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胆管（BD）在肝脏门静脉周围发育，是将肝细胞分泌的胆汁输送到肠道的重要通道。胆管细胞来源于肝母细胞，构成了肝内胆管（IHBD）的上皮部分。IHBD的结构功能障碍会导致胆汁无法正常排出，引发严重的肝损伤，胆管与血管（BV-BD）之间的相互作用对IHBD的发育至关重要。
近日，东京大学Hideki Taniguchi研究团队在《自然通讯》（Nat Commun）上发表了一篇题为《通过结合人iPSC诱导的血管在肝类器官内生成3D胆管结构》的研究论文。
该团队通过共培养人类诱导多能干细胞（hiPSC）生成的肝祖细胞和人工血管，成功模拟了肝上皮组织与血管间的相互作用，构建了含有人工血管的肝类器官（BVLO），并重建了人类胆管结构，为研究先天性胆道疾病提供了有效的体外模型。
研究指出，肝门处的门静脉平滑肌细胞（PV-SMCs）在胆管细胞的早期分化中起重要作用。实验表明，胆管细胞的分化高度依赖于门静脉（PV），而Notch配体Jagged1（JAG1）的敲除会引起胆管发育异常。
通过对小鼠和人类胎肝进行免疫染色分析，研究发现PV-SMCs在肝门区域表达高水平的αSMA，而在外围区域主要表达SM22和低水平的αSMA。外围区域的未成熟平滑肌细胞（imSMCs）与胆管细胞的早期分化相关，并且在这些细胞中JAG1的表达较高。这表明PV-SMCs的未成熟状态与胆管发育的早期阶段密切相关。
为探讨不同成熟阶段的hiPSC-SMCs对胆管细胞分化的影响，研究人员从hiPSC中诱导出血管平滑肌细胞（SMCs）。免疫荧光和定量PCR（qPCR）数据显示，在hiPSC-SMC的分化过程中，第6天出现了SM22+αSMA低细胞，而第10天出现了SM22+αSMA高细胞。
研究人员将第6天和第10天生成的细胞分别称为hiPSC-imSMCs和hiPSC-SMCs，qPCR分析显示，JAG1在hiPSC-imSMCs中表达较高，提示未成熟的SMCs（imSMCs）可能具有更高的诱导胆管细胞分化的潜力。
为验证这一假设，研究团队应用三维（3D）共培养系统，将含有JAG1、TGFβ1和Laminin 511的人hiPSC血管与肝类器官结合，成功诱导出胆管样结构。在三周的培养期内，胆管细胞分化并形成了具有典型标志物和结构特征的胆管样结构。这一系统有效地模拟了胆管细胞的分化过程，且具备潜力作为研究胆管发育的模型。
研究人员对BVLO中生成的hiPSC-胆管进行了结构和功能分析，发现这些胆管形成了管状结构，并具有紧密连接和微绒毛等典型胆管上皮细胞特征。此外，这些胆管显示出依赖多药耐药蛋白1（MDR1）的排泄和分泌功能。检测到的γ-谷氨酰转移酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）的活性也进一步证实了hiPSC-胆管的功能性。总体来说，BVLO中的hiPSC-胆管成功再现了真实胆管的结构和功能。
当将来源于人iPSC的肝祖细胞移植到免疫缺陷小鼠的肝脏表面时，研究人员观察到移植后的胆管细胞在顶端表面表达了OPN和乙酰化微管蛋白。这些标志物表明这些细胞在体内环境中进一步成熟。
为了验证这些移植的胆管细胞是否与宿主胆管系统相连，研究团队向移植细胞的小鼠肝组织中注射了碳墨水，并进行了免疫荧光分析。结果显示，移植的胆管细胞与宿主的肝内胆管建立了连接，证实体内环境有助于胆管细胞的高度成熟，并与宿主形成功能性连接。
为进一步研究BVLO移植对胆汁淤积性疾病的影响，研究团队在小鼠中通过胆管结扎（BDL）诱导胆汁淤积性肝损伤，并将BVLO移植到小鼠肝脏表面。结果表明，移植后的小鼠存活时间显著延长，胆红素水平下降，体重减轻程度减轻。分析显示，移植的胆管结构腔体扩张，推测可能为肝脏提供了一个辅助胆汁储存空间，暂时缓解了胆汁淤积症状。
通过单细胞RNA测序分析BVLO中的细胞组分，发现TGFβ和Notch信号通路在胆管与血管的相互作用中发挥关键作用。结果显示，BVLO中的细胞与成人肝脏细胞具有相似性，尤其是在肝细胞和胆管细胞的亚群划分方面。TGFβ信号在内皮细胞-胆管细胞和间充质细胞-胆管细胞的相互作用中最为显著，而JAG1-NOTCH信号则主要在间充质细胞-胆管细胞的相互作用中激活。
总结而言，此研究通过模拟胎儿肝脏发育中的门静脉-胆管相互作用，在hiPSC肝脏类器官中成功生成了胆管结构。结果表明未成熟的平滑肌细胞在胆管发育初期发挥了关键作用，而人工血管的引入有助于胆管腔的形成。移植后的胆管结构显示出成熟的表型标志，但仍需进一步优化以实现完全成熟。这一方法有效模拟了胆管发育异常，为研究先天性胆道疾病提供了有效的体外模型。
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