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导读：迄今为止，全球范围内已有超过50种针对新型冠状病毒的疫苗获得批准，它们主要分为四类：灭活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗以及mRNA疫苗。其中，mRNA疫苗以其研发和生产速度的优势，以及其在激发免疫反应方面的高效性，引领了医药领域的新变革。mRNA技术的潜力正在被不断挖掘，其应用范围已经扩展到肿瘤治疗、病毒预防、蛋白质疗法和基因编辑等多个领域。
目前，根据mRNA分子的特性，mRNA疫苗可以被分为几种类型：标准线性mRNA疫苗、自扩增RNA(saRNA)疫苗以及环状RNA(circRNA)疫苗。在新冠疫苗的早期研发阶段，Moderna和BioNTech公司研发的mRNA-1273和BNT162b2疫苗，采用了编码S蛋白的标准线性mRNA技术。随后，一些公司如Gritstone和HDT bio开始尝试开发基于自扩增RNA的新冠疫苗，最终，Arcturus Therapeutics与澳大利亚CLS合作开发的全球首个自扩增RNA疫苗在日本获得批准上市。
在之前的讨论中，我们已经对自扩增RNA的骨架序列和其递送机制进行了深入分析。本期，我们将探讨如何通过多种策略来增强saRNA疫苗的免疫效果，包括多抗原编码序列的设计、抗原编码序列的优化、减少不良免疫刺激、与免疫激活因子的融合以及异源疫苗接种等。
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多抗原编码的自扩增RNA疫苗
面对未来可能出现的新冠变异病毒，研究者们致力于开发能够针对多种变异株的多抗原疫苗，以期激发更广泛的中和抗体和细胞免疫反应。特别是针对病毒保守区域的细胞免疫反应，如N蛋白，可以在抗体反应减弱时提供额外的保护。
ZIP1642是一种采用脂质纳米颗粒(LNP)封装的双抗原新冠saRNA疫苗，它包含两个独立的saRNA分子，分别编码原始新冠病毒株的S-RBD和N抗原。在小鼠进行的初免-加强免疫方案中，使用1 µg ZIP1642（两种RNA等比例混合）可以诱导对四种新冠变异株的中和抗体(nAb)，同时扩增S抗原和N抗原特异性的CD4(+)和CD8(+) T细胞，并诱导Th1型细胞因子反应。此外，在仓鼠模型中，使用1ug或5 µg ZIP1642进行初免-加强免疫可以显著提高中和抗体水平。攻毒实验显示，接种ZIP1642的仓鼠肺部病毒载量显著降低，且在最高剂量下能够防止病毒引起的肺部损伤。尽管在Beta B.1.351变异株攻毒后，ZIP1642未能显著提高针对该变异株的中和抗体反应，但其通过增强细胞免疫或非抗体介导的功能，仍然能够减少肺部病毒载量并保护仓鼠免受体重下降的影响。
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优化自扩增RNA疫苗的抗原编码
研究表明，SARS-CoV-2感染后体内产生的大多数中和抗体都针对S蛋白的受体结合域(RBD)。基于此发现，研究者开发了表达可溶性或膜锚定RBD的saRNA疫苗。在小鼠实验中，与分泌型RBD的saRNA疫苗相比，RBD-TM-saRNA疫苗显示出更高的抗体滴度和对多种变异株的细胞免疫反应。进一步在仓鼠和非人灵长类动物(NHP)中的测试也证实了其增强的免疫原性，并能有效防止病毒攻击。
为了进一步增强免疫效果并扩大保护范围，研究者设计了一种新型saRNA疫苗，该疫苗编码融合了TM区域的SARS-CoV-2 Gamma RBD，并在仓鼠中进行了测试。攻毒实验表明，接种该疫苗的仓鼠能够防止体重下降，且免疫效果优于基于Wuu-Hu-1序列的原始RBD-TM-saRNA疫苗。通过修改RBD序列，可以更新saRNA-RBD-TM疫苗以应对新的变异株，这可能简化新疫苗的开发流程。
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降低自扩增RNA的免疫原性
早期临床试验数据显示，与标准mRNA疫苗相比，自扩增RNA疫苗触发的中和抗体水平较低，可能是由于自扩增RNA引发的强烈I型干扰素反应抑制了RNA复制和抗原表达。研究者尝试了多种方法来降低自扩增RNA的免疫原性，包括序列优化、共表达病毒抑制蛋白、递送系统改进等，但这些方法并不普遍适用。最通用的方法是通过核苷修饰来降低RNA的免疫原性。有趣的是，研究发现使用N1-甲基假尿苷合成的自扩增RNA会抑制蛋白表达活性。这可能是因为修饰核苷的引入改变了自扩增RNA的序列结构，导致RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)无法识别关键元件，如末端的保守序列元件(CSEs)或基因组启动子(SGP)。
然而，最近的一项研究可能为saRNA疫苗开发带来重大突破，即发现saRNA也可以通过使用修饰核苷酸来降低免疫原性。波士顿大学的Grinstaff实验室在BioRxiv上发表的研究中，筛选出与自扩增RNA相容的修饰核苷酸，这些修饰核苷酸能够抑制干扰素反应，并显著提高蛋白表达水平，这与当前主流观点相反。他们使用27种修饰核苷酸合成了mcherry-saRNA，并在HEK293细胞中进行了转染效率的评估，筛选出5-羟甲基胞苷(5OHmC)、5-甲基胞苷(5mC)和5-甲基尿苷(5mU)这三种转染效率最高的修饰核苷酸。与未修饰的自扩增RNA相比，这些修饰核苷酸显著提高了转染效率。
此外，VLP Therapeutics公司的Wataru Akahata团队在medrxiv上发表的研究中，通过在自扩增RNA疫苗中掺入修饰核苷5-甲基胞嘧啶来减少先天免疫反应，降低反应原性。在1期临床剂量递增研究中，接种了不同剂量的5-甲基胞嘧啶修饰的自扩增RNA新冠疫苗的受试者在第28天的血清中抗体滴度增加了约3倍，证实了修饰自扩增RNA在临床上的安全性和有效性。
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与免疫刺激分子结合
将疫苗与能够激活免疫细胞表面免疫刺激受体（如OX40、CD137或CD40）的分子或能够阻断免疫检查点（如PD-1、CTLA-4）的分子结合，可以增强疫苗诱导的免疫反应。有效的抗原特异性T细胞反应对于建立持久的抗病毒免疫记忆至关重要。共刺激分子如OX40激动剂不仅可以增强效应T细胞的激活，还可以增加长期记忆T细胞的数量。OX40是TNF受体家族的成员，在CD4 T细胞表面表达上调，并与活化APC表面的OX40L结合，增强T细胞的扩增和存活。OX40激动剂的使用可以提高T细胞细胞因子水平，有助于病毒清除，并增强抗肿瘤T细胞反应。此外，OX40激动剂还可以与Tfh细胞上的ICOS协同作用，增强体液免疫反应，产生更高亲和力的抗体和长寿命的记忆B细胞。
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异源接种
由于新冠疫苗的快速研发和供应限制，人们可能会在初次免疫和加强免疫时接种不同的疫苗。与同源免疫相比，异源免疫可能具有不同的安全性或有效性特征。考虑到许多人已经通过疫苗接种或感染获得了针对SARS-CoV-2的抗体，异源加强免疫可能是在预先存在免疫力的情况下增强免疫反应的有效方法。临床研究表明，ChAd-mRNA异源疫苗接种可以诱导更高频率的S特异性T细胞和针对不同变异株的更高中和抗体滴度。
saRNA疫苗在异源免疫中的优势也得到了评估。与单剂ChAd或saRNA接种相比，使用ChAd或saRNA初免和替代加强疫苗（即ChAd-saRNA或saRNA-ChAd）或两剂saRNA进行异源疫苗接种可以诱导最高的IgG反应。在所有疫苗接种组中均检测到了相当数量的SARS-CoV-2刺突特异性IgM，而使用saRNA-ChAd异源疫苗接种可以诱导更高的血清SARS-CoV-2刺突特异性IgA。异源免疫的小鼠中ELISpot检测到最高的IFNγ反应，但仅在某些情况下具有显著的统计学意义。疫苗接种后细胞介导的反应主要由CD8+ T细胞主导。此外，无论疫苗顺序如何，在远交和近交系小鼠中均测量到抗原特异性T细胞的最高数量。
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总结
早在1998年，Peter Liljeström团队就证明了可以使用裸露的saRNA进行小鼠免疫。saRNA相对于传统mRNA的优势之一是其自我复制特性，可以减少疫苗接种所需的RNA剂量。为了优化自扩增RNA疫苗的免疫效果，需要提高递送系统的效率和靶向性，同时改善自扩增RNA分子的免疫原性、抗原选择和编码序列。此外，自扩增RNA疫苗与其他疫苗的异源接种可以进一步增强免疫反应。
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