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最近，中国疾病预防控制中心的病毒病预防控制所，由冯霞领导的研究团队在 Research Square 上发布了一篇预印本论文，题为 "Optimization of the 5' untranslated region of mRNA vaccines." 这项研究并没有提出突破性的方法，而是采用了标准的技术路径。研究团队设计了五种不同的5'UTR序列，用以驱动报告基因和HIV gp145基因的表达，并基于蛋白质的表达效率和水平，筛选出了表现最佳的5'UTR序列。研究中有两个引人注目的发现：
相同的5'UTR在质粒和mRNA上驱动同一基因的表达时，细胞内的蛋白质表达水平存在显著差异。这意味着，通过质粒筛选出的最佳UTR可能不适用于mRNA。
5'UTR的二级结构与帽结构之间的距离对mRNA的蛋白表达效率有着显著影响。
研究团队总共筛选了五种5'UTR候选序列，其中包括：
α-globin-5'UTR和β-globin-5'UTR，它们源自人体细胞中高表达基因的天然UTR，其中α-globin-5'UTR被用于辉瑞/BioNTech的BNT162b2疫苗。
minimal 5'UTR，其表达水平与α-globin-5'UTR相当或更高，源自一篇关于最小化5'-UTR以最大化mRNA治疗翻译效率的研究。
CYBA-5'UTR，能够增强mRNA的翻译水平而不改变其半衰期，源自一篇关于人类细胞CYBA UTR序列的研究。
Albumin-5'UTR，来自白蛋白基因，白蛋白是血浆中最丰富的水溶性球状蛋白。
研究团队使用百度开发的生物信息学平台Paddlehelix，预测了不同mRNA构建体中5'UTR区和编码序列前30个氨基酸的二级结构，以及第一个发夹结构的热力学稳定性和与帽结构的距离。
在确定了五种不同的5'UTR候选序列后，研究人员确保了启动子、目标基因、3'UTR和PolyA的一致性。通过常规的酶切连接或直接合成序列的方法，将5'UTR候选序列与目标基因和质粒载体连接起来。质粒构建完成后，通过体外转录反应合成了携带不同5'UTR序列的mRNA。
研究人员将含有不同5'UTR的重组报告基因质粒转染到BHK-T7细胞中，并在不同时间点检测了绿色荧光蛋白的表达，发现CYBA-5'UTR和Albumin-5'UTR的报告基因表达水平较高，而其他三种5'UTR的表达水平较低。
当研究人员将含有不同5'UTR的mRNA转染到HEK293T细胞时，发现β-globin-5'UTR的报告基因表达水平最高，而CYBA 5'UTR的表达水平最低。
HIV gp145是一种有前景的基于Env的HIV候选疫苗，由gp120和gp41亚基组成，模仿HIV病毒颗粒表面的天然Env刺突。临床前研究表明，gp145能够引发针对HIV包膜的强烈抗体反应。研究中，含有不同5'UTR的gp145-mRNA在HEK293T细胞中转染后，β-globin-5'UTR的表达量最高。
讨论部分指出，质粒和mRNA驱动的蛋白表达之间没有相关性，因为它们涉及不同的机制。质粒需要入核转录为mRNA，然后出核至细胞质中进行翻译，而外源合成的mRNA可以直接在细胞质中启动翻译。因此，筛选5'UTR序列最好直接在RNA水平上进行。
此外，5'UTR序列的长度、二级结构稳定性及其位置对蛋白翻译效率有显著影响。非结构化的5'UTR通常有利于较高的翻译起始率，而紧邻帽的茎环结构则显著抑制起始。根据钱永健的研究，发夹结构的稳定性小于−35 kcal/mol时，翻译效率与其距帽子的距离显著相关。研究中使用Paddlehelix预测了不同5'UTR序列的二级结构和发夹结构稳定性，发现五个5'UTR发夹结构的预测热力学稳定性均小于−30 kcal/mol。
最后，尽管我们希望找到表达效率高且兼容性广的UTR序列，但同一个UTR序列在不同的靶标基因和转染细胞中可能表现出完全不同的蛋白表达效率，这使得UTR序列的筛选变得复杂。随着AI技术的发展，未来我们可能只需输入靶标基因序列，AI序列优化平台就能从大量数据库中筛选出最佳的候选UTR序列，经过简单的细胞水平验证后即可使用。
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