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今年9月17日，来自Dana-Farber Cancer Institute和哈佛医学院的Katherine A. Donovan和Eric S. Fischer合作，在预印本平台上发表了一篇文章，全面揭示了由分子胶诱导的CRBN互作蛋白的研究成果。本文将详细介绍他们的主要研究发现。
1. 在裂解液中无偏识别降解剂诱导的互作蛋白
研究团队开发了一种简化的免疫共沉淀质谱方法（IP-MS），使用重组蛋白作为诱饵，在细胞裂解液中创造一个稳定且可控制的环境，以减少生物学变异性。他们在使用FLAG-CRBN和DDB1蛋白复合物作为诱饵，并通过flag抗体富集小分子降解剂所形成的复合物。研究在MOLT4和Kelly细胞系中，使用pomalidomide和一种激酶双功能降解剂（SB1-G-187），共鉴定出11个蛋白（MOLT4中为9个蛋白，Kelly细胞中为4个蛋白），其中包含三个新靶点ASS1, ZBED3和ZNF219。这些新靶点还通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）得到了验证。
2. 映射IMiD分子胶降解剂的互作组
为了提高实验的灵敏度和通量，研究团队自动化了富集和样品制备程序。他们筛选了20种不同的IMiD类似物，并结合MOLT4和Kelly细胞系的数据，总共鉴定出298个蛋白。其中，排名前五的蛋白是PATZ1, ZBED3, WIZ, IKZF2和ASS1。ZBED3和ASS1被鉴定为非降解型的互作靶点。
在这298个靶点中，有270个是未被报道的新靶点。研究团队根据超家族和结构域的特征对这些靶点进行了分类和比例计算。
3. 鉴定CRBN招募的锌指蛋白新底物
在这些被鉴定的蛋白质靶标中，发现C2H2型锌指超家族是最大的类别，占所有靶标的14%以上。这与先前的研究结果一致，即CRBN分子胶倾向于招募含有C2H2型锌指结构域的转录因子。
通过比较MOLT4和Kelly细胞系中的锌指蛋白，研究团队发现了一些在这两种细胞系中均富集的锌指蛋白，提示这些锌指蛋白可能是CRBN分子胶的常见靶标。利用AlphaFold2（AF2）数据库中的结构信息，研究团队评估了这些锌指蛋白与已知CRBN-IMiD复合物的结合潜力。特别关注G-loop结构，发现大多数被鉴定的锌指蛋白含有与已知CRBN结合的IMiD分子相似的G-loop结构。除了已知的靶点，研究还鉴定了一批新的锌指蛋白靶点，包括ASS1、ZBED3、ZNF219、ZMYND8和RNF166。
4. 鉴定CRBN招募的新非锌指蛋白
在研究中，发现298个靶标中251个是非锌指蛋白（非ZF蛋白），这些蛋白包括蛋白激酶、RNA识别基序蛋白、代谢酶和翻译蛋白，覆盖了不同的生物途径。这些新靶标通过TR-FRET实验进行了直接招募验证，并使用G-loop结构对齐辅助确定新靶标。值得注意的是，通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构分析，揭示了PPIL4和PDE6D与CRBN-DDB1DB-FPFT-2216复合物的相互作用。晶体结构显示PPIL4的RRM结构域在三元复合物的形成中发挥重要作用，这表明具有RRM结构域的蛋白可能是CRBN分子胶诱导的新底物。
5. 鉴定PPIL4的新型选择性分子胶
通过对约6000种IMiD类似物的生化筛选，研究团队对PPIL4进行了TR-FRET筛选，鉴定出一种新型先导化合物Z6466608628，其对PPIL4的招募效果优于FPFT-2216。
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