)。
[0056]表5不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼血清免疫指标的影响
[0057]
[0058]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0059]4肠道组织形态学分析
[0060]取Bouin氏液固定的肠道样品，经过75％，80％，95％，100％梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋与切片(厚度为5微米)、苏木精-伊红(HE)染色后中性树胶封片，置于OLYMPUS显微镜下观察，并拍照记录样本。使用Image J软件测量肠道肌层厚度、绒毛高度和杯状细胞个数。
[0061]饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的肠道组织形态学指标见表6，染色结果如图1所示。M2组肌层厚度和绒毛高度显著高于M0组(P<0.05)；5-HMF组和对照组之间杯状细胞的个数没有显著差异。
[0062]表6不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼肠道组织形态学指标的影响
[0063]
[0064]
[0065]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0066]5微生物总DNA的提取与高通量测序
[0067]将采集的样品采用DNA抽提试剂盒(MagPure Soil DNAKF Kit)对样本的基因组DNA进行提取，之后利用Nano Drop 2000和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度并分离。以基因组DNA为模板，使用带barcode的特异引物，Tks Gflex DNA Polymerase(Takara)进行PCR，采用引物343F(5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’)和798R(5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)扩增16S V3-V4区。扩增的序列经琼脂糖凝胶电泳检测合格后交由青岛欧易生物科技有限公司通过Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序。
[0068]对添加不同浓度5-HMF的黄条鰤幼鱼消化道微生物进行多样性指数分析，结果如表7所示。Coverage指数表示样品的测序深度，也表明样品的覆盖率，12个处理组中的Coverage指数均在0.99以上，表明样品中未被检测到的可能性较低。Shannon指数以及Simpson指数反映群落的多样性(species diversity)，相同物种丰富度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性。M2组幽门盲囊中的shannon指数显著高于其他组(P<0.05)，而simpson指数指数显著低于其他组(P<0.05)。Chao指数反映样品中群落的丰富度(species richness)，即简单指群落中物种的数量，而不考虑群落中每个物种的丰度情况。M2组肠道的chao1指数显著高于其他组(P<0.05)。
[0069]表7不同浓度5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道alpha多样性指数
[0070]
[0071]注：上标不同小写字母表示不同实验组有显著差异(P＜0.05)。
[0072]注：分组M0S、M0P、M0G为对照组的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M1S、M1P、M1G为添加量为0.25％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M2S、M2P、M2G为添加量为0.5％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M3S、M3P、M3G为添加量为1％的胃部、幽门盲囊、肠道样品。
[0073]在门水平上对微生物门类和相对丰度进行统计，结果表明：在饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的消化道样品间菌群数量无显著差异。其消化道样品中菌群丰度前5位的为Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Desulfobacterota(脱硫菌门)。各组中拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的相对丰度均达到90％以上，但是在各组所占比例有所不同。
[0074]在属水平上对微生物门类和相对丰度进行统计，结果表明：饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道的菌群组成相似，主要是由拟杆菌属(Bacteroides)、Muribaculaceae、Lachnoclostridium、乳杆菌属(Lactobacillus)、副杆菌属(Parabacteroides)、回肠杆菌属(Ileibacterium)、毛螺旋菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普拉梭菌属(Faecalibaculum)等组成。各组中相对丰度较高并且共有的菌属有拟杆菌属、Muribaculaceae、Lachnoclostridium和乳杆菌属。各菌属所占的百分比见表8。
[0075]表8黄条鰤幼鱼消化道的菌群组成百分比注：分组M0S、M0P、M0G为对照组的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M1S、M1P、M1G为添加量为0.25％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M2S、M2P、M2G为添加量为0.5％的胃部、幽门盲囊、肠道样品，M3S、M3P、M3G为添加量为1％的胃部、幽门盲囊、肠道样品。
[0076]
[0077]6数据统计与分析
[0078]高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为FASTQ格式的原始测序序列，经过一系列剪切、去杂、拼接、质控和去除嵌合体后得到有效序列。根据序列的相似性，将序列归为多个可分类操作单元(OTU)，序列相似度≥97％被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包选取每个OTU中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列，并将所有代表序列与Silva(version123)数据库进行比对注释，物种比对注释使用RDP classifier软件，保留置信区间大于0.7的注释结果。采用tax4fun(0.3.1)对微生物群基因参与的KEGG通路进行比对分析。
[0079]数据处理使用Excel2016，并用SPSS26.0软件进行统计分析，同类样品在不同浓度下指标采用配对T检验分析差异性，同一浓度下不同类型样品采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，并对组间差异作Duncan多重比较，显著差异水平P＜0.05时认为差异显著。数值均采用“平均值±标准差”(Mean±S.D.)表示。
[0080]对饲料中添加不同浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道菌群的OTUs在KEGG数据库进行功能预测分析，根据Kruskal-Wallis算法在Level 3水平上筛选具有显著性组间差异的功能通路(P＜0.05)。消化道各组织中菌群基因参与的主要信号通路相同，但在基因丰度方面存在一定差异，根据消化道菌群OTUs注释的数量发现，差异通路主要集中在碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(Amino Acid Metabolism)和能量代谢(Energy Metabolism)等。
[0081]综上所述，饲料中添加0.5％的5-HMF实验饲料可以改善黄条鰤肠道形态和生长性能，提高血清免疫指标和肝脏抗氧化能力，从黄条鰤幼鱼肠道微生物变化来看，厚壁菌门与拟杆菌门在各组幼鱼肠道菌群中均占绝对优势，而且各组的幼鱼肠道菌群具有相同的优势菌属，此外，各组的黄条鰤幼鱼消化道菌群基因参与的主要功能相近。
