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AAV载体基因治疗产品由DNA、蛋白质和相应辅料构成，是一种复杂的混合物体。其本身或相关杂质具有不可忽视的异质性。
产品异质性指的是在AAV产品中，存在不同于目标分子，但在活性、效力和安全性方面性质相当的变异体。这可能包括翻译后修饰的衣壳、不同化学计量比的衣壳蛋白、以及包装不完整的病毒颗粒等。这些产品变异体有的被视为产品变异体，也有的被列为产品相关杂质，取决于它们对产品活性、效力和安全性的影响。例如，治疗A型血友病的AAV载体基因治疗产品Roctavian中，由于其使用的表达盒超出AAV5血清型的最大包装能力，分析患者肝活检样本时发现“有30-40%的全长或ITR融合的表达载体，这表明有相当多的AAV包装是不完整的，如缺乏5’或3’ITR，并且相邻的启动子或polyA区域也可能被截断…”。尽管这些截断的产品变异体比例很高，但基于成功的临床研究，认为这些变异体的存在并不影响产品的安全性和有效性，因此该产品顺利获得市场批准。
产品相关杂质指的是那些与目标产品分子在活性、效力和安全性方面不可比的变异体。例如，空壳病毒、病毒聚集体、可复制型AAV、未含目的基因的病毒（例如包装的是HCD、质粒DNA）、衣壳蛋白不完整等。FDA在2020年发布的人类基因治疗IND CMC指导原则中指出：“典型的产品相关杂质包括有缺陷的干扰性病毒颗粒、无感染活性的病毒颗粒、空衣壳病毒或复制型病毒。这些杂质应被检测，并以比例形式报告，如完整病毒与空壳病毒的比例，或物理滴度与感染滴度的比例。”另外，2021年FDA的CTGTAC会议也强调：“空衣壳病毒增加了整体抗原负荷，可能加剧由衣壳触发的先天和适应性免疫反应。此外，AAV空衣壳可能与完整衣壳竞争受体结合，这可能需要增加载体剂量。”2023年，国内CDE发布的《腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则》也要求对包括空壳病毒、不完整包装病毒、游离衣壳蛋白等在内的杂质进行全面分析。
控制AAV载体基因治疗产品异质性的策略，无论是产品异质性还是相关杂质，都是对AAV生产工艺和质量控制的重大挑战。产品可能包含携带不同长度DNA序列的病毒颗粒，包括长于或短于目标AAV产品的DNA序列。
在进行分子设计时，应考虑野生型AAV表达盒约4.7kb的长度（包含两端ITRs）。rAAV的包装机制更倾向于包装接近这一长度的序列。略大于4.7kb的基因组依然可以被包装，但效率较低，且截断体风险增大。例如，如果表达盒长度远小于野生型AAV的一半（<2.4 kb），可采用自身互补型基因组设计（scAAV）或添加非编码序列，以降低包装外源DNA的风险。因此，表达盒设计应尽量接近野生型长度，以避免降低病毒生产率和增加产品杂质。
在正式进行CMC开发前，应进行小规模制备样品的异质性评价工作。例如通过检测空壳率、实心率、错包率和基因组完整性，尽早识别风险并进行必要的分子设计优化。在产品开发初期，应对产品进行充分的质量表征，积累产品异质性和相关杂质的数据，了解病毒衣壳和衣壳内包装物的特性。结合生产批次的历史数据以及非临床和临床研究的安全性、效力数据，综合评价异质性和杂质对产品的影响，有助于加速产品上市审批。
参考文献：
1. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(6), 811–830
2. Dark Horse consulting white paper. Jan 12, 2023
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