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结核病（TB）是一种由结核分枝杆菌（MTB）引起的全球性传染病，每年新增病例超过1000万，并导致超过160万人死亡。MTB是全球第二大致死传染性病原体，仅次于新冠病毒（SARS-CoV-2），超过了艾滋病病毒（HIV）。随着耐药结核的出现和逐渐增多，全球结核疫情的防控形势日益严峻。
MTB的耐药机制主要通过两种路径实现：一是药物靶点基因突变，使药物失效；二是通过激活和过表达药物外排泵，降低细菌内的有效药物浓度。多药外排泵A (Efflux pump A, EfpA) 是第一个在MTB中被发现的药物外排泵，也是MTB生存的必要条件。在各种临床耐药菌株中，EfpA的过量表达使MTB对异烟肼、利福平、阿米卡星等多种药物的耐受性大幅增强。近日，新型抗MTB抑制剂BRD-8000系列和BRD-9327被证实能够特异性靶向EfpA。然而，我们对EfpA在MTB中的实际功能及其抑制机制知之甚少。
2024年9月4日，南方科技大学廖茂富团队在《Nature Communications》期刊上发表了题为《结核分枝杆菌外排泵EfpA结构揭示了转运和抑制机制》的研究论文。该研究表明，EfpA可能作为脂质转运蛋白，在MTB细胞内促进脂质在磷脂双层之间的翻转，并揭示了新型抑制剂在EfpA上的作用位点及其抑制机制。
研究团队利用冷冻电镜技术解析了EfpA在向外开放构象下结合内源性脂质或抑制剂的高分辨率结构。EfpA属于重大转运蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily, MFS），但与经典的12条跨膜螺旋结构的MFS转运蛋白不同，EfpA除了NTD和CTD各6条跨膜螺旋外，还包含一个与NTD和CTD相连接的含两条跨膜螺旋的铰链结构域（HD）。
有趣的是，EfpA内部存在一个从质膜磷脂双层内叶延伸至外叶的“阶梯”型通道，其中三个脂质分子以头对头、尾对尾的方式依次结合在通道的不同位点（A、B和C位）。分子动力学模拟显示，这些脂质分子能够稳定地结合在该通道内。在该通道中间区域，两者的亲水头部与周围螺旋结构共同形成一个向外开放的带负电荷的口袋，该口袋的结构与EfpA外排的亲水性底物（如EtBr和异烟肼）相匹配。
在EfpA与抑制剂BRD-8000.3结合的结构中，BRD-8000.3取代了A位脂质分子，占据了EfpA内脂质通道的内叶脂质结合位点。这与之前报道的几种BRD-8000.3耐受突变株的突变位点相一致。而BRD-9327耐受突变则位于脂质结合位点B周围。通过分子对接分析，BRD-9327可以结合到B位脂质结合位点，从而替代该位点的脂质分子。BRD-9327和BRD-8000.3在EfpA中的结合位点不同，解释了两者联合使用时具有的协同抑制作用。
小分子占据EfpA中的脂质结合位点进而抑制MTB，表明这些脂质与EfpA在MTB中的内在功能存在至关重要的联系。为了进一步探究EfpA的内在功能，研究者利用COFACTOR和Dali进行基因结构功能预测，搜索结果一致地将MFS超家族中的溶血磷脂转运蛋白MFSD2A视为最佳匹配。尽管序列同源性较低（11%），EfpA和MFSD2A在结构上表现出高度相似性，B和C两个脂质结合位点也对应。这些发现表明EfpA可能类似于MFSD2A，具备脂质转运蛋白的功能。
此外，研究者比较了EfpA向外开放的冷冻电镜结构与AlphaFold预测的向内开放的EfpA结构，揭示了构象变化以及脂质通道的改变。最后，他们提出了EfpA脂质转运的“阶梯翻转”模型及小分子抑制机制。
总而言之，该研究解析了MTB多药外排泵EfpA的结构，揭示了EfpA在MTB中可能行使的脂质转运蛋白功能，确定了新型MTB抑制剂在EfpA内的结合位点。这些研究进展为靶向EfpA的抗结核新药的开发和优化提供了可靠的结构基础，并促进了对MFS超家族脂质转运蛋白机制的深入理解。
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